CN1212404C - 一种提高埃博霉素a产量的发酵工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高粘细菌次级代谢产物产量的方法，即提高粘细菌中埃博霉素(Epothilone)产生菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)的代谢产物埃博霉素A产量的方法。该方法包括1)对成团生长的粘细菌液体均匀生长的驯化方法，2)适合埃博霉素A产生的地瓜淀粉、水解乳蛋白等的选定以及3)综合地消除产物代谢积累的混合树脂添加方法等步骤，从而使得埃博霉素A产物的产量达到62.7mg/L的水平。
Description
(一)技术领域
本发明涉及提高粘细菌代谢产物产量的方法，具体地说涉及一种提高粘细菌中纤维堆囊菌的埃博霉素A产量的方法。
(二)背景技术
目前临床上最为成功的抗肿瘤化疗药物是促微管聚合类天然化合物紫杉醇(paclitaxel，Taxol)及其类似物docetaxel(Taxotere)，被用于卵巢癌、胸腺癌、结肠癌、肺癌和肝癌等实体癌的治疗。诱导型抗肿瘤药物紫杉醇的成功及其在化疗中的不足(低水溶性和化疗过程中出现的细胞耐药性等)促使研究人员进一步筛选具有更好的化学性质、生物学性质和药理学性质的微管稳定剂。然而经过长时间、大量的筛选，直到近年才发现了四类新的天然化合物。其中，1993年赫弗勒等报道从粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)中分离出新的16元大环内酯类化合物埃博霉素(Epothilone)A和B，在1995年博拉格等在对具有促微管聚合活性的天然化合物大规模筛选中发现埃博霉素的促微管聚合活性后，引起了人们的广泛关注。和紫杉醇相似，埃博霉素可诱导微管蛋白在低温和不含三磷酸鸟苷或微管相关蛋白条件下形成微管。与紫杉醇不同的是，埃博霉素对p-糖蛋白表达型多药抗性细胞株系和肿瘤依然保持活性。另一方面，紫杉醇的内毒素样活性在临床化疗中可能引起非血液性副作用，而埃博霉素不引发细胞的内毒素信号途径。此外，也有研究显示微管稳定剂如紫杉醇或埃博霉素A还具有抗疟活性，能够阻碍裂殖子的形成。
埃博霉素较紫杉醇简单的结构、良好的水溶性和极大的药用潜力，使得人们投入了巨大的热情进行研究，以期更快的将其开发成为抗肿瘤药物。化学家们把很多的精力投入到埃博霉素及其类似物的合成和分离上，但是，对于生物法发酵制备埃博霉素，仅见哥特等人的方法(抗生素杂志，1996，49：560-563)。该方法包括能够产生埃博霉素的纤维堆囊菌So ce90菌株，发酵容器为300ml三角瓶，发酵条件为：马铃薯淀粉8g/L，葡萄糖2g/L，脱脂大豆蛋白2g/L，酵母浸汁2g/L，FeNaEDTA 8mg/L，CaCl2.2H2O1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，HEPES 11.5g/L，加入20ml/L的树脂XAD-16。接种后在30℃培养5天。埃博霉素A的产量约为23mg/L。
上述发酵技术方法的不足在于：1)由于粘细菌在液体中生长时的聚团性质，影响了菌体细胞数量的提高，从而限制了粘细菌代谢产物埃博霉素的产生；2)产生埃博霉素的发酵条件过于复杂，成本较高，并且马铃薯淀粉、葡萄糖、脱脂大豆蛋白和酵母浸汁不是埃博霉素产生的最适碳源和氮源；3)为减少粘细菌代谢产生的埃博霉素对产物的反馈抑制，在发酵过程中添加的XAD-16树脂价格昂贵，并且该种树脂仅能对低极性的代谢产物吸附，对于其他中等极性或高极性的代谢产物的反馈抑制没有作用等。
针对上述不足，对相关技术和方法进行改进的文献或专利至今未见报道。
(三)发明内容
本发明的目的是针对上述粘细菌发酵产生埃博霉素技术和方法上的不足，提供一种提高埃博霉素A产量的方法，它可以有效地克服现有生产工艺的缺陷，具有产生菌的生长量大，培养条件简单和价格低廉等特点，为在工业生产中应用提供了基础。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的，具体步骤顺序如下：
(1)发酵菌株的选择：粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384，ATCC25531和ATCC25569菌株之一；
(2)粘细菌菌株在保持代谢产物合成能力前提下，液体培养均匀生长的驯化：将上述菌株接种在固体斜面培养基上，固体培养基成分为：大豆蛋白胨5～15g/L，马铃薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L；30℃，培养5天后，接种至液体发酵培养基，液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨5～15g/L，马铃薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA8mg/L；30℃，120转/分摇床培养5~7天，将上述培养菌重新接回至固体培养基培养，依原条件培养后再接种至液体发酵培养基，如此重复传代驯化，在95～100代时，培养的菌株在液体发酵培养基中的生长呈现适应性的均匀化生长，表现为菌体细胞在液体中由原来的聚团状态变成了均匀生长状态，同时细胞生长的代时缩短，生长量提高，达到最大细胞量的时间由原来的10～12天，缩短至5～7天，获得的最大细胞量由原来的1～4×108细胞/ml，增加到5～10×109细胞/ml；
