CN101974469A - 一种杀真菌素链霉菌突变菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidious)突变菌株FYFJ03，其保藏号CGMCC No.4113，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2010年8月25日。本发明还提供了上述菌株在恩拉霉素生产中的应用。本发明的突变菌株，能够积累苏氨酸，增加恩拉霉素合成前体苏氨酸的含量，从而提高恩拉霉素的生产水平。

Description

一种杀真菌素链霉菌突变菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于制备多肽类抗生素的菌株，具体地说，涉及一种杀真菌素链霉菌突变菌株及其在恩拉霉素生产中的应用。

背景技术

恩拉霉素(Enramycin)，又称恩来霉素、安来霉素、持久霉素，它是一种环状多肽类抗生素，由13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子组成，氨基酸组成环状多肽，脂肪酸分子连在末端的天冬氨酸上，根据末端脂肪酸分子的不同分为恩拉霉素A和恩拉霉素B，恩拉霉素是这两种组分的混合物。

恩拉霉素对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，主要阻碍细菌细胞壁的合成。敏感细菌有金黄色葡萄球菌等各种革兰氏阳性球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌、破伤风梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌等。长期使用此药物不易产生抗药性，且它能改变肠道内细菌的群落分布，有利于饲料营养成份的消化吸收，能够促进动物体重增加和提高饲料的利用率，因此世界上许多国家推荐此药物作为畜禽的抗生素和促生长剂。恩拉霉素的另一个特点是不易被吸收，因此畜禽体内残留较少。

恩拉霉素是由土壤中分离出来的杀真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidious)发酵产生的，一般兽用使用的是恩拉霉素即为杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidious)的干燥菌丝体，不用纯化纯品，但现有的杀真菌素链霉菌生产水平较低。以往的筛选仅局限于从环境中筛选野生型菌株，不但工作量大、效率低，结果也不理想。这可能是野生型菌株的代谢途径不利于向恩拉霉素合成的方向进行，或者是合成的前体物质量不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种恩拉霉素产量高的杀真菌素链霉菌突变菌株，其通过简单的筛选抗α-氨基-β-羟基戊酸累积恩拉霉素合成前体的突变株，从而进一步筛选获得。

本发明的另一目的是提供所述菌株在恩拉霉素生产中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidious)突变菌株FYFJ03，其保藏号为CGMCCNo.4113，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2010年8月25日。

筛选上述突变菌株的方法，包括如下步骤：

1)抗α-氨基-β-羟基戊酸突变菌株的获得：将出发菌种杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidious)经活化培养至对数期，加入5-溴尿嘧啶(5-BU)作为诱变剂后制成菌悬液，并涂布于含有10mg/mL的α-氨基-β-羟基戊酸的琼脂培养基上，筛选抗α-氨基-β-羟基戊酸的突变株；

2)恩拉霉素高产菌株的筛选：分别培养金黄色葡萄球菌和步骤1)筛选得到的抗α-氨基-β-羟基戊酸的突变株，以无菌滤纸将突变株发酵液贴附在金黄色葡萄球菌平板上，以出发菌株杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidious)为对照，观察抑菌圈筛选高产恩拉霉素的菌株。

本发明还提供上述杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidious)突变菌株FYFJ03在恩拉霉素生产中的应用。

所述应用是将上述突变菌株在28℃，200rpm条件下进行发酵，制得发酵液。

所述发酵的发酵培养基成分为：玉米粉35g/L，玉米浆25g/L，黄豆饼粉34.0g/L，可溶性淀粉60g/L，葡萄糖20g/L，碳酸钙30g/L，FeSO₄·7H₂O 2g/L，MnCl₂·4H₂O 2g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L。发酵时间为7d。

本发明的杀真菌素链霉菌突变菌株，是利用化学诱变技术，并结合抗性物质定向筛选的方法获得的。该突变株能够使恩拉霉素合成前体苏氨酸含量提高，使高丝氨酸脱氢酶不受苏氨酸的反馈抑制，有助于恩拉霉素合成前体的累积，从而达到提高恩拉霉素产量的目的；本发明的筛选方法具有操作简单，技术要求不高，筛选方法可靠等优点。

附图说明

图1为本发明通过抑菌圈对恩拉霉素高产菌株进行筛选的示意图。

图2为出发菌株恩拉霉素HPLC图。

图3为突变菌株恩拉霉素HPLC图。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1抗α-氨基-β-羟基戊酸突变菌株的获得

