CN101011412A - 低分子量褐藻多糖硫酸酯在制备治疗肝脏疾病的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了分子量为15000－200000的低分子量褐藻多糖硫酸酯在制备治疗肝损害疾病的药物中的用途，其中的肝损害疾病包括但不限于肝炎、脂肪肝、肝纤维化和肝硬化，其中的肝炎包括但不限于在临床上常见的病毒性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、重金属中毒性肝炎等。本发明中的低分子量褐藻多糖硫酸酯可以从海带、墨角藻、泡叶藻、昆布或绳藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯降解而得。
Description
技术领域
本发明涉及低分子量褐藻多糖硫酸酯的制药用途，特别涉及低分子量褐藻多糖硫酸酯在制备治疗肝脏疾病药物方面的用途。
背景技术
褐藻多糖硫酸酯是一类硫酸化多糖，存在于褐藻中，首先由Kylin在1913年用稀酸从掌状海带中提取出来。Kylin将提取物水解后分离出L-岩藻糖，他将这种多糖命名为fucoidin，现根据多糖的命名原则一般定名为fucoidan，中文名称为墨角藻多糖、岩藻多糖、岩藻聚糖、岩藻聚糖硫酸酯、褐藻糖胶或褐藻多糖硫酸酯。现在人们对褐藻多糖硫酸酯的组成有较为清晰的了解，它是一类化学组成和结构非常复杂的多糖，以岩藻糖和硫酸基为主，随着藻的种类不同还含有半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。海带Fucoidan由岩藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖等单糖组成。以岩藻糖和半乳糖为主，岩藻糖与半乳糖大概在3∶1。
褐藻多糖硫酸酯化学结构非常复杂，不同褐藻中分离到的褐藻多糖硫酸酯其结构有很大差异。到目前为止，对来源于墨角藻(Fucus vesiculosus)和泡叶藻(Ascophyllum nodosum)的褐藻多糖硫酸酯的结构研究最多，墨角藻褐藻多糖硫酸酯主要以α(1→3)糖苷键连接，硫酸化主要发生在C4位。对泡叶藻褐藻多糖硫酸酯的多项研究都表明其中存在大量的α(1→3)和α(1→4)糖苷键。此外还有几种褐藻褐藻多糖硫酸酯的结构被报道。昆布(Ecklonia kurome)褐藻多糖硫酸酯主要为α(1→3)连接，硫酸化在C4位。来源于枝管藻(Cladosiphonokamuranus)和绳藻(Chorda filum)的褐藻多糖硫酸酯主链均为α(1→3)的岩藻糖，硫酸化在C4位，而且，二者均有少量的2-O-乙酰化。
墨角藻、泡叶藻褐藻多糖硫酸酯结构
昆布褐藻多糖硫酸酯结构
绳藻褐藻多糖硫酸酯结构
关于海带褐藻多糖硫酸酯的结构，多数的研究资料表明海带褐藻多糖硫酸酯主要是以α-(1→3)连接的L-岩藻糖组成，硫酸化发生在C4或C2位，而且部分研究显示存在部分(1→2)连接的L-岩藻糖作为侧链。与上图中绳藻褐藻多糖硫酸酯结构有相似之处。但绳藻中有部分乙酰基。而且不同取代基团所占的比例也不一样。当然分子中还存在半乳糖、木糖、鼠李糖等单糖，半乳糖可能参与了主链的组成，而木糖、鼠李糖等是以侧链的形式存在。
已有多篇文献公开了褐藻多糖硫酸酯以及低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法及其制药用途。日本专利昭46-2248采用十六烷氯化吡啶或十六烷三甲基溴化铵与褐藻多糖硫酸酯反应成季胺盐复合物，再利用该复合物对盐的溶解度差异，用乙醇、甲醇和离子交换树脂处理，纯化除去褐藻胶、中性多糖和其它杂质，而得到比较纯化的褐藻多糖硫酸酸酯。CN1129109A则公开了由干海带浸泡、数次过滤、二次乙醇提取、一次乙醇洗涤、配合调节PH范围等的碱凝析法。CN1344565A则公开了另一种制备方法，包括原料预处理、控温搅拌浸提、离心、浓缩、乙醇沉淀、无水乙醇脱水等步骤。CN1517356A则将岩藻聚糖硫酸酯配制成水溶液，加入过氧化氢、次氯酸或亚硝酸及其盐，将所得混合溶液加热，用截留分子量3000-5000的膜超滤，得到岩藻聚糖硫酸酯低聚糖。