CN1688707A - 台勾霉素的制备 - Google Patents

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Abstract

用于制备和回收台勾霉素的方法、工艺和材料，其中台勾霉素是通过在营养培养基中培养属于物种桔橙指孢囊菌的hamdenensis亚种微生物而产生，所述微生物具有产生和积累一种或多种台勾霉素的能力，所述营养培养基包括碳源、氮源、诸如无机盐之类的痕量元素、和吸附剂，其中所述氮源包括鱼粉，且其中所述台勾霉素的收率大于约50mg/L培养基。

Description

台勾霉素的制备
Youe-Kong Shue，Ming-Hsi Chiou，Yuan-Ting Chen，Mei-Chiao Wu，FrankDu，Jonathan Duffield，Franklin Okumu
发明背景
台勾霉素(tiacumicins)是一族结构相关的化合物，其包含如下所示的18元大环内酯环。
目前，已经鉴别出几种不同的台勾霉素，根据它们的取代基R1、R2和R3的具体结构定义了这些台勾霉素中的6种(台勾霉素A-F)(美国专利第4,918,174号；J.Antibiotics，1987，575-588)。
闰年霉素(lipiarmycins)是一族与台勾霉素非常相关的天然产物。闰年霉素族中的两个成员(A3和B3)分别与台勾霉素B和C相同(J.Antibiotics，1988，308-315；J.Chem.Soc.Perkin Trans I，1987，1353-1359)。
已经利用多种物理方法来表征台勾霉素和闰年霉素。已报道的这些化合物的化学结构都是基于光谱学的(紫外线可见光谱测量(UV-vis)，红外线(IR)以及1H和13C核磁共振(NMR))、质谱和元素分析(例如参见J.Antibiotics，1987，575-588；J.Antibiotics，1983，1312-1322)。
台勾霉素是通过细菌制备的，包括桔橙指孢囊菌hamdenensis亚种(dactylosporangium aurantiacum subspecie hamdenensis)，该细菌可从如下机构获得：the ARS Patent Collection of the Northern RegionalResearch Center，United States Department of Agriculture，1815 NorthUniversity Street，Peoria，IL 61604，保藏号为NRRL 18085。菌株AB718C-41的特征在J.Antibiotics，1987，567-574和美国专利第4,918,174号中有所公开。
闰年霉素是通过细菌制备的，包括德干高原游动放线菌(Actinoplanes deccanensis)(美国专利第3,978,211号)在内。J.Antibiotics，1975，247-25中论述了菌株A/10655型的分类学研究，该菌株保存于ATCC，保存号为21983。
台勾霉素，特别是台勾霉素B，表现出抗各种细菌性病原体，特别是艰难梭菌(Clostridium difficile)的活性，一种革兰氏阳性细菌(Antimicrob.Agents Chemother.1991，1108-1111))。艰难梭菌是一种引起肠道感染的厌氧性的产孢子细菌。痢疾是最常见的症状，但是也可能产生腹痛和发烧。艰难梭菌是在摄入抗生素之后发生的大肠炎(结肠发炎)和痢疾的主要病原体。这种细菌主要在医院和长期护理设施中获得。由于台勾霉素B表现出有希望对抗艰难梭菌(C.difficile)的活性，它被期望用于哺乳动物的细菌感染治疗，特别是胃肠道的细菌感染治疗。这类治疗的例子包括但不限于治疗结肠炎以及治疗过敏性肠道综合症。也发现台勾霉素可用于治疗胃肠癌。
采用发酵方法以获得抗生素，包括台勾霉素。通过在深层需氧发酵(submerged aerobic fermentation)条件下，于含有易于吸收的碳源、氮源和无机盐的培养基中培养微生物，直到过程中的分析推断产生了大量的抗生素活性，从而制备得到抗生素。由于全世界对抗生素的需求增长，因此正需要制备抗生素的改进方法。
附图简要说明
