CN106176799A - 一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用 - Google Patents

一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海洋生物技术领域，具体讲是一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用本发明以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，测定了褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的活性，发现褐藻多糖硫酸酯可显著增加NO及TNF‑α、COX‑2等多种细胞因子的表达，并从基因和蛋白水平了解到其机理，有望开发成为一种新型的免疫增强剂，尤其是作为免疫佐剂的应用。

Description

一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，具体讲是一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。
背景技术
免疫增强剂通常指的是在单用或与抗原同时使用时可增强机体免疫应答的物质，亦被称为免疫调节剂或免疫刺激剂。免疫增强剂可通过不同的作用途径发挥作用，如增强巨噬细胞的活性、增强抗原物质的免疫原性和稳定性以及促进抗体的合成与分泌等，从而增强机体的特异性和非特异性免疫应答。随着免疫学研究的不断深入，开发高效、稳定、安全的免疫增强剂越来越受到人们的重视。
巨噬细胞是调节机体固有免疫和适应性免疫反应重要的抗原递呈细胞，在宿主对病原菌感染的防御系统中扮演着重要角色，被刺激后可产生不同的炎性介质、细胞因子等，从而抵抗病原菌。因而本发明以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，测量NO表达量，并从mRNA和蛋白表达水平上测定iNOS、TNF-α、COX-2等细胞因子的表达量，为褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用提供参考依据。
褐藻多糖硫酸酯是存在于所有褐藻中的细胞间多糖，又称褐藻糖胶，其成分复杂，具有抗凝血、抗病毒、抗肿瘤等多种活性，许多生物学效应都与它的化学组分特别是硫酸根含量密切相关。本发明所用的褐藻多糖硫酸酯具有良好的水溶性，因而应用更加方便。以小鼠腹腔巨噬细胞为模型，测定其免疫指标及机理，从而为开发新的免疫增强剂提供可靠的依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。
所述褐藻多糖硫酸酯为按照常规的提取方式从褐藻中提取获得。褐藻为海带、裙带菜等。
所述褐藻多糖硫酸酯分子量为2000-15000Da。
用经灭菌超纯水溶解的所述褐藻多糖硫酸酯，得褐藻多糖硫酸酯水溶液。
所述褐藻多糖硫酸酯水溶液浓度为50-200ug/mL。
以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，测定利用褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的活性：
1)不同浓度的褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞NO表达量的影响
取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。在5％的CO2培养箱中培养24h后，加入不同浓度褐藻多糖硫酸酯各100uL，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，LPS做阳性对照，终浓度为1ug/mL，均设置3个复孔。将96孔板继续培养24h后，每孔取100ul上清液到新的96孔板，加入等体积的Griess试剂，室温避光放置10min，酶联免疫检测仪570nm下测吸光度，平行重复3次，代入标准曲线求出NO量。
2)褐藻多糖硫酸酯细胞毒性评价
取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。在5％的CO2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的褐藻多糖硫酸酯各100ul，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，以LPS做阳性对照，终浓度为1ug/ml，均设置3个复孔。将96孔板继续培养24h后，弃去旧的培养基，然后每孔加入100uL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液。放入培养箱中培养4小时后，每孔加入100uL的stopping buffer，继续培养18小时，取出用酶联免疫检测仪于550nm测OD值。
3)褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞细胞因子表达量的影响：
