CN102115757A

CN102115757A - 台勾霉素的生物合成基因簇及其应用

Info

Publication number: CN102115757A
Application number: CN 201010592416
Authority: CN
Inventors: 张长生; 肖毅; 李苏梅; 牛四文; 张光涛; 张海波; 胡涛; 鞠建华
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2030-12-16
Also published as: CN102219815A; CN102115757B; CN102219815B

Abstract

本发明公开了一种台勾霉素的生物合成基因簇及其应用。整个基因簇饱含31个基因：聚酮合成酶基因，即tiaA1、tiaA2、tiaA3、tiaA4：脱氧糖基的生物合成基因，即tiaS1、tiaS2、tiaS3、tiaS4、tiaS5、tiaS6、tiaG1、tiaG2：2，4-二羟基-3，5-二氯-6-乙基苯甲酸合成酶基因，即tiaE、tiaF、tiaB、tiaM：异丁酰基合成基因，即tiaC、tiaD：甲基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A合成基因，即tiaJ、tiaK、tiaL、tiaN：环骨架后修饰基因，即tiaP1、tiaP2，共2个基因：调节、抗性和未知功能基因，即tiaI、tiaR1、tiaR2、tiaT1、tiaT2、tiaT3、tiaT4。通过对上述生物合成基因进行遗传改造可以得到台勾霉素的结构类似物。本发明提供的基因及其蛋白可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Description

台勾霉素的生物合成基因簇及其应用

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及抗生素台勾霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

背景技术：

近年来，抗生素的滥用导致了各种耐药菌的出现，直接威胁人类的生命和健康。艰难梭菌(Clostridium difficile)就是其中的一种。艰难梭菌引起的腹泻(Clostridium difficile-associateddiarrhoea，CDAD)已经成为困挠人类健康的一个严重的问题(Johnson，2007)，另外，部分抗生素腹泻(antibiotic-associated diarrhea，AAD)和大部分抗生素性结膜炎(antibiotic associatedcolitis，AAC)也是由艰难梭菌引起的(Gerber & Ackermann，2008；Y-K·舒；C-K·王；Y-H·邱；A·罗梅罗；F·巴巴卡尼；P·西尔斯；F·奥库姆，2005)。这些疾病成为卫生保健体系的主要经济负担，据保守估计，美国医院每年都为此花费30-60亿美元(Kyne et al.，2002；Y-K·舒；C-K·王；Y-H·邱；A·罗梅罗；F·巴巴卡尼；P·西尔斯；F·奥库姆，2005)。大环内酯类抗生素台勾霉素(tiacumicins，又称lipiarmycins)，具有抗各种细菌病原体的活性，特别是针对艰难梭菌有明显的抗菌活性(Ackermann et al.，2004；Karlowsky et al.，2008)。台勾霉素是一系列18元环大环内酯类抗生素的总称，由放线菌指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085，游动放线菌Actinoplanes deccanensis ATCC 21983和小孢链菌Catellatospora sp.Bp3323-81等产生(Coronelli et al.，1975；Hochlowski et al.，1987；Kurabachew et al.，2008)。研究发现台勾霉素中台勾霉素B(Tiacumicin B)是最好的活性组分，其拥有两个脱氧糖基和一个芳香环支链，C-18为R-羟基(见图1)，对艰难梭菌具有较低的最小抑制浓度(MIC)值，体外对艰难梭菌的抗菌活性为万古霉素的8-10倍(Y-K·舒；C-K·王；Y-H·邱；A·罗梅罗；F·巴巴卡尼；P·西尔斯；F·奥库姆，2005)。目前该药物已经进入到三期临床试验阶段(Louie et al.，2009；Shue et al.，2008)。最近有报道表明，台勾霉素B也具有很好的抗结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)活性(Kurabachew et al.，2008)和体外抗癌活性(Wu et al.，2009)。因此，这种针对革兰氏阳性细菌的高效新型抗生素具有很大的潜力开发成新药(Gerber & Ackermann，2008)。

近年来蓬勃发展起来的组合生物合成技术，为改造台勾霉素的生产菌指孢囊菌NRRL18085带来了新的机遇。在阐明了自然界的生物合成途径、理解自然界聚酮化合物天然组合生物合成机理的基础上，人们可以采用组合生物合成技术对抗生素的生物合成基因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等操作，不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。

发明内容：

本发明的第一个目的在于提供一种台勾霉素的生物合成基因簇。

本发明的台勾霉素的生物合成基因簇，其特征在于，该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含31个基因，具体为：

1)聚酮合成酶基因，即tiaA1、tiaA2、tiaA3、tiaA4共4个基因：

tiaA1位于基因簇核苷酸序列第41491-57180个碱基处，长度为15690个碱基对，编码聚酮合成酶，5229个氨基酸；

tiaA2位于基因簇核苷酸序列第57186-66803个碱基处，长度为9618个碱基对，编码聚酮合成酶，3205个氨基酸；

tiaA3位于基因簇核苷酸序列第66829-71337个碱基处，长度为4509个碱基对，编码聚酮合成酶，1502个氨基酸；

tiaA4位于基因簇核苷酸序列第71361-81746个碱基处，长度为10386个碱基对，编码聚酮合成酶，3461个氨基酸；

2)脱氧糖基的生物合成基因，即tiaS1、tiaS2、tiaS3、tiaS4、tiaS5、tiaS6、tiaG1、tiaG2共8个基因：

tiaS1位于基因簇核苷酸序列第8508-7492个碱基处，长度为1017个碱基对，编码GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶，338个氨基酸；