图1示出了按照实施例1制备的粗发酵产物的HPLC色谱；台勾霉素B的保留时间约为12.6分钟。
图2示出了按照实施例2制备的粗发酵产物的HPLC色谱；台勾霉素B的保留时间约为11.8分钟。
图3示出了按照实施例2的方法发酵制备的纯化台勾霉素B(通过HPLC纯化)的HPLC色谱；台勾霉素B的保留时间约为12.0分钟。
图4示出了由发酵，采用反相介质压力液相色谱纯化，然后按照实施例3的方法进行研磨而制备的台勾霉素B的HPLC色谱；台勾霉素B的保留时间约为10.1分钟。
发明概述
本发明提出了制备台勾霉素的方法、工艺和材料。本发明还提出了采用本发明的发酵方法、工艺和材料所制备的台勾霉素。
本发明的一个实施方式包括制备台勾霉素的方法，包括在营养培养基(nutrient medium)中培养微生物，属于物种桔橙指孢囊菌的hamdenensis 亚种(dactylosporangium aurantiacum subspeciehamdenensis)，具有能产生台勾霉素的能力；以及在营养培养基中积累至少一种台勾霉素，其中至少一种台勾霉素的收率大于约50mg/L培养基(broth)。
在本发明的一种实施方式中，描述了用于发酵制备台勾霉素B的改进培养基和条件。因此，本发明的一种实施方式是用于制备台勾霉素的营养培养基，包括碳源、氮源、痕量元素如无机盐，以及吸附剂，其中所述的氮源包括鱼粉(fish powder)，所述的营养培养基用于以大于约50mg/L培养液(broth)的收率制备一种或多种台勾霉素。
在本发明的另一种实施方式中，描述了一种改进的回收方法，即台勾霉素B的树脂吸附法。
本发明的另外一种实施方式涉及采用与桔橙指孢囊菌hamdenensis亚种有关的菌株作为制备台勾霉素的微生物。因此，本发明包括台勾霉素，其由在营养培养基中培养属于物种桔橙指孢囊菌hamdenensis亚种微生物，其具有产生台勾霉素的能力；以及在营养培养基中积累一种或多种台勾霉素而制备，该营养培养基包括碳源、氮源、痕量元素如无机盐，以及吸附剂，其中所述的氮源包括鱼粉，所述的台勾霉素的收率大于约50mg/L肉汤(broth)。
本发明的另一种实施方式涉及采用反相介质压力液相色谱、和/或液/液分配、和/或研磨从粗发酵产物中纯化台勾霉素。
这些改进，或者是单独的或者是联合的，使得台勾霉素B以较大提高的收率(＞50mg/L培养液(broth))进行发酵制备和回收。
发明详述
将本文所引用的所有专利、公开文献和专利申请全文并入以作参考。除非另外指出，本文中所采用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的意义。下文中描述了示例性的方法和材料。然而，类似于或相当于本文公开的方法和材料也可用于获得本发明的变体。这些材料、方法和实施例仅为阐释性的，而并非限制性的。
含有本发明台勾霉素的组合物可用于预防和/或治疗目的的给药。在治疗应用中，如上所述，以组合物向已经受到感染的病人给药，组合物的量足以治愈或至少部分抑制感染的症状。足以达到这一效果的量被定义为“治疗有效量或剂量(therapeutically effective amount ordose)”。对这一用途有效的量将取决于感染的严重程度和进程、以前的治疗、病人的健康状态和对药物的反应，以及治疗医师的判断。在预防应用中，以含有本发明台勾霉素的组合物向易于感染或者存在某一特殊感染危险的病人给药。这样的量被定义为“预防有效量或剂量(prophylactically effective amount or dose)”。在这一用途中，精确的量还是取决于病人的健康状况、体重和类似因素。
一旦病人的状况有所改善，在必要的情况下，以维持剂量(maintenance dose)进行给药。后来，给药的剂量剂量或给药频率，或两者，可作为症状的函数，而减少至保持状况改善的水平。当症状已经被减轻到预期的水平时，可以终止治疗。然而病人可要求长期对疾病症状的复发进行间歇性的治疗。
一般来说，对本发明台勾霉素合适的有效剂量的范围是对每位接受者每日为0.1到1000毫克(mg)，优选为1到500mg/日。所需的剂量优选为在一天中以合适的间隔进行1，2，3，4或4次或更多次分剂量给药。给药的分剂量可为单位剂型，例如每一单位剂型含有5到1000mg，优选10到200mg的活性成分。优选地，本发明化合物的给药量为约1.0mg/kg到250mg/kg病人体重，每日1到4次。
