CN102190739A - 一种提取香菇多糖的工艺及香菇多糖分子量分布测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取三螺旋香菇多糖的工艺，所述的工艺以香菇子实体为原料，通过粉碎、碱水加热提取、过滤、浓缩、醇沉、冷冻干燥得粗品；粗品经溶解、搅拌、过滤、沉淀，酸洗涤、碱溶解、Sevag法除蛋白、乙醇沉淀、乙醚洗脱、干燥得香菇多糖精制品。经测定，该精制品保持了香菇多糖的三螺旋结构不被破坏，并能有效提高香菇多糖精制品的收率；此外，本发明还公开了一种新的香菇多糖的分子量分布测定方法。采用高效凝胶渗透色谱法，以香菇多糖系列标准品直接绘制标准曲线，测定本品精制品重均分子量为40-80万。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物化学，公开了一种可用做消化系统等恶性肿瘤的辅助治疗的三螺旋香菇多糖的提取分离新工艺。属于香菇多糖分离纯化的技术领域，并涉及多糖分子量及其分布检测领域。
背景技术
香菇(Lentinnula edodes)是我国传统的著名食用菌，也是一种著名的药用菌，在世界上最早被人工驯化栽培。香菇药用部位为子实体，1969年，日本学者千原吴郎从香菇子实体中提取、分离、纯化研制成的多糖(Nature 1969，p687-688)，即香菇多糖，日本名称为レンチナン，英文名为Lentinan，是一种免疫增强剂，被证明其在抗肿瘤方面具有明显的作用。日本厚生省于1985年批准上市并外销，用于癌症的辅助治疗，取得满意的临床疗效。香菇多糖商品名难能治、力提能，英文名Lentinan，是一种生物免疫调节剂，可用于抗肿瘤辅助治疗。
香菇多糖有明确的物理和化学特征，结构组成明确，β-(1→3)为主链、β-(1→6)为侧链，分子量40-80万，旋光[α]20 D＝+19.5°～21.5°，VKBT maxcm-1890有β-葡萄糖的特征吸收，并有13CNMR数据等佐证其结构，结构式已经确定，如下。
自然界中很多多糖由于其特定的化学结构和分子间氢键的作用而具有很高的刚性，在溶液中能保持螺旋构象。具有活性的香菇多糖即是具有三螺旋构象的多糖。它依靠分子内氢键维持其螺旋结构，而由分子间的氢键维持多股螺旋链。然而，在强碱条件或者强极性溶剂及高温下，分子内和分子间氢键会被取代，使螺旋结构破坏，这个过程称之为螺旋多糖的变性。因此在提取过程中应避免对三螺旋结构的破坏才能使其保留生物活性，发挥更大疗效，而目前很多香菇多糖的提取工艺为了保留其三螺旋结构导致产品收率很低，而一些工艺为了提高收率采用高浓度的碱则破坏了三螺旋结构。
香菇中成分复杂，为了提高多糖的纯度往往要通过很多步骤进行处理，工艺非常复杂，这就导致最终的成品收率不高。日本学者千原吴郎在Nature上发表的工艺表明，其提取的香菇多糖的收率只有0.365‰，而国内大多发表的文献中香菇多糖的提取收率都维持在万分之几到千分之一的水平。
如中国专利CN101261203A，专利申请号200710051644.3的发明公开了一种碱溶性香菇多糖的提取、分离、纯化及分子量的测定方法，该方法以香菇子实体为原料，通过粉碎、碱水浸提、过滤、浓缩、洗涤、级分、低温干燥得粗品、粗品溶解、离心、DEAE纤维素柱除杂纯化、离子交换树脂吸附脱色、过滤通过不同分子量的膜包超滤浓缩。采用GPC激光光散射凝胶色谱仪测定分子量，按测定分子量的范围，再分别装入透析袋透析、冻干得分子量为10-100万Da的碱溶性香菇多糖。该方法制得的香菇多糖虽具有较高的纯度，但其使用高浓度的碱液提取香菇多糖，使得香菇多糖的螺旋结构容易被高浓度的碱破坏失去生物活性，从而导致产品的收率过低。此外，该专利公开的分子量测定方法主要是依赖仪器，是通过多角度激光光散射来进行测定，如果分子的形状不是很规则，测定结果就存在较大的误差，并且测定分子量的仪器价格十分昂贵，不适于推广。
现有的香菇多糖的分子量测定目前大多采用激光光散射法和普适校正法，激光光散射法设备昂贵，而普适校正法需要分别测定对照品和样品的k与α值，并仍需用激光光散射法确定样品的不同级分的绝对分子量以及各级分的粘度，再通过若干公式进行繁杂的计算，所以操作起来比较繁琐。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于寻求一种新的适合工业化生产，在不破坏香菇多糖三螺旋结构的前提下提高香菇多糖收率的提取分离新工艺。
为达到该目的，本发明采用如下技术手段：一种提取三螺旋香菇多糖的工艺，包括如下步骤：(1)取香菇子实体进行前处理；(2)将前处理后的香菇子实体进行碱水加热提取处理，得提取液；(3)将提取液过滤，滤液浓缩后加入醇溶液使其沉淀，沉淀干燥后得香菇多糖粗品；(4)粗品经溶解后过滤，在滤液中加入沉淀剂使其沉淀，得沉淀物；(5)沉淀物用酸溶液洗涤；(6)将酸溶液洗涤后的沉淀溶解于碱溶液；(7)沉淀物去蛋白；(8)加入醇溶液使其沉淀，收集沉淀物；(9)沉淀物经洗涤，干燥后得香菇多糖精制品；所述的步骤(2)中碱水加热提取，所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠或碳酸钾，优选氢氧化钠；所用碱浓度为0.05mol/L-0.1mol/L；优选0.08mol/L；碱水加热提取的温度范围为65℃-95℃，优选85℃。