tiaS2位于基因簇核苷酸序列第9742-8534个碱基处，长度为1209个碱基对，编码C-甲基转移酶，402个氨基酸；

tiaS3位于基因簇核苷酸序列第10785-9787个碱基处，长度为999个碱基对，编码GDP-甘露糖4，6-脱水酶，332个氨基酸；

tiaS4位于基因簇核苷酸序列第21789-22820个碱基处，长度为1032个碱基对，编码GDP-甘露糖4，6-脱水酶，343个氨基酸；

tiaS5位于基因簇核苷酸序列第33022-34347个碱基处，长度为1326个碱基对，编码糖O-甲基转移酶，441个氨基酸；

tiaS6位于基因簇核苷酸序列第38882-40021个碱基处，长度为1140个碱基对，编码O-酰基转移酶，379个氨基酸；

tiaG1位于基因簇核苷酸序列第7441-6044个碱基处，长度为1398个碱基对，编码糖基转移酶，465个氨基酸；

tiaG2位于基因簇核苷酸序列第20351-21772个碱基处，长度为1422个碱基对，编码糖基转移酶，473个氨基酸；

3)2，4-二羟基-3，5-二氯-6-乙基苯甲酸合成酶基因，即tiaE、tiaF、tiaB、tiaM共4个基因：

tiaE位于基因簇核苷酸序列第14006-13260个碱基处，长度为747个碱基对，编码II型硫酯酶，248个氨基酸；

tiaF位于基因簇核苷酸序列第14189-15220个碱基处，长度为1032个碱基对，编码酰基载体蛋白合成酶/缩合酶，343个氨基酸；

tiaB位于基因簇核苷酸序列第15220-20349个碱基处，长度为5130个碱基对，编码可重复利用的聚酮合成酶，1709个氨基酸；

tiaM位于基因簇核苷酸序列第37305-38789个碱基处，长度为1485个碱基对，编码卤化酶，494个氨基酸；

4)异丁酰基合成基因，即tiaC、tiaD共2个基因：

tiaC位于基因簇核苷酸序列第11219-12280个碱基处，长度为1062个碱基对，编码支链α酮酸脱氢酶的E1α亚单元，353个氨基酸；

tiaD位于基因簇核苷酸序列第12277-13254个碱基处，长度为978个碱基对，编码支链α酮酸脱氢酶的E1β亚单元，325个氨基酸；

5)甲基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A合成基因，即tiaJ、tiaK、tiaL、tiaN共4个基因：

tiaJ位于基因簇核苷酸序列第27166-28398个碱基处，长度为1233个碱基对，编码3-羟乙酰基-辅酶A脱氢酶，410个氨基酸；

tiaK位于基因簇核苷酸序列第28395-29759个碱基处，长度为1368个碱基对，编码巴豆酰基-辅酶A还原酶/羧化酶，454个氨基酸；

tiaL位于基因簇核苷酸序列第29770-31200个碱基处，长度为1431个碱基对，编码丙酰-辅酶A羧化酶，476个氨基酸；

tiaN位于基因簇核苷酸序列第82097-83296个碱基处，长度为1200个碱基对，编码烯酰-辅酶A水合酶/异构酶，399个氨基酸；

6)环骨架后修饰基因，即tiaP1、tiaP2，共2个基因：

tiaP1位于基因簇核苷酸序列第32479-31301个碱基处，长度为1179个碱基对，编码细胞色素P-450氧化酶，392个氨基酸；

tiaP2位于基因簇核苷酸序列第41304-40105个碱基处，长度为1200个碱基对，编码细胞色素P-450氧化酶，399个氨基酸；

7)调节、抗性和未知功能基因，即tiaI、tiaR1、tiaR2、tiaT1、tiaT2、tiaT3、tiaT4共7个基因：

tiaI位于基因簇核苷酸序列第26853-24502个碱基处，长度为2352个碱基对，编码ATP-依赖的DNA解螺旋酶，783个氨基酸；

tiaR1位于基因簇核苷酸序列第34415-37186个碱基处，长度为2772个碱基对，编码LuxR家族转录调节因子，923个氨基酸；

tiaR2位于基因簇核苷酸序列第88114-88527个碱基处，长度为414个碱基对，编码TetR家族转录调节因子，137个氨基酸；

tiaT1位于基因簇核苷酸序列第24505-22880个碱基处，长度为1626个碱基对，编码膜转运蛋白，541个氨基酸；

tiaT2位于基因簇核苷酸序列第83304-84590个碱基处，长度为1287个碱基对，编码膜转运蛋白，428个氨基酸；

tiaT3位于基因簇核苷酸序列第85955-84642个碱基处，长度为1314个碱基对，编码NitT/TauT家族ABC转运蛋白，437个氨基酸；

tiaT4位于基因簇核苷酸序列第87757-86003个碱基处，长度为1755个碱基对，编码NitT/TauT家族ABC转运蛋白，584个氨基酸。

SEQ ID NO.1的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。SEQ ID NO.1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或DNA体外合成技术或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO.1中DNA序列的重组DNA载体的途径。

本发明还提供了产生台勾霉素生物合成基因被中断或其他基因改造的途径，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO.1中的核苷酸序列。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列SEQ ID NO.1的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与台勾霉素生物合成基因相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从指孢囊菌NRRL 18085基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有指孢囊菌NRRL 18085基因组中邻近区域未克隆的DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修饰或进行突变，包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并了解它们在宿主代谢中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成2，4-二羟基-3，5-二氯-6-乙基苯甲酸、脱氧糖及台勾霉素聚酮大环骨架，进一步催化合成抗生素台勾霉素B。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得其他新型生物合成途径或者产生新的化合物。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因DNA片段可以通过中断台勾霉素生物合成的一个或几个步骤而得到新的台勾霉素结构类似物或前体。包含DNA片段或基因可以用来提高台勾霉素或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。

包含本发明所提供的聚酮合成酶可以通过缺失、插入或失活来自于相同或不同的聚酮合成酶系统的一个或多个聚酮合成酶结构域、模块或基因而产生新的聚酮化合物。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来构建聚酮合成酶库或聚酮合成酶衍生库或组合库。

本发明所提供的催化合成2，4-二羟基-3，5-二氯-6-乙基苯甲酸的合成基因可用于合成台勾霉素衍生物。

本发明所提供的台勾霉素大环骨架的后修饰基因或糖基转移酶或其他酶提供了通过遗传修饰得到类似物的途径，所包含的催化大环内酯生成或后修饰的其他应用。

本发明所提供的卤化酶TiaM可以应用于台勾霉素的2，4-二羟基-6-乙基苯甲酸的结构域卤素基团的改变。

总之，本发明所提供的包含台勾霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解台勾霉素家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

用于本发明的指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085，已在本申请以前公开记载于美国专利，其专利号为US4,918,174的专利中。根据该专利文献的记载，指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085保藏于美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，简写：NRRL)，其登录号为NRRL 18085。

附图说明：

图1是台勾霉素B的化学结构；

图2是阳性克隆的限制性酶切图谱及其相互重叠区示意图，包括了阳性克隆pCSG1，pCSG4-7，pCSG9，pCSG10，pCSG12，pCSG15-18，黑色部分表明了序列测定区域，E：EcoRI、B：BglII；

图3是台勾霉素生物合成基因簇的组织结构示意图；

图4是推测的台勾霉素B的生物合成途径，(A)台勾霉素大环内酯骨架的形成及其关键后修饰过程；(B)芳香环的生物合成；(C)脱氧糖基的生物合成及其修饰；(D)乙基丙二酰辅酶A的生物合成；

