CN105039382A - 一种恩拉霉素高产菌株的构建方法及相关基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种恩拉霉素高产菌株的构建方法及相关基因和菌株；相关基因序列如序列1所示，同时提供含有如权利要求所述的恩拉霉素产量高且链霉素抗性好的基因工程菌株P1。本发明首先针对目前工业生产用恩拉霉素产生菌P建立并优化了出一套简便易行的遗传转化体系，并首次利用定点突变技术对该菌株中的核糖体蛋白(S12)编码基因rpsl进行了定点改造，同时对改造后菌株的产素水平及生理生化特性进行了研究。结果显示：工程菌Streptomyces？fungicidicus？P1的恩拉霉素产量与原始菌株相比提高了约20﹪，同时该菌株对链霉素的抗性提高了至少10倍。

Description

一种恩拉霉素高产菌株的构建方法及相关基因

技术领域

本发明属于工业微生物分子育种领域，以目前恩拉霉素生产用菌株StreptomycesfungicidicusF1为出发菌株，通过对其核糖体蛋白编码基因进行定点改造来达到提高其恩拉霉素产量的目的。

背景技术

恩拉霉素(Enramycin)又名持久霉素，是由土壤中的放线菌发酵产生的一种非核糖体多肽(NRP)类抗生素，对革兰氏阳性菌特别是禽畜肠道内有害梭状芽孢杆菌具有较强的抑制作用；饲料中添加适量的恩拉霉素不仅可以预防常见的动物消化道疾病，还可改善动物肠道内的群落平衡，有利于饲料营养成份的消化吸收，促进动物增重。同时恩拉霉素具有广谱、低毒、无残留、不易产生耐药性和交叉抗性等优点，因此是目前少数几种可用于饲料添加剂的抗生素之一。目前恩拉霉素的生产主要由抗真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidicus)发酵获得，由于该菌株发酵周期长，产素水平低，限制了恩拉霉素的大规模生产和进一步的推广应用，因此对恩拉霉素产生菌进行菌种改良以提高其产素水平及生产性能具有重要的应用价值和研究意义。

上世纪90年代，Shimg等人发现在Streptomyceslividans的核糖体蛋白S12编码基因rpls中引入某些突变位点，可激活该菌株中某些沉默基因的表达，并导致放线紫红素的过量合成。随后的大量研究表明：在其它放线菌及芽孢杆菌中的核糖体编码基因中引入特定突变均可对这些菌株中的次级代谢产生重大影响，并导致抗生素、细胞色素等次级代谢物的大量合成。核糖体编码基因的改变往往会导致核糖体结构和功能的改变，而某些核糖体结构的改变可反映为对作用于核糖体上的抗生素的抗性发生变化，因此通过筛选或构建相应的抗性突变，可获得核糖体结构和功能突变的菌株,进而获得次生代谢产物合成能力提高的菌株。因此可以这些抗性突变为筛选标记建立一种简单易行的微生物菌种育种方法，即核糖体工程。目前与核糖体工程相关的几种抗性突变主要有：链霉素抗性突变、利福平抗性突变、晚霉素抗性突变、硫链丝菌素抗性突变以及夫西地酸抗性突变等。其中链霉素抗性突变在选育抗生素高产菌株中应用最多。例如，Hosoya等在Streptomyceschattanoogensis突变株中随机筛选出50至100株链霉素抗性突变株，并对其Fredericamycin的合成能力进行了检测，结果显示约有1/2的突变菌株其抗生素合成能力明显提高，产量最高的可达野生菌株的26倍。此外，在蜡状芽胞杆菌和吡诺尼群假单胞菌的链霉素抗性突变株中出现抗生素高产突变株的比例为7﹪到30﹪，并且有枯草芽孢杆菌链霉素抗性突变株的抗生素产量比野生型菌株提高了50倍的报道。然而，目前对恩拉霉素产生菌Streptomycesfungicidicus的核糖体工程改造尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种恩拉霉素高产菌株的构建方法，和一株恩拉霉素高产工程菌。本发明的目的在于通过基因工程手段以及核糖体工程手段来提高StreptomycesfungicidicusP(StreptomycesfungicidicusATCC21013)的恩拉霉素产量,该方法是分子生物学方法的一种,通过点突变StreptomycesfungicidicusP染色体上的rpsL基因,达到提高恩拉霉素产量的目的。