“药物组合物(pharmacological composition)”是指本文所述的一种或多种台勾霉素或其生理学上可接受的盐，与诸如生理学上可接受的载体和/或赋形剂的其它化学成分所构成的混合物。药物组合物的目的在于促进化合物向生物体给药。
本发明化合物的“药学上可接受的盐(pharmaceutically acceptablesalts)”包括从药学上可接受的有机和无机酸和碱衍生得到的盐。合适的酸的例子有盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、羟基乙酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、间苯-对-磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、1，2-乙基磺酸(乙磺酸)、半乳糖基-D-葡糖酸，和类似酸。其它酸，例如草酸，尽管它们本身并不是药学上可接受的，也可用于制备获得本发明化合物和其药学上可接受的酸加成盐的有用中间体的盐。从合适的碱衍生的盐包括碱金属(如钠)盐、碱土金属(如镁)盐、铵盐和N(C1-C4烷基)4 +盐，和类似物。
“生理学上可接受的载体(physiologically acceptable carrier)”是指不对生物体造成明显刺激，且并不消除给药化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。
“赋形剂(excipient)”是指加入到药物组合物中以进一步促进化合物给药的惰性物质(inert substance)。赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种淀粉类型、纤维素衍生物、白明胶、植物油和聚乙二醇。
本文中所采用的术语“营养培养基(nutrient medium)”是指合成的或天然存在的成分的混合物。通常地，营养培养基包括碳源、氮源、例如无机盐的痕量元素，任选的维生素或其它生长因子，以及吸附剂。
本文中所采用的术语“肉汤(broth)”是指在发酵期间或发酵之后获得的流体培养液(基)。肉汤包括水、需要的抗生素、存活的或死亡的生物体、代谢产物，以及附有或缺乏吸收产物的吸附剂所构成的混合物。
本文中所采用的术语“台勾霉素(Tiacumicin)”是指包括如下所示的18-元大环内酯环(18-membered macrolide ring)的一族化合物：
术语“台勾霉素B(Tiacumicin B)”是指据具有下列结构的分子：
本文中所采用的术语“收率(yield)”是指在体积与原始发酵肉汤相同的甲醇中再生的粗台勾霉素的量。采用标准的HPLC技术确定收率。收率以单位mg/L报导。
本发明的一种实施方式包括制备抗生素试剂如台勾霉素的方法，采用微生物的深层需氧发酵(submerged aerobic fermentation)。这类生物体的一个例子是桔橙指孢囊菌的hamdenens亚种(Dactylosporangium aurantiacum subspecies hamdenens)。根据本发明的一种实施方式，台勾霉素，例如台勾霉素B，是通过树脂吸附从发酵肉汤中以异常好的收率(＞100mg/L培养液)回收，和采用各种极性的溶剂洗涤而从树脂和菌丝体中洗脱出的。可采用溶剂萃取，和/或色谱分离如塞法戴克斯(Sephadex)、硅凝胶、高效液相色谱法(HPLC)或反相介质压力液相色谱法(reverse phase medium pressure liquidchromatography)，和/或采用一种或多种溶剂进行重结晶，和/或采用一种或多种溶剂进行研磨而进行纯化。
