CN102645506A - 恩拉霉素高效液相色谱测定方法 - Google Patents

Abstract

一种恩拉霉素高效液相色谱测定方法，包括，缓冲盐溶液的配制，样品处理，标准品处理，进样，采集图谱记录峰面积，数据处理，面积计算等步骤。本发明的恩拉霉素高效液相色谱测定方法的优点是，1：样品处理简单；2：检测步骤简单，对人员要求不高，这个方法主要依靠仪器分析，简单易学，推广容易；3：检测周期短：上机进样时间为30min，检测当天就能出具结果；4：检测结果相对偏差小：这种方法要求同一操作者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于2%。

Description

恩拉霉素高效液相色谱测定方法

技术领域

本发明涉及一种适用于配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料及恩拉霉素预混剂中恩拉霉素高效液相色谱测定方法。

背景技术

恩拉霉素(enramycin)是由放线菌(Streptomyces fungicidicus)发酵而得，是不饱和脂肪酸与十几种氨基酸结合的多肽类抗生素，主要组分有恩拉霉素A和B，是其盐酸形式应用。白色或微黄白色粉末 (粗品呈灰色或灰褐色的粉末，有特臭)。234～238℃分解，易溶于稀盐酸、微溶于水、甲醇、乙醇，不溶于丙酮。恩拉霉素对革兰氏阳性菌有很强的活性，特别是对肠内的有害梭状芽孢杆菌(Clostridium)抑制力很强。长期使用后不容易产生抗药性，因它改变了肠道内的细菌群，所以对饲料中营养成分的利用效果好，可以促进猪、鸡增重和提高饲料转化率。

目前关于恩拉霉素的检测方法仅有《饲料中恩拉霉素的测定--微生物学法》 GB/T21542-2008。该方法在检测过程中存在几点不足之处：1、样品处理繁琐，该方法先用酸性甲醇溶液将恩拉霉素提取，再将提取液用大孔树脂吸附，洗脱；2、检测操作步骤复杂，对检测人员要求较高，这种方法在检测步骤包括制备平板双碟，放置牛津杯，加样，培养，其中关键环节较多，要求检测人员经验丰富，手法熟练；3、检测周期长，这种方法需要在36℃-37℃培养16h-18h，在检测当天不能检测出来；4、检测结果相对偏差大，这种方法要求同一操作者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于15%即可。

发明内容

本发明的目的就是提供一种样品处理简单、步骤少、周期短、检测结果相对偏差小的恩拉霉素高效液相色谱测定方法。

本发明的恩拉霉素高效液相色谱测定方法，包括以下步骤：

1、缓冲盐溶液的配制：

称取分析纯无水磷酸二氢钠5.999g于干燥洁净烧杯中，加纯水溶解，转移至1000mL容量瓶中，加纯水定容至刻度，摇匀，用磷酸调pH=4.5即得； 

2、样品处理：  

称取样品0.5g至250mL具塞三角瓶中，加入按分析纯丙酮:2mol/L盐酸:水=20:1:21比例配制的稀释液78-85mL，超声40min，静置，冷却至室温，或用往复式振荡器振荡150-180min，转移至100mL容量瓶中，用稀释液定容至刻度，振荡使均匀，制备成200ug/ml样品溶液；完毕，用滤纸过滤后，用注射器吸取样品溶液用0.25μm有机滤膜过滤，丢弃第一次滤液，取续滤液于样品瓶中，按批号放入进样盘中，按序列采集，进样，记录色谱图； 

3、标准品处理：

称取标准品至50mL容量瓶中，用按分析纯丙酮:2mol/L盐酸:水=20:1:21比例配制的稀释液溶解、定容至刻度，振荡使均匀，配制成浓度为200ug/mL的标准溶液，用注射器吸取标品溶液用0.25μm有机滤膜过滤，丢弃第一次滤液，取续滤至样品瓶中，进样，采集图谱；  

4、测定法： 

取试样滤液20μL进样，记录峰面积，面积计算，即得， 

色谱条件：

色谱柱：C18反向色谱柱，规格为 250×4.6mm或150×4.6mm ，

柱温：30℃， 

流速：1.0mL/min ，

进样量：20μL ，

检测波长：267 nm ，

流动相：色谱纯乙腈:0.05mol/L磷酸二氢钠溶液＝30:70，pH4.5 ，

运行时间：30 min ；

5、数据处理：

样品含量（Py，%）=                                                 

 =   

     Ay（a+b）——样品A、B组分峰面积之和 

      As（a+b）——标品A、B组分峰面积之和 

       Cs  ——标品浓度，μg/mL 

        Ms  ——标品称样量，mg  

        My  ——样品称样量，mg 

        Vs  ——标品稀释体积，mL 

Vy  ——样品稀释体积，mL 

          Ps  ——标品含量，μg /mg 

          1000——校正因子，1mg=1000μg ；

6、 偏差 

标样连续进2针，计算（a+b）峰面积的相对标准偏差（RSD），如果RSD不大于2.0%，即可按照标样溶液、试样溶液的顺序连续测定；如果RSD大于2.0%，需要继续进样，直到连续两针之间的RSD不大于2.0%，方可进样； 