所述的步骤(3)中的醇溶液采用体积浓度为40％-90％的乙醇，优选60％；所述的步骤(3)中的干燥采用低温冷冻干燥。
所述的步骤(4)中的沉淀剂选用十六烷基三甲基氢氧化铵或十六烷基三甲基溴化铵，优选十六烷基三甲基氢氧化铵，沉淀剂的浓度为0.1-0.4mol/L，优选0.2mol/L。
所述的步骤(5)中的酸溶液为盐酸或乙酸，优选乙酸；所用酸的体积浓度为10％-80％，优选50％，酸溶液的用量为沉淀物的8-12倍，优选10倍。
所述的步骤(6)中的碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠或碳酸钾，优选氢氧化钠；所用碱浓度为5％-30％，优选10％。
所述的步骤(7)采用Sevag法去蛋白，所用试剂为氯仿和正丁醇，二者的体积比为3∶1-6∶1，优选为4∶1。
所述的步骤(9)中的干燥为低温干燥，温度为10℃-30℃，优选20℃。
香菇多糖提取、分离、纯化的工艺流程图见图1，香菇多糖的红外色谱图见图2。
为了进一步摸索出最佳的提取工艺，在本发明的研发过程中，发明人做了大量的对比实验以筛选出合适的提取条件，从而达到本发明的目的。
1、碱水提取中碱液浓度对香菇多糖三螺旋结构及产品收率的影响实验方法：取香菇子实体10kg，粉碎，加入各种浓度的碱溶液，于80℃提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量50％乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10％氢氧化钠洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇4∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品。计算纯度及收率，以不同碱浓度提取的样品照中国药典2005年版二部附录VIG黏度测定法第三法测定各样品的特性粘数，并以特性粘数和碱浓度绘制曲线，来考察碱浓度对香菇多糖三螺旋结构的影响。(特性粘数(intrinsic viscosity)[η]是高聚物溶液粘度的最常用的表示方法，它和分子量符合Mark-Howink方程：[h]＝K×Mwa，k和a是常数，因此可以通过特性粘数来反应分子量的变化情况)。
实验结果：见表1和图3(碱浓度对香菇多糖三螺旋结构的影响(以特性粘数变化体现))。
表1碱液浓度对产品的含量及收率的影响
由图3可知，当碱浓度大于0.01mol/L时，所得到香菇多糖精制品的粘度快速下降，可见其三螺旋结构遭到破坏，变成了单链结构。因此优选的碱浓度应小于0.1mol/L。综合结构、纯度及收率，优选的碱浓度为0.08mol/L。
| NaOH浓度(mol/L) | 0.01 | 0.03 | 0.05 | 0.08 | 0.1 | 0.15 | 0.3 | 0.5 |
| 精制品质量(g) | 19 | 22 | 30 | 38 | 40 | 28 | 21 | 15 |
| 含量(％) | 85.2 | 90.4 | 97.5 | 98.9 | 96.9 | 92.5 | 88.7 | 82.8 |
| 收率(‰) | 1.9 | 2.2 | 3 | 3.8 | 4 | 2.8 | 2.1 | 1.5 |
| 特性粘数 | 102 | 96 | 90 | 88 | 86 | 48 | 42 | 36 |
2、碱水提取中温度对产品收率的影响实验方法：取香菇子实体10kg，粉碎，加入0.08mol/L浓度的NaOH溶液，于各实验温度下提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量50％乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10％氢氧化钠洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇4∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品。计算纯度及收率。
实验结果：见表2。
表2碱液提取的温度对产品的含量及收率的影响
结论：实验结果表明：在相同的提取条件下，调整碱液提取时碱液的浓度和提取温度对产品的纯度、收率都存在较大影响，发明人在大量实验数据的基础上认为，当碱液浓度为0.05-0.1mol/L；优选0.08mol/L；温度范围为65℃-95℃，优选温度为85℃时，该提取工艺能够获得高纯度高产量的香菇多糖精制品。
| 提取温度(℃) | 30 | 40 | 50 | 60 | 65 | 80 | 85 | 95 |
| 精制品质量(g) | 18 | 22 | 25 | 24 | 26 | 32 | 39 | 38 |
| 含量(％) | 79.8 | 82.4 | 84.3 | 87.8 | 90.6 | 97.5 | 98.8 | 96.8 |