图5是基因遗传改造指囊孢菌NRRL 18085中台勾霉素的生物合成基因得到台勾霉素结构类似物的高压液相分析图：(0)野生型菌株指孢囊菌NRRL18085经发酵获得了台勾霉素B；(1)敲除了tiaM-卤化酶基因，获得的突变株发酵TCM50产生了化合物1；(2)敲除了tiaS1-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得的突变株TCM51发酵产生了化合物2，3，4，5；(3)敲除了tiaS6-O乙酰转移酶基因，获得的突变株TCM53发酵产生了化合物4，5，6，7；(4)敲除了tiaP2-P450基因，获得的突变株TCM54发酵产生了化合物8，9，10，11；(5)敲除了tiaS2-C甲基转移酶基因，获得的突变株发酵TCM55产生了化合物2，3，4；(6)敲除了tiaR1-Lux家族的调控基因，获得的突变株TCM56失去了产生tiacumicinB的能力；(7)敲除了tiaG1-糖基转移酶基因，获得的突变株TCM57发酵产生了化合物3，4，5，6，12；(8)敲除了tiaG2-糖基转移酶基因，获得的突变株TCM64发酵产生了化合物13，14，15，16；(9)敲除了tiaF-ACP合成酶基因，获得的突变株TCM62发酵产生了化合物13，14，15，16；(10)敲除了tiaP1-P450基因，获得的突变株TCM69发酵产生了化合物17；(11)敲除了tiaB-可重复利用聚酮合成酶基因，获得的突变株TCM63发酵产生了化合物4，13，14，15，16；(12)敲除了tiaS3-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得的突变株TCM52发酵仍旧生产台勾霉素B；(13)敲除了tiaS4-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得的突变株TCM65发酵生产台勾霉素B和化合物4；(14)敲除了ORF(-1)-转座酶基因，获得的突变株TCM58发酵仍旧生产台勾霉素B；(15)敲除了tiaC-Alpha支链酮酸脱氢酶基因，获得的突变株TCM59发酵仍旧生产台勾霉素B；(16)敲除了tiaD-Alpha支链酮酸脱氢酶基因，获得的突变株TCM60发酵仍旧生产台勾霉素B；(17)敲除了tiaE-硫酯合成酶基因，获得的突变株TCM61发酵仍旧生产台勾霉素B，同时产生了化合物13，14，15，16；(18)敲除了tiaJ-3-羟酰辅酶A脱氢酶基因，获得的突变株TCM66发酵仍旧生产台勾霉素B；(19)敲除了tiaK-Crotonyl辅酶A脱羧酶/还原酶基因，获得的突变株TCM67发酵仍旧生产台勾霉素B；(20)敲除了tiaL-丙酰辅酶A脱羧酶基因，获得的突变株TCM68发酵仍旧生产台勾霉素B；(21)敲除了tiaS5-氧甲基转移酶基因，获得的突变株TCM70发酵产生了化合物18-29；(22)敲除了tiaN-烯醇酰辅酶A脱水酶/异构酶基因，获得的突变株TCM71发酵仍旧生产台勾霉素B；(23)敲除了tiaR2-Ars家族转录调控子编码基因，获得的突变株TCM72发酵仍旧生产台勾霉素B，产量略有提高；(24)敲除了orf1-短链脱氢辅基因，获得的突变株TCM73发酵仍旧生产台勾霉素B；(25)敲除了tiaT2-Na/H膜转运蛋白编码基因，获得的突变株TCM74发酵仍旧生产台勾霉素B；(26)敲除了tiaT4-ABC膜转运蛋白编码基因，获得的突变株TCM76发酵仍旧生产台勾霉素B；(27)敲除了tiaA1-聚酮合成酶编码基因，获得的突变株TCM77失去生产台勾霉素B及其类似物的能力；

图6是基因遗传改造台勾霉素的生物合成基因得到的台勾霉素结构类似物的化学结构式；

图7是卤化酶TiaM的体外生化鉴定，(A)TiaM催化反应的示意图；(B)纯化蛋白TiaM和SsuE的蛋白电泳分析；(C)TiaM反应产物的高压液相分析图：(i)TiaM的标准反应体系包括26μM化合物1，0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，4mM NADH，100mM NaCl，2.9μM TiaM和0.22μM SsuE；(ii)标准反应体系缺少SsuE；(iii)标准反应体系缺少TiaM；(iv)标准反应体系缺少FAD；(v)标准反应体系缺少NADH；(vi)标准反应体系缺少NaCl；(vii)标准反应体系中用化合物30替代化合物1；(viii)台勾霉素B标准品；(ix)标准反应体系中用NaBr替代NaCl；(x)标准反应体系中用化合物30替代化合物1，用NaBr替代NaCl。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1.台勾霉素的生物合成基因簇克隆、序列分析及功能分析：

台勾霉素B(图1)中有一个大环内脂的骨架，是由聚酮合成酶PKS催化产生的，因此设计PKS的兼并引物TCM-PKS4F：5′-CTW CGT SGA GGC SCA YGG CAC SGG-3′和TCM-PKS5R：5′-CCR TGM CCS GAG AAS ACC CAS AC-3′，通过PCR扩增从指孢囊菌NRRL 18085基因组中获得一个约700bp的PCR片段，连入到T载体中，测序后将序列进行blast比对，结果表明，该序列与已知的PKS具有高度同源性。同样台勾霉素B中的芳香环支链上有两个氯原子，这暗示有卤化酶参与了台勾霉素B的生物合成。我们采用文献报道的次级代谢产物卤化酶的兼并引物引物Halo-B4-FW：5′-TTC CCS CGS TAC CAS ATC GGS GAG-3′和Halo-B7-RV：5′-GSG GGA TSW MCC AGW ACC ASC C-3′(Hornung et al.，2007)，从指孢囊菌NRRL 18085的基因组DNA中扩增获得了约550bp的DNA片段。序列测定(GenBank序列号为GU292810)和Blast结果显示该DNA片段所对应的蛋白多肽序列跟一系列的次级代谢产物的卤化酶有高度相似性。