取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。在5％的CO2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的壳聚糖硫酸酯100ul，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每个浓度设置3个复孔。同时设置LPS阳性对照组，终浓度为1ug/ml，3个复孔。将96孔板继续培养24h后，收集细胞上清液，按照相应ELISA试剂盒说明测定细胞上清液中IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2的含量。
4)褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞因子mRNA水平的影响
将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于六孔板中，细胞接种密度为2.5×106个/mL，5个孔中每孔接种2mL。培养24小时后，弃去旧的培养基，除空白对照外，每孔加入褐藻多糖硫酸酯，使其终浓度为100ug/mL，置于细胞培养箱中分别培养0.5、1、3、6小时后，收集细胞于小离心管中，提取RNA，并测定提取的RNA量，变性后跑琼脂糖凝胶电泳并拍照保存。然后进行逆转录反应，并用PCR仪扩增。将扩增后的产物进行电泳检测并拍照保存。
5)处于对数生长期的褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞因子蛋白表达量的影响
将RAW264.7细胞接种于六孔板中，接种密度为2.5×106个/mL，5个孔中每孔接种2mL。培养24小时后，除空白对照外，每孔加入壳聚糖硫酸酯，使其终浓度为100ug/mL，置于细胞培养箱中分别培养0.5、1、3、6小时后，收集细胞于小离心管中，每管加入200uL蛋白裂解液和一小匙玻璃珠，充分震荡，4℃、12000rpm离心15min，取上清液即为蛋白提取液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。煮沸变性后，以每孔40μg的核蛋白点样，10％SDS-PAGE分离。通过电转仪将凝胶上蛋白样品移至PVDF膜上，分别与一抗和辣根过氧化氢酶标记的二抗孵育，洗膜后加入发光剂和稳定剂，曝光拍照。
经上述测定可见褐藻多糖硫酸酯能够明显促进RAW264.7细胞产生NO，且具有剂量依赖性。
褐藻多糖硫酸酯可显著增加RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、COX-2、IL-1α、PGE2细胞因子的表达，且具有剂量依赖性。
褐藻多糖硫酸酯可促进TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS在mRNA水平上的表达，且随着时间的延长，呈先上升后下降趋势。
褐藻多糖硫酸酯可促进TNF-α、COX-2、iNOS在蛋白水平上的表达，且随着时间的增加，各细胞因子的蛋白表达量也增加。
本发明所具有的优点：
本发明所用褐藻多糖硫酸酯为海带、裙带菜等褐藻的提取物，原料天然无毒，且水溶性好，无细胞毒性。
本发明充分利用了海藻资源，提高其附加值和综合利用水平，经济效益显著。
本发明以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，通过产生的NO及IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2等细胞因子的多少，可快速、准确地判断免疫活性强弱并了解其机理，且可检测是否有细胞毒性，为新型免疫增强剂的开发提供依据。
附图说明
图1为褐藻多糖硫酸酯经高效液相色谱图测得分子量图。
图2为褐藻多糖硫酸酯对于TNF-α等细胞因子在基因水平上表达量的影响图。
图3为褐藻多糖硫酸酯对TNF-α等细胞因子在蛋白水平上表达量的影响图。
具体实施方式
本发明的实施例结合附图进一步说明如下。
下述实施例褐藻多糖硫酸酯，可按照常规的提取方式从海带、裙带菜等褐藻中提取获得。提取参考文献为：Jing Wang,Quanbin Zhang,Zhongshan Zhang,ZhienLi.Antioxidant activity of sulfated polysaccharide fractions extracted fromLaminaria japonica.International Journal of Biological Macromolecules 42(2008)127–132
上述提取获得褐藻多糖硫酸酯采用高效凝胶排阻色谱测定褐藻多糖硫酸酯的分子量。具体分析条件如下，色谱柱：TSK G4000-PWXL；流动相：0.05M的硫酸钠溶液；流速：0.5mL/min；柱温：40℃；检测器：示差检测器。样品浓度为2％(w/v)。采用不同分子量的葡聚糖670000，410000,270000，80000，25000，12000，5000Da对凝胶色谱柱进行校准。其高效液相色谱图如图1，测得分子量为2000-15000Da。
实施例1不同浓度的褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞NO表达量的影响
(1)试验材料及试剂：
①称取上述获得褐藻多糖硫酸酯12.2mg，用244uL灭菌超纯水将其溶解，使其浓度为50mg/mL，而后用RPMI1640完全培养基稀释为400ug/mL，然后倍比稀释至400，200，100，50，25，12.5ug/mL(现配现用)；
②Griess A试剂配制：对氨基苯磺酰胺400mg溶于40mL5％的磷酸溶液中；
③Griess B试剂配制：40mgN-1-萘乙二胺盐酸盐溶于40mL超纯水中；