| 收率(‰) | 1.8 | 2.2 | 2.5 | 2.4 | 2.6 | 3.2 | 3.9 | 3.8 |
3、碱水溶解中浓度对产品收率的影响实验方法：取香菇子实体10kg，粉碎，加入0.08mol/L浓度的NaOH溶液，于各实验温度下提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量50％乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量不同浓度的氢氧化钠洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇4∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品，计算纯度及收率。
实验结果：见表3。
表3碱液溶解的浓度对产品的含量及收率的影响
结论：实验结果表明：在相同的提取条件下，调整碱液溶解时碱液的浓度对产品的纯度、收率都存在较大影响，发明人在大量实验数据的基础上认为，当碱液浓度为5％-30％；优选10％时，该提取工艺能够获得高纯度高产量的香菇多糖精制品。
| 碱液浓度(％) | 1 | 3 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| 精制品质量(g) | 18 | 22 | 25 | 24 | 26 | 32 | 39 | 38 |
| 含量(％) | 69.5 | 83.1 | 95.3 | 98.8 | 96.6 | 95.5 | 93.8 | 88.4 |
| 收率(‰) | 4.8 | 4.2 | 3.9 | 3.8 | 3.6 | 3.2 | 2.9 | 2.5 |
香菇多糖提取、分离、纯化详细操作工艺步骤：取香菇子实体，粉碎，加20倍量0.05-0.1mol/L氢氧化钠水溶液，于65℃-95℃提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量50％乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10％氢氧化钠洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇4∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品。经检测香菇多糖重均分子量均在40-80万范围内，经检测其具有三螺旋结构，其性状、溶解性、比旋度、红外、熔点、酸碱度、干燥失重、含量等指标均与香菇多糖国家标准的要求保持一致。
采用上述方法制得的香菇多糖精制品分子量在40-80万，含量大于96％，收率大于3‰。经测定，本品保持了香菇多糖的三螺旋结构，比传统香菇多糖提取工艺的收率提高约5-10倍。本方法工艺先进，适合大批量工业化生产，在保证产品质量稳定的前提下，可以获得高纯度的精制品，并将产品的收率提高到目前传统工艺的5-10倍。
本发明的第二目的在于建立一种简便准确的分子量分布测定方法对香菇多糖进行质量控制。该方法直接用香菇多糖不同级分的对照品作为标准品，直接绘制标准曲线，检测方法简单，结果准确。
为实现本发明的第二目的，本发明采用如下技术手段：一种香菇多糖分子量分布测定方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1、制备至少5种不同分子量的香菇多糖分级分离标准品；2、通过激光光散射法测定香菇多糖分级分离标准品的重均分子量；3、通过高效凝胶渗透色谱法和GPC软件确定香菇多糖分级分离标准品的保留时间，根据香菇多糖分级分离标准品的保留时间与重均分子量，绘制标准曲线；4、取香菇多糖样品，通过高效凝胶渗透色谱法和GPC软件计算其保留时间；5、根据香菇多糖样品的保留时间与标准曲线，确定其分子量及其分布。
所述的高效凝胶渗透色谱，固定相采用1-4根多糖专用凝胶柱，分离范围可选用1000-4000000道尔顿，优选固定相为Ohpak SB-803、SB-804、SB-805HQ串联而成的凝胶柱组，采用的流动相为水、盐溶液或缓冲盐溶液，优选0.1mol/L的硫酸钠溶液，所述的香菇多糖分级标准品重均分子量范围为20万-95万，优选5种香菇多糖分级分离标准品重均分子量分布为89.6×104，57.4×104，41.9×104，30.8×104，23.5×104。
所述的标准曲线，其回归方程为：Y＝8.0596-0.0524X，r＝0.9999。
香菇多糖分子量及其分布测定方法通过下列方法实施：1、仪器：LC-10ATVP恒流泵，R1 Detecor K-2301示差折光检测器，GPC凝胶色谱数据工作站，柱温箱，其他像适应的高效液相色谱仪器同样适用。
2、色谱柱：凝胶色谱柱，分离范围可选用1000-4000000道尔顿，可采用2根或3根色谱柱串联。如日本OHpak凝胶色谱柱SB-803、SB-804、SB-805。
3、流动相：水、盐溶液或缓冲盐溶液，如0.1mol/L硫酸钠溶液。