于是将这两个片段用地高辛标记为探针，从指囊孢菌NRRL 18085的基因组文库1920个克隆中筛选，用PKS探针获得了16个阳性克隆，其中的8个用卤化酶探针能够同时筛选获得，但用卤化酶探针未能筛选到其他阳性克隆。这些阳性克隆经酶切分析表明涵盖了染色体约100kb的区域(图2)。在此基础上，再经过染色体步移获得了2个交叠的质粒pCSG17和pCSG18。这18个涵盖了染色体约130kb的区域。DNA序列测定了110,633bp的染色体区域，通过生物信息学分析包含了50个开放读码框(图3)，其中31个可能与台勾霉素B的生物合成有关(表1)。根据基因编码蛋白的功能分析，台勾霉素的生物合成基因簇被初步确定为从基因tiaG1到tiaR2(图3)涵盖染色体82.5kb的区域，包含31个开放读码框。整个台勾霉素的生物合成基因簇共31个基因，其中4个聚酮合成酶基因tiaA1、tiaA2、tiaA3、tiaA4用于编码I型聚酮合成酶((PKS)，共包含9个模块，40个功能域，负责催化台勾霉素大环骨架部分聚酮链的生物合成；8个脱氧糖基生物合成基因tiaS1、tiaS2、tiaS3、tiaS4、tiaS5、tiaS6、tiaG1、tiaG2编码的蛋白负责脱氧甘露糖的生物合成，并进一步与大环骨架缩合；4个2，4-二羟基-3，5-二氯-6-乙基苯甲酸合成酶基因tiaE、tiaF、tiaB、tiaM用于编码重复使用的PKS及氯化修饰酶，负责催化2，4-二羟基-3，5-二氯-6-乙基苯甲酸的生物合成；2个异丁酰基合成基因tiaC、tiaD用于编码支链α酮酸脱氢酶的α和β组分，负责异丁酰基合成；4个甲基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A合成基因tiaJ、tiaK、tiaL、tiaN用于编码甲基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A合成；2个环骨架后修饰基因tiaP1、tiaP2编码氧化酶，催化台勾霉素大环骨架的后修饰；7个调节、抗性和未知功能基因tiaI、tiaR1、tiaR2、tiaT1、tiaT2、tiaT3、tiaT4负责还编码2个调节基因产物和4个抗性基因产物和一个未知功能的蛋白。

表1：台勾霉素的生物合成基因簇的基因及其功能分析

a氨基酸数目；b括号中包含了同源蛋白的GeneBank登录号，及与之对应的相似性/一致性(similarity/identity)。

2.台勾霉素的生物合成基因簇的分析及边界的确定：

生物信息学分析表明，orf(-1)基因编码转座酶，与台勾霉素的生物合成无关。通过最近建立的指孢囊菌NRRL 18085的遗传操作体系(肖毅等，微生物学报，2010，50：1014-1022)，构建了orf(-1)基因灭活的突变株TCM58，该突变株经发酵仍旧能够生产台勾霉素B，产量与野生型相当，从而确证了orf(-1)不参与台勾霉素的生物合成。与此相反，灭活与orf(-1)相邻的糖基转移酶基因tiaG1，得到突变株TCM57不再能够生产台勾霉素B，而是产生了新的衍生物，表明tiaG1是台勾霉素的生物合成基因。这些结果表明orf(-1)是台勾霉素生物合成基因簇的左边界(图3)。台勾霉素生物合成基因簇的右边界还不是十分确定。灭活编码短链脱氢酶的基因orf1，获得突变株TCM73，该突变株仍能生产台勾霉素B，产量与野生型相当，排除了orf1基因参与台勾霉素B生物合成的可能性。同时，灭活与orf1基因相邻的编码ArsR家族转录调节因子的tiaR2基因，获得的突变株TCM72仍能生产台勾霉素B，产量与野生型相比略有增加，说明tiaR2可能是台勾霉素生物合成的负调控因子。灭活编码膜转运蛋白的tiaT2和tiaT4基因获得的突变株TCM74和TCM76仍能生产台勾霉素B，但产量低于野生型，说明这两个基因可能参与产台勾霉素B的跨膜转运。因此，台勾霉素B的生物合成基因簇的边界的上游初步确定为tiaG1，下游为tiaR2(图3)。

3.台勾霉素聚酮大环骨架的合成：

台勾霉素大环骨架聚酮链部分是由典型的I型聚酮合成酶PKS催化合成的，具体催化流程如图4A所示。其中，tiaA1编码的PKS包含4个模块，起始模块包含AT，ACP两个结构域。延伸模块1包含KS，AT，KR，ACP结构域，延伸模块2包含KS，AT，DH，KR，ACP结构域，延伸模块3包含KS，AT，DH，KR，ACP结构域。tiaA2编码的PKS包含2个模块，延伸模块4包含KS，AT，KR，ACP结构域，延伸模块5包含KS，AT，DH，KR，ACP结构域。tiaA3编码的PKS包含1个模块，即延伸模块6包含KS，AT，KR，ACP结构域。tiaA4编码的PKS包含2个模块，延伸模块7包含KS，AT，KR，DH，ACP结构域，延伸模块8包含KS，AT，DH，KR，ACP，TE结构域。在所有的模块中的AT结构域中，模块1，模块6，模块7中的识别丙二酰辅酶A，模块2，模块3，模块5，模块8中的识别甲基丙二酰辅酶A，模块4中的识别乙基丙二酰辅酶A。在上述PKS的催化下依此经活化、脱羧合生成聚酮长链，然后环化形成台勾霉素的大环内酯的骨架结构。体内突变实验表明，灭活tiaA1的突变株TCM77不再能够产生台勾霉素B。

4.2，4-二羟基-3，5-二氯-6-乙基苯甲酸的生物合成：

2，4-二羟基-3，5-二氯-6-乙基苯甲酸的生物合成流程如图4B所示：tiaB编码的为重复使用的聚酮合成酶催化1分子丙酰辅酶A缩合和3分子丙二酰辅酶A缩合，脱掉1分子的水生成2，4-二羟基-6-乙基苯甲酸，进一步在tiaM编码的卤化酶作用下发生两次氯化，从而完成台勾霉素中的2，4-二羟基-3，5-二氯-6-乙基苯甲酸单元的生物合成。

5.脱氧甘露糖的生物合成及后修饰：

脱氧甘露糖的生物合成如图4C所示：tiaSl，S2，S3编码的NDP-D-甘露糖4，6-脱水酶和还原酶的催化下发生6位脱氧，形成6-脱氧甘露糖。接着tiaS5编码的O-甲基转移酶催化形成2-甲氧基-6-脱氧甘露糖；6-脱氧甘露糖被tiaS2编码的C甲基转移酶作用形成5-甲基-6-脱氧甘露糖。

6.乙基丙二酰辅酶A的生物合成：

由乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A，再有TiaJ所编码的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶催化下形成3-羟基丁酰辅酶A，然后再由tiaN编码烯酰(巴豆酰基)-辅酶A水合酶/异构酶催化生成烯酰-辅酶A，最后由tiaK编码的巴豆酰基-辅酶A还原酶/羧化酶催化生成乙基丙二酰辅酶A(图4D)。