④RAW264.7细胞、RPMI1640培养基、胎牛血清。
试验方法(培养检测过程中均在RPMI1640完全培养基中进行)：
①取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106cell/mL，于96孔板每孔接种100ul。
②在5％的CO2培养箱中37℃培养24h后，加入不同浓度的褐藻多糖硫酸酯各100uL，使其终浓度分别为0,6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每个样品设置3个复孔。LPS做阳性对照，终浓度为1ug/ml。
③将96孔板继续培养24h后，每孔取100ul上清液到新的96孔板，加入等体积(100ul)的Griess试剂(Griess A和Griess B等体积混合，现配现用)，室温避光放置10min，以完全培养基加显色剂作为空白对照，用酶联免疫检测仪570nm下测吸光度，平行重复3次，代入标准曲线求出NO量。
④标准曲线的绘制：将1mol/L的NaNO2贮存液经水稀释至100μmol/L后，依次倍比稀释为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0umol/L浓度的NaNO2标准溶液。吸取100ul各浓度标准溶液于96孔板中，各浓度重复3孔，然后每孔加入100ul Griess试剂(Griess A和Griess B等体积混合，现配现用)，室温避光反应10min后，使用酶联免疫检测仪测540nm吸光度。以NaNO2标准溶液浓度为横坐标，以OD540为纵坐标，各浓度OD值扣除培养基空白对照OD值后，绘制NO标准曲线为y＝0.0073x+0.00373。
试验结果，不同浓度的褐藻多糖硫酸酯增加NO表达量的结果如下：
表1：不同浓度的褐藻多糖硫酸酯对NO表达量的影响
褐藻多糖硫酸酯浓度(ug/mL) NO表达量(uM)
0 1.7±1.38
6.25 10.33±0.931
12.5 22.93±3.09
25 34.04±1.53
50 39.72±2.06
100 43.8±0.31
200 47.13±2.89
从上表可以看出，褐藻多糖硫酸酯能够明显促进细胞产生NO，且具有剂量依赖性。
实施例2不同浓度的褐藻多糖硫酸酯细胞毒性评价
(1)试验材料及试剂:
①0.5mg/mL的MTT溶液：噻唑蓝用超纯水配制为5mg/mL母液，避光保存，用前避光稀释10倍；
②Stopping buffer配制：10％(w/v)的十二烷基硫酸钠与0.01mol/L的盐酸配制200ml。
③RAW264.7细胞、RPMI1640培养基、胎牛血清。
(2)试验方法(培养检测过程中均在RPMI1640完全培养基中进行)：
①取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。
②在5％的CO2培养箱中37度培养24h后，加入不同浓度的褐藻多糖硫酸酯100ul，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每个浓度设置3个复孔。LPS做阳性对照，终浓度为1ug/ml。
③将96孔板继续培养24h后，弃去旧的培养基，然后每孔加入100uL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液。
④放入培养箱中培养4小时后，每孔加入100uLstopping buffer，继续培养18小时，取出用酶联免疫检测仪于550nm测OD值。
(3)试验结果：用RAW264.7细胞评价细胞毒性结果如下：
表2：褐藻多糖硫酸酯的细胞毒性评价
褐藻多糖硫酸酯浓度(ug/mL) 细胞存活率(％)
0 100.44±0.62
6.25 100.88±16.34
12.5 100.39±1.65
25 98.92±2.41
50 93.37±6.09
100 83.6±6.32
200 73.14±7.35
由上表可以看出，低浓度的褐藻多糖硫酸酯无明显的细胞毒作用，当浓度超过100ug/mL时有细胞毒性。
实施例3褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞细胞因子表达量的影响：
试验材料与试剂：IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2细胞因子ELISA试剂盒
试验方法(培养检测过程中均在RPMI1640完全培养基中进行)：
①取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。
②在5％的CO2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的褐藻多糖硫酸酯100ul，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，每个浓度设置3个复孔。同时设置LPS阳性对照组，终浓度为1ug/ml，3个复孔。
③将96孔板继续培养24h后，收集细胞上清液，按照相应ELISA试剂盒说明测定细胞上清液中IL-6、IL-lβ、IL-10、TNF-α、PGE2的含量。
试验结果，不同浓度褐藻多糖硫酸酯对各类细胞因子表达量的影响如下：
表3不同浓度褐藻多糖硫酸酯对各类细胞因子表达量的影响
由上表可以看出，随着褐藻多糖硫酸酯浓度的增加，其细胞因子表达量也增加，但当浓度为200ug/mL时，其细胞因子表达量基本不再增加，甚至下降。最高浓度的褐藻多糖硫酸酯各细胞因子表达量可达空白对照的10-20倍，表明褐藻多糖硫酸酯可显著增加各细胞因子的表达，且具有剂量依赖性。