(3)发酵培养条件的优化：将步骤(2)均匀化生长的菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为：碳源是地瓜淀粉、马铃薯淀粉、葡聚寡糖、木聚糖之一，浓度均为20g/L，氮源是水解乳蛋白、大豆蛋白胨、酒石酸铵、柠檬酸铵之一，浓度均为10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂选择XAD-16，添加量为20ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养5～7天；
(4)综合消除代谢产物对菌株产生埃博霉素的影响：将上述菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为地瓜淀粉20g/L，水解乳蛋白10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂选择XDA，AB-8或混合树脂之一，添加量为10～40ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养6～7天；
(5)埃博霉素A的分离提取纯化：发酵结束后，将液体发酵培养基中添加的树脂取出，经甲醇浸提，浸提物再经过离子交换，分子筛和高效液相提取纯化，即得到埃博霉素A。
其中步骤(1)所述的发酵菌株选择纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCCl5384。
其中步骤(2)所述的固体培养基成分为：大豆蛋白胨8g/L，马铃薯淀粉20g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L。
其中步骤(2)所述的液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10g/L，马铃薯淀粉21g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L。
其中步骤(3)所述的液体发酵培养基的成分中碳源是地瓜淀粉。
其中步骤(3)所述的液体发酵培养基的成分中氮源是水解乳蛋白。
其中步骤(4)所述混合树脂的添加量为20ml/L。
其中步骤(4)所述混合树脂是指CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.8～2.2∶0.8～1.2∶2.8～3.2∶1.8～2.2混合。
其中步骤(4)所述混合树脂是指CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比1∶1∶2∶1∶3∶2混合。
将上述发酵液中添加的混合树脂取出，加10倍体积甲醇浸提，浸提物经过离子交换，分子筛和高效液相纯化。纯化得到的化合物，分别测定了质谱(见附图1)，紫外谱图(见附图2)和核磁共振谱图(见附图3和4)，确认了埃博霉素(Epothilone)A结构(附图5)。
表1的结果显示了菌株液体均匀生长驯化后的埃博霉素A产量。本项技术的创造性在于：1)通过液体均匀生长驯化方法，改变粘细菌生长的成团性质，从而提高菌体的生长细胞密度，并且菌体细胞的生长代时缩短，缩短了发酵周期；2)该方法是以发酵培养基为驯化生长培养基，从而使得液体均匀生长的菌株对发酵培养基有更好的适应性，避免了驯化菌株丢失埃博霉素产生能力的情况。本项技术获得的结果是均匀生长的菌株产生埃博霉素A的产量是成团生长的野生菌株的三倍。
表1
菌株 原始菌株 液体均匀生长驯化菌株
埃博霉素A(mg/L) 12.3 33.7
表2是不同碳源对液体均匀生长驯化菌株的埃博霉素A合成的影响。其中地瓜淀粉、马铃薯淀粉、葡聚寡糖、木聚糖、葡萄糖等对埃博霉素A的产生具有明显的促进作用。
表2
| 碳源 | 浓度(g/L) | 埃博霉素A(mg/L) | 碳源 | 浓度(g/L) | 埃博霉素A(mg/L) |
| 地瓜淀粉 | 20 | 49.5 | 葡萄糖 | 8 | 33.6 |
| 木聚糖葡聚寡糖马铃薯淀粉可溶性淀粉木糖甘露糖 | 202020200808 | 36.342.945.019.218.96.0 | 阿拉伯糖麦芽糖纤维二糖CF11纤维素粉几丁质菊糖 | 888202020 | 24.08.422.2000 |
表3是不同氮源对液体均匀生长驯化菌株的埃博霉素A合成的影响。其中水解乳蛋白、大豆蛋白胨、酒石酸铵、柠檬酸铵、脱脂奶粉等对埃博霉素A的产生具有明显的促进作用。
表3
| 氮源 | 浓度(g/L) | 埃博霉素A(mg/L) | 氮源 | 浓度(g/L) | 埃博霉素A(mg/L) |
| 脱脂奶粉酪蛋白胨鱼粉蛋白胨大豆蛋白胨水解乳蛋白牛肉提取物 | 101010101010 | 35,211.513.243.355.514.4 | 碳酸铵硝酸铵酒石酸铵酒石酸铵柠檬酸铵尿素 | 101010051010 | 015.742.433.739.88.5 |
