CN1311069C

CN1311069C - 一种原始霉素的高效发酵方法

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Publication number: CN1311069C
Application number: CNB200310100179XA
Authority: CN
Inventors: 金志华; 李春波; 岑沛霖; 张国钧; 金一平; 陶正利; 林建平; 徐志南
Original assignee: Zhejiang Pharmaceutical Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang Pharmaceutical Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2003-10-16
Filing date: 2003-10-16
Publication date: 2007-04-18
Anticipated expiration: 2023-10-16
Also published as: CN1607245A

Abstract

本发明涉及始旋链霉菌CGMCC 0957，用其生产原始霉素。本发明还涉及生产原始霉素的方法，即在培养基中以适宜的条件培养始旋链霉菌CGMCC 0957，高效生产原始霉素的方法。

Description

一种原始霉素的高效发酵方法

技术领域：

本发明涉及用始旋链霉菌CGMCC 0957发酵，高效生产原始霉素的方法。

背景技术：

原始霉素(pristinamycin)属于链阳性菌素类抗生素，由约30％的原始霉素I和约70％的原始霉素II组成。原始霉素I为环六肽内酯，由原始霉素I_A、原始霉素I_B和原始霉素I_C组成。原始霉素I_A的分子量为866，分子式为C₄₅H₅₄O₁₀N₈；原始霉素I_B的分子量为852，分子式为C₄₄H₅₂O₁₀N₈；原始霉素I_C的分子量为852，分子式为C₄₄H₅₂O₁₀N₈。原始霉素II为多不饱和环内酯，由原始霉素II_A和原始霉素II_B组成。原始霉素II_A的分子量525，分子式为C₂₈H₃₅O₇N₃；原始霉素II_B的分子量527，分子式为C₂₈H₃₇O₇N₃。原始霉素I_A和原始霉素II_A是原始霉素的主要组分。

原始霉素主要对革兰氏阳性菌尤其是金葡菌和链球菌有较好的抗菌活性，其作用机理为作用于细菌核糖体50S亚基，抑制细菌蛋白质的合成。原始霉素I组分和II组分之间具有协同作用。

现有技术中，美国专利US3154475(1964年)和英国专利GB998195(1965年)中描述了生产原始霉素的传统发酵和提取方法。在这两个专利中所用的菌种为始旋链霉菌，特别是菌株5647，或NRRL 2958，所用的发酵培养基为培养链霉菌的营养培养基，特别是含有黄豆粉和葡萄糖的培养基能产生较好的结果。在这两个专利的实例中提供了原始霉素发酵生产的种子培养基和发酵培养基：在170升种子罐中所用种子培养基含酶水解酪素1200克、葡萄糖1200克、麦芽提取物360克、自来水100升、豆油60毫升；在800升发酵罐中所用的发酵培养基含黄豆粉17.75千克、distiller’s solubles 2.25千克、氯化钠2.25千克、豆油1800毫升、碳酸钙2.25千克、自来水360升。用此培养基发酵生产原始霉素，原始霉素的发酵效价为1190u/ml。由于原始霉素的发酵效价较低，因此生产成本较高。

发明内容：

为了克服现有原始霉素发酵效价低、生产成本高的缺点，本发明提供一种Streptomyces pristinaespiralis微生物。

本发明提供一种生产原始霉素的高效发酵方法。

本发明的发酵方法能将原始霉素的发酵效价提高到3000-5000u/ml。

使用的微生物

Streptomyces pristinaespiralis属于链霉菌属始旋链霉菌种，为放线菌。

Streptomyces pristinaespiralis已于2003年6月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为0957。

使用的微生物的具有如下的性质：

菌种的菌学特性

(a)形态特征：孢子丝波曲或松螺旋形，1-3圈。孢子卵圆形，表面带疣。在无机盐淀粉琼脂、甘油天冬素琼脂和酵母麦牙膏琼脂上气生菌丝灰色，基内菌丝反面无色至灰黄或浅黄褐，可溶色素无或少量黄色，不产生黑色素。

(b)碳源利用

可利用：木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、棉子糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、肌糖。不利用或生长可疑：山梨糖、乙二醇、赤藻糖醇、己六醇、山梨醇、乙醇、乙酸钠、油酸钠、甲酸钠、琥珀酸、葡萄糖酸钙。