实施例4褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞因子mRNA水平的影响
根据细胞增殖试验和NO试验结果，选择浓度50ug/mL进行试验。
(1)试验材料及试剂
①DEPC水配制：100mL超纯水中加入0.1mL的DEPC，37℃放置12小时后，121高压灭菌20分钟。
②Trizol、氯仿、异丙醇、溴化乙锭、琼脂糖、逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒
(2)试验方法(培养检测过程中均在RPMI1640完全培养基中进行)：
①细胞的培养和处理：将RAW264.7细胞接种于六孔板中，接种密度为2.5×106个/mL，5个孔中每孔接种2mL。培养24小时后，弃去旧的培养基，除空白对照外，每孔加入褐藻多糖硫酸酯，使其终浓度为50ug/mL，置于细胞培养箱中分别培养0.5、1、3、6小时后，收集细胞于小离心管中。
②细胞RNA提取：每管中加入1mLTrizol试剂，用移液枪吹打数次促进细胞裂解，然后置于冰上静置10分钟，使核蛋白充分解离。然后每管中加入100μL氯仿，小心盖好管，充分剧烈震荡15秒，于冰上静置5分钟。然后4℃12000g离心15分钟，取上清液400μL，加入400uL异丙醇，轻轻混匀5次，室温下静置10分钟。4℃12000g离心8分钟后弃去上清，向沉淀中加入1mL的75％乙醇DEPC水，混匀。离心弃去上清，晾干后每管中加入30uLDEPC水溶解，然后测定提取的RNA量。
③逆转录反应：1uL的oligo dT与1uL的10×dNTP混合，加一定量的RNA和DEPC水，总体积达12uL，65℃变性5分钟，迅速转移到冰上，按试剂盒说明书加入FSB buffer、DTT、DEPC水，混匀，37℃水浴2分钟，于冰上冷却。然后每管加入1uL的M-MLVRT，逆转录反应条件为37℃，50min；70℃，15min。得到20uLcDNA体系，加入60uL灭菌水，置于-20℃冰箱保存。
④PCR扩增：采用试剂盒进行反应，体系如下：2×Es Taq MasterMix 10uL，正向引物(10uM)1uL，反向引物(10uM)1uL，cDNA 2uL，不含RNA酶的水加至20uL。PCR反应条件如下：
Program1：94℃，2min；1个循环
Program2：94℃，30s；55-65℃，30s；72℃，30s；20-30个循环
Program3：72℃，2min
⑤电泳检测：0.25g琼脂糖加25mL0.5×TAE及0.5uL溴化乙锭制胶，每孔加入PCR反应后的溶液10uL，100v，30min跑电泳。放入电泳成像系统，拍照保存(参见图2)。
(3)试验结果
褐藻多糖硫酸酯对于TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS在mRNA水平上表达量的影响如图1，其中GAPDH为内参，由图2可以看出，褐藻多糖硫酸酯可以促进上述细胞因子的表达，随着时间的延长，呈先上升后下降趋势。
实施例5褐藻多糖硫酸酯对RAW264.7细胞因子蛋白水平表达量的影响
(1)试验材料及试剂：
BCA法蛋白定量测定试剂盒、玻璃珠、蛋白裂解液、PVDF膜、对应的一抗和二抗。
(2)试验方法
①细胞的培养和处理：将RAW264.7细胞接种于六孔板中，接种密度为2.5×106个/mL，5个孔中每孔接种2mL。培养24小时后，弃去旧的培养基，除空白对照外，每孔加入用新鲜培养基配制的褐藻多糖硫酸酯2mL，浓度为50ug/mL，置于细胞培养箱中分别培养0.5、1、3、6小时后，收集细胞于小离心管中。
②蛋白的提取：每管加入200uL蛋白裂解液和一小匙玻璃珠，充分震荡，4℃、12000rpm离心15min，取上清液即为蛋白提取液，BCA法测定蛋白浓度。
③煮沸变性后，以每孔40g的核蛋白点样，SDS-PAGE分离。通过电转仪将凝胶上蛋白样品移至PVDF膜上，分别与一抗和辣根过氧化氢酶标记的二抗孵育，洗膜后加入发光剂和稳定剂，曝光拍照(参见图3)。
(3)试验结果
褐藻多糖硫酸酯对TNF-α、COX-2、iNOS在蛋白水平上表达量的影响如图3，其中β-actin为内参，可以看出随着时间的增加，各细胞因子的蛋白表达量也增加。

Claims (5)

1.一种褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用。
2.按权利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯为在褐藻中提取获得。
3.按权利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用，其特征在于:所述褐藻多糖硫酸酯分子量为2000-15000Da。
4.按权利要求1-3任意一项所述的褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用，其特征在于：用经灭菌超纯水溶解的所述褐藻多糖硫酸酯，得褐藻多糖硫酸酯水溶液。
5.按权利要求4任意一项所述的褐藻多糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯水溶液浓度为50-200ug/mL。
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