7、重复性 

由同一操作者对同一试样同时两次平行测定所得含量相对标准偏差不得大于2.0%，取其平均值。

本发明的恩拉霉素高效液相色谱测定方法的优点是，1：样品处理简单：样品仅需丙酮-盐酸水溶液超声40min，过滤即可上机进样；2：检测步骤简单，对人员要求不高，这个方法主要依靠仪器分析，简单易学，推广容易；3：检测周期短：上机进样时间为30min，检测当天就能出具结果；4：检测结果相对偏差小：这种方法要求同一操作者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于2%。

具体实施方式

实施例1:称取样品0.5008g至250mL具塞三角瓶中，加入按分析纯丙酮:2mol/L盐酸:水=20:1:21比例配制的稀释液80mL，超声40min，静置，冷却至室温，转移至100mL容量瓶中，用稀释液定容至刻度，振摇使均匀，制备成200ug/ml样品溶液。完毕，用滤纸过滤后，用注射器吸取样品溶液用0.25μm有机滤膜过滤，丢弃第一次滤液，取续滤液于样品瓶中，按批号放入进样盘中，按序列采集，进样，记录色谱图。 

称取标准品至50mL容量瓶中，用按分析纯丙酮:2mol/L盐酸:水=20:1:21比例配制的稀释液溶解、定容至刻度，振荡使均匀，配制成浓度为200ug/mL的标准溶液，用注射器吸取标品溶液用0.25μm有机滤膜过滤，丢弃第一次滤液，取续滤至样品瓶中，进样，采集图谱。  

取试样滤液20μL进样，记录峰面积，面积计算,含量为4.06%， 

实施例2：称取样品0.5004g至250mL具塞三角瓶中，加入按分析纯丙酮:2mol/L盐酸:水=20:1:21比例配制的稀释液80mL，超声40min，静置，冷却至室温，转移至100mL容量瓶中，用稀释液定容至刻度，振摇使均匀，制备成200ug/ml样品溶液。完毕，用滤纸过滤后，用注射器吸取样品溶液用0.25μm有机滤膜过滤，丢弃第一次滤液，取续滤液于样品瓶中，按批号放入进样盘中，按序列采集，进样，记录色谱图。 

称取标准品至50mL容量瓶中，用按分析纯丙酮:2mol/L盐酸:水=20:1:21比例配制的稀释液溶解、定容至刻度，振荡使均匀，配制成浓度为200ug/mL的标准溶液，用注射器吸取标品溶液用0.25μm有机滤膜过滤，丢弃第一次滤液，取续滤至样品瓶中，进样，采集图谱。  

取试样滤液20μL进样，记录峰面积，面积计算,含量为4.04%。

Claims (1)

1.一种恩拉霉素高效液相色谱测定方法，其特征在于：它包括以下步骤：

（1）、缓冲盐溶液的配制：

称取分析纯无水磷酸二氢钠5.999g于干燥洁净烧杯中，加纯水溶解，转移至1000mL容量瓶中，加纯水定容至刻度，摇匀，用磷酸调pH=4.5即得； 

（2）、样品处理：  

称取样品0.5g至250mL具塞三角瓶中，加入按分析纯丙酮:2mol/L盐酸:水=20:1:21比例配制的稀释液78-85mL，超声40min，静置，冷却至室温，或用往复式振荡器振荡150-180min，转移至100mL容量瓶中，用稀释液定容至刻度，振荡使均匀，制备成200ug/ml样品溶液；完毕，用滤纸过滤后，用注射器吸取样品溶液用0.25μm有机滤膜过滤，丢弃第一次滤液，取续滤液于样品瓶中，按批号放入进样盘中，按序列采集，进样，记录色谱图； 

（3）、标准品处理：

称取标准品至50mL容量瓶中，用按分析纯丙酮:2mol/L盐酸:水=20:1:21比例配制的稀释液溶解、定容至刻度，振荡使均匀，配制成浓度为200ug/mL的标准溶液，用注射器吸取标品溶液用0.25μm有机滤膜过滤，丢弃第一次滤液，取续滤至样品瓶中，进样，采集图谱；  

（4）、测定法： 

取试样滤液20μL进样，记录峰面积，面积计算，即得， 

色谱条件：

色谱柱：C18反向色谱柱，规格为 250×4.6mm或150×4.6mm ，

柱温：30℃， 

流速：1.0mL/min ，

进样量：20μL ，

检测波长：267 nm ，

流动相：色谱纯乙腈:0.05mol/L磷酸二氢钠溶液＝30:70，pH4.5 ，

运行时间：30 min ；

（5）、数据处理： 

样品含量（Py，%）=                                                 =  

   Ay（a+b）——样品A、B组分峰面积之和 

          As（a+b）——标品A、B组分峰面积之和 

            Cs  ——标品浓度，μg/mL 

          Ms  ——标品称样量，mg  

          My  ——样品称样量，mg 

        Vs  ——标品稀释体积，mL 

Vy  ——样品稀释体积，mL 

           Ps  ——标品含量，μg /mg 

           1000——校正因子，1mg=1000μg ；

（6）、偏差： 

标样连续进2针，计算（a+b）峰面积的相对标准偏差（RSD），如果RSD不大于2.0%，即可按照标样溶液、试样溶液的顺序连续测定；如果RSD大于2.0%，需要继续进样，直到连续两针之间的RSD不大于2.0%，方可进样； 

（7）、重复性：

由同一操作者对同一试样同时两次平行测定所得含量相对标准偏差不得大于2.0%，取其平均值。