CN102584963A - 一种活性灵芝多糖肽对照品、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种活性灵芝多糖肽对照品、制备方法及应用。其提供一种具有活性成分多糖肽对照品，测定并评价灵芝及灵芝产品质量。该对照品可纠正灵芝在深加工的过程中添加淀粉类为辅料，用葡萄糖作对照品测定多糖所产生误差。采用赤芝为原料。用水浸泡，煮沸获得提取液，将其浓缩、离心、透析、截留具有活性高分子部位的多糖蛋白GL-PP，而后将GL-PP进一步采用乙醇梯度分离，离心，收集沉淀。分别进行柱分离，选择具有活性多糖肽GL-PPS为检测糖肽类的对照品，能在UV仪器中准确测定微量活性多糖肽的含量。本纯品可作为对照品用于检测灵芝类的产品质量，可排除灵芝产品中淀粉等辅料的干扰，从而提升了灵芝产品的质量标准。

Description

一种活性灵芝多糖肽对照品、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种灵芝及灵芝产品质量测定用对照品，特别是一种活性灵芝多糖肽(GL-PPS)对照品、制备方法及应用。

背景技术

现有测定灵芝及灵芝产品质量方法，根据中国药典规定蒽酮-硫酸法，适用于以葡聚糖为主要结构，相对分子质量1×10⁴以上的水溶性粗多糖的测定。该法以葡萄糖或葡聚糖为对照品，以无水葡萄糖或葡聚糖计，而忽视有药用价值的多糖肽活性成分的含量。特别是灵芝提取物生产工艺过程中，往往在灵芝提取液中加入淀粉，或其它淀粉类辅料，使该法无法排除辅料干扰，造成灵芝产品的多糖含量虚高的问题，从而造成不能真实反映灵芝产品的质量。

2002年王光亚等提出多糖测定最好能提出样品中所含多糖的纯品作对照品，用HPLC法来分离检测(王光亚主编，保健食品功效成分检测方法，中国轻工业出版社，2002年，P10)。为此，我们根据这思路，提取分离灵芝活性成分多糖肽(GL-PPS)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，而提供一种可用于检测灵芝和灵芝深加工产品中多糖肽含量，从而可提高灵芝产品质量的一种活性灵芝多糖肽(GL-PPS)对照品。

本发明的另一目的在于提供一种活性灵芝多糖肽(GL-PPS)对照品的制备方法。

本发明的目的还在于提供一种活性灵芝多糖肽(GL-PPS)对照品在检查灵芝产品质量中的应用。

一种活性灵芝多糖肽(GL-PPS)对照品，其具有如下特征：

(1)性状：浅褐色至褐色粉末状；

(2)性质：易溶于水，不溶乙醇、丙酮，乙醚等，易受潮；

(3)纯度：99％以上；

(4)峰位分子量(MP)1.06～1.2×10⁴；

(5)化学结构：鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)和葡萄糖(Glc)组成，含17种氨基酸，糖苷键为β-构型；

其主链是1，3-与1，4-两者交替连接的葡萄糖构成，在部分主链葡萄糖的6位有分支，非还原末端均由葡萄糖构成，也含主链由1，6或1，3连接的β-D-Glcp的构成，在部分1.6-的主链葡萄糖的2或3位有分支；

(6)GL-PPS对照品的百分摩尔比：Rha∶Man∶Glc＝1.49∶9.7∶75.4；

(7)分子量范围为5.0×10³～1.5×10⁴。

一种活性灵芝多糖肽(GL-PPS)对照品的制备方法，其步骤如下：

(1)将灵芝子实体挑选，经切成薄片(2～20mm)或破碎后过40～60目筛网，加10～30倍体积的无离子水，于90℃浸泡2小时，90～100℃提取1.5～2.0h，间歇搅拌翻动，以3000～4000rpm离心，去沉淀取提取液，离心后的残渣再加5～10倍原子实体重量的水，反复提取二次，合并提取上清液；

(2)将上清液浓缩至原投料量的5～10倍，离心除去杂质，留清液，流水透析(36MD)48小时，将透析液浓缩一半，再次离心(10000-12000rpm)，除去杂质，留上清液；

(3)向上清透析液中缓慢加入透析液的三倍体积95％乙醇，搅拌均后，置4～5℃冰箱收集沉淀物，将沉淀溶于水，加入其4倍体积无水乙醇，4～5℃放置，离心(10000-12000rpm)，除去清液，沉淀物用丙酮和乙醚洗涤沉淀，置真空低温干燥得赤灵芝多糖肽粗品GL-PP；