7.台勾霉素生物合成基因簇的应用-对台勾霉素生物合成基因簇的基因遗传突变获得其结构类似物：

在克隆、分析了完整的台勾霉素的生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白可能的功能的基础上，本发明对台勾霉素的生物合成机制进行了探讨，采用PCR-targetting技术针对27个生物合成基因，进行了灭活突变(灭活引物参见表2，检测引物参见表3)，获得了TCM50-TCM77等27个突变株。

表2：构建突变株所需的灭活引物名称和序列

表3：构建突变株所需的检测引物名称和序列

我们通过对突变株进行发酵和代谢产物的分离鉴定，阐明了部分生物合成基因的功能，为进一步通过对生物合成基因簇进行遗传修饰获得台勾霉素活性类似物提供了可能。同时本发明也从突变株中获得了一系列的新产物(如图5和图6所示)：

(1)敲除了tiaM-卤化酶基因，获得的突变株发酵TCM50产生了化合物1，证明了TiaM是个双卤化酶。

(2)敲除了tiaS1-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得的突变株TCM51发酵产生了化合物2，3，4，5，表明TiaS1的功能与5-C-甲基鼠李糖的生物合成相关。

(3)敲除了tiaS6-O酰基转移酶基因，获得的突变株TCM53发酵产生了化合物4，5，6，7，证明了TiaS6负责在5-C-甲基鼠李糖的4位羟基上添加一个酰基。

(4)敲除了tiaP2-P450基因，获得的突变株TCM54发酵产生了化合物8，9，10，11，表明TiaP2是C20位的羟化酶。

(5)敲除了tiaS2-C甲基转移酶基因，获得的突变株发酵TCM55产生了化合物2，3，4，证明TiaS2是5-C-甲基鼠李糖的C-甲基转移酶。

(6)敲除了tiaR1-Lux家族的调控基因，获得的突变株TCM56失去了产生tiacumicinB的能力，表明tiaR1是个正调控因子。

(7)敲除了tiaG1-糖基转移酶基因，获得的突变株TCM57发酵产生了化合物3，4，5，6，12，表明TiaG1是个C11位的5-C-甲基鼠李糖转移酶。

(8)敲除了tiaG2-糖基转移酶基因，获得的突变株TCM64发酵产生了化合物13，14，15，16，表明TiaG2是C20位的2-O-甲基鼠李糖转移酶。

(9)敲除了tiaF-ACP合成酶基因，获得的突变株TCM62发酵产生了化合物13，14，15，16。

(10)敲除了tiaP1-P450基因，获得的突变株TCM69发酵产生了化合物17，表明TiaP1是个C18位的羟化酶。

(11)敲除了tiaB-可重复利用聚酮合成酶基因，获得的突变株TCM63发酵产生了化合物4，13，14，15，16。

(12)敲除了tiaS3-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得的突变株TCM52发酵仍旧生产台勾霉素B。

(13)敲除了tiaS4-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得的突变株TCM65发酵生产台勾霉素B和化合物4。

(14)敲除了ORF(-1)-转座酶基因，获得的突变株TCM58发酵仍旧生产台勾霉素B，表明Orf(-1)与台勾霉素生物合成无关。

(15)敲除了tiaC-Alpha支链酮酸脱氢酶E1α组分基因，获得的突变株TCM59发酵仍旧生产台勾霉素B。

(16)敲除了tiaD-Alpha支链酮酸脱氢酶E1β组分基因，获得的突变株TCM60发酵仍旧生产台勾霉素B。

(17)敲除了tiaE-硫酯合成酶基因，获得的突变株TCM61发酵仍旧生产台勾霉素B，同时产生了化合物13，14，15，16。

(18)敲除了tiaJ-3-羟酰辅酶A脱氢酶基因，获得的突变株TCM66发酵仍旧生产台勾霉素B。

(19)敲除了tiaK-Crotonyl辅酶A脱羧酶/还原酶基因，获得的突变株TCM67发酵仍旧生产台勾霉素B。

(20)敲除了tiaL-丙酰辅酶A脱羧酶基因，获得的突变株TCM68发酵仍旧生产台勾霉素B。

(21)敲除了tiaS5-氧甲基转移酶基因，获得的突变株TCM70发酵产生了化合物18-29，证明TiaS5是个2-O-甲基转移酶。

(22)敲除了tiaN-烯醇酰辅酶A脱水酶/异构酶基因，获得的突变株TCM71发酵仍旧生产台勾霉素B。

(23)敲除了tiaR2-Ars家族转录调控子编码基因，获得的突变株TCM72发酵仍旧生产台勾霉素B，产量略有提高，说明tiaR2有可能是个负调控基因。

(24)敲除了orf1-短链脱氢辅基因，获得的突变株TCM73发酵仍旧生产台勾霉素B。

(25)敲除了tiaT2-Na/H膜转运蛋白编码基因，获得的突变株TCM74发酵仍旧生产台勾霉素B，产量明显降低。

(26)敲除了tiaT4-ABC膜转运蛋白编码基因，获得的突变株TCM76发酵仍旧生产台勾霉素B，产量略有降低。

(27)敲除了tiaA1-聚酮合成酶编码基因，获得的突变株TCM77失去生产台勾霉素B及其类似物的能力。

8.台勾霉素生物合成基因tiaM的生化功能鉴定及其应用：

生物合成基因tiaM在大肠杆菌中获得了可溶性表达(图7)，经过生化反应鉴定TiaM为后修饰酶，能够以化合物1为底物催化二次氯化，先后形成化合物30和台勾霉素B(图7A)。同时，TiaM还能够利用NaBr作为底物形成化合物31和32，能够将化合物30溴化成为化合物33(图7A)。

以下进一步提供实施例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。

实施例1

台勾霉素产生菌指囊孢菌NRRL 18085总DNA的提取：

将新鲜指囊孢菌NRRL 18085的菌丝体按照5％的接种量接种于50ml的YMS培养基(酵母抽提物4g，麦芽抽提物10g，可溶性淀粉4g，CoCl₂·6H₂O 5mg，加水至1L，pH 7.2-7.4)中，28-30℃，振荡培养约36-40小时，4000rpm离心10分钟收集菌体。向收集的菌丝中加入10ml裂解液(Tris-Cl 25mM，EDTA25mM，pH8.0，含溶菌酶4mg/ml，0.05mg/mlRNA酶)，涡旋均匀，37℃温浴0.5-1小时，加入至终浓度0.5-1mg/ml的蛋白酶和1％SDS，混匀，放入50℃水浴约2小时，待溶液澄清。置于冰上冷却，加入1/10体积的3MKAc，冰上冷却。加入等体积的中性饱和酚，轻柔混匀，4000rpm离心15分钟，然后用剪过的大口径枪头吸取上清到新的离心管中，用同样的方法用酚反复处理3次，然后用氯仿洗两次，4000rpm，4℃离心10分钟。用用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管，加2倍体积的乙醇，混匀沉淀DNA，12000rpm，4℃离心20分钟。用70％乙醇洗涤两次，将液体倾出，在37℃下略微烘干，加5mL TE溶解。