鉴定出本发明所采用的一种微生物属于游动放线菌科(Actinoplanaceae)，指孢囊菌属(Dactylosporangium)(Journal ofAntibiotics，1987，p.567-574和美国专利4,918,174)。已经命名为桔橙指孢囊菌(Dactylasporangium aurantiacum)的亚种hamdenensis718C-41。传代培养物从美国农业部的北方区域研究中心的ASR专利菌种保藏中心(ARS Patent Collection of the Northern Regional ResearchCenter，United States Department of Agriculture).1815 North UniversityStreet，Peoria，IL 61604，U.S.A.获得，在该保藏处的保藏号为NRRL18085。菌株AB 718C-41的特征在Journal of Antibiotics，1987，p.567-574和US专利4,918,174中有所描述。
能产生台勾霉素的其它微生物包括突变种，它与现有技术中已知的品种相比具有有利的性质。这类菌株可由母体菌株通过诱发突变而生成。诱发突变的策略和方法，筛选和分离发生突变的菌株的方法，用于产生本发明突变菌株的培养基组合物都是本领域中已知的。被命名为菌株的微生物可以体现出如下优点，例如所需大环内酯的产量增加，营养培养基的利用更有效，或对有氧生长所需的氧的需求下降。
在优选实施方式中，为制备台勾霉素而进行的桔橙指孢囊菌亚种hamdenensis AB 718C-41 NRRL 18085的培养，是在培养基中进行，该培养基包括在合适的有氧条件下的易于同化的碳源、氮源、无机盐和其它有机成分以及一种或多种吸附剂，是在无菌环境中混合的。用于产生本发明的抗生素的营养培养基组合物将在实施例中详述。
能支持微生物生长的碳源(carbon sources)包括但不限于葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、淀粉、糖蜜、麦芽提取物、糊精、乳清、甘油、脂类、玉米面和类似物，以及它们的混合物。根据本发明的一种方式，所存在的碳源的量以重量计为0.2-10％。本发明的一种方式中，碳源的量如表2所示。
能支持微生物生长的氮源(nitrogen sources)包括但不限于牛肉提取物、大豆饼、棉籽仁、全部酵母、酵母提取物、大豆粉、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、鱼粉、玉米浆、铵盐、酪蛋白、氨基酸和类似物，及其组合物(combinations)。根据本发明的一种实施方式，营养培养基包括作为氮源的鱼粉(999 Prime quality fishmeal(999上等质量的鱼粉)，TripelNine Fish Protein，a.m.b.a.Fiskerihavnsgade 35,6700 Esbjerg，Demark)。根据本发明的一种实施方式，氮源的存在量以重量计为0.1-5.0％。
生物体的生长和成长必须的基本痕量元素(essential traceelements)可存在为培养基中其它成分的杂质，其量足以满足生物体的生物合成需要。然而，在培养介质中加入有助于微生物生长的其它可溶性营养无机盐可能是有益的。能支持微生物生长的无机盐包括但不限于K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCO3等。基本痕量元素的存在量范围以重量计为0.02-2.0％。根据本发明一种实施方式的各个基本元
素的用量列于表2中。
商业途径可以得到的吸附剂树脂被发现在发酵中能提高台勾霉素的产率和回收效率。这样的吸附剂包括但不限于AmberliteXAD16，XAD16HP，XAD2，XAD7HP，XAD1180，XAD1600和IRC5(所有是Rohm & Haas Co.，USA的产品)，DuoliteXAD761(Rohm & Haas Co.，USA)和类似物。以重量计，吸附剂的优选存在量在0.5-15％的范围内。根据本发明的一个实施方案的吸附剂的量在表2中给出。
正如在需氧深层培养工艺中通常采用的一样，无菌的空气分散于整个培养介质中。氧浓度保持高于3％(InPro 6000 series O2 sensors(InPro 6000系列O2传感器)，Mettler Toledo)。在这样的条件下，细胞的生长保持在防止生长条件变为厌氧的水平下。在一些实施方式中，限制成分从碳源、氮源或细胞所要求的其它成分进行选择(如在流加培养(feed medium)中)。