4、其它色谱条件：柱温：25℃，流速：0.5ml/min，进样量：100-200μl5、系统适应性实验分析状态下实验表明，理论板数按乙二醇峰(0.25％乙二醇的水溶液)计算，大于3000。参考国家标准将本品理论板数定为不小于3000(0.25％乙二醇的水溶液峰计)。
6、标准曲线的绘制(1)制备至少5种不同分子量的香菇多糖分级分离标准品；本发明所使用的不同分子量的分级分离标准品可通过如下方式获得：将香菇多糖原料药(已经经过结构确证并全检合格的样品)通过分子筛装柱，将样品用碱液溶解后上柱，达到一定的上样量后停止上样，再用碱液洗脱，下面分步收集洗脱液，并用紫外测定吸收值，将吸收值相近部分的样品合并，再透析后冻干即可获得不同分子量的分级分离标准品。此外，也可以通过现有技术的其他方法制备不同分子量的香菇多糖分级分离标准品。
制备至少5种不同分子量的香菇多糖分级分离标准品，优选5种，为了提高本方法的实用性，各香菇多糖分级分离标准品的重均分子量通常介于20万-95万之间。
(2)通过激光光散射法确定香菇多糖分级分离标准品的重均分子量，本发明所述的五个标准品的重均分子量系委托国家标准物质研究中心通过激光光散射法测定。其重均分子量分别为89.6×104，57.4×104，41.9×104，30.8×104，23.5×104。本发明所使用的香菇多糖分级分离标准品不限于上述5种，选用至少5个重均分子量范围介于20万-95万之间的其他香菇多糖分级分离标准品，也可以建立一个标准曲线和回归方程，实现本发明。
现有技术中公开了以激光光散射法测定香菇多糖分子量的应用。如Triple Helix ofβ-D-Glucan from Lentinus Edodes in 0.5M NaCl Aqueous Solution Characterized By LightScattering(Polymer Journal，Vol.33，No.4，pp317-321)(2001)(光散射研究来自香菇的β-D-葡聚糖在0.5mnacl水溶液的三螺旋结构)中披露了可采用光散射法测定香菇多糖的分子量。此外，中国专利CN101261203A也公开了光散射法用于香菇多糖的分子量测定及其分布。
(3)通过高效凝胶渗透色谱法和GPC软件确定香菇多糖分级分离标准品的保留时间，根据香菇多糖分级分离标准品的保留时间与重均分子量，绘制标准曲线；取5个分子量不同的标样各4mg，重均分子量为89.6×104，57.4×104，41.9×104，30.8×104，23.5×104，分别加0.5mol/L氢氧化钠溶液0.5ml使溶胀，研磨，溶解，分别再滴加0.5mol/L盐酸溶液至pH试纸呈7～8，加水至2.0ml，摇匀，过滤，制成每1ml中含2.0mg的溶液。分别吸取200μl进样，记录色谱图，应用GPC软件绘制标准曲线，其回归方程为：Y＝8.0596-0.0524X，r＝0.9999见表3，图4。
表3香菇多糖标样线性考察结果表
7、样品分子量及其分布的测定(4)取香菇多糖样品，通过高效凝胶渗透色谱法和GPC软件计算其保留时间。
| 编号 | 已知分子量(Mw) | 保留时间(min) |
| 1 | 896000 | 40.502 |
| 2 | 574000 | 44.751 |
| 3 | 419000 | 45.251 |
| 4 | 308000 | 48.751 |
| 5 | 235000 | 51.751 |
取香菇多糖样品(1，2，3)各4mg，分别加0.5mol/L氢氧化钠溶液0.5ml使溶胀，研磨，溶解，分别再滴加0.5mol/L盐酸溶液至pH试纸呈7～8，加水至2.0ml，摇匀，过滤，制成每1ml中含2.0mg的溶液。分别吸取200μl进样，记录色谱图。
(5)根据香菇多糖样品的保留时间与标准曲线，确定其分子量及其分布。
8、HPGPC检测系统重复性的考察为考察HPGPC系统的重复性，将香菇多糖样品1重复处理进样6次，其结果见表4。
表4重复进样6次的HPGPC图谱参数比较表
试验结果表明，RSD＝1.0％，本方法的重复性良好。
| 测定 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RT(min) | 43.578 | 43.275 | 43.777 | 43.152 | 43.152 | 43.407 |
| Mw | 561321 | 573924 | 572620 | 567653 | 578794 | 570691 |
| Mn | 412294 | 431415 | 436737 | 430858 | 447011 | 436822 |
| Mw/Mn | 1.36 | 1.33 | 1.31 | 1.32 | 1.29 | 1.31 |
9、样品溶液稳定性的考察为考察香菇多糖样品溶液的稳定性，将香菇多糖样品1每间隔2小时进样5次，其结果见表5。
表5样品溶液稳定性考察结果表
试验结果表明，RSD＝0.8％，本方法的稳定性良好。
| 时间(hr) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 |
