CN103160521A

CN103160521A - arylomycins A生物合成基因簇

Info

Publication number: CN103160521A
Application number: CN2011104222017A
Authority: CN
Inventors: 靳旭; 饶敏; 魏维; 戈梅; 朱丽; 陈玲玲; 万明玉
Original assignee: Shanghai Laiyi Biomedical Research And Development Center LLC; Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Laiyi Biomedical Research And Development Center LLC; Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-06-19

Abstract

本发明公开了由Streptomyces parvus CGMCC No.4027菌株产生的具有抗菌活性的抗生素--arylomycins A的生物合成基因簇。整个基因簇共包含8个基因：3个NRPS基因(aryA、aryB、aryD)；1个后修饰基因(aryC)；3个前体合成基因(aryF、aryG、aryH)以及1个MbtH基因(aryE)。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断arylomycin A2和arylomycinA4的合成。本发明所提供的基因也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Description

arylomycins A生物合成基因簇

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体地说，是关于抗生素arylomycins A的生物合成基因簇。

背景技术

随着致病菌耐药性问题的日益严峻，临床上对新抗生素的需求也显得更为迫切。为了应对这一局面，人们一方面对已有抗生素进行改造，另一方面也加快了新型抗生素筛选的步伐。Alexandra

等在2002年从Streptomyces sp.Tü6075分离得到了两组脂肽类化合物arylomycins，包括arylomycins A和arylomycins B(Schimana，Gebhardt et al.2002)。它们都属于六肽化合物，含有相同肽链(D-Me-Ser-D-Ala-Gly-L-Me-Hpg-L-Ala-L-Tyr)，不同的是，arylomycins B中的Tyr含有-NO₂取代基。最近，我们从Streptomyces parvus CGMCC No.4027的发酵液中分离到了arylomycin A2和arylomycin A4，结构如图1所示。

2004年，Mark Paetzel等获得了arylomycin A2与Escherichia coli I型信号肽酶结合复合物

分辨率的晶体结构，研究发现arylomycin A2的C端可与信号肽酶催化活性中心的Ser和Lys残基侧链形成氢键，同时arylomycin A2形成β-折叠结构模拟信号肽酶底物的结合(Paetzel，Goodall et al.2004)。I型信号肽酶(SPase I，EC 3.4.21.89)是一种广泛存在于真细菌细胞膜中的丝氨酸蛋白酶，负责将前蛋白N-端的信号肽切除，对细菌的生存和生长至关重要。SPase I被抑制后，会造成分泌蛋白在细胞膜上的大量积累并最终导致细菌死亡(Dalbey and Wickner 1985)。一直以来，病原菌蛋白酶抑制剂被认为药物发展的一个方向，但是对人体的毒害性降低了这些抑制剂最终成药的可能性。区别于经典的Ser/His/Asp催化机制，SPase I利用独特的Ser/Lys催化二元体机制，这就意味着SPase I抑制剂有着更高的特异性，对真核细胞有着更低的毒性。同时，由于催化活性中心位于细胞膜外侧，I型信号肽酶被认为是一种很有潜力的抗生素筛选靶标。虽然已经得到了arylomycin A2与Escherichia coli SPase I结合复合物的晶体结构，但在最初生物活性研究中，arylomycins只对Streptococcuspneumonia、Staphylococcus epidermidis及土壤微生物Rhodococcus opacus、Brevibacillus brevis有抗菌活性，而对大多的病原菌如Staphylococcus aureus、Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa没有活性，这大大限制了其成为药物的可能性。但2010年有研究发现，Staphylococcus aureus、Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa之所以对arylomycins表现出耐药性，是由于这些病原菌的SPase I催化活性中心的Ser突变为Pro从而导致两者的亲和力降低。通过对自然界中厚壁菌门、放线菌们、变形菌门、拟杆菌门及疣微菌门衣原体属中SPase I相应位置Pro突变的分布研究表明，很多自然界中的细菌不存在Pro突变而对arylomycins表现为敏感，如革兰氏阳性边病原菌Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、S.haemolyticus 及革兰氏阴性病原菌Chlamydia trachomatis等(Smith，Roberts et al.2010)。因此arylomycins作为广谱性抗生素有着广阔的应用前景。

除了加工与生存及生长相关蛋白，I型信号肽酶与其它生命活动如细菌耐药性、细菌毒素的分泌等，也有着密切关系。例如，一些病原菌由于能分泌β-内酰胺酶而对β-内酰胺类抗生素产生耐药性，而研究表明arylomycins类似物lipoglycopeptides能抑制S.aureus β-内酰胺酶的分泌(Kulanthaivel，Kreuzman et al.2004)。因此除了直接作为抗生素使用，arylomycins还能够调节细菌毒性或者使得病原菌变得对其它抗生素敏感，这将大大扩大arylomycins应用范围(Roberts，Smith et al.2007)。