细菌在合适的生长条件下进行生长。这类合适的生长条件的特征是以保持所述细菌生长的有氧条件这一方式，是通过限制生长培养基成分的可利用度和/或流加培养基实现。这类条件的特征还在于，例如保持溶解的氧的浓度为约2％到30％。溶解的氧的浓度水平可依据用于生长细菌和测定溶解的氧浓度的特殊设备而有所不同。
采用本领域已知的技术，可在范围为从摇瓶到大型“分批”发酵罐的容器中，使产生台勾霉素的细菌生长。为制备大量的台勾霉素，采用在罐中进行深层需氧发酵。然而，可通过摇瓶培养而获得少量台勾霉素。在罐发酵中，优选采用营养体接种物(vegetative inoculum)。通过将少量体积的培养基用孢子形式，菌丝体片段，或生物体的冻干沉淀物接种，得到生物体的新鲜的、积极生长的培养物，制备出营养体接种物。然后将营养体接种物转移到更大的罐中，经过合适的孵育时间之后，在该较大的罐中产生了收率有所提高的台勾霉素抗生素。
如果生成的泡沫成为问题的话，可能会有必要向大规模的发酵介质中加入少量的消泡剂。
在带有其它添加剂/成分的对照介质中进行制备，以提高产量。采用液面下的、搅拌培养方法以产生台勾霉素。发酵在25到37℃的温度范围下进行。仔细监测碳源的消耗，按照需要加入额外量的碳源。发酵的pH值优选保持在约6.0到约8.0之间。产生了台勾霉素B，且台勾霉素在发酵接种之后的3到15天之间积累起来。标准对照培养基由下列量的下列成分构成：
鱼粉        0.1％到5％
葡萄糖      0.2％到10％
K2HPO4   0.02到0.5％
MgSO4.7H2O          0.02％到0.5％
KCl                    0.01％到0.3％
CaCO3                0.1％到2％
其它的添加剂/成分由下列物质组成：
酪蛋白氨基酸           0.05％到2％，
酵母提取物             0.05％到2％
XAD-16树脂             0.5％到15％
发酵完全后，通过筛分从肉汤中分离出固体物质(包括吸附剂树脂)。用有机溶剂，如乙酸乙酯、甲醇、乙腈或两种或两种以上有机溶剂的混合物，从树脂中洗脱出台勾霉素。然后在减压条件下浓缩提取物。采用低极性的溶剂，如己烷、庚烷、甲基环己烷进行研磨；或在诸如乙酸乙酯/水、乙酸乙酯/氯化钠水溶液、甲醇/己烷、乙腈/己烷、或两种或两种以上不同比例的溶剂、或其组合的两相溶剂系统之间进行分配；或采用以合适有机溶剂体系进行洗脱的塞法戴克斯柱色谱法进一步纯化残留物。如果需要，台勾霉素可通过结晶、和/或色谱分离、和/或高效液相色谱法(HPLC)、和/或液/液分配、和/或研磨进一步纯化。
实施例
从以上公开内容所能理解的是，本发明具有多种应用。因此，以下所提供的实施例意在阐释而并非是限制。
实施例1
将桔橙指孢囊菌亚种hamdenensis AB 718C-41 NRRL 18085(-20℃存放)保持于1mL第104号培养基中(表1)。将装有第104号培养基(50mL)的种子瓶(250mL)，经过标准的灭菌条件(30分钟，121℃，1.05kg/cm2)之后，用AB718C-41 NRRL 18085进行接种，在30℃下在摇床(设置在250rpm(转数/分钟))上放置72hr(小时)。然后，在无菌条件下，将5％营养体接种物从第一传代的种子瓶中转移到装有表1所列的相同成分的发酵瓶中。
表1第104号培养基的成分
鱼粉 葡萄糖 K2HPO4 MgSO4.7H2O KCl CaCO3 酪蛋白氨基酸(Casaminoacid) 酵母提取物 XAD-16
10g/L 20g/L 0.5g/L 0.5g/L 0.3g/L 3g/L 2.5g/L 2.5g/L 20g/L
在旋转的摇床上，将发酵瓶于30℃下孵育3到12天。过滤整个培养发酵培养基的样品。用MeOH洗涤滤饼，在减压下除去溶剂。残留物在与原始的发酵肉汤体积相同的甲醇中再生。采用带有Waters 24872-通道UV/Vis监测器的Waters BREEZE HPLC系统进行分析。在50×4.6μm I.D.，5μm YMC ODS-A柱(YMC编号：CCA AS05-0546WT)上分析台勾霉素，该柱采用溶于含有0.1％磷酸的水中的45％乙腈为流动相，流速为1.5mL/分钟。在266nm下检测台勾霉素。粗产物的HPLC色谱图见图1所示(台勾霉素B的保留时间为12.6分钟)。在这一实施例中，7天后台勾霉素B的粗收率为约250mg/mL。采用HPLC纯化之后，台勾霉素B的收率为约100mg/mL。