实施例2

台勾霉素生产菌指囊孢菌NRRL 18085基因组文库的建立：

首先通过一系列的稀释实验来确定Sau 3AI的用量，在20μl体系中，含有17μl的DNA，2μl的10x缓冲液和1μl的限制性核酸内切酶Sau 3AI，其终止反应为4μl 0.5M EDTA和合适的上样缓冲液。通过摸索确定了0.025-0.05U的酶活单位比较合适。在此基础上大量通过部分酶切得到的DNA片段略大于40kb，脱磷。SuperCosl先用Xba I从两个cos序列中间切开然后用去磷酸化酶脱磷，然后再从多克隆位点处用Bam HI切开，获得两个臂。与制备的基因组部分酶切的40kb的DNA片段连接过夜，连接体系为10μl，1.25μg去磷酸化的部分酶切的基因组DNA和0.5μg处理过的SuperCosl质粒，1μl的10xBuffer，0.3U的连接酶。从-80℃冰箱中取出包装混合物置于冰中，将包装混合物在指间迅速融化，在刚刚开始融化时加入4μl的连接产物，用枪混匀，22℃放置2小时。加入500μl SM缓冲液(5.8gNaCl，2.0gMgSO₄，50mL 1M pH 7.5Tris-HCl，5mL 2％(w/v)明胶)，再加入50μl氯仿，轻轻混匀，离心机离心5秒，出现沉淀，于4℃保存。将冻存于-80℃的菌株E.coli XL1-Blue MR涂布在LB培养基上复苏。取单克隆接种于LB培养基中(添加0.2％麦芽糖和10mM MgSO₄)，于37℃，200rpm振荡4-6个小时，等OD₆₀₀约为1时，离心(500g，10分钟)收集菌体，用一半体积的10mMMgSO₄，稀释菌体到OD₆₀₀值约为0.5。取用25μl的如上菌体和25μl的已经处理好的10倍稀释的包装液轻轻混合于室温下放置30分钟，然后加入200μl LB液体在37℃下培养1个小时，并每隔15分钟轻轻晃动。收集菌体，涂布于氨苄和卡那抗生素平板上。将长出来的单个克隆子，用牙签点种于20块含合适抗生素的LB的96孔板上，长好后，加入终浓度为20％的甘油，混合均匀，至于-80℃保存。

实施例3

从台勾霉素生产菌指囊孢菌NRRL 18085基因组文库中筛选含有台勾霉素合成的生物基因的阳性克隆子：

设计PKS的兼并引物TCM-PKS4F：5′-CTW CGT SGA GGC SCA YGG CAC SGG-3′和TCM-PKS5R：5′-CCR TGM CCS GAG AAS ACC CAS AC-3′通过PCR扩增获得一个约700bp的PCR片段，连入到T载体中，测序后将序列进行blast比对，结果表明，与已知的PKS具有高度同源性。同样采用文献报道的次级代谢产物卤化酶的兼并引物，引物Halo-B4-FW：5′-TTC CCS CGS TAC CAS ATC GGS GAG-3′和Halo-B7-RV：5′-GSG GGA TSW MCCAGW ACC ASC C-3′(Hornung et al.，2007)，从NRRL 18085的基因组DNA中扩增获得了约550bp的DNA片段。序列测定(GenBank序列号为GU292810)和Blast结果显示，该DNA片段所对应的蛋白多肽序列跟一系列的次级代谢产物的卤化酶有高度相似性。将这两个DNA片段作为筛选克隆文库的探针。

采用地高辛对DNA探针进行标记，使用Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit I试剂盒，按照说明书的要求对DNA探针进行标记。即将DNA片段进行DIG-DNA标记，37℃反应4-20小时。反应完成后，将其让入到65℃水浴锅内10分钟。然后取出8μl在沸水中煮沸5分钟，立即放入到冰上备用。

准备好合适尺寸的含有卡那和氨苄抗生素的LB平板，上面覆盖有合适尺寸的尼龙膜，小心覆盖其上，避免产生气泡，并用B4铅笔做好标记。将保存于96孔板上的克隆子，用48孔接种针点种于尼龙膜上，并做好标记记住顺序。将20个96孔板上的菌落全部接种在尼龙膜上，然后连同平板一起放入到37℃温箱中过夜培养。用变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)将滤纸全部侵湿，放在玻璃板上，把长有菌落的尼龙膜放在滤纸上(长有菌落的一面向上)，15分钟后拿下来放在干净的滤纸上把变性液尽量吸干；用中和液(1.5M NaCl，1M Tris-Cl，pH 7.4)将滤纸全部侵湿，放在玻璃板上，把刚才的尼龙膜放在滤纸上，15分钟后拿下来放在干净的滤纸上把液体尽量吸干；用2xSSC(0.3M NaCl，30mM柠檬酸钠，pH 7.0)将两张滤纸全部侵湿，把尼龙膜放在滤纸上10分钟后拿下来放在干净的滤纸上；用杂交交联仪处理尼龙膜让DNA交联在膜上，参数为120mJ/cm，5分钟；用终浓度约0.6mg/ml的蛋白酶K浸泡在37℃2个小时，每隔半个小时摇晃一下；反应完后将尼龙膜拿出，放在一张水浸湿的滤纸上，然后上面覆一张同样的滤纸上，用刮铲在上面刮，使尼龙膜上的菌的碎片段松动，最后用2xSSC清洗膜，并将膜至于这种溶液中，4℃保存。

将尼龙膜至于杂交桶内，按照说明书加入60ml的DIGEasy Hyb进行预杂交，4个小时，其目的是让鱼精DNA将膜封闭，温度是54℃。预杂交完后，倒出预杂交液，放入15ml的DIGEasy Hyb(含有25ng/ml的预备探针)，在54℃下进行过夜杂交。

将杂交膜取出，用2xSSC(含0.1％SDS)洗膜两次，每次浸泡15分钟，洗完后放在干净的滤纸上。然后再用预热到68℃的同样液体在68℃洗膜15分钟，两次。室温下用清洗缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl，0.3％吐温20，pH 7.5)洗膜5分钟，并轻轻摇晃。然后用Blocking Buffer(即10xBlocking Buffer用马来酸缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH 7.5)稀释而成)将膜浸泡30分钟，然后倒出液体换成Blocking Buffer(含有1∶10000的抗体溶液)，使膜浸泡30分钟。接着取出膜用清洗缓冲液洗两次，每次15分钟，除去没有结合的抗体。将膜放入到检测缓冲液(0.1M Tris-Cl，0.1M NaCl，pH9.5)中5分钟，然后用显色液(1ml的NBT/BCIP稀释到50ml检测缓冲液中)，刚刚覆盖在膜上即可，放在暗室中5-6小时后观察。有结果后，拍照记下阳性克隆子的位置。