表2和表3的结果获得的地瓜淀粉和水解乳蛋白比文献培养基条件高15~25％的埃博霉素A的产量。本项技术的创造性在于：获得的培养基条件比文献的培养基条件所产生的埃博霉素A产量高，同时培养基成分的来源更为便宜易得，为工业化发酵奠定了基础。
表4是在发酵不同树脂对埃博霉素A合成的影响。结果显示这些国产的树脂能够有效地吸附埃博霉素A，其中XDA、AB-8和几种树脂的等比例混合的效果较好。
表4
| 树脂 | 加量(ml/L) | 埃博霉素A(mg/L) | 树脂 | 加量(ml/L) | 埃博霉素A(mg/L) |
| CD180CAD-40XDA混合树脂 | 20202020 | 15.1055.562.7 | S-8NKA-IIAB-8对照XAD-16 | 20202020 | 20.012.345.553.6 |
表5是混合树脂加量对埃博霉素A合成的影响。其中10ml/L到40ml/L的效果较好。
表5
混合树脂(ml/L) 埃博霉素A(mg/L)
0 12.5
10 43.7
20 63.2
40 37.7
70 31.0
表4和表5的结果不但获得了与XAD-16相当或更高的埃博霉素A产量，而且所使用的树脂均为廉价的国产树脂，从而降低了生产成本，从而具有更好的工业化可行性。此外，采用混合树脂的思路，不但降低了埃博霉素对代谢途径的反馈抑制，而且也同时降低了其他代谢产物对产生菌的代谢的反馈抑制，从而从总体上提高了菌体的代谢能力，并为进一步提高埃博霉素A的产量提供可能性。
(四)附图说明：
图1提纯得到的埃博霉素A的质谱谱图
图中所示，样品为提纯后的埃博霉素A，得出组分的(M+H)+为494.2561，拟合化合物的分子式为C26H39O6NS，相对偏差1.922e-06；与埃博霉素A的理论值完全吻合。
图2提纯得到的埃博霉素A的紫外光谱图
图3提纯得到的埃博霉素A的PMR谱图
图4提纯得到的埃博霉素A的13C-NMR谱图
图5埃博霉素(Epothilone)A的化学结构
(五)具体实施方式
实施例1：
(1)发酵菌株选择粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384。
(2)粘细菌菌株在保持代谢产物合成能力前提下，液体培养均匀生长的驯化：将上述菌株接种在固体斜面培养基上，固体培养基成分为：大豆蛋白胨8g/L，马铃薯淀粉20g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L；30℃，培养5天后，接种至液体发酵培养基，液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10g/L，马铃薯淀粉20g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L；30℃，120转/分摇床培养7天，将上述培养菌重新接回至固体培养基培养，依原条件培养后再接种至液体发酵培养基，如此重复传代驯化，在100代时，培养的菌株在液体发酵培养基中的生长呈现适应性的均匀化生长，表现为菌体细胞在液体中由原来的聚团状态变成了均匀生长状态，达到最大细胞量的时间由原来的11天缩短至6天，获得的最大细胞量由原来的4×108细胞/ml，增加到10×109细胞/ml；
(3)发酵培养条件的优化：将步骤(2)均匀化生长的菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为：碳源是地瓜淀粉、，浓度为20g/L，氮源是水解乳蛋白，浓度为10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂是XAD-16，添加量为20ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养7天；
(4)综合消除代谢产物对菌株产生埃博霉素的影响：将上述菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为地瓜淀粉20g/L，水解乳蛋白10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂选择混合树脂，添加量为20ml/L；混合树脂由CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比1∶1∶2∶1∶3∶2混合而成，发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养7天；
(5)埃博霉素A的分离提取纯化：发酵结束后，将液体发酵培养基中添加的树脂取出，加10倍体积甲醇浸提，浸提物再经过离子交换，分子筛和高效液相提取纯化，获到埃博霉素A的产量为66.7mg/L。
实施例2：
(1)发酵菌株选择粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384。