| RT(min) | 43.377 | 43.023 | 43.008 | 43.140 | 43.120 |
| Mw | 575201 | 574978 | 576457 | 574452 | 584923 |
| Mn | 457244 | 457047 | 423575 | 421517 | 436795 |
| Mw/Mn | 1.26 | 1.26 | 1.36 | 1.36 | 1.34 |
10、样品测定结果：实验结果列于表6，图5.1、5.2、5.3。三批样品的重均分子量均在40-80万之间，且大于2万的组分超过90％。
表6三批香菇多糖原料的分子量测定结果表
结论：上述实验结果表明，香菇多糖样品的重均分子量均在40～80万之间。完全符合香菇多糖国家标准的相关规定。该方法十分简便可行，易于推广普及，且测定结果稳定、可靠。
| 批号 | Mw | Mn | Mw/Mn | Mw大于2万组分含量(％) |
| 090406 | 580517 | 429877 | 1.36 | ＞90 |
| 090412 | 514701 | 412903 | 1.25 | ＞90 |
| 090418 | 541249 | 393829 | 1.37 | ＞90 |
附图说明
图1香菇多糖提取、分离、纯化的工艺流程图；图2香菇多糖红外色谱图；图3碱浓度对香菇多糖三螺旋结构的影响(以特性粘数变化体现)；图4香菇多糖GPC标准曲线图；图5.1香菇多糖样品1的GPC色谱图；图5.2香菇多糖样品2的GPC色谱图；图5.3香菇多糖样品3的GPC色谱图。
具体实施方式
香菇多糖提取分离实施实例实施例1：取香菇子实体10kg，粉碎，加20倍量0.05mol/L氢氧化钾水溶液，于65℃提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入40％的乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖300g。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量50％乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10％氢氧化钾洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇3∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品30g，产品的含量为96.5％，收率为3‰。
实施例2：取香菇子实体10kg，粉碎，加20倍量0.08mol/L氢氧化钠水溶液，于85℃提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入60％的乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖320g。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量50％乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10％氢氧化钠洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇4∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品40g。，产品的含量为96.9％，收率为4‰。
实施例3：取香菇子实体15kg，粉碎，加20倍量0.08mol/L氢氧化钠水溶液，于90℃提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入60％的乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖450g。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量50％乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10％氢氧化钠洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇4∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品58g，产品的含量为97.2％，收率为3.8‰。
实施例4：取香菇子实体20kg，粉碎，加20倍量0.08mol/L氢氧化钠水溶液，于85℃提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入90％的乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖610g。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量50％乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10％氢氧化钠洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇4∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品78.5g，产品的含量为98.9％，收率为3.9‰。