(c)氮源利用

可利用：硝酸钠、亚硝酸钠、硫酸氨、腺苷、尿素、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬酰氨、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、组氨酸、蛋白胨、酵母抽提物、黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、鱼粉。

不利用或生长可疑：乙酰胺、琥珀酸盐、苯甲酰胺、肌氨酸、肌氨酸酐、甜菜碱。

任何能产生原始霉素的菌种都适用于本发明。优选的菌种为始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)，该菌种在美国标准菌种收藏所(ATCC)和美国农业部北方开发利用研究部(NRRL)均有保存，编号分别为ATCC 25486和NRRL 2958。更优选的菌种为Streptomyces pristinaespiralis CGMCC 0957。

本发明还涉及用产生原始霉素的菌种进行发酵生产原始霉素的方法，具体包括种子的制备和发酵生产。为了提高原始霉素产量，需要采用改进的种子培养基和发酵培养基。改进的培养基与现有技术的上述两个专利中的培养基有很大区别，使用本发明的培养基可以大幅度地提高原始霉素的产量。

本申请中所有的培养基的百分比是培养基成分的质量与种子培养基的总体积之比，单位是克/毫升或公斤/升(即g/ml或kg/l)。

改进的种子培养基含有：

a)2-5％的可利用碳源，合适的可利用碳源包括淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖等。

b)1-4％的有机氮源，合适的有机氮源包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等。

改进的发酵培养基含有：

a)4-8％的可利用碳源，合适的可利用碳源包括缓慢利用碳源和快速利用碳源以2∶1到6∶1的比例加入。缓慢利用的碳源包括淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、纤维二糖等；优选的缓慢利用的碳源包括淀粉。快速利用的碳源包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘油等；优选的快速利用碳源为葡萄糖。

b)2-5％(W/V，培养基成分的质量与发酵培养基的总体积之比)的有机氮源，合适的有机氮源包括缓慢利用有机氮源和快速利用有机氮源以3∶1到8∶1的比例加入。合适的缓慢利用有机氮源包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉和鱼粉等；合适的快速利用有机氮源包括蛋白胨、酵母粉等。

c)0.1-1％(W/V，培养基成分的质量与发酵培养基的总体积之比)的无机氮源，合适的无机氮源为KNO₃、NaNO₃、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃等，优选的无机氮源为(NH₄)₂SO₄。

使用具有上述特征的培养基是实现本发明高水平发酵生产原始霉素的主要方面。

将产生原始霉素的菌种(如始旋链霉菌)的孢子培养物接种到本发明的种子培养基中制备种子，再将种子接种到发酵培养基中进行发酵以生产原始霉素。

孢子培养物的制备：

将产生原始霉素的菌种(如始旋链霉菌)接种到产孢子培养基上培养，产孢子培养基可以采用高氏1号培养基、ISP2培养基，更优选的是高氏1号培养基。合适的培养温度为20-40℃，优选培养温度为25-37℃，更优选的培养温度是30℃。培养时间为2-15天，优选为5-10天，更优选是6天。

种子的制备：

合适的种子培养基含有：1)2-5％的可利用碳源，合适的可利用碳源包括淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖等。2)1-4％的有机氮源，合适的有机氮源包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等。

种子培养基的制备：种子培养基可通过传统技术(如在120-140℃分别或同时灭菌碳源和氮源)制备。

接种：将孢子培养物制成孢子悬浮液后接种到种子培养基中或用挖块法直接接种到种子培养基中培养制备种子。

培养：种子培养采用深层液体沉没培养法，根据规模大小在摇瓶或种子罐中进行。在摇瓶培养时通过瓶口介质过滤空气(通过控制摇瓶装液量来控制，摇瓶装液量为摇瓶体积的10-20％)，并通过摇床振荡(摇床转速为150-250转/分)使无菌空气中的氧气与培养基和菌种充分接触；在种子罐中培养时通过通入无菌压缩空气和搅拌提供氧气(通气量为每分钟每升发酵液0.5-1.5升空气，搅拌速度为100-600转/分)。种子培养时合适的培养温度为20-40℃，优选为25-37℃，合适的培养时间为24-72小时，优选为36-60小时。种子培养结束时要求种子液中的菌丝浓度达到10-30％，优选为15-25％，更优选的是20％。