本发明的目的是这样实现的：

一种针对恩拉霉素产生菌的遗传转化及分子改造方法，步骤如下：

第一步，通过引物rpsLF1和rpsLR1从杀真菌素链霉菌基因组DNA中PCR扩增rpsL基因；在rpsL基因内部设计引物rpsLF2和rpsLR2，采用反向PCR，获得rpsL两侧部分基因片段；设计引物S12F1和S12R1获得包含rpsL基因序列；

第二步，设计突变引物MrpsLF1/MrpsLR1、MrpsLF2/MrpsLR2和MrpsLF3/MrpsLR3分别与S12F1/S12R1组合进行重叠PCR，PCR产物测序，得到突变序列，构建突变序列的基因重组载体；

第三步，通过接合转移将第二步得到的重组载体转移到初始杀真菌素链霉菌中；

第四步，通过抗性筛选得到含有rpsL基因突变重组载体的杀真菌素链霉菌菌株；

第五步，通过PCR验证第四步得到的杀真菌素链霉菌菌株。

一种恩拉霉素高产且链霉素抗性好的基因，基因序列如序列1所示。

一种恩拉霉素高产且链霉素抗性好的基因的工程菌。

一种恩拉霉素高产且链霉素抗性好的工程菌，所述工程菌的出发菌株为ATCC21013，出发菌株的rpsL基因突变为如序列1所示的基因。

本发明首先针对恩拉霉素产生菌StreptomycesfungicidicusP摸索并优化出一套完整的遗传转化方法，该方法主要以含有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567为供体菌株，通过结合转移的方式将目的基因转入受体菌株StreptomycesfungicidicusP。

本研究克隆了StreptomycesfungicidicusP中核糖体蛋白S12的编码基因rpsL及其上下游序列，并通过分子生物学手段及上述遗传转化方法，对StreptomycesfungicidicusP中的rpsL基因进行了定点突变。

通过链霉素抗性筛选获得了3株改造后菌株，与原始菌株相比，其恩拉霉素产量提高了近20﹪，由于改造后菌株StreptomycesfungicidicusP-1具有良好的生产性能，因此做为本发明的保护对象。

具体实施过程如下：

一种针对恩拉霉素产生菌的遗传转化及分子改造方法，步骤如下：

第一步，通过引物rpsLF1和rpsLR1从杀真菌素链霉菌基因组DNA中PCR扩增rpsL基因；在rpsL基因内部设计引物rpsLF2和rpsLR2，采用反向PCR，获得rpsL两侧部分基因片段；设计引物S12F1和S12R1获得包含rpsL基因序列；

第二步，设计突变引物MrpsLF1/MrpsLR1、MrpsLF2/MrpsLR2和MrpsLF3/MrpsLR3分别与S12F1/S12R1组合进行重叠PCR，PCR产物测序，得到突变序列，构建突变序列的基因重组载体；

第三步，通过接合转移将第二步得到的重组载体转移到初始杀真菌素链霉菌中；

第四步，通过抗性筛选得到含有rpsL基因突变重组载体的杀真菌素链霉菌菌株；

第五步，通过PCR验证第四步得到的杀真菌素链霉菌菌株。

一种恩拉霉素高产且链霉素抗性好的基因，基因序列如序列1所示。

一种含有恩拉霉素高产且链霉素抗性好的基因的工程菌。

一种恩拉霉素高产且链霉素抗性好的工程菌，所述工程菌的出发菌株为StreptomycesfungicidicusATCC21013，出发菌株的rpsL基因突变为如序列1所示的基因。