(4)用浓度为1％的灵芝多糖肽GL-PP溶液，在不断搅拌中缓慢滴加无水乙醇至1∶0.5(V/v)，置冰箱过夜，离心(10000-12000rpm)，用无水乙醇分级沉淀，收集33％乙醇沉淀部分，置冰箱真空干燥得第1级成分为GL-PP1得率为27～30％；

(5)取步骤(4)上清液再滴加无水乙醇至1∶1(V/v)同上处理，收集33～50％的沉淀，置冰箱真空干燥得第2级成分为GL-PP2得率为20～30％；将上清液继续再加乙醇至1∶1.5(V/v)，得第3级组分GL-PP3得率为20～25％。置真空低温干燥得GL-PP3多糖肽粗品；

(6)取GL-PP3以1∶10比例加水微热溶解，离心10000-12000rpm去杂璺，通过聚丙烯胺凝胶Bio-Gel P-10Gel 45～90μm wet柱分离，用含50mol·L^-1NaCl的5.8-6.0pH＝0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液0.2mol/L收集洗脱液，流水透析12～48h，蒸馏水透析4～12h，取袋内液浓缩，用三倍无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀部分，冷冻干燥，得浅褐色粉末状物质为赤芝多糖肽GL-PPZ；

(7)GL-PPZ再以Bio-Gel P-30柱分离同步骤(6)法收集GL-PPS，得率72％。

经HPLC检测结果为单一多糖，纯度为99％以上，得率为22％。

一种活性灵芝多糖肽(GL-PPS)对照品在检查灵芝产品质量中的应用，其可作为鉴别灵芝类药材或测定灵芝类药材(包含糖肽类产品)活性成分多糖肽含量测定。其还可用于测定灵芝提取物(包含糖肽类)中多糖肽含量。

本发明赤芝多糖肽GL-PPS对照的峰位分子量检测灵芝类产品中峰位分子量，如检测国药“准”灵芝胶囊中峰位分子量，评价《灵芝胶囊》产品质量。

本发明赤芝多糖肽GL-PPS对照品特征如下：

特征之一：糖肽结合的色谱法识别样品溶于流动相(0.2mol.L^-1硫酸钠)，经TSK G4000PW_XL柱分离后，经先UV后RI检测。比较样品在两种检测器中出峰时间，鉴别糖肽是否为结合型。

GL-PPS经紫外和示差检测器先后检测，在220～300nm区进行紫外扫描，在15.0～18.0分钟左右出现色谱峰(见图4)。样品在两种串联的检测器中测得峰位基本吻合，提示GL-PPS多糖肽为结合态的糖和肽。

特征之二：红外光谱(IR)：通过400-4000cm^-1扫描，GL-PPS红外光谱(IR)，分析表明，具有典型的多糖特征吸收峰，分别为3385～3425cm^-1，2915～2931cm^{- 1}，1635～1647cm^-1，1291～1385cm^-1和1074～1081cm^-1等多糖吸收峰，其中3325～3385cm^-1为强宽峰分子中羟基形成多种氢键所致的强吸收峰，在(891±7)cm^-1处为β构型的特征吸收峰，这表明该糖肽具β-D葡萄糖苷键(见图5)。

特征之三：¹H-核磁共振谱(¹HNMR)：赤芝多糖肽GL-PPS的信号多数在δ4.0-5.5ppm范围，β型的多糖小于5.0ppm。灵芝多糖肽GLPPS的δ4.21ppm处具有宽的异头碳信号，说明这是D-葡萄糖残基的构象(见图6)。

特征之四：¹³C-核磁共振谱(¹³C NMR)实验表明，灵芝多糖肽化学位移103.8→70.2ppm，表明有β-(1→6)；103.8→86.7ppm，表明有β-(1→3)；103.8-80.1ppm，表明有β-(1→4)存在，β-(1→4)连接还有δ81.0处的信号；103-105ppm为甘露糖和杂多糖等单糖构型和构象(见图7)

特征之五：赤芝多糖肽GL-PPS中糖与钛连接特性：在温和条件下，样品经水和碱分别处理后的上紫外扫描，结果显示两者均在紫外区有明显特征吸收，其碱处理吸收值大于水，表明样品中存在O-糖苷键(见图8)。

特征之六：从赤芝子实体中分离GL-PPS，是以葡萄糖为主的杂多糖和摩尔比用2mol.L^-1TFA2ml，封管，在110℃下加热水解2h，已完全水解，水解物经还原，醋酐乙酰化，氯仿萃取，干燥后，气相色谱检出鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)和葡萄糖(Glc)，其百分摩尔比为14.9∶9.7∶75.4。说明该多糖肽中多糖是以葡萄糖为主的杂多糖组成。

特征之七：GL-PPS高效凝胶渗透色谱法测定纯度与分子质量经HPGPC分析，以标准分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标，进行线性回归。测定其纯度达95.04～99.37％。GPC专用软件自动计算其M_w为1.06×10⁴～1.6×10⁴；M_n为6.0×10³～90×10³；M_w/M_n为1.20～2.88。M_p为1.06×10⁴～1.2×10⁴。

特征之八：smith降解与甲基化分析检测糖链连接形式从甲基化、还原、乙酰化衍生物的GL-MS图谱分析得知，GL-PPS含有碎片1→3)β-Glcp(1→、→4)，β-Glcp(1→、→4、6)，β-Glcp(1→、→3、6)。从GC-MS分析的结果显示，GL-PPS为一具有分支的多糖，其主链由1→3与1→4连接两者交替的葡萄糖构成，在部分主链葡萄糖的6位有分支，非还原末端均由葡萄糖构成。鼠李糖和甘露糖由于含量低，在气质联用的分析时未检到相应的信号(见表1)。

表1GL-PPS的甲基化分析

Table  Methylation analysis of GL-PPS

根据GL-PPS甲基化、NMR等分析，说明GL-PPS多糖肽主链由1→3及1→4两者交替连接的葡萄糖构成主链。在部分主链葡萄糖的6位有分支，非还原末端均由葡萄糖构成。GL-PPS经过碘酸盐氧化，平均每摩尔葡萄糖残基消耗过碘酸盐0.7摩尔，生成甲酸0.1摩尔，与根据甲基化分析计算的结果(N_aIO₄消耗0.65mol，生成甲酸0.08mol)基本一致。反应产物经NaBH₄还原，生成多羟基衍生物GL-PPS-PO，经完全水解后，转变为糖醇乙酸酯，进行GC分析。结果表明产物中存在丙三醇、赤藓醇和葡萄糖(见图9)。葡萄糖的出现说明原多糖中含有1，3-连接(或1，3，6-连接)的葡萄糖，赤藓醇则来源于1，4-或1，4，6-连接的葡萄糖，丙三醇则源自于非还原末端的葡萄糖。Smith降解的结果与甲基化分析检测到的糖链连接形式一致。

可推断GL-PPS具有以下的单元结构。

特征之九：多糖肽的糖链和肽链连接性质为O糖苷键连接。在温和条件下的稀碱水解，可以把与钛链上的丝氨酸或苏氨酸的羟基相连的单糖或链水解下来。样品在两种串联的检测器中测得峰位基本吻合，提示GL-PPS中糖与肽紧密结合。

特征之十：氨基酸分析结果表明GL-PPS由17种氨基酸组成(见图10)。分别为(％)：(1)天门冬氨酸(Asp)0.57；(2)苏氨酸(Thr)0.98；(3)丝氨酸(Ser)1.18；(4)谷氨酸(Glu)0.56；(5)甘氨酸(Gly)0.48；(6)丙氨酸(Ala)0.70；(7)胱氨酸(Cys)0.09；(8)缬草氨酸(Vla)0.27；(9)蛋氨酸(Met)0.23；(10)异亮氨酸(Ile)0.19；(11)亮氨酸(Leu)0.22；(12)酪氨酸(Tyr)0.04；(13)苯丙氨酸(Phe)0.14；(14)赖氨酸(Lys)0.17；(15)组氨酸(His)0.12；(16)精氨酸(Arg)0.12；(17)脯氨酸(Pre)0.41。氨基酸总量达6.47％。

综上所述的，本发明相比现有技术如下优点：

本发明提供一种具有活性成分多糖肽对照品，以测定并评价灵芝及灵芝产品质量：以代替传统的以葡萄糖(或葡聚糖)为对照品测定多糖含量的方法。该对照品可纠正灵芝在深加工的过程中添加淀粉类为辅料，用葡萄糖作对照品测定多糖所产生误差。对含有淀粉类添加物以葡萄糖为对照品，测试结果多糖含量虚高，不能真实反映活性多糖肽的含量。发明人采用赤芝Ganoderma licudum(curtis.)P.Karst.为原料。用水浸泡，煮沸获得提取液，将其浓缩、离心、透析、截留具有活性高分子部位的多糖蛋白GL-PP，而后将GL-PP进一步采用乙醇梯度分离，离心，收集沉淀。分别进行柱分离，选择具有活性多糖肽GL-PPS为检测糖肽类的对照品，在检测样品众多的干扰因素中，能在UV仪器中准确测定微量活性多糖肽的含量。本品化学结构清晰，测定纯度达95％以上，Mw为1.06×10⁴Mn为0.87×10⁴，分子量分布为1.21。该化学组分经药理活性实验具有提高免疫功能，抑制肿瘤生长和肿瘤扩散作用。

本纯品可作为对照品用于检测灵芝类的产品质量，可排除灵芝产品中淀粉等辅料的干扰，从而提升了灵芝产品的质量标准。

附图说明

图1是灵芝多糖肽GL-PP组分。

图2是灵芝多糖肽第一级成分为GL-PP1图谱。

图3是灵芝多糖肽(GL-PPS)的HPGPC图。

图4是紫外和示差检测器检测重叠色谱图。

图5是GL-PPS红外光谱。

图6是GL-PPS¹H核磁共振图。

图7是GL-PPS¹³C核磁共振图。

图8是GL-PPS成分中糖与钛连接。

图9是Smith降解与甲基化检测。

图10是GL-PPS氨基酸组成色谱图。

图11是GL-PPS标准曲线图。

图12是灵芝多糖肽紫外光谱扫描图。

图13是灵芝多糖肽标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。

实施例1.

1、一种活性灵芝多糖肽(GL-PPS)对照品，其具有如下特征：

(1)性状：浅褐色至褐色粉末状；

(2)性质：易溶于水，不溶乙醇、丙酮，乙醚等，易受潮；

(3)纯度：99％以上；

(4)峰位分子量(MP)1.06～1.2×10⁴；

(5)化学结构：鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)和葡萄糖(Glc)组成，含17种氨基酸，糖苷键为β-构型；

其主链是1，3-与1，4-两者交替连接的葡萄糖构成，在部分主链葡萄糖的6位有分支，非还原末端均由葡萄糖构成，也含主链由1，6或1，3连接的β-D-Glcp的构成，在部分1.6-的主链葡萄糖的2或3位有分支；

(6)GL-PPS对照品的百分摩尔比：Rha∶Man∶Glc＝1.49∶9.7∶75.4；

(7)分子量范围为5.0×10³～1.5×10⁴。

实施例2

一种活性灵芝多糖肽(GL-PPS)对照品的制备方法，其步骤如下：

(1)将灵芝子实体挑选，经切成薄片(2～20mm)或破碎后过40～60目筛网，加10～30倍体积的无离子水，于90℃浸泡2小时，90～100℃提取1.5～2.0h，间歇搅拌翻动，以3000～4000rpm离心，去沉淀取提取液，离心后的残渣再加5～10倍原子实体重量的水，反复提取二次，合并提取上清液；

(2)将上清液浓缩至原投料量的5～10倍，离心除去杂质，留清液，流水透析(36MD)48小时，将透析液浓缩一半，再次离心(10000-12000rpm)，除去杂质，留上清液；

(3)向上清透析液中缓慢加入透析液的三倍体积95％乙醇，搅拌均后，置4～5℃冰箱收集沉淀物，将沉淀溶于水，加入其4倍体积无水乙醇，4～5℃放置，离心(10000-12000rpm)，除去清液，沉淀物用丙酮和乙醚洗涤沉淀，置真空低温干燥得赤灵芝多糖肽粗品GL-PP；

(4)用浓度为1％的灵芝多糖肽GL-PP溶液，在不断搅拌中缓慢滴加无水乙醇至1∶0.5(V/v)，置冰箱过夜，离心(10000-12000rpm)，用无水乙醇分级沉淀，收集33％乙醇沉淀部分，置冰箱真空干燥得第1级成分为GL-PP1得率为27～30％；

(5)取步骤(4)上清液再滴加无水乙醇至1∶1(V/v)同上处理，收集33～50％的沉淀，置冰箱真空干燥得第2级成分为GL-PP2得率为20～30％；将上清液继续再加乙醇至1∶1.5(V/v)，得第3级组分GL-PP3得率为20～25％。置真空低温干燥得GL-PP3多糖肽粗品；

(6)取GL-PP3以1∶10比例加水微热溶解，离心10000-12000rpm去杂璺，通过聚丙烯胺凝胶Bio-Gel P-10Gel 45～90μm wet柱分离，用含50mol·L^-1NaCl的5.8-6.0pH＝0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液0.2mol/L收集洗脱液，流水透析12～48h，蒸馏水透析4～12h，取袋内液浓缩，用三倍无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀部分，冷冻干燥，得浅褐色粉末状物质为赤芝多糖肽GL-PPZ；

(7)GL-PPZ再以Bio-Gel P-30柱分离同步骤(6)法收集GL-PPS，得率72％。经HPLC检测结果为单一多糖，纯度为99％以上，得率为22％。

灵芝产品的鉴别：以对照品多糖肽峰的峰位保留时间，观察供试品是否符合规定规范。

在特定的凝胶色谱条件下，色谱柱：Tsk gel G4000PWxl或TSKG3000SWxl，Waters1515泵、示差折光检测器(Waters 2414)、Empower 2软件。流动相：0.2mol/L Na2So4，柱温：35℃，进样量：50ul min^-1；流速：0.5ml.min^-1。灵芝供试品与对照品多糖肽峰，其峰位保留时间误差在±10％以内。测试结果如下：

表2样品与对照品峰位保留时间观察

以上测试结果表明：供试品与对照品多糖肽GL-PPS峰位保留时间符合规定范围内。说明科慧灵芝散和仲华灵芝宝都是灵芝的同一产品。

实施例2.分子量或分子量分布测定：据中国药典分子排阻色谱法通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)，测定分子量或分子量分布是控制糖肽类产品的关键指标。GL-PPS经HPGPC分析，以标准分子量(右旋糖酐)系列的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标，进行线性回归。测定其纯度达99.37％。Empower2软件自动计算其Mw为1.06×10⁴；Mn为9.00×10³；Mw/Mn  为1.20；Mp为1.06×10⁴。

表3分子量或分子量分布

上表说明：灵芝产品除了“郑州X X灵芝胶囊”外，均含有灵芝提取物为原料。用本法对糖肽类的保健品的质量可以用分子量标准来监控。

实施例3.以GL-PPS为对照品的检测灵芝多糖肽产品含量的方法：

1.检测条件试验

1.1波长的选择：以0.25％GL-PPS在分光光度计上扫描(900～450nm)，其最大吸收峰处在761.50nm上，吸收值为0.509。因此，检测吸收波长选择为760nm。

1.2供试液的制备

1.2.1灵芝供试液的制备：准确称取粉碎的灵芝子实体5g置于100mL锥形瓶中，加入20倍体积蒸馏水，60℃下超声15min，冷却后过滤，得滤液①。滤渣再加入10倍体积蒸馏水，60℃下超声15min，冷却后过滤，得滤液②。合并①②滤液，蒸发浓缩，4000rpm离心20分钟，定容100mL。精确量取定容液4mL，加12mL无水乙醇，10000rpm离心10min，沉淀加水溶解，定容于10mL。

1.2.2《科慧灵芝散》供试液的制备：随机抽取《科慧灵芝散》产品5～10袋，撤开混匀，按四分法逐级缩分2g左右，准确称取1g置于小烧杯中，加少许水混匀，移入100ml容量瓶，60℃超声溶解10分钟，冷却后，加水稀释至刻度。摇匀，过滤。精确量取4ml，加12ml无水乙醇搅匀，10000rpm离心10分钟，沉淀加水溶解并定容至10ml。

1.3制备供试液的条件试验

1.3.1超声时间的选择：

表4超声时间试验

1.3.2离心时间的选择：

表5离心时间试验

1.3.3用无水乙醇沉淀多糖肽时间的选择：

表6多糖肽沉淀时间

结论：由上述试验结果可知，制备供试液的最佳条件为：在60℃超声10min，过滤后，滤液可立即离心，离心时间为10min。

2检测方法(分光光度法)

2.1方法学考察

以GL-PPS为对照品检测灵芝类产品，分析方法为福林酚法(Lowry法)，以GL-PPS为对照品制作标准曲线y＝0.0040+0.01056 r²＝0.99729。

2.1.1精密度试验

表7精密度试验(湖南正清胶囊)