实施例5：取香菇子实体15kg，粉碎，加20倍量0.08mol/L碳酸氢钠水溶液，于95℃提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入60％的乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖460g。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量80％乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10％碳酸氢钠洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇3∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品60g，产品的含量为97.8％，收率为4‰。
实施例6：取香菇子实体10kg，粉碎，加20倍量0.05mol/L氢氧化钾水溶液，于65℃提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入40％的乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖300g。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量10％盐酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10％氢氧化钾洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇6∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品32g，产品的含量为97.5％，收率为3.2‰。
实施例7：取香菇子实体12kg，粉碎，加20倍量0.05mol/L氢氧化钠水溶液，于95℃提取12小时，过滤，滤液减压浓缩相对密度为1.05(50℃)，放冷，加入乙醇沉淀，使含醇量达到60％，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖360g。将上述粗多糖加400倍量纯化水溶解，过滤，滤液加入0.2mol/L的十六烷基三甲基氢氧化铵至pH为12，使产生沉淀，收集沉淀物。沉淀物用10倍量50％乙酸洗涤二次，沉淀最后用10倍量10％氢氧化钠洗涤二次，合并碱溶液，用saveg法(氯仿-正丁醇4∶1的混合液)去蛋白，有机溶媒用量为样液体积的1/4，共去除三次；溶液加入乙醇使沉淀，收集沉淀物，沉淀物用乙醚洗涤，室温下真空干燥得香菇多糖精制品36g，产品的含量为96.8％，收率为3‰。
香菇多糖分子量及其分布测定方法实施实例实施例8：制备5个分子量不同的标样各4mg，重均分子量为89.6×104，57.4×104，41.9×104，30.8×104，23.5×104，分别加0.5mol/L氢氧化钠溶液0.5ml使溶胀，研磨，溶解，分别再滴加0.5mol/L盐酸溶液至pH试纸呈7～8，加水至2.0ml，摇匀，过滤，制成每1ml中含2.0mg的溶液。分别吸取200μl进样，记录色谱图，应用GPC软件绘制标准曲线，样品前处理方法同对照品。以0.1mol/L硫酸钠溶液为流动相，Ohpak SB-803、SB-804、SB-805HQ三根串联为固定相，柱温25℃，流速0.5ml/min，以示差折光检测器检测，记录试验结果，通过GPC专用软件计算，测定样品1的重均分子量，结果分子量为58万，符合40-80万的规定。
实施例9：制备5个分子量不同的标样各4mg，重均分子量为89.6×104，57.4×104，41.9×104，30.8×104，23.5×104，分别加0.5mol/L氢氧化钠溶液0.5ml使溶胀，研磨，溶解，分别再滴加0.5mol/L盐酸溶液至pH试纸呈7～8，加水至2.0ml，摇匀，过滤，制成每1ml中含2.0mg的溶液。分别吸取200μl进样，记录色谱图，应用GPC软件绘制标准曲线，样品前处理方法同对照品。以0.1mol/L硫酸钠溶液为流动相，Ohpak SB-803、SB-804、SB-805HQ三根串联为固定相，柱温25℃，流速0.5ml/min，以示差折光检测器检测，记录试验结果，通过GPC专用软件计算，测定样品2的重均分子量，结果分子量为51万，符合40-80万的规定。