迄今为止，还没有arylomycins生物合成基因簇相关研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供由Streptomyces parvus CGMCC No.4027菌株产生的具有抗菌活性的抗生素--arylomycins A的生物合成基因簇。

根据本发明，抗生素arylomycins A的生物合成基因簇包含8个基因：

aryA编码非核糖体肽合成酶NRPS；

aryB编码非核糖体肽合成酶NRPS；

aryC编码P450酶；

aryD编码非核糖体肽合成酶NRPS；

aryE编码MbtH家族蛋白；

aryF编码羟基扁桃酸合酶Hmas；

aryG编码羟基扁桃酸氧化酶Hmo；

aryH编码羟基苯甘氨酸氨基转移酶HpgT。

根据本发明，所述基因aryA位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第3739-5493个碱基处，长度为1755个碱基对，编码584个氨基酸。

根据本发明，所述基因aryB位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第5481-15938个碱基处，长度为10458个碱基对，编码3485个氨基酸。

根据本发明，所述基因aryC位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第16567-17736个碱基处，长度为1170个碱基对，编码389个氨基酸。

根据本发明，所述基因aryD位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第17795-30688个碱基处，长度为12894个碱基对，编码4297个氨基酸。

根据本发明，所述基因aryE位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第30714-30935个碱基处，长度为222个碱基对，编码73个氨基酸。

根据本发明，所述基因aryF位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第30983-32047个碱基处，长度为1065个碱基对，编码354个氨基酸。

根据本发明，所述基因aryG位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第32044-33159个碱基处，长度为1116个碱基对，编码371个氨基酸。

根据本发明，所述基因aryH位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第33152-34501个碱基处，长度为1350个碱基对，编码449个氨基酸。

根据本发明，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明所提供的包含arylomycins A生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解arylomycins类天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

附图说明

图1为arylomycin A2及arylomycin A4的化学结构示意图。

图2为本发明的arylomycins A生物合成基因簇结构示意图。

图3为原始菌株及各突变株发酵液HPLC分析结果图。其中，I为原始菌株，II为orf-1敲除突变株，III为orf1敲除突变株，IV为orf2敲除突变株，V为aryA敲除突变株，VI为aryB敲除突变株，VII为aryC敲除突变株，VIII为aryD敲除突变株。

图4为arylomycins A中非天然氨基酸HPG的生物合成途径示意图。

图5为原始菌株、突变株及HPG补料后各菌株发酵液HPLC分析结果图。其中， I为原始菌株，II为aryF敲除突变株，III为aryG敲除突变株，IV为aryH敲除突变株，V为aryF敲除突变株HPG补料，VI为aryG敲除突变株HPG补料，VII为aryH敲除突变株HPG补料。

图6为arylomycin A2和arylomycin A4的生物合成过程示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。

本发明所用的菌种为Streptomycesparvus，于2010年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.4027。

本发明中所涉及的分子生物学操作参照Practical Streptomyces Genetics(Norwich：John Innes Foundation，2000)和《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory，2001)等进行。

实施例1、arylomycins生物合成基因簇的克隆

1.1、Streptomyces parvus CGMCC No.4027总DNA提取

将新鲜S.parvus CGMCC No.4027斜面孢子接种到3ml TSB培养基中，28℃，220rpm振荡培养30h。取2ml至2ml离心管中，12000rpm离心10min，用无菌水洗涤一次，菌丝体重悬于250μl SET，并加入溶菌酶至终浓度4mg/ml，37℃水浴40～60min。加入50μl 10％SDS和2.5μl 10mg/ml蛋白酶K，于55℃水浴2h，期间不断震荡。然后加入200μl 5mol/LNaCl和500μl氯仿，混匀，室温放置30min，12000rpm离心15min。取上清，加入1ml异丙醇，12000rpm离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤一次并抽干，加入100μl TE缓冲溶液于-20℃保存。

1.2、arylomycins生物合成基因簇的克隆

微生物代谢具有多样性，随着越来越多次级代谢产物生物合成基因簇的获得，发现不同的微生物的基因组中也会含有相同化合物的合成基因簇。如A21978C产生菌Streptomyces roseosporus NRRL 15998虽然没有报道其能够产生核苷肽类抗生素，但在其基因组中发现了类似负责Pacidamycin生物合成的基因簇(Zhang，Ostash et al.2010)。