CN1560086A则公开了一种高硫酸根含量岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，用热水或酸水浸提褐藻，制得含褐藻聚糖硫酸酯的提取液，将该提取液浓缩至多糖的重量百分数为2-10％，调PH5-8，加入壳聚糖溶液搅拌，离心或过收集沉淀，将沉淀用于5-10倍盐溶液提取2-4次，离心或过滤收集清液，将该清液透析或超滤脱盐。CN1616494A以天然海藻硫酸多糖为原料，将海藻硫酸糖溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢，控制反应温度，恒温降解时间为0.5-3hr，再透析或超滤，减压浓缩，制得4-100KDa的低分子量海藻硫酸多糖产物。另外，CN1670028A、CN1392160A、CN1197674A也分别公开了采用絮凝等方法制备海藻多糖。在本发明中，以上发明公开的内容均被全文引入本文作为参考。
此外，以上发明还公开了褐藻多糖硫酸酯以及低分子量褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血、提高免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗辐射、抑制腹水瘤等活性，CN1547478A则公开了其在治疗粘连、关节炎和牛皮癣中的用途。营养学报[2003，25(3)：286-289]公开了分子量为10000的低分子量褐藻多糖硫酸酯对小鼠肝损伤的保护作用。
发明内容
经研究，本发明申请人发现分子量15000～200000的低分子量褐藻多糖硫酸酯，特别是分子量为15000～30000的低分子褐藻多糖硫酸酯，与其它分子量范围低分子量褐藻多糖硫酸酯相比，对于肝损害具有意料不到的良好的保护作用，而且具有较低的毒副作用。因此，本发明的目的是提供分子量15000～200000低分子量褐藻多糖硫酸酯在治疗肝损害疾病方面的用途，即其在作为保肝药方面的用途。特别是提供了一种分子量15000～30000的低分子量褐藻多糖硫酸酯在治疗肝损害疾病方面的用途。其中，所述的肝损害是药源性或病源性肝损害，具体症状包括但不限于黄疸、转氨酶升高、胆红素升高等，涉及的疾病包括但不限于肝炎、脂肪肝、肝纤维化和肝硬化。其中所述的肝炎包括但不限于在临床上常见的病毒性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、重金属中毒性肝炎等。
另一方面，本发明提供了含低分子量褐藻多糖硫酸酯的药物组合物。所述组合物中包含治疗有效量的低分子量褐藻多糖硫酸酯和至少一种药学上可接受的辅料。该组合物的给药方式可以是但不限于经静脉注射、口服、肌肉、皮下、皮肤表面、直肠内、局部注射等方式给药，其剂型可以但不限于是注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、凝胶剂、贴片、膏剂等，其中优选注射液和冻干粉针剂。本领域技术人员根据现有技术以及制剂领域的公知常识可以方便地制备出所需剂型。
本发明中的低分子量褐藻多糖硫酸酯，是指将褐藻多糖硫酸酯通过某种合适的方式(降解方式包括但不限于酸降解法、碱降解法、酶降解法、物理降解法、自由基氧化降解法等)降解而制得的硫酸化多糖或寡糖类物质，其分子量较未降解褐藻多糖硫酸酯分子量低，具体的分子量范围可以是15000～200000，优选是15000～100000，更优选是15000～80000，最佳为15000～30000。褐藻多糖硫酸酯可以来源于人工养殖的海带，也可以是野生褐藻马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻或墨角藻。优选来源于海带。
本发明的组合物中，低分子量褐藻多糖硫酸酯的含量≥50％，优选为≥70％，更优选为≥90％，最佳是≥95％。单位制剂中褐藻多糖硫酸酯的含量可以是1mg～1000mg，优选10mg～800mg，更优选20mg～500mg，最优选20mg～300mg，最佳是30mg～100mg。
本发明的褐藻多糖硫酸酯可以按以下方式提取和纯化、分级：
1.提取
褐藻多糖硫酸酯可以用水、稀酸或氯化钙溶液提取，然后向提取液中加入氢氧化铅、氢氧化铝、乙醇或季胺盐类阳离子表面活性剂，都可使褐藻多糖硫酸酯沉淀出来，为了减少色素、蛋白质等的溶出，提取之前可以先以高浓度醇类或甲醛溶液处理藻体。