本发明的优点和积极效果是：

本发明建立了针对StreptomycesfungicidicusP方便快捷的遗传操作方法,克服了物理化或学诱变的育目性和浩大繁琐的筛选工作，利用定点突变技术对StreptomycesfungicidicusP中的核糖体蛋白S12编码基因rpsL进行了改造,通过改变核糖体结构进而获得了恩拉霉素高产菌株。改造后菌株StreptomycesfungicidicusP-1与原始菌株相比对链霉素抗性提高了至少10倍，从而为该工程菌株提供了一个选择标记及筛选方法。

本专利首先针对恩拉霉素生产用菌株StreptomycesfungicidicusF1建立并优化出一套成熟完整的遗传操作体系，同时对该菌株中编码核糖体蛋白S12的基因rpls及其上下游序列进行了克隆和测序；然后通过定点突变技术对S12编码基因rpls进行了定点改造，并通过链霉素抗性筛选获得了多株链霉素抗性突变菌株。经改造后菌种发酵及HPLC检测，结果表明：改造后菌株StreptomycesfungicidicusM1的恩拉霉素产量与原始菌株相比提高了约20﹪，并且产素水平稳定，同时该菌株对链霉素抗性提高了10倍。因此该方法是一种行之有效的恩拉霉素高产菌株的构建及筛选方法。

附图说明

图1为利用定点突变rpsL基因提高StreptomycesfungicidicusP恩拉霉素产量的流程图；

图2为采用重叠PCR获得包含rpsL突变基因序列原理图；

图3为本发明实例中rpsL基因突变后恩拉霉素产量提高的效果图；

图4为本发明实例中用于StreptomycesfungicidicusP中rpsL基因突变的重组载体pKC1139M1；

图5为本发明实例中野生型菌株StreptomycesfungicidicusP与突变后菌株StreptomycesfungicidicusP-1中rpsL基因序列比较。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例；需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本申请了对比，在突变时设计了三套突变引物，同时产生三个突变序列，但是通过检测其产量和抗性结果，另外两种结果均较差，因此不再具体提供两外M2和M3的具体序列和引物序列。

M1序列涉及并用到的所有引物如下：

rpsLF1:gtgcctacgatccagcagct

rpsLR1:acttctccttcttggcgc

rpsLF2：gccgagttcggcttcttcg

rpsLR2：acaacctgcaggagcactcc

S12F1：ccgaattctgaacggcaaggcggtcgc

S12R1：gcaagcttgcaggtcaagtgaagtggta

MrpsLR1:accaccccgaacaagccgaa

MrpsLF1:ttcggcttgttcggggtggt

本发明属于工业微生物分子育种领域，具体涉及大肠杆菌-StreptomycesfungicidicusP(该菌种为StreptomycesfungicidicusATCC21013，其公开文件为TheenduracidinbiosyntheticgeneclusterfromStreptomycesfungicidicus，XihouYinandT.MarkZabriskie，Microbiology(2006),152,2969–2983)结合转移系统的建立，高产恩拉霉素菌株的选育，中间载体的构建和利用抗性筛选得到StreptomycesfungicidicusP-1菌株提高恩拉霉素产量的方法，rpsL突变引起次级代谢产物的过量生产是因为其引起核糖体S12蛋白结构发生改变，导致一些次级代谢产物相关基因被激活或过量表达。其中天变铅青链霉菌的rpsL突变株L90K和R94G，显著地提高了放线菌紫红素的生产。天蓝色链霉菌的rpsl突变株K88E和P91S激活在天蓝色放线紫红素和十一烷基令菌红素。本发明建立在Streptomycesfungicidicus中将rpsL基因定点改变，利用改造的菌株提高恩拉霉素的产量。