2.1.2稳定性试验

表8稳定性试验(草栽灵芝提取物)

2.1.3重现性试验

表9重现性试验：(菌草灵芝提取物)

2.1.4回收率试验

表10回收率试验(科慧灵芝宝)

说明：方法学考察结果表明，GLPPS作为灵芝产品测定的对照品是可行的。

2.2供试液的制备

2.2.1灵芝供试液的制备：准确称取粉碎的灵芝子实体5g置于100mL锥形瓶中，加入20倍体积蒸馏水，60℃下超声30min，冷却后过滤，得滤液①。滤渣再加入10倍体积蒸馏水，60℃下超声20min，冷却后过滤，得滤液②。合并①②滤液，蒸发浓缩，4000rpm离心20分钟，弃渣、清液、定容100mL。精确量取定容液4mL，加12mL无水乙醇，10000rpm离心10min，沉淀加水溶解，定容于10mL。

2.2.2《科慧灵芝散》供试液的制备：随机抽取《科慧灵芝散》产品5～10袋，撤开混匀，按四分法逐级缩分2g左右，准确称取1g置于小烧杯中，加少许水混匀，移入100ml容量瓶，60℃超声溶解10分钟，冷却后，加水稀释至刻度。摇匀，过滤。精确量取4ml，加12ml无水乙醇搅匀，10000rpm离心10分钟，沉淀加水溶解并定容至10ml。

2.2.3改良Lowry法：

(1)原理：Lowry反应是双缩脲方法的发展，第一步涉及到在碱性溶液中铜-蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin氏试剂)，产生深蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)。

(2)方法特点：

A.0.25％GL-PPS光谱扫描结果表明，其最大吸收峰处于760nm，故检测波长做了修改(原方法中检测波长为500nm)。

B.原方法中在加入(Folin氏试剂)后，于20～25℃保温30分钟，进行比色，其结果稳定性较差。经过反复实验结果表明，当加入Folin氏试剂后，于60℃保温30分钟，再进行比色，其结果稳定。

(3)操作方法

A.样品测定

取1mL供试液(约含200-800μg多肽)，加入1mL试剂甲，混匀，于20～25℃放置10分钟。再加入0.5mL试剂乙(Folin氏试剂)，立即振摇均匀，在60℃保温5分钟，然后于750nm处比色。以1mL水代替供试液做空白对照。

B.标准曲线的绘制

称取10mg GL-PPS配制成1000ug/ml，分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mLGL-PPS标品溶液，用水补足到1mL，相当于GL-PPS 0，200，400，600，800，1000(ug/ml)，然后按样品测定方法进行操作，测定光吸收值。以GL-PPS浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，作为定量的依据(见图11)。

C.Folin-酚试剂的配置(均用分析纯试剂)

试剂甲：由下述4种溶液配制。(1)4％碳酸钠(Na₂CO₃)溶液；(2)0.2mol/L氢氧化钠溶液；(3)1％硫酸铜溶液(CuSO₄·5H₂O)溶液；(4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾、酒石酸钠)。在使用前，将(1)与(2)等体积混和配成碳酸钠-氢氧化钠溶液，将(3)与(4)等体积配成硫酸铜-酒石酸钾钠溶液。然后将这两种溶液按50∶1的比例混合，即为Folin-酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。

试剂乙(Folin氏试剂)：购于SIGMA公司产品。

3试验结果

3.1分光光度计上扫描图(见图12)。

3.2标准曲线图：标准曲线用计算回归方程为r相关系数r为0.99957；线性范围在50～500μg/ml，其呈良好线性关系。(见图13)。

3.3稳定性试验

表11样品稳定性试验

由表11可见检测结果稳定，精确称取样品1g，按样品测定方法进行显色测定，每隔30分钟再测一次，持续2小时后4小时再测一次。连续测定三个样品，其RSD在0.74-0.82之间。将2小时内测定稳定的样品，延长至4小时，再度检测，依然稳定(见稳定性试验)。

3.4精密度试验

表12样品精密度试验

由表12可见，精密度高，将待测液分别连续进样5次，RSD在0.09-0.24之间(n＝3)。

3.5重现性实验

表13样品重现性实验

3.6回收率实验

表14回收率实验

结论：据上述试验结果表明，用GL-PPS作为标准品，检测《科慧灵芝散》中灵芝多糖肽含量的方法，其稳定性、精密度、回收率和重现性均符合要求，RSD分别为0.74～0.82％、0.09～0.10％、1.73％、1.26～1.86％。