近年来也陆续有人采用微波提取、超声波提取以及高分子絮凝沉淀提取等方法。
2纯化
制备的粗褐藻多糖硫酸酯通常会含有部分水溶性褐藻胶、蛋白质、褐藻淀粉、色素等，需要进一步纯化，纯化方法有以下几种：
乙醇重沉淀：西出英一(西出英一等，日本水産学会誌，1982，48(12)：1771)对热水提取的粗褐藻多糖硫酸酯水溶液在0.05M MgCl2存在时，以20％乙醇沉淀除去作为杂质的水溶性褐藻胶。王作芸、赵学武(王作芸.赵学武.铜藻的褐藻糖胶、褐藻淀粉和褐藻胶的分离及提纯.水产学报.1985；9(1)：71)在研究铜藻中褐藻多糖硫酸酯时，将制得的粗褐藻多糖硫酸酯溶于水后，先后以4M CaCl2和30％乙醇沉淀去除褐藻胶，然后用80％乙醇沉出纯化的褐藻多糖硫酸酯。
季胺盐类沉淀法：利用阳离子表面活性剂如十六烷基氯化吡啶(CPC)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)能与高分子电解质产生沉淀的性质使褐藻多糖硫酸酯沉淀下来。
在提取和纯化过程中，为除去溶液中的离子和小分子物质一般都采用透析的方法。也有人采用超滤分离方法以排除分子量较小的物质。有时为除去混杂在提取液中的褐藻淀粉和蛋白质，可采取酶消化法。Feury等(Fleury N andLahaye M.Studies on by-products from the industrlal extration of alglnate2.Chemieal structure analysis of fucans from the leach-water.J Appl Phycol，1993，5：605-610)在研究法国褐藻胶工业的副产品时就采用葡聚糖酶和alcalase来清除其中的褐藻淀粉和蛋白质。分离褐藻淀粉和褐藻多糖硫酸酯还可以采用离子交换树脂法，因为前者是电中性的，而后者为多聚阴离子形式。
3分级
由于褐藻多糖硫酸酯化学组分相当复杂，对制备出的粗褐藻多糖硫酸酯的色谱和电泳检查一般都呈现不均一性，因此人们逐步使用分级方法将混杂的多糖分成不同级分以进行深入研究常用的分级方法有两种：一种是乙醇分级沉淀，即利用不同的乙醇浓度沉淀出不同的级分，另一种是层析法，利用凝胶过滤柱层析和离子交换层析进行分级。离子交换层析法能将多糖分成荷电性不同的级分，凝胶过滤层析法则将多糖按照分子量大小进行分级。还可以采用超滤技术对褐藻多糖硫酸酯进行分级。
将褐藻多糖硫酸酯降解从而制备低分子量褐藻多糖硫酸酯的方法则可采用以下几种：
1.酸降解，在酸性条件下，酸性溶液能引起多糖中糖苷键的断裂，使多糖降解为低分子片段。控制酸的浓度、温度及时间可获得不同分子量大小的降解产物。多糖降解产品分子量分布较难控制，硫酸根含量变化较大。
2.碱解法，在碱性条件下，往往引起酸性多糖的改性及硫酸根的脱落，影响产品的活性，因此不适用于海藻硫酸多糖。
3.酶解法，酶解法是利用专一性糖苷酶通过开裂多糖中的某一糖苷键来达到降解的目的。酶降解反应因其高度的专一性、高效性以及降解条件及过程易于控制，无副反应等，在多糖降解中已逐渐受到重视。但由于酶的专一性强，因此不具有广泛的适用性，而且酶生产周期长，容易失去活性，成本高。这些缺点都使得该法目前无法推广应用。
4.物理降解法，包括超声波和微波等方法。这两种方法由于能耗高，仪器设备条件要求高，样品处理量小，目前无法应用于工业生产。超声波辐射的结果表明，无论辐射时间长短，解聚分子量有个低限；而且，解聚物具有相当窄的分子量分布。
5.自由基氧化降解例如以过氧化氢降解法肝素所得产物的硫酸化程度较高，成本较低，具有较大的应用价值。
另外，本文中所引用专利公开的提取方法以及由这些方法制备的产品也可以被本领域技术人员任意地采用。
在本发明的一个具体实施方式中，低分子量褐藻多糖硫酸酯是采用以下制备方法制备：将海带粉碎后以甲醛溶液浸泡过夜，添加蒸馏水沸水提取，提取液以硅藻土助滤过滤，滤液水透析，将透析液浓缩，加乙醇至浓度为75％沉淀，沉淀干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。将粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl2存在下20％乙醇沉淀除去水溶性褐藻胶，滤液透析、浓缩后75％乙醇沉淀，干燥后即得到纯化的褐藻多糖硫酸酯。取适量海带褐藻多糖硫酸酯，溶于蒸馏水中；向该溶液中加入适量抗坏血酸和过氧化氢，混合均匀，在室温下搅拌反应，对反应液进行透析和超滤，，将超滤液进行减压浓缩，将浓缩液冷冻干燥。