已知Streptomycesparvus CGMCC No.4027也能够产生A21978C系列物质，另外还发现其可以产生arylomycins类代谢产物。在对已经公开的A21978C产生菌Streptomyces roseosporus NRRL15998的基因组进行分析的过程中，发现基因 SSGG_05586-SSGG_05590编码非核糖体肽合成酶(NRPS)，其中模块组成、异构化(E)结构域及甲基化(M)结构域与arylomycins结构中肽链组成对应，因此其可能与arylomycins基因簇类似。根据SSGG_05586-SSGG_05590上下游序列，利用Vector NTI软件设计引物，以1.1中制备的S.parvus CGMCC No.4027染色体为模板逐段PCR。

PCR反应体系(50μl)包括PrimerSTAR HS DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、2×GC缓冲液25μl、dNTP(浓度各为2.5mM)4μl、引物(20mM)各0.5μl、Streptomyces parvus CGMCC No.4027总DNA 1μl、dH₂O 18.5μl。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，58～68℃复性30s，72℃延伸2.5min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

低熔点胶回收预期大小DNA片段，与pMD18-T simple Vector连接，转化E.coli DH5α，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养。挑取单菌落过夜培养，抽提质粒，根据大小将可能含有预期大小DNA片段的质粒测序。

引物序列及PCR产物大小如表1所示。最终将所得16个片段拼接起来，所得序列总长为39503bp，GC含量为71.9％。核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

表1、引物序列及PCR产物大小

实施例2、arylomycins生物合成基因簇功能分析

通过生物信息学分析，所得序列共包含17个开放阅读框，如图2所示。包含3个功能未知基因(orf-1、orf-2、orf-3)，3个NRPS基因(aryA、aryB、aryD)，1个后修饰基因(aryC)，3个前体合成基因(aryF、aryG、aryH)，1个MbtH基因(aryE)，2个ABC转运相关基因(orf1、orf2)，3个与细菌外被膜形成相关基因(orf3、orf4、orf5)，详细分析结果如表2所示。

表2、arylomycins生物合成基因簇生物信息学分析

实施例3、arylomycins A生物合成基因簇边界确定

3.1、S.parvus CGMCC No.4027遗传转移系统的建立

将含有待接合转移质粒的E.coli ET1256737℃过夜培养，取200μl菌液至装有20ml LB培养基的250ml三角瓶中，37℃培养3～4h至OD₆₀₀达到0.5左右。然后将菌液转移至50ml离心管中4000rpm离心5min收集菌体，并用等体积的新鲜LB洗涤两次，然后重悬于2ml LB中，作为大肠杆菌供体细胞。取-70℃保存的S.parvus CGMCC No.4027孢子悬液一管8000rpm离心2min，去上清，用1ml的2×YT培养基洗涤两次，重悬于500μl 2×YT培养基中，50℃水浴10min。待冷却后加入500μl大肠杆菌供体细胞，混匀，涂布于含有10mM MgCl₂的MS平板上，28℃培养16～20h。在平板表面覆盖1ml无菌水(含0.5mg/ml萘啶酮酸和1mg/ml安普霉素)，用涂布棒涂匀并吹干，28℃培养3～4天。挑取接合子进行筛选验证。

3.2、基因orf-1缺失突变株的构建

设计引物orf-1_u-F(5’-aagcttgacacgttgcccggcaagag-3’)、orf-1_u-R(5’-ctgcagaccccgtcggcaacttcgtc-3’)，和引物orf-1_d-F(5’-ctgcagcgaagctcaaggaatccgac-3’)、orf-1_d-R(5’-gaattcagctgacgcagacgctgac-3’)分别PCR扩增orf-1的上、下游片段orf-1_u、orf-1_d。PCR产物回收后分别与pMD18-T载体连接，转化E.coli DH5α提取质粒并测序验证。然后pMD18-T-orf-1_u质粒经HindIII和Pst I酶切，回收orf-1_u片段；pMD18-T-orf-1_d质粒用Pst I和EcoR I酶切，回收orf-1_d片段；orf-1_u、orf-1_d与经过HindIII和EcoR I酶切的pKC1139连接得到重组质粒pKC1139-orf-1_u-orf-1_d。重组质粒转化E.coli ET12567后按3.1中所述接合转移方法导入S.parvus CGMCC No.4027。

挑取接合子至含50μg/ml安普霉素的MS平板37℃培养2～3天。然后挑取单菌落接种于液体TSB培养基，28℃培养三代。菌液适当稀释后涂布于MS平板，挑选对安普霉素敏感的单菌落，利用引物orf-1-F(5’-ccttccgcgagatcttcgatcttc-3’)、orf-1-R(5’-gattccttgagcttcgccgcag-3’)进行PCR验证。