实施例2
在装有第104号培养基(50mL)的种子瓶(250mL)经过标准的灭菌条件(30分钟，121℃，1.05kg/cm2)之后，用AB718C-41 NRRL 18085进行接种，在30℃下在摇床(设置为250rpm)上培养72hr。然后，在无菌条件下，将5％营养体接种物从第一传代的种子瓶中转移到装有表1所列的同样成分的发酵瓶中，并在旋转的摇床上于30℃下培养72hr。然后，采用第二传代的种子瓶中的5％接种物，对装有第104号培养基(2.5L)的5L发酵罐进行AB 718C-41 NRRL 18085接种。加入消泡剂(Sigma A-6426)控制过量的泡沫形成。该产品是一种存在于多元醇分散系中的非硅酮类有机消泡剂的混合物。
监测作为生长参数的葡萄糖消耗量。通过加入流加培养基而控制葡萄糖的水平。实施例2的流加培养基和条件如下：
流加培养基(feeding medium)
酵母提取物 酪蛋白氨基酸 葡萄糖 K2HPO4 MgSO4.7H2O KCl
1.5％ 1.5％ 30％ 0.5％ 0.5％ 0.3％
发酵罐培养基：第104号
发酵罐体积：4L
灭菌：40分钟，121℃，1.05kg/cm2
培养温度：30℃
通气比率：0.5-1.5体积的空气/培养物体积和分钟
发酵罐搅拌速率：300-500rpm
发酵进行8天，通过筛分从培养肉汤中分离出XAD-16树脂。用水洗涤之后，用甲醇(XAD-16的5-10倍体积)洗脱XAD-16树脂。蒸发除去甲醇，用乙酸乙酯萃取油状残留物三次。合并提取物，在减压下进行浓缩，得到油状残留物。油状残留物干燥后用己烷进行洗涤，得到粗产物，为浅棕色的粉末，该产物的HPLC色谱图如图2所示(台勾霉素B的保留时间为11.8分钟)。采用硅胶柱(以乙酸乙酯和己烷作为洗脱液)纯化粗产物，得到台勾霉素B，其为白色固体。用HPLC色谱法测定的纯度＞95％，色谱图如图3所示(台勾霉素B的保留时间为12.0分钟)。分析分离出的台勾霉素B，得到1H和13C NMR数据与J.Antibiotics，1987，575-588中所报道的相同，将这些数据总结如下。
台勾霉素B：
mp 129-140℃(由RP-HPLC得到的白色粉末)；
mp 166-169℃(由异丙醇中得到的白色针状物)；
[α]D 20-6.9(c 2.0，MeOH)；
MS m/z(ESI)1079.7(M+Na)+；
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.21(d，1H)，6.59(dd，1H)，5.95(ddd，1H)，5.83(br s，1H)，5.57(t，1H)，5.13(br d，1H)，5.09(t，1H)，5.02(d，1H)，4.71(m，1H)，4.71(br s，1H)，4.64(br s，1H)，4.61(d，1H)，4.42(d，1H)，4.23(m，1H)，4.02(pentet，1H)，3.92(dd，1H)，3.73(m，2H)，3.70(d，1H)，3.56(s，3H)，3.52-3.56(m，2H)，2.92(m，2H)，2.64-2.76(m，3H)，2.59(heptet，1H)，2.49(ddd，1H)，2.42(ddd，1H)，2.01(dq，1H)，1.81(s，3H)，1.76(s，3H)，1.65(s，3H)，1.35(d，3H)，1.29(m，1H)，1.20(T，3H)，1.19(d，3H)，1.17(d，3H)，1.16(d，3H)，1.14(s，3H)，1.12(s，3H)，0.87(t，3H)；
13C NMR(100MHz，CD3OD)δ178.4，169.7，169.1，154.6，153.9，146.2，143.7，141.9，137.1，137.0，136.4，134.6，128.5，126.9，125.6，124.6，114.8，112.8，108.8，102.3，97.2，94.3，82.5，78.6，76.9，75.9，74.5，73.5，73.2，72.8，71.6，70.5，68.3，63.9，62.2，42.5，37.3，35.4，28.7，28.3，26.9，26.4，20.3，19.6，19.2，18.7，18.2，17.6，15.5，14.6，14.0，11.4。