以下通过具体实施方式对本发明进行进一步说明。这里想要指出的是，下面的具体实施方式仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发明精神的前提下，可以根据本技术领域的现有技术和公知知识对本发明进行相应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。
具体实施方式
实施例1褐藻多糖硫酸酯的制备
将海藻粉碎后以3.7％甲醛溶液浸泡过夜，然后添加蒸馏水沸水提取，提取液以硅藻土助滤过滤，滤液先以自来水流水透析一天，然后以蒸馏水透析一天，将透析液浓缩，加乙醇至浓度为75％沉淀，沉淀干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。将粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl2存在下20％乙醇沉淀除去水溶性褐藻胶，滤液透析、浓缩后75％乙醇沉淀，干燥后即得到纯化的褐藻多糖硫酸酯。按照上述方法制备四种海藻褐藻多糖硫酸酯，其化学组分分析如下表所示：
| 海藻 | 岩藻糖(％) | 硫酸根(％) | 峰位分子量(kD) | 灰分(％) | 单糖摩尔比率 | |||
| 岩藻糖 | 半乳糖 | 木糖 | 葡萄糖 | |||||
| 海黍子 | 26.5 | 14.8 | 980 | 20.8 | 1.00 | 0.24 | 0.05 | 0.04 |
| 鼠尾藻 | 25.4 | 17.0 | 650 | 22.6 | 1.00 | 0.24 | 0.03 | |
| 冬青叶马尾藻 | 13.3 | 12.5 | 588 | 20.8 | 1.00 | 0.35 | 0.16 | 0.08 |
| 海带 | 28.8 | 30.2 | 250 | 31.2 | 1.00 | 0.36 | ||
低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备
1.称取150g海带褐藻多糖硫酸酯，溶于10L蒸馏水中配成浓度为1.5％的溶液；向该溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢，使它们的浓度分别达到35mmol/L，混合均匀，在室温下搅拌反应2小时，反应完毕后，对反应液进行透析和超滤，将超滤液进行减压浓缩，再将浓缩液冷冻干燥；制得分子量范围为8000-10000Da的低分子量褐藻多糖硫酸酯A；经高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法检测该产物重均分子量为9.8KD。化学组分分析结果：岩藻量28.4％，硫酸根含量28.7％。
2.称取150g海带褐藻多糖硫酸酯，溶于10L蒸馏水中配成浓度为1.5％的溶液；向该溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢，使它们的浓度分别达到2mmol/L，混合均匀，在室温下搅拌反应2小时，反应完毕后，对反应液进行透析和超滤，将超滤液进行减压浓缩，再将浓缩液冷冻干燥；制得分子量范围为50KD-80KD的低分子量褐藻多糖硫酸酯B；经高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法检测该产物的重均分子量为72.2KD。化学组分分析结果：岩藻糖含量28.1％，硫酸根含量29.2％。
3.称取150g海带褐藻多糖硫酸酯，溶于10L蒸馏水中配成浓度为1.5％的溶液；向该溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢，使它们的浓度分别达到10mmol/L，混合均匀，在室温下搅拌反应2小时，反应完毕后，对反应液进行透析和超滤，除去残存的抗坏血酸和过氧化氢，将超滤液进行减压浓缩，再将浓缩液冷冻干燥；制得分子量范围15KD-30KD的低分子量褐藻多糖硫酸酯C；经高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法检测该产物的重均分子量为27KD。化学组分分析结果：岩藻量28.5％，硫酸根含量28.2％。
