ITMI20120560A1 - Procedimento per la purificazione della tiacumicina b - Google Patents
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Description
PROCEDIMENTO PER LA PURIFICAZIONE DELLA TIACUMICINA Bâ€
Campo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce a un procedimento migliorato per la purificazione della Tiacumicina B. Più specificamente, l’invenzione si riferisce a un procedimento semplificato e ottimizzato per la purificazione della Tiacumicina B da un brodo di fermentazione mediante tecniche cromatografiche. Il procedimento secondo questa invenzione à ̈ più semplice dei procedimenti noti nella tecnica e può essere facilmente utilizzato su larga scala per la produzione commerciale.
Tecnica precedente
La Tiacumicina B appartiene alla famiglia delle Tiacumicine; le Tiacumicine, prodotte per fermentazione di Dactylosporangium aurantiacum, sono un gruppo di macrocicli insaturi a 18 termini appartenenti alla classe dei macrolidi, che differiscono per il tipo di sostituenti dell’anello insaturo. La Tiacumicina B ha la struttura illustrata sotto:
Le Tiacumicine, e in particolare Tiacumicina B, mostrano attività nei confronti di numerosi batteri patogeni, compreso Clostridium difficile.
Le Lipiarmicine sono un’altra classe di prodotti strettamente correlata alle Tiacumicine. In particolare, la Tiacumicina B à ̈ identica alla Lipiarmicina A3.
La Lipiarmicina à ̈ stata isolata per la prima volta da Actinoplanes deccanensis negli anni ’70. Il brevetto U.S. No. 3,978,211 rivendica Lipiarmicina e un procedimento per la sua produzione per fermentazione di Actinoplanes deccanensis ATCC 21983 in un terreno nutritivo acquoso contenente fonti assimilabili di carbonio, azoto e sali inorganici. Il recupero di Lipiarmicina, descritto (ma non rivendicato) nel brevetto, utilizza procedure convenzionali, come l’estrazione del brodo con un solvente organico (cioà ̈ butanolo), la purificazione del prodotto grezzo mediante cromatografia (colonna di gel di silice - eluente: miscela cloroformio: metanolo) e infine la cristallizzazione da una miscela di dietil etere e etere di petrolio.
Il brevetto U.S. No. 4,918,174 rivendica Tiacumicine e un procedimento per la loro produzione mediante fermentazione aerobica sommersa di Dactylosporangium aurantiacum subspecies hamdenensis. Il brevetto descrive (ma anche in questo caso non rivendica) il recupero degli antibiotici dal brodo di fermentazione tramite estrazione con un solvente organico, purificazione per ripartizione solvente-solvente e cromatografia (Sephadex LH-20 e gel di silice).
Il brevetto U.S. No. 7,507,564 descrive un metodo migliorato di produzione di Tiacumicine. Il brevetto rivendica la produzione di Tiacumicine mediante coltura di Dactylosporangium aurantiacum subspecies hamdenensis in un terreno nutritivo che comprende una certa quantità di resina adsorbente.
Inoltre, detto brevetto descrive e rivendica un procedimento di recupero della Tiacumicina B a partire da brodo di fermentazione contenente una resina adsorbente. Il procedimento descritto in detto brevetto comprende: 1) l’estrazione del prodotto dalla resina con un solvente o una miscela solvente; 2) la precipitazione del grezzo; 3) la purificazione mediante cromatografia (cromatografia su gel di silice, HPLC a fase inversa); e 4) la cristallizzazione.
Di conseguenza, per ottenere i risultati richiesti in termini di qualità (purezza >95%), sono necessari diversi stadi di purificazione, compresi RP-HPLC, il che penalizza la resa del procedimento e ne rende difficile l’applicazione su scala commerciale.
Pertanto nella tecnica esiste la necessità di sviluppare una procedura di purificazione semplice, che possa essere realizzata su larga scala con pochi stadi per isolare la Tiacumicina B purificata da un brodo di fermentazione.
Descrizione dell’invenzione
La presente invenzione fornisce un procedimento migliorato per la purificazione della Tiacumicina B, che risulta in un prodotto con una purezza di almeno il 95%. Il metodo dell’invenzione utilizza la Cromatografia per Interazione Idrofobica (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC). Oltre a questo stadio, à ̈ possibile effettuare normali procedure di isolamento, come l’insolubilizzazione o la cristallizzazione del prodotto finale. Il procedimento descritto à ̈ più semplice di quelli descritti nella tecnica precedente e rende superfluo l’uso di RP-HPLC.