1.菌种处理：将菌种杀真菌素链霉菌Streptomyces fungicidious(ATCC 27432)接种于燕麦粉琼脂-1(燕麦粉20g/L，FeSO₄·7H₂O0.1g/L，MnCl₂·4H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L，琼脂15g/L)斜面培养基上，28℃恒温培养。将划线形成的单菌落用灭菌牙签挑取适量接种于液体燕麦粉培养基(燕麦粉20g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，MnCl₂·4H₂O 0.1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L)中，在温度为28℃、转速为200rpm的条件下，培养菌体至对数生长期，取此生长期的菌株作化学诱变实验。

2.菌种突变及筛选：取上述菌液5000rpm离心10min收集菌体，加入生理盐水，形成悬浮液，培养8-10h。加入诱变剂5-BU到悬浮液中至浓度为0.1-0.3mg/mL，混合均匀，取0.2-0.5mL诱变后的菌悬液涂布于含有10mg/mL的α-氨基-β-羟基戊酸的琼脂培养基(培养基成分同本实施例中1的燕麦粉琼脂-1)上，于28℃条件下培养，筛选在平板上生成的单菌落即为抗α-氨基-β-羟基戊酸的突变株。

实施例2恩拉霉素高产菌株的筛选

1.金黄色葡萄球菌的活化：取保存于斜面上的金黄色葡萄球菌划线于营养肉汁(蛋白胨10g/L，牛肉浸取物3g/L，NaCl 5g/L)琼脂平板上，37℃培养16h。将活化形成的单菌落用灭菌牙签挑取适量接种于液体营养肉汁琼培养基中，在温度为37℃、200rpm的条件下震荡培养14-16h，培养菌体的OD₆₀₀至1.0-1.5的对数生长期时，吸取120μL涂布于营养肉汁琼脂平板上，37℃培养，待用。

2.恩拉霉素产生菌的筛选：取实施例1中的抗α-氨基-β-羟基戊酸突变株的单菌落于液体燕麦粉培养基(培养基成分同实施例1中所述)中培养5-7d，用直径为5μm的无菌滤纸片浸湿后贴附在上述的金黄色葡萄球菌平板上，28℃恒温培养，观察抑菌圈情况，同时以出发菌株为对照，以此来筛选抑菌圈比较大的即为高产恩拉霉素的菌株，命名为FYFJ03，保藏号为CGMCC No.4113(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，保藏日期2010年8月25日。结果见图1。

实施例3恩拉霉素高产菌株的发酵

取实施例2中筛选的菌株作为发酵菌株，以出发菌株为对照，分别接种于发酵培养基中发酵，发酵培养基的组分为玉米粉35g/L，玉米浆25g/L，黄豆饼粉34.0g/L，可溶性淀粉60g/L，葡萄糖20g/L，碳酸钙30g/L，FeSO₄·7H₂O 2g/L，MnCl₂·4H₂O 2g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L。在温度为28℃、200rpm条件下培养，发酵时间为7d。

实施例4恩拉霉素的检测

取实施例3中的发酵液，在10000rpm条件下，离心5min后取上清液，同时以出发菌株为对照，以HPLC法检测其中的恩拉霉素含量。

采用Agillent 1100HPLC系统，分析柱为ZORBAX SB C-18色谱柱，流动相组分为超纯水(含0.1％三氟乙酸)和乙腈，流速为1mL·min^-1，柱温为50℃，检测波长为267nm，恩拉霉素在浓度为50-500μg/mL范围内的峰面积与浓度呈良好的线性关系。出发菌株及本发明的突变菌株的HPLC检测结果分别如图2、3所示，经测定，出发菌株的恩拉霉素产量为5g/L，突变菌株的产量达14g/L。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidious)突变菌株FYFJ03，其保藏号为CGMCC No.4113。

2.权利要求1所述的突变菌株在恩拉霉素生产中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，其为将权利要求1所述的突变菌株在28℃，200rpm条件下进行发酵，制得发酵液。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵的发酵培养基成分为：玉米粉35g/L，玉米浆25g/L，黄豆饼粉34.0g/L，可溶性淀粉60g/L，葡萄糖20g/L，碳酸钙30g/L，FeSO₄·7H₂O 2g/L，MnCl₂·4H₂O 2g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，发酵时间为7d。

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