本发明提供的提高Streptomycesfungicidicus恩拉霉素产量的方法如图1所示,操作思路如下：

首先，通过引物rpsLF1和rpsLR1从StreptomycesfungicidicusP基因组DNA中PCR扩增rpsL基因；在rpsL基因内部设计引物rpsLF2和rpsLR2，采用反向PCR，获得rpsL两侧部分基因片段；设计引物S12F1和S12R1获得包含rpsL基因序列。

第二步，设计突变引物MrpsLF1/MrpsLR1、MrpsLF2/MrpsLR2和MrpsLF3/MrpsLR3分别与S12F1/S12R1组合进行重叠PCR，PCR产物测序，得到突变序列M1、M2和M3。构建M1、M2和M3基因重组载体，在本发明的实施例中构建了三个这样的重组载体，即pKC1139M1、pKC1139M2和pKC1139M3。

第三步，通过接合转移将第二步得到的重组载体转移到StreptomycesfungicidicusP中。

第四步，通过抗性筛选得到含有rpsL基因突变重组载体的StreptomycesfungicidicusP菌株。

第五步，通过PCR验证第四步得到的StreptomycesfungicidicusP菌株。

本发明的实施例得到了三株这样的Streptomycesfungicidicus菌株，分别是P-1、P-2和P-3。

第六步，对第五步所得的Streptomycesfungicidicus菌株P-1、P-2和P-3进行发酵分析，得到恩拉霉素高产菌株。

在本实例中以下是应用到的一些培养基的组成(包含一些单项的制备方法)；

2XYT培养基：蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min。

LB培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容到1L，pH调节至7.0，121℃灭菌20min。

MS培养基(用于大肠杆菌与Streptomycesfungicidicus的结合转移)配方：甘露醇20g，大豆粉20g，琼脂粉15g，自来水1000ml，121℃，20min灭菌后备用。

MS培养基(用于大肠杆菌与Streptomycesfungicidicus的结合转移)配方：甘露醇20g，大豆粉20g，琼脂粉15g，自来水1000ml，121℃，20min灭菌后备用。

本发明利用定点突变Streptomycesfungicidicus菌株中的rpsL基因来提高恩拉霉素产量，具体操作步骤如下：

一、在StreptomycesfungicidicusP的基因组DNA中PCR克隆rpsL基因，然后通过反向PCR、重叠PCR等分子克隆方法获得包含rpsL突变的基因片段

⑴在30ml2XYT培养基中接种StreptomycesfungicidicusP，在28℃培养48h，收集菌丝体，抽提因组DNA；

⑵为了使含有突变位点的基因片段能与染色体高效交换，预想获得长度为1500bp左右的模板片段。经过生物信息分析发现rpsL基因非常保守且只有371bp大小，但两侧基因不保守，为了得到rpsL基因两侧基因，采用反向PCR获得：

首先，提取StreptomycesfungicidicusP基因组DNA，然后用BamH1酶切基因组DNA，酶切产物电泳跑胶，切胶回收1.5kb-3kb大小基因片段，回收片段进行环化自连；

其次，在保守区rpsL基因内部设计引物rpsLF2和rpsLR2进行反向PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变形5min，94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸1min30s，30循环，72℃延伸10min。PCR琼脂块凝胶电泳检测，得到1.5kb左右的带，切胶回收产物连接T载体测序。根据测序结果与rpsl部分保守区基因序列比对，确定该序列是rpsL两侧部分基因；

⑶对⑵得到的序列进行分析，以StreptomycesfungicidicusP基因组DNA为模板设计含有酶切位点引物S12F1和S12R1进行PCR。

PCR反应条件：94℃预变形5min，94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸1min30s，30循环，72℃延伸10min。经跑胶验证与理论分析片段大小相符。

同时设计突变引物MrpsLF1/MrpsLR1、MrpsLF2/MrpsLR2和MrpsLF3/MrpsLR3，利用突变引物MrpsLF1/MrpsLR1、MrpsLF2/MrpsLR2、MrpsLF3/MrpsLR3分别和引物S12F1/S12R1进行重叠PCR，将PCR产物连接T载体，酶切验证正确，送华大测序。对测序结果分析，得到突变序列M1其序列见序列1。