实施例2低分子量褐藻多糖硫酸酯注射剂的制备
取低分子量褐藻多糖硫酸酯50g，加入注射用水500ml，甘露醇50g，调PH值至7.0，分装，冷冻干燥。
实施例3低分子量褐藻多糖硫酸酯片剂的制备
取低分子量褐藻多糖硫酸酯50g，加入微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，混合，加入适量水，制软材，制粒，干燥。粒子加入交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁，混合，压片，每片含低分子量褐藻多糖硫酸酯10-200mg。
实施例4低分子量褐藻多糖硫酸酯对四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型的作用
采用四氯化碳溶于橄榄油，配制成0.1％，注射给予，10ml/kg，引起急性肝损伤模型。
将动物随机分组，设低分子量褐藻多糖硫酸酯A、B、C组(200mg/kg)、联苯双酯组(280mg/kg)、空白对照组和模型对照组，除空白对照组8只外，其余每组10只。试验前各组提前24h给药7次(空白对照组除外)，颈部皮下注射四氯化碳橄榄油悬液；药组灌胃给药(i.g)，10ml/kg，模型对照组灌胃等量的水，正常对照组不作任何处理，同样条件下饲养，每日一次，连续给药7天。于处死前最后一次给药40min后，眼球采血，收集血清，测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、白蛋白/球蛋白(A/G)比值。
实验结果
四氯化碳造模后，与正常动物组比较，小鼠肝功能发生显著性变化，血清中ALT、AST出现显著性升高(P＜0.05)，表明四氯化碳引起了动物肝功能的损害，造成了肝损伤模型。结果见表1
低分子量褐藻多糖硫酸酯A、B、C分别灌胃给药后，与模型对照组比较，200mg/kg能明显抑制CCl4引起的急性肝损伤所致的血清ALT、AST的升高(P＜0.05)，并升高急性肝模型所致的血清ALB、A/G的降低(P＜0.05)，其中疗效为C组＞B组＞A组。结果见表1
实施例5低分子量褐藻多糖硫酸酯对D-氨基半乳糖(DAG)致小鼠急性
肝损伤模型的作用
将动物随机分组，设低分子量褐藻多糖硫酸酯A、B、C组(200mg/kg)、联苯双酯组(280mg/kg)、空白对照组和模型对照组，除空白对照组8只外，其余每组10只。先各组一次ip DAG(空白对照组除外)，30min后各组动物灌胃(ig)给药，每日一次，连续7天。于用DAG7后天处理各组动物，自眼球后静脉丛采血，收集血清，测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、白蛋白/球蛋白(A/G)比值，同时剖取肝脏，固定，作病理组织学检查。
试验结果
生化检测结果：
DAG造模后，与正常动物组比较，小鼠肝功能发生显著性变化，血清中ALT、AST出现显著性升高(P＜0.05)，表明DAG引起了动物肝功能的损害，造成了肝损伤模型。结果见表2
低分子量褐藻多糖硫酸酯经治疗性口服给药后，200mg/kg能明显抑制DAG引起的急性肝损伤所致的血清ALT、AST的升高(P＜0.05)，显著性升高ALB，A/G(P＜0.05)，表明低分子量褐藻多糖硫酸酯能抑制DAG引起的急性肝损伤，有显著的保护作用，其中C的效果最优。结果见表2
病理检查结果：
检验方法送检标本为10％福尔马林固定的ICR小鼠肝脏组织。分别修块，经梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片(厚度5μ)，H·E染色和Masson染色，光镜下检查，结果如下。
DAG急性肝损伤模型组：DAG急性肝损伤模型组中10/10例中重度肝细胞水变性，1/10例中度肝细胞坏死。模型对照组具备DAG急性肝损伤后的病理变化。
低分子量褐藻多糖硫酸酯A组：低分子量褐藻多糖硫酸酯组中8/10例肝细胞水变性，其余肝脏组织未见肝细胞脂肪变性、肝细胞水变性、肝细胞坏死、肝纤维组织增生及炎细胞浸润。