原始霉素发酵：

合适的发酵培养基含有：1)4-8％的可利用碳源，合适的可利用碳源包括一定比例的缓慢利用碳源和快速利用碳源。缓慢利用的碳源包括淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、纤维二糖等，快速利用的碳源包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘油等，优选的快速利用碳源为葡萄糖。2)2-5％的有机氮源，合适的有机氮源包括一定比例的缓慢利用有机氮源和快速利用有机氮源。合适的缓慢利用有机氮源包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉和鱼粉等；合适的快速利用有机氮源包括蛋白胨、酵母粉等。3)0.1-1％的无机氮源，合适的无机氮源为KNO₃、NaNO₃、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃等，优选的无机氮源为(NH₄)₂SO₄。

通过传统技术制备发酵培养基(如在120-140℃分别或同时灭菌碳源和氮源)。将种子以1-20％(接入的种子液体积与发酵培养基体积的比例)的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养。发酵也采用深层液体沉没培养法，根据规模大小在摇瓶或发酵罐中进行。在摇瓶发酵时通过瓶口介质过滤空气(通过控制摇瓶装液量来控制，摇瓶装液量为摇瓶体积的10-20％)，并通过摇床振荡(摇床转速为150-250转/分)使无菌空气中的氧气与培养基和菌种充分接触；在发酵罐中发酵时通过通入无菌压缩空气(通气量为每分钟每升发酵液0.5-1.5升空气)和搅拌(搅拌转速为100-600转/分)提供氧气。发酵培养时合适的培养温度为25-37℃，优选为28-32℃，合适的培养时间为24-72小时，优选为36-60小时。

在本发明优选的实施方案中，适宜的培育条件喜氧条件，培养基的曝气速度为每单位体积的培养基、每分钟空气体积大于0.5(vvm)，曝气速度一般都采用0.5-1.5(vvm)。

在本发明优选的实施方案中，在种子罐和发酵罐中为了控制泡沫的产生，可以加入消泡剂如豆油、菜油、花生油、泡敌(聚氧乙烯氧丙烯甘油)等，优选的消泡剂为泡敌。

在本发明的实施方案中，通过使用具有上述特征的种子培养基和发酵培养基，可以大幅度地提高原始霉素的产量。

通过给产生原始霉素的菌种提供一个改进的环境，可以使原始霉素的发酵效价提高到3000-5000u/ml。已经发现通过使用改进的种子培养基和发酵培养基，可以大幅度地提高原始霉素产量，缩短生产时间，降低成本。

具体实施方式

实验例1

孢子培养物的制备：

孢子培养基：采用高氏1号培养基(可溶性淀粉20克，KNO₃1克，K₂HPO₄ 0.5克，NaCl 0.5克，MgSO₄ 0.5克，FeSO₄ 0.01克，琼脂20克，蒸馏水加至1升，培养基灭菌前用氢氧化钠调pH7.0-7.2)。将上述培养基成分混合后分装到小试管中，121℃灭菌30分钟后，将试管中的培养基铺成斜面。

将始旋链霉菌接种到产孢子培养基上培养，在温度为30℃的条件下培养6天。

种子的制备：

种子培养基：葡萄糖30克，黄豆饼粉10克，蛋白胨5克，酵母粉5克，KNO₃ 3克，NaCl 2克，CaCO₃ 4克，自来水加至1升，灭菌前用氢氧化钠调pH 7.0。

种子培养基的制备：种子培养基混合后，分装到500毫升摇瓶(每只摇瓶装100毫升种子培养基)中，在121℃灭菌30分钟。

接种：将孢子培养物用挖块法(挖块大小为1×1平方厘米)接种到制备好的100毫升种子培养基中培养制备种子。

培养：种子培养采用深层液体沉没培养法，在500毫升摇瓶(装100毫升种子培养基)中进行。在摇瓶培养时通过瓶口介质(10层纱布)过滤空气，并通过摇床振荡(摇床转速为220转/分)使无菌空气中的氧气与培养基和菌种充分接触。保持种子培养温度为30℃，培养36小时，当种子液中链霉菌的菌丝浓度达到20％时结束培养。

原始霉素发酵：

发酵培养基的制备：淀粉30克，葡萄糖20克，黄豆饼粉25克，蛋白胨5克，(NH₄)₂SO₄ 3克，MgSO₄ 1克，KH₂PO₄ 1克，CaCO₃ 4克，自来水加至1升，灭菌前用氢氧化钠调pH7.0-7.2。发酵培养基混合后，分装到500毫升摇瓶(每只摇瓶装50毫升发酵培养基)中，在121℃灭菌30分钟。