Abbiamo ora trovato che, utilizzando le colonne HIC a differenti pH, à ̈ possibile eluire in modo differenziale, e quindi separare, differenti tipi di impurezze, e in tal modo migliorare notevolmente la qualità del prodotto. Questa caratteristica non ha precedenti in questo ambito, e non poteva essere prevista in base alle proprietà chimiche e alle struttura del prodotto. Il metodo descritto in maggior dettaglio qui avanti fornisce un procedimento di purificazione molto semplice, e un prodotto sostanzialmente puro.
La presente invenzione si riferisce a un procedimento per il recupero e la purificazione di Tiacumicina B che comprende sottoporre un liquido contenente Tiacumicina B ad almeno una cromatografia ad interazione idrofobica.
La cromatografia ad interazione idrofobica utilizza una resina scelta nel gruppo delle resine assorbenti del tipo stireniche-divinilbenzeniche. In particolare possono essere utilizzate le resine HP20, HP21, HP20SS, SP20, SP20SS, SP825, SP850, SP207, XAD16, XAD1600, XAD18, ecc. ottenibili da Mitsubishi, Rohm & Haas. In una forma di attuazione preferita, la resina à ̈ HP20SS a granulometria molto fine.
Il materiale di partenza del procedimento secondo la presente invenzione può essere preparato col metodo descritto nel brevetto U.S. No. 4,918,174.
Il brodo di fermentazione usato come materiale di partenza della presente invenzione viene filtrato e poi sottoposto a purificazione mediante HIC. Il brodo filtrato può essere pre-purificato prima dello stadio cromatografico per eliminare i composti chimicamente diversi dalla Tiacumicine e sostanze correlate di polarità significativamente differente. Stadi non limitativi di pre-trattamento del brodo filtrato sono, per esempio, estrazione con un solvente idro-immiscibile o precipitazione del grezzo.
La cromatografia ad interazione idrofobica preferibilmente comprende gli stadi di:
a) caricare il liquido contenente Tiacumicina B ad un pH tra 2.0 e 8.0, preferibilmente tra 2.5 a 6.5, sulla resina ad interazione idrofobica; b) eluire le impurezze dalla resina ad interazione idrofobica con una miscela costituita da acqua e un solvente organico scelto tra metanolo, etanolo, acetonitrile, acetone, THF o una miscela di essi ad un pH tra 2.0 e 8.0, preferibilmente tra 2.5 e 6.5;
c) eluire la Tiacumicina B dalla resina ad interazione idrofobica con una miscela costituita da acqua e un solvente organico scelto tra metanolo, etanolo, acetonitrile, acetone, THF o una miscela di essi ad un pH tra 2.0 e 8.0, preferibilmente tra 2.5 e 6.5.
Secondo una realizzazione preferita della presente invenzione, la Tiacumicina B Ã ̈ purificata utilizzando due successive cromatografie ad interazione idrofobica.
Durante l’eluizione del prodotto, vengono isolate le frazioni; le frazioni contenenti il prodotto di purezza desiderata sono combinate a dare l’eluato dalla prima HIC. Questo primo stadio di HIC aumenta la purezza della Tiacumicina B da circa 40% a 80% o più.
In seguito, dopo allontanamento del solvente, la soluzione di Tiacumicina B parzialmente purificata viene nuovamente caricata su una colonna, che contiene la stessa resina della prima cromatografia per interazione idrofobica e sottoposta ad una seconda cromatografia per interazione idrofobica. La soluzione à ̈ caricata sulla colonna a pH nell’intervallo da 2.0 a 8; preferibilmente il pH della soluzione à ̈ nell’intervallo da 2.5 a 6.5. Anche nel secondo stadio di HIC la resina, dopo il carico, viene lavata con un’appropriata miscela costituita da acqua e un solvente polare organico in condizioni in cui le impurezze si dissociano dalla resina, mentre la Tiacumicina B rimane legata. Infine la Tiacumicina B à ̈ eluita in condizioni in cui si dissocia dalla resina. Il solvente organico à ̈ scelto tra metanolo, etanolo, acetonitrile, acetone THF o miscele di essi. Durante l’eluizione del prodotto, le frazioni sono isolate; le frazioni contenenti il prodotto di purezza desiderata sono combinate a dare l’eluato dalla seconda HIC. Questo secondo stadio di HIC aumenta la purezza della Tiacumicina B da circa 80% a 95% o più. La Tiacumicina B à ̈ quindi isolata dalla soluzione purificata in condizioni standard (cioà ̈ per insolubilizzazione con un anti-solvente). Il prodotto finale purificato ha una purezza di almeno 95%.