3.3、基因orf1和orf2缺失突变株构建

基因orf1和orf2缺失突变株的构建方法与3.2中orf-1缺失突变株的构建方法相同，只是所用引物不同，具体情况如表3所示。

表3、基因orf1和orf2缺失突变株构建和验证引物

3.4、S.parvus CGMCC No.4027及相关突变株液体发酵及HPLC分析

3.4.1、液体发酵

将S.parvus CGMCC No.4027及相关突变株的新鲜斜面孢子(高氏一号斜面培养基)接种于种子培养基(葡萄糖1％，糊精4％，黄豆饼粉2％，磷酸二氢钾0.02％，氯化钠0.25％，pH 7.3～7.5)，28℃，220rpm振荡培养44h。然后以8％接种量转入液体发酵培养基(黄豆饼粉2.2％，糊精3.6％，葡萄糖0.8％，磷酸二氢钾0.02％，pH 7.3～7.5)，28℃，220rpm振荡培养5天。

3.4.2、发酵液处理

取800μl 3.4.1中获得的发酵液，然后加入等体积的无水甲醇，混匀，4℃放置30min，12000rpm离心15min。取上清进行HPLC分析。

3.4.3、HPLC分析

对3.4.2中获得的发酵液进行HPLC分析，具体条件如下：

流动相：A相：乙腈-缓冲液(10∶90)

B相：乙腈-缓冲液(45∶55)

缓冲液：0.5％(NH₄)H₂PO₄

分析用柱：Hypersil C18，4.6×250mm，5μm

柱温：30℃

检测波长：223nm

流速：1.5mL/min

梯度条件如表所示：

时间(min)	0	15	17
				A％	25	0	0
B％	75	100	100

3.5、arylomycins A生物合成基因簇边界确定

根据基因编码的蛋白功能分析，arylomycins A生物合成基因簇左侧边界研究集中在aryA基因上游，orf-1、orf-2、orf-3编码3个未知功能蛋白，和原始菌株相比(图3I)，对orf-1基因的敲除不影响arylomycins合成(图3II)，表明其与arylomycins生物合成无关。arylomycins的生物合成基因簇右侧边界研究集中在aryH下游，orf1、orf2分别编码ABC转运ATP结合蛋白、ABC转运透性酶，orf1、orf2敲除后，影响到其它化合物的合成，其中orf1突变株很多化合物不能合成(图3III)，而orf2突变株很多化合物的产量降低(图3IV)，同时突变株的色素产量提高，产孢能力减弱。因此orf1、orf2两个基因并非仅仅与arylomycins相关，排除在基因簇之外。orf3、orf4、orf5三个基因分别编码分泌蛋白、聚γ谷氨酸合成蛋白PgsC、荚膜合成蛋白CapB，它们与细菌外被膜的形成有关，而与arylomycins合成无关。因此，最终将arylomycins A生物合成基因簇确定为aryA-aryH，共8个开放阅读框。

实施例4、arylomycins A生物合成基因簇中功能基因的鉴定

arylomycins A生物合成基因簇包含aryA-aryH共8个基因，其中3个NRPS基因(aryA、aryB、aryD)分别编码非核糖体肽合酶NRPS，负责arylomycins中非核糖体合成六肽(D-Me-Ser-D-Ala-Gly-L-Me-Hpg-L-Ala-L-Tyr)的合成；3个前体合成基因(aryF、aryG、aryH)分别编码羟基扁桃酸合酶Hmas、羟基扁桃酸氧化酶Hmo、羟基苯甘氨酸氨基转移酶HpgT，负责非天然氨基酸对羟基苯甘氨酸(HPG)的合成；1个后修饰基因(aryC)编码P450酶，负责甲基HPG与Tyr酪氨酸之间联芳键的合成。

另外，基因簇中还有1个编码MbtH家族蛋白基因(aryE)，MbtH家族蛋白通常与NRPS连锁，具有反式互补特性，其中一个MbtH敲除后会被基因组其它位置编码的相应蛋白互补。Felnagle E.A等研究表明MbtH蛋白可能影响氨基酸的活化，是NRPS的构成部分(Felnagle，Barkei et al.2010)。为了确定除了aryE以外的aryA-aryD和aryF-aryG确实负责arylomycins A的生物合成，按照3.2中所述的方法构建基因aryA、aryB、aryC、aryD、aryF、aryG、aryH缺失突变株，引物如表4所示。