将3毫升种子接种到50毫升发酵培养基中，以深层液体沉没培养法在500毫升摇瓶(装50毫升发酵培养基)中进行发酵培养。在摇瓶培养时通过瓶口介质(10层纱布)过滤空气，并通过摇床振荡(摇床转速为220转/分)使无菌空气中的氧气与培养基和菌种充分接触。发酵培养时的培养温度为30℃，培养时间为48小时。

发酵结束时用生物测定法检测发酵液中的原始霉素效价为4000u/ml。

实验例2

在110升种子罐中种子的制备：

在110升种子罐中装入60升种子培养基，培养基成分与实验例1中摇瓶种子培养基相同，但要加26毫升泡敌。培养基的灭菌采用实罐灭菌法，在121℃灭菌30分钟。

将100毫升摇瓶种子用火焰法接种到含60升种子培养基的110升种子罐中培养制备种子。在种子罐中通过通入无菌压缩空气和搅拌提供氧气(通气量为每分钟每升种子液0.8升空气，搅拌转速为200转/分)。保持种子培养温度为30℃，培养36小时。当种子液中始旋链霉菌的菌丝浓度达到20％时结束培养。

在1000升发酵罐中原始霉素发酵：

在1000升发酵罐中装入700升发酵培养基，培养基成分与实验例1中摇瓶发酵培养基相同，但需加300毫升泡敌。培养基的灭菌采用实罐灭菌法，在121℃的条件下灭菌30分钟。

将60升种子接种到含700升发酵培养基的1000升发酵罐中进行发酵培养。在发酵罐中通过通入无菌压缩空气(通气量为每分钟每升发酵液1.2升空气)和搅拌提供氧气(搅拌速度为250转/分)。发酵培养时的培养温度为30℃，培养时间为48小时。

发酵结束时用生物测定法检测发酵液中的原始霉素效价为3500u/ml。

实验例3

将实验例2得到的700升发酵液(3500u/ml)用6N盐酸调至pH3，过滤，再用100升水顶洗。滤液用氢氧化钠稀溶液调pH7，然后用二氯甲烷萃取。有机相减压浓缩至4.8升。浓缩液中加入5升石油醚，得到沉淀，洗涤干燥后得到粗品236克，粗品效价为7560u/mg。

将236克粗品(7560u/mg)溶解于12升二氯甲烷中，过滤，滤液进含3.6升颗粒活性炭的柱，用22升二氯甲烷冲洗，收集中央部分，减压浓缩至1.2升，浓缩液过滤，滤液用石油醚处理，得到沉淀，洗涤干燥后得到纯品141克，纯品效价为8055u/mg。

Claims

1、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)CGMCC0957。

2、一种制备原始霉素的方法，其特征在于，发酵权利要求1所述的菌株Streptomyces pristinaespiralis CGMCC 0957。

3、根据权利要求2的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

A)种子制备

B)发酵培养。

4、根据权利要求3的方法，其特征在于，所述的种子制备所用的培养基含有质量与体积比为2-5％的可利用碳源和质量与总体积比为1-4％的有机氮源；

所述的可利用碳源选自淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖中的一种或一种以上；

所述的有机氮源选自黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、蛋白胨、酵母粉和鱼粉中的一种或一种以上。

5、根据权利要求3的方法，其特征在于，所述的发酵培养所用的培养基含有：

(1)质量与体积比为4-8％的可利用碳源，所述的可利用碳源为缓慢利用碳源和快速利用碳源，其比例为2∶1到6∶1；

所述的缓慢利用碳源选自淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、纤维二糖中的一种或一种以上；

所述的快速利用碳源选自葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘油中的一种或一种以上的；

(2)质量与体积比为2-5％的有机氮源，所述的有机氮源为缓慢利用有机氮源和快速利用有机氮源，其比例为3∶1到8∶1；

所述的缓慢利用有机氮源选自黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉和鱼粉中的一种或一种以上；

所述的快速利用有机氮源选自蛋白胨、酵母粉中的一种或一种以上；

(3)质量与体积比为0.1-1％的无机氮源，所述的无机氮源为KNO₃、NaNO₃、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃。