CN112480279A - 一种小分子量海带硫酸化多糖及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小分子量海带硫酸化多糖及应用，所述多糖按如下方法制备：将海带粉末用乙醇水溶液回流提取，获得脱脂海带粉；脱脂海带粉中加稀盐酸浸提，收集上清液；浓缩，缓慢加入CaCl₂水溶液，静置沉淀，收集上清液；过滤，浓缩，以蒸馏水为透析液，室温透析，收集截留液；浓缩，加入95％乙醇，静置沉淀；收集沉淀，烘干，得到海带粗多糖；海带粗多糖溶于蒸馏水中，加入抗坏血酸和过氧化氢，室温搅拌；超滤；浓缩，乙醇沉淀，得到小分子量海带硫酸化多糖。本发明所述海带硫酸化多糖硫酸基含量为44.6±0.9％，糖醛酸含量为28.9±2.1％，总糖含量为56.7±4.2％，相对分子质量为12±0.5kDa。

Description

一种小分子量海带硫酸化多糖及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种小分子量海带多糖及其制备与在预防肥胖和调节肠道菌群结构中的应用。

背景技术

根据世界卫生组织规定身体质量指数(BMI)≥30为肥胖，是脂肪过度累积的一种状态。中国肥胖人口已达9000万，已经成为全球肥胖人口最多的国家。肥胖是世界范围内导致人类死亡的第五大因素，每年至少有280万人由于肥胖相关疾病死亡。肠道菌是一组位于肠道内与宿主协同作用的共生微生物群，它不仅参与免疫调节和物质代谢，还与多种疾病密切相关。肠道菌群失衡被认为是肥胖的一个重要诱因。海带 (Laminaria japonica)是一种多年生冷水性的大型食用藻类。主要分布于北太平洋与大西洋沿海地区。硫酸化多糖是海带中最主要的活性化合物之一。近年来，从海带中提取的硫酸化多糖被报道有多种生物学活性，包括抗氧化，抗炎，抗癌和免疫调节等活性。因此，制备和筛选可以预防肥胖和调节肠道菌群结构的硫酸化多糖有巨大的潜力和应用价值。

海带硫酸化多糖因组分复杂，分子量大等因素，严重影响了对其体内吸收和代谢的研究，也导致其生物活性的不稳定性。目前，小分子量海带硫酸化多糖的报道较少，尚未见其预防肥胖和调节肠道菌方面的报道。本发明制备的小分子量海带硫酸化多糖可以显著预防高脂饮食引起的体重增加，并且可以显著调节高脂饮食诱导肥胖小鼠的肠道菌群紊乱，不仅可以作为预防肥胖的药品和食品添加剂使用，还可以作为益生元及治疗肠道菌群紊乱的药物和食品添加剂使用。

发明内容

本发明目的是提供一种小分子量海带硫酸化多糖及其制备与在制备预防肥胖制品或调节肠道菌群结构制剂中的应用。所述的海带硫酸化多糖资源丰富、无毒副作用，能有效预防高脂饮食引起的体重增加和肠道菌群紊乱。可以作为功能食品或药品等的主要成分，用于防治各种因素导致的肥胖和肠道菌群紊乱。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种小分子量海带硫酸化多糖，所述海带硫酸化多糖按如下方法制备：

(1)脱脂：将海带粉与体积浓度70～100％乙醇水溶液混合，回流提取2～4h，冷却过滤，滤饼干燥(优选50～70℃)，获得脱脂海带粉；

(2)稀盐酸提取：室温下，向步骤(1)脱脂海带粉中加0.1M稀盐酸浸提3h (优选提取两次)，离心，收集上清液；

(3)除海藻胶：将步骤(2)中的上清液浓缩5-10倍体积，获得浓缩液；搅拌下(优选300rpm)向浓缩液中缓慢加入0.04g/mL的CaCl₂水溶液，静置沉淀(不少于15min)，离心，收集上清液；

(4)透析：将步骤(3)中的上清液过滤(优选中速滤纸，孔径30-50μm)，滤液浓缩2-5倍体积，获得浓缩液；将浓缩液在透析袋内，以蒸馏水为透析液，室温透析24～48h，收集截留液；

(5)乙醇沉淀：步骤(4)截留液浓缩2-5倍体积，加入体积浓度95％乙醇水溶液，在0～4℃下静置沉淀12～24h；离心，收集沉淀，烘干(优选50～70℃)，得到海带粗多糖；