(2)粘细菌菌株在保持代谢产物合成能力前提下，液体培养均匀生长的驯化：将上述菌株接种在固体斜面培养基上，固体培养基成分为：大豆蛋白胨10g/L，马铃薯淀粉22g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L；30℃，培养5天后，接种至液体发酵培养基，液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨12g/L，马铃薯淀粉23g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L；30℃，120转/分摇床培养5天，将上述培养菌重新接回至固体培养基培养，依原条件培养后再接种至液体发酵培养基，如此重复传代驯化，在96代时，培养的菌株在液体发酵培养基中的生长呈现适应性的均匀化生长，表现为菌体细胞在液体中由原来的聚团状态变成了均匀生长状态，达到最大细胞量的时间由原来的10天缩短至5天，获得的最大细胞量由原来的2×108细胞/ml，增加到7×109细胞/ml；
(3)发酵培养条件的优化：将步骤(2)均匀化生长的菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为：碳源是马铃薯淀粉、，浓度为20g/L，氮源是大豆蛋白胨，浓度为10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂是XAD-16，添加量为20ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养5天；
(4)综合消除代谢产物对菌株产生埃博霉素的影响：将上述菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为地瓜淀粉20g/L，水解乳蛋白10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂选择XDA，添加量为20ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养6天；
(5)埃博霉素A的分离提取纯化：发酵结束后，将液体发酵培养基中添加的树脂取出，加10倍体积甲醇浸提，浸提物再经过离子交换，分子筛和高效液相提取纯化，获到埃博霉素A的产量为66.3mg/L。
实施例3：
(1)发酵菌株选择粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384。
(2)粘细菌菌株在保持代谢产物合成能力前提下，液体培养均匀生长的驯化：将上述菌株接种在固体斜面培养基上，固体培养基成分为：大豆蛋白胨6g/L，马铃薯淀粉17g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L；30℃，培养5天后，接种至液体发酵培养基，液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨7g/L，马铃薯淀粉17g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L；30℃，120转/分摇床培养7天，将上述培养菌重新接回至固体培养基培养，依原条件培养后再接种至液体发酵培养基，如此重复传代驯化，在98代时，培养的菌株在液体发酵培养基中的生长呈现适应性的均匀化生长，表现为菌体细胞在液体中由原来的聚团状态变成了均匀生长状态，达到最大细胞量的时间由原来的12天缩短至7天，获得的最大细胞量由原来的2×108细胞/ml，增加到5×109细胞/ml；
(3)发酵培养条件的优化：将步骤(2)均匀化生长的菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为：碳源是葡聚寡糖、，浓度为20g/L，氮源是酒石酸铵，浓度为10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂是XAD-16，添加量为20ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养7天；
(4)综合消除代谢产物对菌株产生埃博霉素的影响：将上述菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为地瓜淀粉20g/L，水解乳蛋白10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂选择AB-8，添加量为20ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养5天；
(5)埃博霉素A的分离提取纯化：发酵结束后，将液体发酵培养基中添加的树脂取出，加10倍体积甲醇浸提，浸提物再经过离子交换，分子筛和高效液相提取纯化，获到埃博霉素A的产量为65.4mg/L。
Claims (8)
1.一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法，该方法具体步骤顺序如下：
(1)发酵菌株的选择：粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384；