进行第二轮杂交前，需要对尼龙膜进行脱色处理：将膜置于50-60℃预热的N，N-二甲基甲酰胺中浸泡，反复处理直至蓝色的斑点被洗净。然后将膜过一遍水后放入到0.2M NaOH和0.1％SDS溶液中，两次，每次20分钟。然后再用2xSSC清洗两次，最后浸泡到2xSSC中4℃保存。

实施例4

台勾霉素产生菌指囊孢菌NRRL 18085遗传转移系统的建立及基因中断突变菌株的获得：

tiaM-卤化酶基因敲除突变菌株(TCM50)的获得

利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的台勾霉素合成基因簇序列，参照文献报道的PCR-targeting系统，设计一对tiaM基因的敲除引物，引物序列见于表2中的tiaM敲除引物。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒然后转入到结合转移的供体菌中。具体步骤如下：(1)将cosmid质粒pCSG5转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/pCSG5，用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，接着回收约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用50PTs和50PTa引物通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μl的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μl，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO 2.5μl，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水至50μl。PCR反应条件为：预变性94℃ 5min；扩增循环为94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，用LB筛选平板(含100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素，50μg/ml阿泊拉霉素)上于37℃过夜培养，从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，命名为pCSG50，该质粒中的tiaM基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒pCSG50电转到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG50，作为接合转移的供体菌。

野生型指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.Hamdenensis NRRL 18085菌株在50ml YMS液体培养基中培养3天，4000r/min离心10min收集菌体，弃上清，用同样的培养基清洗菌丝体3遍，悬浮于4ml YMS培养基中，作为接合转移的受体菌。供体菌E.coliET12567/pUZ8002/pCSG50在50ml含50μg/ml卡那霉素，25μg/ml氯霉素和50μg/ml阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD₆₀₀值约为0.8时，离心收集菌体(4000r/min，10min)，用LB清洗菌体3遍，悬浮于300μl LB培养基中，作为接合转移的供体菌。将上述受体菌和供体菌各取100μl混合均匀涂布于不含任何抗生素的2CMY固体培养基上，吹干后，于30℃培养16h。然后将平板取出后用3ml无菌水覆盖，用灭菌涂棒轻刮平板表面，吸出刮掉的含菌液体。清洗完毕后，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为35μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于30℃培养箱中，培养7天后观察。

当接合转移平板上长出小菌落后，用针头将其转接到含有35μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml甲氧苄氨嘧啶的YMS丰富培养基平板上，30℃培养3天后，将单个突变菌株分别接种到含同样抗生素的2.5ml YMS液体培养基中，于30℃培养5天。抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物，引物序列见于表3中的tiaM的检测引物序列，通过PCR检测获得阳性克隆，即获得tiaM-卤化酶基因敲除突变菌株(TCM50)。

其他各个基因的灭活引物和检测引物参见表2和表3，参照上述方法，利用PCR-targeting技术获得各个基因敲除的突变菌株。

具体如下：

敲除了tiaS1-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得突变株TCM51；敲除了tiaS6-O乙酰转移酶基因，获得突变株TCM53；敲除了tiaP2-P450基因，获得突变株TCM54；敲除了tiaS2-C甲基转移酶基因，获得突变株发酵TCM55；敲除了tiaR1-Lux家族的调控基因，获得突变株TCM56；敲除了tiaG1-糖基转移酶基因，获得突变株TCM57；敲除了tiaG2-糖基转移酶基因，获得突变株TCM64；敲除了tiaF-ACP合成酶基因，获得突变株TCM62；敲除了tiaP1-P450基因，获得突变株TCM69；敲除了tiaB-可重复利用聚酮合成酶基因，获得突变株TCM63；敲除了tiaS3-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得突变株TCM52；敲除了tiaS4-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得突变株TCM65；敲除了orf(-1)-转座酶基因，获得突变株TCM58；敲除了tiaC-Alpha支链酮酸脱氢酶E1α组分基因，获得突变株TCM59；敲除了tiaD-Alpha支链酮酸脱氢酶E1β组分基因，获得突变株TCM60；敲除了tiaE-II型硫酯酶基因，获得突变株TCM61；敲除了tiaJ-3-羟酰辅酶A脱氢酶基因，获得突变株TCM66；敲除了tiaK-Crotonyl辅酶A脱羧酶/还原酶基因，获得突变株TCM67；敲除了tiaL-丙酰辅酶A脱羧酶基因，获得突变株TCM68；敲除了tiaS5-氧甲基转移酶基因，获得突变株TCM70；敲除了tiaN-烯醇酰辅酶A脱水酶/异构酶基因，获得突变株TCM71；敲除了tiaR2-ArsR家族转录调控子编码基因，获得突变株TCM72；敲除了orf1-短链脱氢辅基因，获得突变株TCM73；敲除了tiaT2-Na/H膜转运蛋白编码基因，获得突变株TCM74；敲除了tiaT4-ABC膜转运蛋白编码基因，获得突变株TCM76；敲除了tiaA1-聚酮合成酶编码基因，获得突变株TCM77。

实施例5

台勾霉素及其衍生物的生物发酵与检测：

将指孢囊菌NRRL 18085野生菌或突变株活化后，按5％的接种量分别接入到250ml三角瓶的50ml发酵培养基(葡萄糖20g，鱼粉10g，酵母抽提物2.5g，酸水解酪蛋白2.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.3g，CaCO₃ 3g，5％大孔树脂XAD-16，加水至1L，pH 7.0)中，于28℃培养6-10天后，离心收集大孔树脂，用数倍体积的乙醇萃取大孔树脂，然后将乙醇抽提物蒸干后再用乙酸乙酯萃取，萃取液用旋转蒸发仪将乙酸乙酯蒸干，残留物溶解于二甲基亚砜(DMSO)形成样品，进行高效液相色谱(HPLC)检测，检测条件为：Phenomex C18 4.6×150mm反相柱，流动相A相为10％乙腈，含0.08％三氟乙酸(TFA)，流动相B相为90％乙腈；流速为1ml/min，检测波长为250nm。HPLC程序：0-20min，5％-100％B相；20-21min，100％B相；21-22min，100％-5％B相，22-30min为5％B。