(6)酸降解：步骤(5)海带粗多糖溶于蒸馏水中，加入抗坏血酸和过氧化氢，室温搅拌2h；超滤；滤液浓缩2-5倍体积后，同步骤(5)进行乙醇沉淀(即加入体积浓度95％乙醇水溶液，在0～4℃下静置沉淀12～24h；离心，收集沉淀，烘干(优选50～70℃))，得到小分子量海带硫酸化多糖。

进一步，步骤(1)-步骤(6)所述离心均为8000rpm离心10min。

进一步，步骤(1)中海带粉末是将质量含水量3-4％的海带粉碎，过80目筛，得到海带粉末。

进一步，步骤(1)中体积浓度70～100％乙醇水溶液体积用量以海带粉末重量计为20-30mL/g，优选30mL/g，乙醇水溶液浓度优选为95％。

进一步，步骤(2)中稀盐酸体积用量以脱脂海带粉质量计为20-40mL/g，优选30mL/g。

进一步，步骤(3)CaCl₂水溶液体积加入量以浓缩液体积计为0.6mL/mL。

进一步，步骤(4)中所述透析袋截留分子量为14kDa。

进一步，步骤(5)中所述95％乙醇与浓缩后的截留液体积比为3:1，静置沉淀条件为4℃沉淀12h。

进一步，步骤(6)中所述超滤膜截留分子量为10kDa。

进一步，步骤(6)中所述蒸馏水加入量以海带粗多糖质量计为100mL/g，抗坏血酸加入量以海带粗多糖质量计为0.5g/g，过氧化氢加入量以海带粗多糖质量计为 0.3mL/g。

本发明还提供一种所述小分子量海带硫酸化多糖在制备预防肥胖的药品或食品添加剂中的应用。

本发明还涉及所述小分子量海带硫酸化多糖在制备治疗肠道菌群紊乱制剂中的应用，所述制剂作为益生元，或者治疗肠道菌群紊乱的药物和食品添加剂。

本发明所述小分子量海带硫酸化多糖可以与其他药物联用，可制成为注射剂或口服制剂。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

(1)本发明所述小分子量海带硫酸化多糖硫酸基含量为44.6±0.9％，糖醛酸含量为28.9±2.1％，总糖含量为56.7±4.2％，相对分子质量为12±0.5kDa。

(2)本发明的制备方法快速提取小分子量海带硫酸化多糖，能耗低，操作容易，工艺成本低等特点，有开发成预防肥胖和调节肠道菌药物或食品添加剂的前景。

(3)本发明所述小分子量海带硫酸化多糖可以显著调节高脂饮食诱导肥胖小鼠的肠道菌群紊乱，进而显著降低禁食血糖和体重作用。在调节肠道菌和防治肥胖及代谢综合征等新药和特医食品开发领域，具有广阔的开发应用前景。

附图说明

图1为小分子量海带硫酸化多糖对高脂饮食喂养小鼠体重和禁食血糖的影响图。其中，A为小鼠体重随时间变化分析，横坐标代表实验时间，纵坐标代表不同组别小鼠体重；B为第16周时，各组小鼠体重增量对比分析，横坐标代表不同组别小鼠，纵坐标代表小鼠体重增加量；C为小鼠禁食血糖随时间变化分析，横坐标代表实验时间，纵坐标代表不同组别小鼠血糖；D为第12周时，各组小鼠血糖对比分析，横坐标代表不同组别小鼠，纵坐标代表小鼠血糖。ND组为正常饮食组，HFD组为高脂饮食对照组，R组为小分子量海带硫酸化多糖实验组，*P<0.05vs.ND group；#P<0.05vs. HFD group。

图2为门水平小分子量海带硫酸化多糖对高脂饮食喂养的小鼠肠道菌群结构的调节作用图。其中，A为各组小鼠肠道菌群α-多样性分析；B为各组小鼠肠道菌群门水平组成分析；C为各组小鼠的放线菌门(Actinobacteria)含量分析；D为各组小鼠的拟杆菌门(Bacteroidetes)含量分析；E为各组小鼠的软壁菌门(Tenericutes)含量分析。 ND组为正常饮食组，HFD组为高脂饮食对照组，R组为小分子海带硫酸化多糖实验组，*P<0.05vs.NDgroup；#P<0.05vs.HFD group。

图3为属水平小分子量海带硫酸化多糖对高脂饮食喂养的小鼠肠道菌群结构的调节作用图。其中，A为各组小鼠的f_S24.7.g_菌属含量分析；B为各组小鼠的 g_Lactonifactor菌属含量分析；C为各组小鼠的g_Macellibacteroides菌属含量分析； D为各组小鼠的f_Bifidobacteriaceae菌属含量分析；E为各组小鼠的g_Parabacteroides 菌属菌属含量分析；F为各组小鼠的g_Dehalobacterium菌属含量分析。ND组为正常饮食组，HFD组为高脂饮食对照组，R组为小分子海带硫酸化多糖实验组，*P<0.05 vs.ND group；#P<0.05vs.HFD group。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明中速滤纸孔径30-50μm；室温为25-30℃。

实施例1：小分子量海带硫酸化多糖的制备和结构分析

1、多糖提取

(1)脱脂：将质量含水量3-4％的海带粉碎，过80目筛，得到海带粉。称取海带粉120g，按照料液比1:30(g/mL)加入体积浓度95％乙醇水溶液，煮沸冷凝回流3 小时，冷却过滤，滤渣在65℃下烘干，得到脱脂的海带粉100g。

(2)稀盐酸提取：取脱脂的海带粉100g，按料液比1:30(g/mL)加入0.1M稀盐酸，室温浸提3h，提取两次，离心，收集上清液2200mL；

(3)除海藻胶：步骤(2)上清液2200mL浓缩5倍体积，在300rpm搅拌条件下加入0.04g/mL的CaCl₂水溶液264mL，加入完毕后，静止30min沉淀海藻酸纳，再以8000rpm的速度离心10分钟，收集上清液600mL。

(4)透析：步骤(3)上清液600mL用中速滤纸(孔径30-50μm)过滤，滤液在55℃抽真空浓缩3倍体积，浓缩液加入透析袋(截留分子量为14kDa)，以蒸馏水为透析液，在4℃条件透析48h，得到截留液210mL。

(5)乙醇沉淀：步骤(4)截留液210mL在55℃抽真空浓缩3倍体积，以浓缩后的截留液体积比为1:3加入95％乙醇，4℃放置12小时使海带多糖充分沉淀。以8000 rpm的速度离心10分钟，在65℃下烘干沉淀12小时，得到3.7g海带粗多糖。

(6)酸降解：将3.7g海带粗多糖溶于370mL蒸馏水中，加入1.85g抗坏血酸和1.11mL过氧化氢，室温搅拌2h，超滤(超滤膜截留分子量10kDa)，截留液浓缩4倍体积，并按上述步骤(5)再次醇沉，离心，烘干，得到1.85g小分子量的海带硫酸化多糖。

2、多糖结构鉴定

对步骤1制备的小分子量海带硫酸化多糖的理化性质进行分析，包括总糖含量测定、糖醛酸含量测定、硫酸根含量测定，分子量分布和单糖组成测定。

(1)总糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定样品中总糖含量：精确称量110℃烘干至恒重的葡萄糖10mg，溶于去离子水中，配成0.1mg/mL的葡萄糖标准液，分别移取0.1、0.3、0.5、0.7、 0.9mL葡萄糖标准液并用去离子水补水至1mL，然后加入体积浓度5％苯酚水溶液 0.5mL及浓硫酸(质量浓度98％)2.5mL，充分混匀后，避光静置20min，用酶标仪在 490nm处测定其吸光值A490。以葡萄糖浓度为横坐标，以A490为纵坐标，绘制标准曲线，曲线方程为y＝3.5589x+0.0052，R²＝0.9981，y为A490nm吸光值，x为糖浓度mg/mL。

精确称取适量海带硫酸化多糖样品，用去离子水配成0.1mg/mL多糖溶液，准确吸取1mL多糖溶液，按上述操作步骤测定吸光值，用标准曲线计算多糖样品中的总糖含量为56.7±4.2％。

(2)糖醛酸测定

采用间羟基联苯法测定多糖样品中糖醛酸含量。准确称取葡萄糖醛酸7.5mg，用去离子水配制0.15mg/mL葡萄糖醛酸标准溶液50mL，分别移取0.02、0.04、0.06、 0.08、0.1mL的葡萄糖醛酸标准液并用去离子水补水至0.1mL，然后在冰水浴条件下加入硫酸-硼砂溶液6mL摇匀，100℃水浴5min，冰水浴冷却至室温，加入间羟基联苯溶液0.1mL摇匀，室温放置15min，使用酶标仪在520nm处测定其吸光值A520。以葡萄糖醛酸浓度为横坐标，以A520吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，曲线方程为 y＝3.7151x+0.0017，R²＝0.9972，y为A520nm吸光值，x为糖醛酸浓度(mg/mL)。

精确称取适量多糖样品，用去离子水配成1mg/mL多糖溶液，准确吸取0.1mL 多糖溶液，按上述操作步骤测定吸光值，用标准曲线计算多糖样品中的糖醛酸含量为 28.9±2.1％。

硫酸-硼砂溶液的配制：准确称取硼砂(NaB₄O₇.10H₂O)1.1925g，加入浓硫酸(质量浓度98％)40mL，摇晃溶解后，加入浓硫酸定溶至250mL得到硫酸-硼砂溶液(浓度为4.77mg/mL)。

间羟基联苯溶液的配制：准确称取0.25g的NaOH，加30mL去离子水溶解，然后加入间羟基联苯75mg，摇晃溶解后加去离子水定容至50mL，得到间羟基联苯溶液(浓度为1.5mg/mL)。

(3)硫酸根含量测定

准确称取35mg硫酸钾用去离子水配制0.35mg/mL硫酸钾(即0.193mg/mL硫酸根)标准溶液100mL。分别移取0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL，2.5mL硫酸钾标准溶液，加去离子水定容至3mL，加0.2M HCl水溶液3.8mL，明胶-氯化钡溶液1mL，充分摇匀，室温反应30min，使用酶标仪在500nm测吸光度。以硫酸根浓度为横坐标，以A500吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，曲线方程为y＝0.6774x+0.0849， R²＝0.9914，y为A500nm吸光值，x为硫酸根浓度(mg/mL)。

精确称取25mg多糖样品溶于6mL 2.0M HCl水溶液中，110℃烘箱中水解6h，取出冷却至室温、中速滤纸过滤，滤液用去离子水定容于25mL容量瓶中得到水解多糖溶液。准确吸取3mL水解多糖溶液，按上述操作步骤测定吸光值，用标准曲线计算多糖样品中的硫酸根含量为44.6±0.9％。

明胶-氯化钡溶液的配制：称取0.5g明胶，加入60mL去离子水，在70℃下溶解后，4℃静置过夜得到明胶溶液。称取烘干的0.5g氯化钡，并转移到配好的明胶溶液中，静置2h后即为明胶-氯化钡溶液(浓度为8.33mg/mL)。

(4)分子量分布

多糖的平均分子量(Mw)通过配备有折射率检测器(RID)的高效凝胶渗透色谱仪(HPGPC)测定。使用的色谱柱为TSK-GEL G5000 PWXL(7.8×300mm)和G3000 PWXL(7.8×300mm)。

将步骤1制备的海带硫酸化多糖配制成15mg/mL的水溶液，0.22μm水膜过滤获得检测样品。不同分子量的葡聚糖标准品(4kDa，12.6kDa，60.6kDa，420kDa， 820kDa)分别配制成5mg/mL的水溶液，分别通过0.22μm水膜过滤获得标准样品。色谱柱保持在25℃，进样20μL，使用0.1M NaNO₃水溶液以0.5mL/min的流速洗脱。根据葡聚糖标准品的不同分子量对数值和保留时间的关系绘制标定曲线，曲线方程为 y＝-0.1961x+10.996，R²＝0.9902，y为分子量对数值，x为保留时间(分钟)。根据标准曲线计算出样品中分子量大小为12±0.5kDa。

(5)单糖组成

单糖的分析是利用PMP衍生化方法。将5mg的小分子量海带硫酸化多糖溶解在5mL的4M三氟乙酸(TFA)水溶液中，在110℃下水解8h，得到样品水解液。随后用蒸发器55℃把样品水解液浓缩至干，加入1mL甲醇，再用蒸发器55℃将样品-甲醇液浓缩至干，以此重复3次以除去残留的TFA。然后用1mL的离子水去溶解最后浓缩至干的样品。将300μL样品与0.3M的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液200 μL，0.3M的NaOH水溶液200μL混合，在60℃下衍生化1h，然后冷却至室温。随后，通过添加0.3M的HCl水溶液200μL终止反应，加入2mL的氯仿摇晃2min 后，除去下层的氯仿，再加入2mL的氯仿摇晃2min后，除去下层的氯仿，将上层水相通过0.45μm膜过滤，并利用Eclipse XDB-C18色谱柱，柱温25℃，流动相为乙腈：0.1M的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲液(pH＝6.8)＝83:17(V/V)，上样体积20 μL，在HPLC上进行紫外254nm波长分析。