实施例10：制备5个分子量不同的标样各4mg，重均分子量为89.6×104，57.4×104，41.9×104，30.8×104，23.5×104，分别加0.5mol/L氢氧化钠溶液0.5ml使溶胀，研磨，溶解，分别再滴加0.5mol/L盐酸溶液至pH试纸呈7～8，加水至2.0ml，摇匀，过滤，制成每1ml中含2.0mg的溶液。分别吸取200μl进样，记录色谱图，应用GPC软件绘制标准曲线，样品前处理方法同对照品。以0.1mol/L硫酸钠溶液为流动相，Ohpak SB-803、SB-804、SB-805HQ三根串联为固定相，柱温25℃，流速0.5ml/min，以示差折光检测器检测，记录试验结果，通过GPC专用软件计算，测定样品3的重均分子量，结果分子量为54万，符合40-80万的规定。
上述实施例中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施例仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中专业技术人员对本发明的技术方案作出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种提取三螺旋香菇多糖的工艺，包括如下步骤：
(1)取香菇子实体进行前处理；
(2)将前处理后的香菇子实体进行碱水加热提取处理，得提取液；
(3)将提取液过滤，滤液浓缩后加入醇溶液使其沉淀，沉淀干燥后得香菇多糖粗品；
(4)粗品经溶解后过滤，在滤液中加入沉淀剂使其沉淀，得沉淀物；
(5)沉淀物用酸溶液洗涤；
(6)将酸溶液洗涤后的沉淀溶解于碱溶液；
(7)沉淀物去蛋白；
(8)加入醇溶液使其沉淀，收集沉淀物；
(9)沉淀物经洗涤，干燥后得香菇多糖精制品；
其特征在于：所述的步骤(2)中碱水加热提取，所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠或碳酸钾，优选氢氧化钠；所用碱浓度为0.05mol/L-0.1mol/L；优选0.08mol/L；碱水加热提取的温度范围为65℃-95℃，优选85℃。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述的步骤(3)中的醇溶液采用体积浓度为40％-90％的乙醇，优选60％；所述的步骤(3)中的干燥采用低温冷冻干燥。
3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于：所述的步骤(4)中的沉淀剂选用十六烷基三甲基氢氧化铵或十六烷基三甲基溴化铵，优选十六烷基三甲基氢氧化铵，沉淀剂的浓度为0.1-0.4mol/L，优选0.2mol/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的工艺，其特征在于：所述的步骤(5)中的酸溶液为盐酸或乙酸，优选乙酸；所用酸的体积浓度为10％-80％，优选50％，酸溶液的用量为沉淀物的8-12倍，优选10倍。
5.根据权利要求1-4任一项所述的工艺，其特征在于：所述的步骤(6)中的碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠或碳酸钾，优选氢氧化钠；所用碱浓度为5％-30％，优选10％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的工艺，其特征在于：所述的步骤(7)采用Sevag法去蛋白，所用试剂为氯仿和正丁醇，二者的体积比为3∶1-6∶1，优选为4∶1。
7.根据权利要求1-6任一项所述的工艺，其特征在于所述的步骤(9)中的干燥为低温干燥，温度为10℃-30℃，优选20℃。
8.一种香菇多糖分子量分布测定方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)、制备至少5种不同分子量的香菇多糖分级分离标准品；
(2)、通过激光光散射法测定香菇多糖分级分离标准品的重均分子量；
(3)、通过高效凝胶渗透色谱法和GPC软件确定香菇多糖分级分离标准品的保留时间，根据香菇多糖分级分离标准品的保留时间与重均分子量，绘制标准曲线；
(4)、取香菇多糖样品，通过高效凝胶渗透色谱法和GPC软件计算其保留时间；
(5)、根据香菇多糖样品的保留时间与标准曲线，确定其分子量及其分布。
9.如权利要求8所述的分子量分布测定方法，其特征在于：所述的高效凝胶渗透色谱，固定相采用1-4根多糖专用凝胶柱，分离范围可选用1000-4000000道尔顿，优选固定相为Ohpak SB-803、SB-804、SB-805HQ串联而成的凝胶柱组，采用的流动相为水、盐溶液或缓冲盐溶液，优选0.1mol/L的硫酸钠溶液，所述的香菇多糖分级标准品重均分子量范围为20万-95万，优选5种香菇多糖分级分离标准品重均分子量分布为89.6×104，57.4×104，41.9×104，30.8×104，23.5×104。
10.如权利要求9所述的分子量分布测定方法，其特征在于：所述的标准曲线，其回归方程为：Y＝8.0596-0.0524X，r＝0.9999。
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