实施例6，

台勾霉素生物合成基因簇的应用-对生物合成基因的遗传修饰获得结构类似物：

通过实施例4和实施例5中所描述的方法，对台勾霉素合成基因簇中的一系列基因进行了敲除获得了一系列的化合物，并进行了结构鉴定，结果如下：(0)野生型菌株指孢囊菌NRRL18085经发酵获得了台勾霉素B(TCM B)；(1)敲除了tiaM-卤化酶基因，获得的突变株发酵TCM50产生了化合物1；(2)敲除了tiaS1-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得的突变株TCM51发酵产生了化合物2，3，4，5；(3)敲除了tiaS6-O乙酰转移酶基因，获得的突变株TCM53发酵产生了化合物4，5，6，7；(4)敲除了tiaP2-P450基因，获得的突变株TCM54发酵产生了化合物8，9，10，11；(5)敲除了tiaS2-C甲基转移酶基因，获得的突变株发酵TCM55产生了化合物2，3，4；(6)敲除了tiaR1-Lux家族的调控基因，获得的突变株TCM56失去了产生tiacumicinB的能力；(7)敲除了tiaG1-糖基转移酶基因，获得的突变株TCM57发酵产生了化合物3，4，5，6，12；(8)敲除了tiaG2-糖基转移酶基因，获得的突变株TCM64发酵产生了化合物13，14，15，16；(9)敲除了tiaF-ACP合成酶基因，获得的突变株TCM62发酵产生了化合物13，14，15，16；(10)敲除了tiaP1-P450基因，获得的突变株TCM69发酵产生了化合物17；(11)敲除了tiaB-可重复利用聚酮合成酶基因，获得的突变株TCM63发酵产生了化合物4、13，14，15，16；(12)敲除了tiaS3-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得的突变株TCM52发酵仍旧生产台勾霉素B；(13)敲除了tiaS4-GDP甘露糖4，6-脱水酶基因，获得的突变株TCM65发酵生产台勾霉素B和化合物4；(14)敲除了orf(-1)-转座酶基因，获得的突变株TCM58发酵仍旧生产台勾霉素B；(15)敲除了tiaC-Alpha支链酮酸脱氢酶E1α组分基因，获得的突变株TCM59发酵仍旧生产台勾霉素B；(16)敲除了tiaD-Alpha支链酮酸脱氢酶E1β组分基因，获得的突变株TCM60发酵仍旧生产台勾霉素B；(17)敲除了tiaE-II型硫酯酶基因，获得的突变株TCM61发酵仍旧生产台勾霉素B，同时产生了化合物13，14，15，16；(18)敲除了tiaJ-3-羟酰辅酶A脱氢酶基因，获得的突变株TCM66发酵仍旧生产台勾霉素B；(19)敲除了tiaK-Crotonyl辅酶A脱羧酶/还原酶基因，获得的突变株TCM67发酵仍旧生产台勾霉素B；(20)敲除了tiaL-丙酰辅酶A脱羧酶基因，获得的突变株TCM68发酵仍旧生产台勾霉素B；(21)敲除了tiaS5-氧甲基转移酶基因，获得的突变株TCM70发酵产生了化合物18-29；(22)敲除了tiaN-烯醇酰辅酶A脱水酶/异构酶基因，获得的突变株TCM71发酵仍旧生产台勾霉素B；(23)敲除了tiaR2-ArsR家族转录调控子编码基因，获得的突变株TCM72发酵仍旧生产台勾霉素B，产量略有提高；(24)敲除了orf1-短链脱氢辅基因，获得的突变株TCM73发酵仍旧生产台勾霉素B；(25)敲除了tiaT2-Na/H膜转运蛋白编码基因，获得的突变株TCM74发酵仍旧生产台勾霉素B；(26)敲除了tiaT4-ABC膜转运蛋白编码基因，获得的突变株TCM76发酵仍旧生产台勾霉素B；(27)敲除了tiaA1-聚酮合成酶编码基因，获得的突变株TCM77失去生产台勾霉素B及其类似物的能力。

实施例7，

卤化酶TiaM的生化反应及其在获得台勾霉素结构类似物中的应用：

应用PCR方法从指孢囊菌NRRL 18085的基因组中扩增获取了tiaM基因，采用高保真酶Pyrobest和引物对为5’-GGACCATATGCCAAAGGTAATCGTC-3’(NdeI)，5’-CATGAATTCTCCTCAAGGTGGGGA-3’(EcoRI)。黄素腺嘌呤二核苷酸还原酶基因ssuE也利用高保真酶Pyrobest和引物对5’-GGAGAGCATATGCGTGTCATCACCCTG-3’(NdeI)和5’-CAGGAATTCTTACGCATGGGC ATTAC-3’(EcoRI)，从大肠杆菌BL21(DE3)的基因组中PCR扩增获得。二者分别连入表达载体pET28a，形成表达质粒pCSG99(tiaM)和pCSG117(ssuE)。含有pCSG99或者pCSG117质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀为0.7左右，然后加入终浓度为0.1mM的异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，继续在20-25℃培养4-5小时诱导蛋白表达。所获取的细胞重悬于缓冲液(300mMNaCl，50mM磷酸盐缓冲液，10mM咪唑，pH 7.4)中，利用超声波破碎法释放内容物。重组TiaM和SsuE的分离纯化利用快速蛋白质液相色谱层析法完成，纯化后的蛋白，其电泳图如图7B所示。具体而言，细胞破碎后的上清液加入到1ml规格的HisTrap柱中，然后用10-500mM的咪唑溶液洗脱。纯化后的蛋白通过PD-10柱脱盐，于-80℃保存在含有1mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM磷酸钠盐缓冲液中。100μL的TiaM的反应液一般包括26μM化合物1，0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，4mM NADH，100mM NaCl，2.9μM TiaM和0.22μM SsuE，缓冲液为50mM磷酸缓冲液，在30℃培养2小时。反应液用3倍体积的乙酸乙酯萃取抽干后，残留物溶解于甲醇并利用高压液相分析。结果表明，如图7A所示，TiaM可以先将化合物1在芳香环的4″′位氯化成化合物30，紧接着在化合物30在芳香环的6″′位发生二次氯化，形成台勾霉素B。而在反应体系中缺少TiaM的反应液一般包括26μM化合物1，0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，4mMNADH，100mMNaCl，2.9μM TiaM和0.22μM SsuE，化合物30通过扩大反应体积至450ml后纯化而得，其结构经过了核磁共振鉴定。高压液相分析表明，TiaM可以将化合物1溴化获得化合物31和32，同时可以将化合物30溴化获得化合物33。