实施例3
按照实施例2所述的方法，通过发酵得到台勾霉素B(15g)，从树脂释放出来后为油状的残留物。在35℃下将油状残留物溶解于乙酸乙酯(300mL)，使溶液在分液漏斗中与水(300mL)一起摇动，并静置1分钟。加入氯化钠饱和水溶液(100mL)后，混合物再静置1分钟。丢弃下面的相和界面处的任何固体，在35℃的减压条件下浓缩上面的相，得到棕色固体。使得到的泡沫状物质经过反相介质压力液相色谱，采用与Lsco UA-vis检测器连接的Biotage75L装置，具有下列参数：
柱：1.2kg，Biotage KP-C18-HS二氧化硅
平衡体系：50∶50∶1，MeCN/H2O/AcOH(6L)
装载方式：在甲醇(20mL)中，通过含有25g Biotage KP-C18-HS二氧化硅的样品注射模块
洗脱液：50∶50∶1，MeCN/H2O/AcOH
流速：230mL/min
压力：溶剂-90psi
      径向(radial)-100psi
检测器：波长-254nm
        路径长度-0.1cm
        灵敏度-2
        制图速度-60cm/hr
        噪音过滤-5sec
级分收集：人工-在主峰和前面的峰之间的拐折处之后立即开始收集，在组分高度的20％处终止收集。
柱的调节：100％MeCN(4L)
向收集的级分中加入氯化钠的饱和水溶液(为级分体积的25％)。摇动混合物，使其分离为两相。除去上面的相并在30℃的减压条件下浓缩至干燥。将得到的固体溶解于乙酸乙酯(75mL)中，并用水(2×75mL)洗涤，除去氯化钠。在30℃的减压条件下浓缩有机相，得到黄色泡沫状物质(回收4.56g，30％；纯度～93％)。
与其它几批的物质合并(总共156.0g，纯度90.8％)，并向其中加入异丙醇(1000mL)。混合物经声波处理，同时在室温下搅拌20分钟以获得米色的悬浮液。此时进行过滤，用异丙醇(300mL)洗涤滤饼。在高度的真空下干燥固体，得到米色的粉末(回收146.2g，94％；纯度91.1％)(图4)。Mp 156-160℃；[α]D 20-8.4(c 2.0，MeOH)；MS 7m/z(ESI)1079.7(M+Na)+；C52H74C12O18的计算值：C，59.03；H，7.05；Cl，6.70。实测值：C，58.75；H，7.04；Cl，6.91。
本文中阐释性描述的发明可在缺乏本文中未特别公开的任一要素或任何一些要素，任一限定或任意一些限定的情况下实施。因此，例如术语“包括(comprising)”，“包含(including)”，“含有(containing)”等应该理解为可扩展式，而并非限制性的。此外，本文中采用的术语和表达已经被用作说明性术语而不具有限制意义，而且并无意使用将未来示出和描述的等价物或其一部分排除在外的那些术语和表达。应该认识到多种修饰是在权利要求的范围内。因此，应该理解尽管本发明已经以优选的实施方式和可选择的特征进行了详述，本领域的技术人员可对本文中公开的发明进行修饰和变化，这类修饰和变化被认为是落入本文中所公开的发明的范围之内。本文中已经对发明进行了广泛性和一般性的描述。落入该种类型公开内容的范围之中的较窄情形和次级类别分组也构成这些发明的一部分。这包括采用条件限定或否定性限制从该类别中去除任何主题而对每个发明进行一般性描述，而不管被除去的物质是否特别地存在于其中。此外，在本发明的特征或方面以马库什组的方式描述时，受到本领域教育的技术人员将认识到本发明也以该马库什组成员中的任何单独成员或亚组成员的方式进行了描述。
应该理解，以上的说明书意在阐释性而并非是约束性的。本领域的技术人员在阅读以上的说明书之后，许多实施方式将是明显的。因此，本发明的范围应该不是参照以上的说明书而确定，但却是应该参照所附的权利要求书以及这些权利要求应该赋予的等价物的全部范围而确定。将所有文章和参考文献，包括专利公开文献的内容并入本文中作为参考。

Claims (26)

