CN111217932A - 一种裙带菜硫酸化多糖及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种裙带菜硫酸化多糖及其应用,所述裙带菜硫酸化多糖是将将裙带菜粉末加入离子水中浸提,收集滤液浓缩后加入MgCl2,过滤后超滤,乙醇沉淀获得的。本发明裙带菜硫酸化多糖平均分子量为846kDa,硫酸基含量为10‑20%,岩藻糖含量为15‑20%;本方法简单便捷,经济省时,绿色高效,便于工业规模化生产,制备的裙带菜硫酸化多糖含量高,低毒安全;本发明提供的裙带菜硫酸化多糖对代谢综合征有明显的缓解作用。
Description
(一)技术领域
本发明涉及硫酸化多糖的提取,特别涉及一种裙带菜硫酸化多糖及其应用。
(二)背景技术
裙带菜(Undaria pinnatifida)是一种可食用褐藻,在韩国,中国和日本是备受喜爱的食物之一。硫酸化多糖是它最主要的活性化合物之一。近年来,从裙带菜中提取的硫酸化多糖,其多种生物学活性被广泛研究,包括抗氧化,抗炎,抗癌,抗肥胖活性。
代谢综合征是指人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱的病理状态,是一组复杂的代谢紊乱症候群,是导致糖尿病心脑血管疾病的危险因素。代谢综合征病因尚未明确,目前认为是多基因和多种环境相互作用的结果,与遗传、免疫等均有密切关系。
现有的裙带菜硫酸化多糖的提取方法有水提法、酸提法、碱提法、微波辅助提取和酶辅助提取等。酸提法和碱提法对环境的污染和设备的损耗较为严重,微波辅助提取和酶辅助提取对提取设备有较大的要求,生产成本高,很难做到规模化生产,这限制了裙带菜硫酸化多糖的综合开发。鉴于此,研究出一种裙带菜硫酸化多糖能够适合工业化生产的方法是从业人员所迫切希望地。水提法是最有可能用于裙带菜硫酸化多糖规模化生产的方法,该方法简单便捷、经济省时、绿色高效,便于放大。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种快速简便、大量提取能缓解代谢综合征的裙带菜硫酸化多糖的方法,该方法效率较高,对设备损耗较小,达到快速提取纯化目标产物的目的。
本发明采用的技术方案是:
本发明提供一种裙带菜硫酸化多糖,所述裙带菜硫酸化多糖按以下步骤制备:
(1)热水提取:将裙带菜粉末加入离子水中,在60-100℃的条件下加热浸提2-5小时,冷却至40-50℃,将浸提液过滤,收集滤液;
(2)除海藻胶:将步骤(1)滤液减压浓缩至5-10倍体积,缓慢加入MgCl2使MgCl2终浓度为0.10-0.25mol/L,静置15min-4h,过滤,收集滤液;
(3)超滤:将步骤(2)滤液进行超滤脱盐,超滤至透过液电导率≤300μs/cm,得到滤液;所述超滤采用截留分子量为1-10kDa的超滤膜;
(4)乙醇沉淀:向步骤(3)滤液中加入无水乙醇,在0~4℃下静置醇沉4~24h(优选4℃沉淀8h),过滤,收集滤饼经无水乙醇洗涤后,烘干,得到所述裙带菜硫酸化多糖。
进一步,步骤(1)所述裙带菜粉末是将新鲜裙带菜清洗后,于60-70℃温度下干燥至恒重,粉粹至40-80目。
进一步,步骤(1)所述去离子水体积加入量以裙带菜粉末重量计为20-40ml/g,优选20ml/g。
进一步,步骤(1)浸提条件优选为100℃浸提2h。
进一步,步骤(2)中MgCl2终浓度优选为0.25mol/L。
进一步,步骤(3)中所述超滤膜的截留分子量优选为2.5kDa。
进一步,步骤(4)无水乙醇体积加入终浓度为70-80%,优选80%。
进一步,步骤(4)中烘干温度为50-70℃。
本发明还提供一种所述裙带菜硫酸化多糖在制备治疗代谢综合征药物中的应用,所述的药物为降低血糖的药物,或者所述药物为减少脂肪堆积的药物。
与现有方法相比,本发明的有益效果在于:1)本发明裙带菜硫酸化多糖平均分子量为846kDa,硫酸基含量为10-20%,岩藻糖含量为15-20%;2)本方法简单便捷,经济省时,绿色高效,便于工业规模化生产,制备的裙带菜硫酸化多糖含量高,低毒安全;3)本发明提供的裙带菜硫酸化多糖对代谢综合征有明显的缓解作用。
(四)附图说明
图1为裙带菜硫酸化多糖的分子量检测图谱。
图2为小鼠12周的体重变化趋势。
图3为小鼠的禁食血糖浓度,注:“**”表示P<0.01。
图4为小鼠口服葡萄糖的血糖浓度。
图5为小鼠口服葡萄糖耐受的AUC。
图6为小鼠注射胰岛素后的血糖浓度。
图7为小鼠注射胰岛素后抵抗的AUC。
图8为小鼠脂肪组织/体重的指数。
(五)具体实施方式
实施例1:裙带菜硫酸化多糖的提取
1、硫酸化多糖
将裙带菜清洗后于60-70℃干燥至恒重,粉碎至80目,取裙带菜粉末8kg放入200L提取罐中,加入160L的水,搅拌均匀后,蒸汽加热至100℃,浸提2小时,冷却至50℃,将提取液用筛板过滤,滤液减压浓缩至10倍体积后,获得浓缩液;向浓缩液中边搅拌边加入MgCl2使其终浓度为0.25mol/L,搅拌均匀后静置4h,过滤,滤液以截留分子量为2.5kDa超滤膜进行超滤脱盐,超滤至透过液电导率≤300μs/cm,滤液加入体积终浓度为80%的乙醇,4℃静置8h后,抽滤,滤饼用200mL无水乙醇洗涤抽干,60℃烘干至恒重,得到裙带菜硫酸化多糖(记为UpW1)72.8g。
实施例2裙带菜硫酸化多糖的理化性质的检测
(1)总糖含量检测:精确称量110℃烘干至恒重的0.01g岩藻糖标准品,用去离子水定容至100mL,配成0.1mg/mL的岩藻糖标准液。移取岩藻糖标准液0mL、1mL、3mL、5mL、7mL、9mL于10mL容量瓶中,去离子水定容,作为待测标品溶液。分别取1mL上述各个浓度的待测标品溶液于试管中,向其中分别加入体积浓度5%苯酚水溶液1mL,迅速加入5mL浓硫酸(质量浓度98%),涡旋混合,490nm处测定吸光度,以葡萄糖浓度为横坐标,以A490为纵坐标,绘制标准曲线,曲线方程为y=0.0015x+0.0555,R2=0.9965,y为A490 nm吸光值,x为糖浓度mg/mL。
精确称取适量实施例1方法制备的裙带菜硫酸化多糖,用去离子水配成0.1mg/mL多糖溶液,准确吸取1mL多糖溶液,按上述操作步骤测定吸光值,用标准曲线计算裙带菜硫酸化多糖中的总糖含量,结果见表2。
(2)硫酸根含量检测:准确称取实施例1方法制备的裙带菜硫酸化多糖样品0.5g,放入25ml水解管中,加入1mol/L盐酸水溶液15mL,封口,在105℃水解4h,冷却至室温,使用快速定量滤纸(购自抚顺滤纸厂,型号9cm)过滤,收集滤液于250mL锥形瓶中,以少量水洗涤水解管和定量滤纸,收集所有滤液于锥形瓶中。将锥形瓶中溶液煮沸1min后,趁热逐滴加入质量浓度10%氯化钡水溶液20mL,再煮沸3~5min,然后,置于70~80℃恒温水浴锅陈化2h,用已烘干至恒重的玻璃砂芯漏斗抽滤,用水洗涤沉淀至无氯离子,将玻璃砂芯漏斗置于105℃恒温干燥箱中至恒重。按下式计算硫酸根含量,结果见表2。
X-样品中硫酸基的含量,单位为百分率(%)
m0-样品质量,单位为克,(g)
m1-无水硫酸钡的质量,单位为克(g)
96.06-硫酸根的摩尔质量,单位为克每摩尔(g/mol),
233.39-硫酸钡的摩尔质量,单位为克每摩尔(g/mol)。
(3)样品中岩藻糖含量检测:准确称取岩藻糖标准品0.01g,用水溶解并定容至10mL,配成浓度为1.0mg/mL的标准溶液。准确称取适量标准溶液,用水稀释成浓度分别为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的标准溶液,然后分别取1mL于5mL具塞玻璃试管中,PMP法柱前衍生化,然后色谱分析,测定岩藻糖的出峰面积,绘制校正曲线,曲线方程为y=8.6518x+23.074,R2=0.9988,y为岩藻糖的出峰面积,x为岩藻糖的浓度μg/mL。
准确称取实施例1方法制备的裙带菜硫酸化多糖样品0.1g于水解管中,加入4mol/L三氯乙酸水溶液10mL,混匀后充入氮气封盖,在110℃电热恒温干燥箱中水解2h,然后冷却至室温,加入4mol/L氢氧化钠水溶液10mL中和,调pH至中性,获得水解液。将水解液转移到25mL容量瓶中,用0.1mol/L磷酸氢二钾缓冲溶液定容至刻度,作为样品制备液,备用。取上述样品制备液1mL于5mL具塞玻璃试管中,加0.3mol/L氢氧化钠水溶液1mL,涡旋混匀,然后加入0.5mol/L PMP甲醇溶液1mL,涡旋混匀,置70℃恒温水浴锅中恒温70min。取出后冷却至室温,加入0.3mol/L乙酸水溶液1mL中和,转移至10mL容量瓶中,加0.1mol/L磷酸氢二钾缓冲溶液定容至刻度。取上述溶液1mL于5mL具塞玻璃试管中,加入三氯甲烷2mL,充分涡旋后去除三氯甲烷相,重复萃取2次,将得到的水相过0.45μm水系膜,进行色谱分析,外标法定量,测定岩藻糖的出峰面积,用校正曲线计算样品制备液中岩藻糖的浓度。
色谱条件:色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm,5μm或相当者;柱温:40℃;流速:1.0mL/min;流动相:溶剂A:乙腈——0.05mol/L磷酸氢二钾缓冲溶液(15+85),溶剂B:乙腈——0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(40+60);梯度洗脱程序如下表1:
表1梯度洗脱程序
运行时间,min | A,% | B,% |
0 | 100 | 0 |
9 | 90 | 10 |
15 | 45 | 55 |
25 | 100 | 0 |
紫外检测器:波长250nm;进样体积:20μL。
样品中的岩藻糖按下式计算,结果见表2。
X——样品中岩藻糖含量,单位为百分率(%),
C——样品制备液中岩藻糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL),
V——样品制备液最终定容体积,单位为毫升(mL),
m——样品的质量,单位为克(g)
f——样品稀释倍数,10倍。
(4)分子量检测:以不同分子量(4.3kDa、1.26kDa、6.06kDa、123.5kDa、420kDa、821.7kDa)的葡聚糖作为标准品,示差折光检测器(流动相:0.1M NaNO3,流速:0.5mL/min)检测实施例1制备的裙带菜硫酸化多糖样品的分子量,检测结果如图1所示和表2。
表2裙带菜硫酸化多糖理化性质
实施例3多糖在缓解代谢综合征中活性评价
SPF级ICR小鼠,雄性,6周龄,共22只,购买于北京斯贝福生物技术有限公司。所有动物均在24±1℃的环境中进行12小时的照明和12小时的黑暗循环,并提供食物和水。
适应1周后,将小鼠分为正常(Normal)组(6只)和模型组(16只),正常组喂养标准饮食,模型组喂养标准饮食+60%脂肪。喂养9周后,模型组小鼠按照35mg/kg(STZ的质量:小鼠体重)每周一次皮下注射17.5mg/mL pH 4.4的链脲佐菌素(STZ)柠檬酸钠溶液,持续皮下注射4周,并在注射前后让模型组小鼠禁食不禁水4h。完成最后一次上述注射后,对模型组组小鼠禁食且不禁水12h小鼠进行空腹血糖水平(FBG)测量,超过8mM被认为代谢综合征模型小鼠(11只)。
随后,随机将代谢综合征模型小鼠分为模型对照组(Mode)(5只)和UpW1组(6只)。UpW1组以200mg/kg/天的剂量(UpW1多糖的质量:小鼠体重:每天)口服实施例1制备的硫酸化多糖(UpW1),正常组和模型对照组小鼠口服无菌水饲养12周,在12周期间对小鼠每周监测一次体重(如图2所示)和每四周测一次禁食且不禁水12h空腹血糖值(如图3所示)。
饲养到11周时,按照2g/kg(葡萄糖质量:小鼠体重)的剂量,每只小鼠灌胃给予用生理盐水配置的666.7mg/ml葡萄糖溶液后,分别在0、15、30、60和120分钟时从尾静脉抽取血液样品,并通过血糖仪测定血浆中血糖浓度,绘制口服葡萄糖耐受曲线(如图4所示),使用模型评估指标计算葡萄糖利用度AUC(Area under the curve)(如图5所示)。
饲养12周时,所有小鼠禁食且不禁水4小时后,按照0.75U/kg(胰岛素:小鼠体重)的剂量,对小鼠皮下注射用生理盐水溶解的0.375U/mL胰岛素溶液后,分别在0、15、30、60和120分钟时从尾静脉抽取血液样品,并通过血糖仪测定血浆中血糖浓度,绘制胰岛素抵抗曲线(如图6所示),使用模型评估指标计算胰岛素抵抗的AUC(如图7所示)。
12周后,使用二氧化碳将所有小鼠窒息而牺牲,通过解剖取出小鼠的脂肪组织并称重,小鼠脂肪组织/体重的指数(mg/g)(如图8所示)。
试验结果表明,根据图2可知,在第一周到第三周内,代谢综合征模型对照小鼠体重逐步上升,随后的9周内体重保持平稳。然而,UpW1在12周内可以使代谢综合征小鼠体重保持平稳。
根据图3可知,UpW1多糖随着給药时间的延长有降低小鼠空腹血糖的趋势,在第12周与代谢综合征模型对照小鼠相比,UpW1多糖能显著降低空腹血糖水平(P<0.01)。根据图4和5可知,UpW1多糖有提高代谢综合征小鼠的葡萄糖耐量的趋势(P=0.0991)。根据图6和7可知,UpW1多糖有缓解代谢综合征小鼠胰岛素抵抗的趋势(P=0.1214)。这些研究说明UpW1多糖可能具有缓解代谢综合征导致的血糖调控混乱。
根据图8可知,与正常组相比代谢综合征模型对照小鼠脂肪组织:体重的指数(mg/g)显著增加。而UpW1多糖能显著缓解代谢综合征模型小鼠脂肪组织:体重的指数(mg:g)显著增加(P<0.01),这说明UpW1多糖可以缓解代谢综合征小鼠脂肪堆积,从而缓解代谢综合征的发展。
综上,UpW1多糖在一定程度上可以缓解代谢综合征模型小鼠体重的上升,显著降低空腹血糖的水平,显著缓解脂肪的堆积和可能具有缓解血糖调控混乱,而达到小鼠缓解代谢综合征。
本发明是结合最佳实施例进行描述的,然而在阅读了本发明的上述内容后,本领域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果,而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体的说,显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说,显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求书所限定的范围。运用本工艺或者在此工艺基础上进行的工艺参数和改变和变动所提取的裙带菜硫酸化多糖用于其他与代谢综合征的预防和治疗,制成不同形成的产品(如药物制剂,营养品,保健品,化妆品)都属于本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种裙带菜硫酸化多糖,其特征在于所述裙带菜硫酸化多糖按以下步骤制备:
(1)热水提取:将裙带菜粉末加入离子水中,在60-100℃的条件下加热浸提2-5小时,冷却至40-50℃,将浸提液过滤,收集滤液;
(2)除海藻胶:将步骤(1)滤液减压浓缩至5-10倍体积,缓慢加入MgCl2使MgCl2终浓度为0.10-0.25mol/L,静置15min-4h,过滤,收集滤液;
(3)超滤:将步骤(2)滤液进行超滤脱盐,超滤至透过液电导率≤300μs/cm,得到滤液;所述超滤采用截留分子量为1-10kDa的超滤膜;
(4)乙醇沉淀:向步骤(3)滤液中加入无水乙醇,在0~4℃下静置醇沉4~24h,过滤,收集滤饼,无水乙醇洗涤后烘干,得到所述裙带菜硫酸化多糖。
2.如权利要求1所述裙带菜硫酸化多糖,其特征在于步骤(1)所述裙带菜粉末是将新鲜裙带菜清洗后,于60-70℃温度下干燥至恒重,粉粹至40-80目。
3.如权利要求1所述裙带菜硫酸化多糖,其特征在于步骤(1)所述去离子水体积加入量以裙带菜粉末重量计为20-40ml/g。
4.如权利要求1所述裙带菜硫酸化多糖,其特征在于步骤(1)浸提条件为100℃浸提2h。
5.如权利要求1所述裙带菜硫酸化多糖,其特征在于步骤(2)中MgCl2终浓度为0.25mol/L。
6.如权利要求1所述裙带菜硫酸化多糖,其特征在于步骤(4)中所述乙醇体积加入终浓度为70-80%。
7.如权利要求1所述裙带菜硫酸化多糖,其特征在于步骤(4)中烘干温度为50-70℃。
8.一种权利要求1所述裙带菜硫酸化多糖在制备治疗代谢综合征药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述的药物为降低血糖的药物。
10.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述的药物为减少脂肪堆积的药物。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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