(2)粘细菌菌株在保持代谢产物合成能力前提下，液体培养均匀生长的驯化：将上述菌株接种在固体斜面培养基上，固体培养基成分为：大豆蛋白胨5～15g/L，马铃薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L；30℃，培养5天后，接种至液体发酵培养基，液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨5～15g/L，马铃薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA8mg/L；30℃，120转/分摇床培养5～7天，将上述培养菌重新接回至固体培养基培养，依原条件培养后再接种至液体发酵培养基，如此重复传代驯化，在95～100代时，培养的菌株在液体发酵培养基中的生长呈现适应性的均匀化生长，表现为菌体细胞在液体中由原来的聚团状态变成了均匀生长状态，同时细胞生长的代时缩短，生长量提高，达到最大细胞量的时间由原来的10～12天，缩短至5～7天，获得的最大细胞量由原来的1～4×108细胞/ml，增加到5～10×109细胞/ml；
(3)发酵培养条件的优化：将步骤(2)均匀化生长的菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为：碳源是地瓜淀粉、马铃薯淀粉、葡聚寡糖、木聚糖之一，浓度均为20g/L，氮源是水解乳蛋白、大豆蛋白胨、酒石酸铵、柠檬酸铵之一，浓度均为10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂选择XAD-16，添加量为20ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养5～7天；
(4)综合消除代谢产物对菌株产生埃博霉素的影响：将上述菌株接种至固体培养基，固体培养基成分同上，30℃，培养5天后，接种至含有树脂的液体发酵培养基，液体发酵培养基的成分为地瓜淀粉20g/L，水解乳蛋白10g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂选择XDA，AB-8或混合树脂之一，添加量为10～40ml/L；发酵容器为500ml三角瓶，内含200ml液体发酵培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120转/分，培养6～7天；
上述混合树脂是指CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.8～2.2∶0.8～1.2∶2.8～3.2∶1.8～2.2混合；
(5)埃博霉素A的分离提取纯化：发酵结束后，将液体发酵培养基中添加的树脂取出，经甲醇浸提，浸提物再经过离子交换，分子筛和高效液相提取纯化，即得到埃博霉素A。
2.如权利要求1所述的一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法，其特征在于，步骤(1)所述的发酵菌株选择纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384。
3.如权利要求1所述的一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法，其特征在于，步骤(2)所述的固体培养基成分为：大豆蛋白胨8g/L，马铃薯淀粉20g/L，CaCl2.2H2O1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L。
4.如权利要求1所述的一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法，其特征在于，步骤(2)所述的液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10g/L，马铃薯淀粉21g/L，CaCl2.2H2O 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L。
5.如权利要求1所述的一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法，其特征在于，步骤(3)所述的液体发酵培养基的成分中碳源是地瓜淀粉。
6.如权利要求1所述的一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法，其特征在于，步骤(3)所述的液体发酵培养基的成分中氮源是水解乳蛋白。
7.如权利要求1所述的一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法，其特征在于，步骤(4)所述混合树脂的添加量为20ml/L。
8.如权利要求1所述的一种提高埃博霉素A产量的发酵工艺方法，其特征在于，步骤(4)所述混合树脂是指CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比1∶1∶2∶1∶3∶2混合。
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