二、StreptomycesfungicidicusP基因组DNA抽提方法：

⑴将平皿中培养5-7天的孢子(1cm²)接种于25mL2XYT液体培养基中，200rpm摇床培养24h。

⑵取500μL培养液于1.5mLEP管中，离心并收集菌丝体。在装有菌丝体的EP管中加入SET缓冲液1mL，在蜗旋振荡器上震荡15s，使菌体充分悬浮。6000rpm离心5min，弃上清，并收集菌丝体。

⑶将约60mg湿菌丝体转移至新的EP管中，加入500μLSET缓冲液，振荡悬浮。

⑷加入15μL溶菌酶溶液(50mg/mlinwater)，37℃消化30-60min。加入20ulproteinaseK(20mg/mlinwater)和60ul10％SDS，混匀后，50℃for2h(proteinaseK终浓度约0.6mg/ml,SDS终浓度1％)。

⑸加入200ul5MNaCl，颠倒混匀，再加入2ulRNase溶液(10mg/mL),消化20min。加入500ul酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)，充分混匀，使裂解液中的蛋白充分变性。然后12000rpm离心10min。用切了头的移液枪头将上层水相转移至新的EP管中(注意不要把两相间变性的蛋白移入新EP管中)。重复该步骤进行第二次抽提，尽可能将蛋白去干净。

⑹再用500ul氯仿抽提一次，去除水相中的酚。在移出的水相中，加入等体积的预冷的异丙醇，混匀后可见棉絮状的DNA析出。

⑺12000rpm离心10min，去上清，加入600μL75％的乙醇洗涤沉淀。

⑻10000rpm离心5min，去上清，并使乙醇充分挥发。

⑼再加入100ulRNase-水(20ug/mL)溶解基因组DNA。

大肠杆菌培养方法：在LB培养基中37℃振荡培养过夜。

三、构建包含突变基因的rpsl基因的重组载体pKC1139M1

⑴将突变序列M1、M2和M3分别与HindIII/EcoRI双酶切载体pKC1139后回收的6.4kb大片段进行酶连反应；

⑵将⑴得到的酶连产物转入感受态JM-109中，挑转化子，提质粒，酶切验证。得到质粒载体pKC1139M1、pKC1139M2和pKC1139M3。

1、大肠杆菌质粒提取方法：

⑴从平板中挑去单菌落接种到5mL含抗性的LB液体培养基中，37℃，180r/min过夜培养；

⑵取2mL培养物至2mL的离心管中，4000r/min离心5min，弃掉上清，沉淀用100μL溶液Ⅰ，充分悬浮细胞，转入1.5mL离心管中；收集菌体，加预冷的溶液I100μL，(革兰氏阳性菌加入10μLLysozyme20mg/mL)，RNaseA(10mg/mL)5ul，充分悬浮菌体，37℃温浴30min；

⑶再沿管壁加入200ul现配的溶液Ⅱ，轻颠倒离心管3-5次，冰浴4min，然后迅速加入150ul溶液Ⅲ，冰浴20min；

⑷加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混合均匀后，12000r/min离心10min，将上清移至新的EP管中，重复此步骤；加入等体积的氯仿，混合均匀后，12000r/min离心10min，将上清移至新的EP管；

⑸加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置20min以上，12000r/min离心10min，弃上清；

⑹沉淀用75％乙醇洗涤，弃去残液，待乙醇挥发后，用适量ddH2O(RnaseA)溶解沉淀，-20℃保存。

2、限制性内切酶的酶切反应方法：用限制性内切酶HindIII/EcoRI双酶切质粒pKC1139，酶切体系为50μL：

3、酶连反应方法：37℃处理4-7h，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收6.4kb大片段基因后分别连接目的序列M1、M2和M3，连接体系为20μL(目的基因浓度：载体浓度为3：1-9：1)。