同样条件下，用混合标准品水溶液(含岩藻糖2.12mg/mL、半乳糖1.8mg/mL)代替样品，测试254nm处的各个吸收峰的面积。以单糖浓度为横坐标，以吸收峰的面积为纵坐标，绘制标准曲线，曲线方程分别为岩藻糖(Fuc)y＝37.261x+1.7099， R²＝0.9956；半乳糖(Gal)y＝45.105x+0.5559，R²＝0.9995；y为不同单糖吸收峰的面积 (mAV*s)，x为不同单糖浓度(mg/mL)。根据标准曲线计算出样品中单糖的组成，小分子量海带硫酸化多糖中半乳糖(Gal)和岩藻糖(Fuc)的比值为0.01:1。

综上所述，该海带多糖分子量为12±0.5kDa，总糖含量为56.7±4.2％，硫酸基含量为44.6±0.9％，糖醛酸含量为28.9±2.1％，结果见表1。

表1展示了所有已公开专利中海带多糖的结构信息，可知本发明中的海带多糖相较于已公开的这些海带多糖，结构信息更完整，岩藻糖和硫酸根含量更高，并且是小分子量的海带硫酸化多糖。

表1海带多糖结构分析比较

实施例2：海带硫酸化多糖的降血糖和抗肥胖活性

雄性C57BL/6小鼠(6周大，20-24g)17只，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。所有动物均在24±1℃的环境中进行12小时照明和12小时黑暗循环，并提供食物和水，适应1周后，将所有小鼠分为正常饮食组(ND，6只小鼠用正常饲料和正常灭菌水喂养)，高脂饮食对照组(HFD，6只小鼠用高脂饲料和正常灭菌水喂养)和多糖处理实验组(R， 5只小鼠用高脂饲料和含多糖的灭菌水喂养，多糖剂量1mg/mL)。多糖如表2所示，包括实施例1制备的海带硫酸化多糖。

每只小鼠分别在每周通过体重测量仪测定小鼠体重，并绘制小鼠体重曲线。分别于第2，4，8，12周通过血糖仪测定血浆中禁食血糖浓度(禁食16h)，并绘制小鼠血糖曲线。在第16周后，实验结束，取小鼠盲肠内容物，在Illumina Miseq PE300高通量测序平台(杭州开泰生物技术有限公司)进行基因测序。测序完成后，在QIIME2多组学分析平台进行物种组成分析，通过STAMP和GraphPad绘图软件进行数据分析。

动物实验结果：

如图1所示(海带硫酸化多糖对高脂饮食喂养小鼠体重和禁食血糖的影响图)，正常饮食组小鼠(ND)在实验过程中的体重增长最少，显著低于高脂饮食对照组(HFD)和多糖处理实验组(R)，其中海带硫酸化多糖可以明显抑制高脂饮食诱导的体重增加，同时可以较好地降低高脂饮食引起的禁食血糖升高。这说明海带硫酸化多糖有很好的预防肥胖效果，且显示了优异的维持血糖稳定的作用。表2展示了所有已公开专利中多糖的抗肥胖活性特点，与其他多糖可以减肥不同的是，本发明中的小分子量海带多糖有很好的预防肥胖效果，且显示了优异的维持血糖稳定的作用。

表2抗肥胖活性比较

如图2所示(门水平海带硫酸化多糖对高脂饮食喂养的小鼠肠道菌群结构的调节作用图)，通过16S rRNA高通量测序分析了16周的高脂饮食和多糖喂养对小鼠盲肠内容物中微生物菌群的影响。结果表明，高脂饮食会引起肠道菌α-多样性降低，而同时喂养了海带硫酸化多糖的小鼠肠道菌群α-多样性有升高的趋势(图2中A)。从门水平上看，高脂饮食显著升高了放线菌门(Actinobacteria)的丰度，降低了拟杆菌门 (Bacteroidetes)和软壁菌门(Tenericutes)的丰度，而海带硫酸化多糖可以降低高脂饮食引起的放线菌门丰度升高，升高拟杆菌门和软壁菌门丰度(图2中B-E)。上述结果表明，海带硫酸化多糖在门水平对高脂饮食喂养的小鼠肠道菌群具有调节作用。