1.一种制备台勾霉素的方法，该方法包括在营养培养基中培养能够产生台勾霉素的微生物，和，在营养培养基中积累至少一种台勾霉素，其中至少一种台勾霉素的收率大于约50mg/L全部发酵肉汤。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的收率大于约100mg/L肉汤。
3.根据权利要求2的方法，其中所述的收率大于约200mg/L肉汤。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的收率为从约50mg/L肉汤到约500mg/L肉汤。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的收率为约100mg/L肉汤到约500mg/L肉汤。
6.根据权利要求1的方法，其中所述的微生物是桔橙指孢囊菌NRRL 18085(Dactylasporangium aurantiacum NRRL 18085)。
7.根据权利要求1的方法，其中所述的台勾霉素是台勾霉素B。
8.根据权利要求1的方法，其中从所述的营养培养基中分离出所述的台勾霉素是采用选自下列的技术：用至少一种溶剂或溶剂混合物进行洗提，通过筛分和除去不需要的物质；用至少一种溶剂或溶剂混合物进行萃取；结晶；色谱分离；高效液相色谱(HPLC)；中压液相色谱(MPLC)；研磨；以及用饱和盐水和至少一种溶剂或溶剂混合物进行萃取。
9.根据权利要求1的方法，其中所述的微生物在约25℃到约35℃的温度，和在约6.0到约8.0的pH值下进行培养。
10.根据权利要求1的方法，其中所述的营养培养基包括一种或多种碳源，选自：葡萄糖、蔗糖、淀粉、糖蜜、糊精、乳清、甘油、脂类和玉米面。
11.根据权利要求1的方法，其中，按照需要，在所述的营养培养基中加入额外的碳源。
12.根据权利要求1的方法，其中所述的营养培养基包括能支持微生物生长的一种或多种氮源/有机源，所述的氮源/有机源选自：牛肉提取物、豆饼、全酵母、酵母提取物、豆粉、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、鱼粉、玉米浆、铵盐、酪蛋白和氨基酸。
13.根据权利要求12的方法，其中所述的营养培养基包括鱼粉。
14.根据权利要求1的方法，其中所述的营养培养基包括能支持微生物生长的一种或多种无机盐，所述的无机盐选自：K2HPO4、MgSO4·7H2O和CaCO3。
15.根据权利要求1的方法，其中所述的营养培养基包括至少一种能在所述的培养期间吸附一种或多种台勾霉素的吸附剂，所述的吸附剂选自：AmberliteXAD16、XAD16HP、XAD2、XAD7HP、XAD1180、XAD1600、IRC50，DuoliteXAD761和反相硅凝胶。
16.根据权利要求15的方法，其中所述的反相硅凝胶选自：KP-C18、KP-C18-WP和KP-C18HS。
17.一种用于由微生物制备台勾霉素的营养培养基，所述的营养培养基包括碳源、氮源、痕量元素和吸附剂，其中所述的营养培养基用于以大于约50mg/mL的收率产生一种或多种台勾霉素。
18.根据权利要求17的营养培养基，其中所述的台勾霉素的收率大于约100mg/mL肉汤。
19.根据权利要求18的营养培养基，其中所述的台勾霉素的收率大于约200mg/mL肉汤。
20.根据权利要求17的营养培养基，其中所述的台勾霉素的收率为约50mg/L肉汤到约500mg/L肉汤。
21.根据权利要求20的营养培养基，其中所述的台勾霉素的收率为约100mg/L肉汤到约500mg/L肉汤。
22.根据权利要求17的营养培养基，其中所述的氮源是鱼粉。
23.根据权利要求17的营养培养基，其中所述的微生物是桔橙指孢囊菌NRRL 18085。
24.根据权利要求17的营养培养基，其中所述的台勾霉素是台勾霉素B。
25.根据权利要求17的营养培养基，其中所述的营养培养基包括至少一种能在所述的培养期间吸收一种或多种台勾霉素的吸附剂。
26.台勾霉素，由在营养培养基中培养属于物种桔橙指孢囊菌的亚种hamdenensis的微生物，其能够产生台勾霉素；以及在营养培养基中积累一种或多种台勾霉素而制备，所述的营养培养基包括碳源、氮源、痕量元素如无机盐，以及吸附剂，其中所述氮源包括鱼粉，所述台勾霉素的收率大于约50mg/L肉汤。
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