In una forma di attuazione preferita di questa invenzione, le due colonne HIC sono utilizzate a pH differente. Ciò consente infatti di separare differenti tipi di composti in base alle loro differenze di polarità e di migliorare la purezza del prodotto. L’ordine con cui vengono effettuati i due stadi di HIC (a differente pH) non à ̈ sostanziale. Secondo una forma di attuazione dell’invenzione, il primo stadio à ̈ realizzato a pH 2.0-5.0, preferibilmente 2.5-3.5, mentre il secondo stadio à ̈ realizzato a pH 3.5-7.0, preferibilmente 5-6.5.
Esempio 1
Il brodo di fermentazione (10 l) contenente Tiacumicina B fu estratto con 10 l di etil acetato. L’estratto di etil acetato fu concentrato per ottenere 320 g di residuo oleoso. Il residuo fu sciolto in metanolo a una concentrazione di 200 g/l. La soluzione risultante fu caricata su una colonna impaccata con resina HP20SS (1 l-50x5 cm) precedentemente equilibrata con 5 volumi del letto della colonna (BV) di tampone fosfato a pH 3,5. La colonna fu lavata con 10 BV di acetonitrile in tampone fosfato pH 3,5 (la % di acetonitrile varia da 10% a 50%). La Tiacumicina B fu eluita con 5 BV di acetonitrile in tampone acetato pH 3,5 (la % di acetonitrile varia da 52% a 60%). L’eluato dalla colonna fu suddiviso in frazioni e ogni frazione fu analizzata per HPLC per valutare la purezza. Le frazioni con una purezza superiore a 75% furono riunite e concentrate; il concentrato fu estratto con etil acetato. Lo strato di etil acetato fu concentrato a secchezza; il residuo fu ridisciolto in metanolo a una concentrazione di 200 g/l. La soluzione risultante fu caricata su una colonna impaccata con resina HP20SS (0,2 l-40x2,5 cm) precedentemente equilibrata con 5 BV di tampone acetato a pH 6,5. La colonna fu lavata con 10 BV di acetonitrile in tampone acetato pH 6,5 (la % di acetonitrile varia da 10% a 45%). La Tiacumicina B fu eluita con 5 BV di acetonitrile in tampone acetato pH 6,5 (la % di acetonitrile varia da 48% a 52%). L’eluato dalla colonna fu suddiviso in frazioni e ogni frazione fu analizzata per HPLC per valutare la purezza. Le frazioni con una purezza superiore a 95% furono riunite e concentrate; il concentrato fu estratto con etil acetato. Lo strato di etil acetato fu lavato con 3 volumi di acqua, concentrato a piccolo volume, poi addizionato di 5 volumi di cicloesano; la sospensione fu tenuta a 4°C per completare la cristallizzazione. Il prodotto fu filtrato e seccato. Furono ottenuti 0,45 g di polvere bianca con una purezza di 97,4%.
Esempio 2
Tiacumicina B grezza (16 g) fu sciolta in metanolo a una concentrazione di 200 g/l. La soluzione risultante fu caricata su una colonna impaccata con resina HP20SS (1 l-50x5 cm) precedentemente equilibrata con 5 BV di tampone acetato a pH 5,0. La colonna fu lavata con 10 BV di acetonitrile in tampone acetato pH 5,0 (la % di acetonitrile varia da 10% a 48%). La Tiacumicina B fu eluita con 5 BV di acetonitrile in tampone acetato pH 5,0 (la % di acetonitrile varia da 50% a 55%). L’eluato dalla colonna fu suddiviso in frazioni e ogni frazione fu analizzata per HPLC per valutare la purezza. Le frazioni con una purezza superiore a 75% furono riunite e concentrate; il concentrato fu estratto con etil acetato. Lo strato di etil acetato fu concentrato a secchezza; il residuo fu ridisciolto in metanolo a una concentrazione di 200 g/l. La soluzione risultante fu caricata su una colonna impaccata con resina HP20SS (1 l-50x5 cm) precedentemente equilibrata con 5 Volumi di letto (BV) di tampone fosfato a pH 3,0. La colonna fu lavata con 10 BV di acetonitrile in tampone fosfato a pH 3,0 (la % di acetonitrile varia da 10% a 52%). La Tiacumicina B fu eluita con 5 BV di acetonitrile in tampone fosfato a pH 3,0 (la % di acetonitrile varia da 55% a 60%). L’eluato dalla colonna fu suddiviso in frazioni e ogni frazione fu analizzata per HPLC per valutare la purezza. Le frazioni con una purezza superiore a 95% furono riunite e concentrate; il concentrato fu estratto con etil acetato. Lo strato di etil acetato fu lavato con 3 volumi di acqua, concentrato a piccolo volume, poi addizionato di 5 volumi di cicloesano; la sospensione fu tenuta a 4°C per completare la cristallizzazione. Il prodotto fu filtrato e seccato. Furono ottenuti 2,8 g di polvere bianca con una purezza di 96,8%.