如图3所示(属水平海带硫酸化多糖对高脂饮食喂养的小鼠肠道菌群结构的调节作用图)，从属水平上看，高脂饮食会引起g_Lactonifactor(催乳素菌)， f_Bifidobacteriaceae；g_(双歧杆菌)和g_Dehalobacterium(脱盐杆菌)菌属相对丰度的升高，而同时喂养海带硫酸化多糖时可以显著缓解这些菌丰度的升高(图3中B，D， F)。同时，高脂饮食会引起f_S24.7.g_(S24.7菌)，g_Macellibacteroides(屠场杆状菌) 和g_Parabacteroides(副杆菌)菌属相对丰度的降低，海带提取多糖R可以不同程度缓解它们丰度的降低(图3中A，C，E)。上述结果表明，海带硫酸化多糖在属水平对高脂饮食喂养的小鼠肠道菌群具有调节作用。表3展示了所有已公开专利中多糖调节肠道菌的活性，可知本发明中的小分子量海带多糖，不仅可以增加拟杆菌门的丰度(与其他多糖类似)，还可以显著降低高脂饮食小鼠的放线菌门丰度和升高软壁菌门丰度，显著缓解高脂饮食引起的g_Lactonifactor，f__Bifidobacteriaceae；g__， g_Dehalobacterium，f_S24.7.g_，g_Macellibacteroides和g_Parabacteroides等菌属相对丰度紊乱。

表3多糖调节肠道菌群比较

本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变，替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小分子量海带硫酸化多糖，其特征在于所述海带硫酸化多糖按如下方法制备：

(1)脱脂：将海带粉与体积浓度70～100％乙醇水溶液混合，回流提取2～4h，冷却过滤，滤饼干燥，获得脱脂海带粉；

(2)稀盐酸提取：室温下，向步骤(1)脱脂海带粉中加0.1M稀盐酸浸提3h，离心，收集上清液；

(3)除海藻胶：将步骤(2)中的上清液浓缩5-10倍体积，获得浓缩液；搅拌下向浓缩液中缓慢加入0.04g/mL的CaCl₂水溶液，静置沉淀，离心，收集上清液；

(4)透析：将步骤(3)中的上清液过滤，滤液浓缩2-5倍体积，获得浓缩液；将浓缩液在透析袋内，以蒸馏水为透析液，室温透析24～48h，收集截留液；

(5)乙醇沉淀：步骤(4)截留液浓缩2-5倍体积，加入体积浓度95％乙醇水溶液，在0～4℃下静置沉淀12～24h；离心，收集沉淀，烘干，得到海带粗多糖；

(6)酸降解：步骤(5)海带粗多糖溶于蒸馏水中，加入抗坏血酸和过氧化氢，室温搅拌2h；超滤；滤液浓缩2-5倍体积后，同步骤(5)进行乙醇沉淀，得到小分子量海带硫酸化多糖。

2.如权利要求1所述小分子量海带硫酸化多糖，其特征在于步骤(1)中海带粉是将质量含水量3-4％的海带粉碎，过80目筛，得到海带粉。

3.如权利要求1所述小分子量海带硫酸化多糖，其特征在于步骤(1)中体积浓度70～100％乙醇水溶液体积用量以海带粉末重量计为20-30mL/g。

4.如权利要求1所述小分子量海带硫酸化多糖，其特征在于步骤(2)中稀盐酸体积用量以脱脂海带粉质量计为20-40mL/g。

5.如权利要求1所述小分子量海带硫酸化多糖，其特征在于步骤(3)CaCl₂水溶液体积加入量以浓缩液体积计为0.6mL/mL。

6.如权利要求1所述小分子量海带硫酸化多糖，其特征在于步骤(4)中所述透析袋截留分子量为14kDa。

7.如权利要求1所述小分子量海带硫酸化多糖，其特征在于步骤(5)中所述95％乙醇与截留液体积比为3:1，静置沉淀条件为4℃沉淀12h。

8.如权利要求1所述小分子量海带硫酸化多糖，其特征在于步骤(6)中所述超滤膜截留分子量为10kDa；所述蒸馏水加入量以海带粗多糖质量计为100mL/g，抗坏血酸加入量以海带粗多糖质量计为0.5g/g，过氧化氢加入量以海带粗多糖质量计为0.3mL/g。

9.一种权利要求1所述小分子量海带硫酸化多糖在制备预防肥胖的药品或食品添加剂中的应用。

10.一种权利要求1所述小分子量海带硫酸化多糖在制备治疗肠道菌群紊乱制剂中的应用。

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