连接体系：

16℃连接过夜。

4、大肠杆菌感受态制备(CaCl₂法)及转化方法：

⑴挑取新鲜的E.coliJM109/ET12567单菌落于5mLLB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜；

⑵取1mL菌液转接到含有50mLLB液体培养基的三角瓶中，37℃振荡培养至OD600约0.4-0.6，将菌液转移到离心管中，冰上放置30min；

⑶4℃、4000r/min离心15min。弃上清，用冰冷的10ml悬浮细胞，冰上放置30min；

⑷4000r/min离心10min，用冰冷的溶液10ml悬浮细胞，每60ul体积分装EP管，70℃保存备用。

5、连接产物转化感受态细胞方法

⑴从-80℃冰箱取60ul取出感受态细胞，加入10ul连接产物，混匀，冰浴30min后；

⑵42℃水浴中热击90s，冰浴2min；

⑶加入800ulLB液体培养基，37℃，180r/min，复苏1h；

⑷4000r/min离心5min，去掉600ul上清，取适量余下的菌液涂布于含有抗性的LA平板上；

⑸37℃倒置培养12-16h。

四、将重组载体pKC1139M1、pKC1139M2和pKC1139M3通过结合转移的方法导入StreptomycesfungicidicusP中

现有技术中没有关于大肠杆菌与Streptomycesfungicidicus的结合转移方法，通过摸索确定StreptomycesfungicidicusP结合转移方法如下：

⑴将重组载体质粒pKC1139M1、pKC1139M2和pKC1139M3分别转化含有pUZ8002质粒的大肠杆菌ET12567感受态细胞中，得到含有两个质粒的大肠杆菌ET12567菌株，表示为E1-Pkc1139M1、E2-Pkc1139M2和E3-Pkc1139M3；

⑵分别挑取大肠杆菌E1-Pkc1139M1、E2-Pkc1139M2和E3-Pkc1139M3单菌落于10ml含有抗生素安普拉霉素(50ug/ml)，氯霉素(25ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基中，37℃过夜培养。

⑶取100ul⑵中大肠杆菌培养液于10ml新鲜含有抗生素安普拉霉素(50ug/ml)，氯霉素(25ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基，37℃培养至OD＝0.4。

⑷用10ml无抗LB培养基洗⑶得到的菌体以防止残留的抗生素对链霉菌孢子抑制，最后用1mlLB悬浮菌体。

⑸取10ul(孢子悬液浓度为10⁸个/ml)StreptomycesfungicidicusP孢子于500ul2XYT培养基中，50℃水浴锅热激10min，冷却至室温。

⑹取500ul⑷大肠杆菌细胞悬浮液和500ul⑸中处理好的孢子，轻轻混匀。

⑺取100ul⑹中混合悬浮液涂布与添加10Mm氯化镁的Ms培养基中，30℃培养16-20h。

⑻在⑺中培养好的平板中覆盖1ml含有0.5mg奈丁酸(20ul的25mg/ml储存液)和1.25mg安普拉霉素(50mg/ml储存液)的灭菌水。用涂布器涂布均匀，30℃继续培养，观察大结合转化子。

五、筛选含有rpsl基因突变的Streptomycesfungicidicus

⑴将转化子接种在含有安普拉霉素抗性的MS培养基中，28℃培养5天；

⑵挑取菌体转移到无抗MS培养基中，40℃培养5天，传代两次；

⑶采用影印法分别将对应菌落克隆到含有终浓度为50ug/ml安普拉霉素抗性MS平板和含有链霉素终浓度为5ug/ml抗性的MS平板上，28℃培养5天，这些在链霉素抗性板上生长而在安普拉霉素抗性板上不长的菌体可能是rpsl基因发生突变的Streptomycesfungicidicus。

六、Streptomycesfungicidicus突变菌株的PCR验证

抽提StreptomycesfungicidicusP-1、P-2和P-3的基因组，用rpsLF1和rpsLF1进行PCR扩增，对扩增序列进行测序，验证rpsL所选位点改变。