(三)灵芝药材及其制品的多糖肽含量测定

1 GL-PPS用于灵芝药材活性成分多糖肽的检测，以多糖肽计，不得少于0.15％。

2 对于测定药准字《科慧灵芝散》质量标准应控制以多糖肽计，2g不得少于0.05g。

附20批《科慧灵芝散》多糖肽含量检测结果

Claims (5)

1.一种活性灵芝多糖肽对照品，其具有如下特征：

(1)性状：浅褐色至褐色粉末状；

(2)性质：易溶于水，不溶乙醇、丙酮，乙醚等，易受潮；

(3)纯度：99％以上；

(4)峰位分子量(MP)1.06～1.2×10⁴；

(5)化学结构：鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)和葡萄糖(Glc)组成，含17种氨基酸，糖苷键为β-构型；

其主链是1，3-与1，4-两者交替连接的葡萄糖构成，在部分主链葡萄糖的6位有分支，非还原末端均由葡萄糖构成，也含主链由1，6或1，3连接的β-D-Glcp的构成，在部分1.6-的主链葡萄糖的2或3位有分支；

(6)GL-PPS对照品的百分摩尔比：Rha∶Man∶Glc＝1.49∶9.7∶75.4；

(7)分子量范围为5.0×10³～1.5×10⁴。

2.一种活性灵芝多糖肽对照品的制备方法，其步骤如下：

(1)将灵芝子实体挑选，经切成薄片(2～20mm)或破碎后过40～60目筛网，加10～30倍体积的无离子水，于90℃浸泡2小时，90～100℃提取1.5～2.0h，间歇搅拌翻动，以3000～4000rpm离心，去沉淀取提取液，离心后的残渣再加5～10倍原子实体重量的水，反复提取二次，合并提取上清液；

(2)将上清液浓缩至原投料量的5～10倍，离心除去杂质，留清液，流水透析(36MD)48小时，将透析液浓缩一半，再次离心(10000-12000rpm)，除去杂质，留上清液；

(3)向上清透析液中缓慢加入透析液的三倍体积95％乙醇，搅拌均后，置4～5℃冰箱收集沉淀物，将沉淀溶于水，加入其4倍体积无水乙醇，4～5℃放置，离心(10000-12000rpm)，除去清液，沉淀物用丙酮和乙醚洗涤沉淀，置真空低温干燥得赤灵芝多糖肽粗品GL-PP；

(4)用浓度为1％的灵芝多糖肽GL-PP溶液，在不断搅拌中缓慢滴加无水乙醇至1∶0.5(V/v)，置冰箱过夜，离心(10000-12000rpm)，用无水乙醇分级沉淀，收集33％乙醇沉淀部分，置冰箱真空干燥得第1级成分为GL-PP1得率为27～30％；

(5)取步骤(4)上清液再滴加无水乙醇至1∶1(V/v)同上处理，收集33～50％的沉淀，置冰箱真空干燥得第2级成分为GL-PP2得率为20～30％；将上清液继续再加乙醇至1∶1.5(V/v)，得第3级组分GL-PP3得率为20～25％。置真空低温干燥得GL-PP3多糖肽粗品；

(6)取GL-PP3以1∶10比例加水微热溶解，离心10000-12000rpm去杂质，通过聚丙烯胺凝胶Bio-Gel P-10Gel 45～90μm wet柱分离，用含50mol·L^-1NaCl的5.8-6.0pH＝0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液0.2mol/L收集洗脱液，流水透析12～48h，蒸馏水透析4～12h，取袋内液浓缩，用三倍无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀部分，冷冻干燥，得浅褐色粉末状物质为赤芝多糖肽GL-PPZ；

GL-PPZ再以Bio-Gel P-30柱分离同步骤(6)法收集GL-PPS，得率72％。经HPLC检测结果为单一多糖，纯度为99％以上，得率为22％。

3.一种活性灵芝多糖肽对照品在鉴别灵芝类药材或测定灵芝类药材、包含糖肽类产品活性成分多糖肽含量测定中的应用。

4.一种活性灵芝多糖肽对照品在测定灵芝提取物含糖肽类中多糖肽含量。

5.一种活性灵芝多糖肽对照品对照的峰位分子量检测灵芝类产品中峰位分子量，评价《灵芝胶囊》产品质量。

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