表4、基因aryA-aryD和aryF-aryH缺失突变株构建和验证引物

按照3.4中所述的方法检测野生菌株和各缺失突变株的发酵产物，发现当aryA(图3V)、aryB(图3VI)、aryC(图3VII)、aryD(图3VIII)、aryF(图5II)、aryG(图5III)、aryH(图5IV)基因阻断后影响到菌株arylomycin A2和arylomycin A4的产生，进一步证明得到的基因簇为arylomycins A生物合成基因簇。

实施例5、Arylomycins A中非天然氨基酸HPG的生物合成

在arylomycins A生物合成基因簇中，aryF、aryG、aryH分别编码羟基扁桃酸合酶(Hmas)、羟基扁桃酸氧化酶(Hmo)、羟基苯甘氨酸氨基转移酶(HpgT)。arylomycin中HPG的生物合成途径如图4所示。4-羟基丙酮酸在Hmas的作用下氧化脱羧产生4-羟基扁桃酸，4-羟基扁桃酸被Hmo氧化生成4羟基苯乙醛酸，然后通过HpgT转氨作用生成对羟基苯甘氨酸。

aryF、aryG、aryH基因敲除后，菌株不能产生arylomycin A2和arylomycin A4。当在发酵液中外源添加HPG时，aryF(图5V)、aryG(图5VI)、aryH(图5VII)基因突变菌株恢复产生arylomycin A2和arylomycin A4，进一步证明了aryF、aryG、aryH编码蛋白AryF、AryG、AryH负责非天然氨基酸HPG的生物合成。

实施例6、arylomycins A骨架合成及后修饰反应

在arylomycins A生物合成基因簇中有三个基因(ayrA、aryB、aryD)负责编码arylomycins骨架组装相关的非核糖体肽合成酶NRPS(AryA、AryB、AryD)，NRPS由多模块组成，模块的特异性结构域具有特定的活性。AryA含有1个结构域(C)；AryB含有两个模块M1(C-A-M-T-E)和M2(C-A-T-E)，共9个结构域；AryD含有4个模块M3*(A-T)、M4(C-A-M-T)、M5(C-A-T)和M6(C-A-T-Te)，共13个结构域；其中AryA编码的C结构域与M3*(A-T)相互作用够成一个完整的模块M3(C-A-T)。模块M1-M6中的A结构域分别负责Ser、Ala、Gly、Hpg、Ala、Tyr的腺苷酰化激活和装载，模块M1和M4中的M结构域负责Ser和Hpg的N-甲基化修饰，模块M1和M2中的E结构域分别负责Ser、Ala的异构化。M1为起始模块，其中的C结构域将活化的脂肪酸链与第一个氨基酸D-Me-Ser通过酰胺键连接。然后，延伸模块通过各自的C结构域与上游的酰基发生缩合组装成arylomycin A骨架，最终通过模块M6中的Te结构域将其从NRPS上分离下来。游离线性脂肽中的HPG和Tyr进一步在AryD的催化作用下形成联芳键产生完整的arylomycins化合物。整个过程如图6所示。

Claims

1.抗生素arylomycins A的生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包含8个基因：

aryA编码非核糖体肽合成酶NRPS；

aryB编码非核糖体肽合成酶NRPS；

aryC编码P450酶；

aryD编码非核糖体肽合成酶NRPS；

aryE编码MbtH家族蛋白；

aryF编码羟基扁桃酸合酶Hmas；

aryG编码羟基扁桃酸氧化酶Hmo；

aryH编码羟基苯甘氨酸氨基转移酶HpgT。

2.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryA位于SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的第3739-5493个碱基处，长度为1755个碱基对，编码584个氨基酸。

3.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryB位于SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的第5481-15938个碱基处，长度为10458个碱基对，编码3485个氨基酸。

4.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryC位于SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的第16567-17736个碱基处，长度为1170个碱基对，编码389个氨基酸。

5.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryD位于SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的第17795-30688个碱基处，长度为12894个碱基对，编码4297个氨基酸。

6.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryE位于SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的第30714-30935个碱基处，长度为222个碱基对，编码73个氨基酸。

7.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryF位于SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的第30983-32047个碱基处，长度为1065个碱基对，编码354个氨基酸。

8.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryG位于SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的第32044-33159个碱基处，长度为1116个碱基对，编码371个氨基酸。

9.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因aryH位于SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的第33152-34501个碱基处，长度为1350个碱基对，编码449个氨基酸。

10.如权利要求1所述的基因簇，其特征在于，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。