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI 1. Un procedimento per purificare la Tiacumicina B comprendente sottoporre un liquido contenente Tiacumicina B ad almeno una cromatografia ad interazione idrofobica.
- 2. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 dove la cromatografia ad interazione idrofobica utilizza una resina stirenica-divinilbenzenica.
- 3. Il procedimento secondo la rivendicazione 2 dove la cromatografia ad interazione idrofobica utilizza una resina stirenica-divinilbenzenica scelta nel gruppo costituto da HP20, HP21, HP20SS, SP20, SP20SS, SP825, SP850, SP207, XAD16, XAD1600, XAD18.
- 4. Il procedimento secondo la rivendicazione 3 dove la resina à ̈ HP20SS.
- 5. Il procedimento secondo le rivendicazioni 1-4 in cui la cromatografia ad interazione idrofobica comprende gli stadi di: a) caricare il liquido contenente Tiacumicina B ad un pH tra 2.0 e 8.0 sulla resina ad interazione idrofobica; b) eluire le impurezze dalla resina ad interazione idrofobica con una miscela costituita da acqua e solvente organico scelto tra metanolo, etanolo, acetonitrile, acetone, THF o una miscela di essi ad un pH tra 2.0 e 8.0; c) eluire la Tiacumicina B dalla resina ad interazione idrofobica con una miscela costituita da acqua e solvente organico scelto tra metanolo, etanolo, acetonitrile, acetone, THF o una miscela di essi ad un pH tra 2.0 e 8.0;
- 6. Il procedimento secondo la rivendicazione 5 in cui il liquido contenente Tiacumicina B Ã ̈ caricato ad un pH tra 2.5 e 6.5 sulla resina ad interazione idrofobica.
- 7. Il procedimento secondo la rivendicazione 5 in cui il pH della miscela eluente utilizzata nell’eluizione dello stadio b) e/o c) à ̈ tra 2.5 e 6.5.
- 8. Il procedimento secondo le rivendicazioni 1-7 in cui il liquido contenente Tiacumicina B Ã ̈ sottoposto a due cromatografie ad interazione idrofobica.
- 9. Il procedimento secondo la rivendicazione 8 in cui una cromatografia ad interazione idrofobica utilizza, negli stadi di eluizione b) e c), una miscela eluente avente un pH tra 2.0 e 5.0 e la seconda cromatografia ad interazione idrofobica utilizza, nell’eluizione degli stadio b) e c), una miscela eluente avente un pH tra 3.5 e 7.0, dove le due cromatografie sono realizzate in qualsiasi ordine.
- 10. Il procedimento secondo la rivendicazione 8 in cui una cromatografia ad interazione idrofobica utilizza, negli stadi di eluizione b) e c), una miscela eluente avente un pH tra 2.5 e 3.5 e la seconda cromatografia ad interazione idrofobica utilizza, nell’eluizione degli stadio b) e c), una miscela eluente avente un pH tra 5.0 e 6.5, dove le due cromatografie sono realizzate in qualsiasi ordine.
- 11. Un procedimento secondo ciascuna delle precedenti rivendicazioni in cui liquido contenente Tiacumicina B Ã ̈ un brodo di fermentazione contenente Tiacumicina B.
- 12. Un procedimento secondo la rivendicazione 11 in cui il brodo di fermentazione à ̈ sottoposto a filtrazione e opzionalmente a pre-purificazione prima della cromatografia ad interazione idrofobica. Milano, 5 aprile 2012
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