七、HPLC分析测定Streptomycesfungicidicus突变菌株的恩拉霉素产量并与出发菌的比较

首先取2ml发酵液，加入18ml预先配制好的甲醇浸提液(甲醇：2M盐酸：水＝20：1：21)，使用超声波震荡30分钟后，离心，取上清液，经过0.45um的滤膜过滤后，注射到HPLC系统中。

—色谱柱：C18反向色谱柱，4.6╳150mm，Φ＝5um

—流速：1.0ml/min

—检测波长：267nm

—流动相：乙腈：50mM的NaH2PO4＝3:7,pH4.5，使用磷酸调节pH值。

根据HPLC分析得到各组分面积，计算改造后菌株Streptomycesfungicidicusp-1、p-2和p-3发酵液中的恩拉霉素产量，与原始菌株相比均有所提高，其中菌株Streptomycesfungicidicusp-1的恩拉霉素产量提高了20％。

八、突变菌株与原始菌株对链霉素抗性的变化

具体实验流程：

⑴最小抑菌浓度测定

制备含有1ug/ml、1.5ug/ml、2ug/ml、2.5ug/ml、3ug/ml、3.5ug/ml链霉素抗性浓度梯度的MS培养基，将原始StreptomycesfungicidicusP孢子涂在上面，28℃培养7天。

结果：当培养基中链霉素浓度小于且包含2.5ug/ml的生长，链霉素浓度大于3ug/ml的不长。因此得出野生型Streptomycesfungicidicus的链霉素最小抑制浓度约为2.5ug/ml。

⑵突变菌株对链霉素抗性检测

制备含有2ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml、20ug/ml、25ug/ml、30ug/ml链霉素抗性浓度梯度的MS培养基，将StreptomycesfungicidicusP、P-1、P-2、P-3孢子分别涂在上面，28℃培养7天。

结果：2ug/ml都生长；5ug/ml抗性板P不生长，而P-1生长；30ug/ml抗性板p-1仍然生长，突变株比原始菌株对链霉素抗性提高至少10倍。

九、说明：

本发明综合实验七和实验八的结果，以及3株改造后菌株的恩拉霉素产量及生产性能发现，改造后rpsL基因M1对提高菌株的恩拉霉素产量明显，并且改造后菌株具有良好的生产性能，因此对改造后基因M1进行保护；同时对改造后菌株StreptomycesfungicidicusP-1及工程菌株的构建方法进行保护。

Claims (4)

1.一种针对恩拉霉素产生菌的遗传转化及分子改造方法，其特征在于：步骤如下：

第一步，通过引物rpsLF1和rpsLR1从杀真菌素链霉菌基因组DNA中PCR扩增rpsL基因；在rpsL基因内部设计引物rpsLF2和rpsLR2，采用反向PCR，获得rpsL两侧部分基因片段；设计引物S12F1和S12R1获得包含rpsL基因序列；

第二步，设计突变引物MrpsLF1/MrpsLR1、MrpsLF2/MrpsLR2和MrpsLF3/MrpsLR3分别与S12F1/S12R1组合进行重叠PCR，PCR产物测序，得到突变序列，构建突变序列的基因重组载体；

第三步，通过接合转移将第二步得到的重组载体转移到初始杀真菌素链霉菌中；

第四步，通过抗性筛选得到含有rpsL基因突变重组载体的杀真菌素链霉菌菌株；

第五步，通过PCR验证第四步得到的杀真菌素链霉菌菌株。

2.一种恩拉霉素高产且链霉素抗性好的基因，其特征在于：基因序列如序列1所示。

3.一种含有如权利要求2所述的恩拉霉素高产且链霉素抗性好的基因的工程菌。

4.一种恩拉霉素高产且链霉素抗性好的工程菌，所述工程菌的出发菌株为ATCC21013，出发菌株的rpsL基因突变为如序列1所示的基因。