低分子量褐藻多糖硫酸酯B组：低分子量褐藻多糖硫酸酯组中7/10例肝细胞水变性，其余肝脏组织未见肝细胞脂肪变性、肝细胞水变性、肝细胞坏死、肝纤维组织增生及炎细胞浸润。
低分子量褐藻多糖硫酸酯C组：低分子量褐藻多糖硫酸酯组中5/10例肝细胞水变性，其余肝脏组织未见肝细胞脂肪变性、肝细胞水变性、肝细胞坏死、肝纤维组织增生及炎细胞浸润。
联苯双酯组：7/10例轻度的肝细胞水变性，其余肝脏组织未见肝细胞脂肪变性、肝细胞水变性、肝细胞坏死、肝纤维组织增生及炎细胞浸润。显示联苯双酯对DAG急性肝损伤后的肝脏病变有一定的治疗作用。
结论：
病理检查提示受试物低分子量褐藻多糖硫酸酯在口服给药7天后对受试动物ICR小鼠的DAG急性肝损伤后肝脏病变有一定的治疗作用，其治疗作用为C组＞B组＞A组。
实施例6低分子量褐藻多糖硫酸酯对慢性肝损伤模型的作用
取大鼠，于3个月内每周2次皮下注射四氯化碳橄榄油悬液，中毒1个月后，中毒大鼠再按体重分组：模型对照组、低分子量褐藻多糖硫酸酯A、B、C组(200mg/kg)、联苯双酯组(200mg/kg)，并同时设立正常对照组。开始给药，2个给药组灌胃给药(i.g)，10ml/kg，模型对照组灌胃等量的水，正常对照组不作任何处理，同样条件下饲养。每天一次，给药2个月，末次给药后2h，眼眶后静脉丛取血，3000转/min离心15min，取血清测定谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、唾液酸(SA)、白蛋白(ALB)、白蛋白/球蛋白(A/G)比值。取血后脱臼处死，取肝组织(固定位置为肝左叶)，分为2部分，一部分匀浆用于测定肝组织中羟脯氨酸的含量，另一部分固定于10％福尔马林溶液中，用于病理组织学检查。
血清唾液酸的测定：
| 测定管 | 标准管 | 空白管 | |
| 血清(ml) | 0.1 | ||
| 1mmol/L SA标准(ml) | 0.1 | ||
| 蒸馏水(ml) | 0.1 | ||
| 试剂一(ml) | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 试剂二显色剂(ml) | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
混匀，100℃水浴(或者开盖煮沸)15min，流水冷却后，3500转/min离心10min，取上清液，560nm波长，1cm光径，空白管调零，测定各管吸光度。
计算：
样本肝组织处理及羟脯氨酸测定步骤：
1)组织水解：精确称取肝组织湿重，加水解液1ml，混匀。将带盖的磨口玻璃试管加盖后，95℃或者沸水浴水解20min。
2)调PH值至6.0～6.8：将各磨口试管流水冷却后各加指示剂1滴，摇匀；各管加入PH甲液1.0ml，混匀(此时溶液应为红色)；用200ul的加样器吸取条PH值的乙液，每滴加入后均要摇匀，之至液体中指示剂的颜色变成黄绿色。此时PH值在6.0～6.8(约加PH乙液100ul～500ul左右)；然后加蒸馏水至10ml，混匀；取3～4ml加适量活性炭(约20～30mg左右，以上清液离心后澄清无色为准)混匀，3500转/min离心10min，取上清液1ml按下步骤操作：
| 空白管 | 标准管 | 测定管 | |
| 蒸馏水(ml) | 1.0 | ||
| 5μg/ml标准液(ml) | 1.0 | ||
| 检测液(ml) | 1.0 | ||
| 试剂一(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 混匀，静置10min | |||
| 试剂二(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 混匀，静置5min | |||
| 试剂三(ml) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
混匀，60℃水浴15min，冷却后，3500转/min离心10min。取上清液2ml
3)测定，取上清液在550nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度。
4)羟脯氨酸含量的计算，按照下述公式计算：
肝胶原蛋白μg/mg肝重＝羟脯氨酸μg/mg肝重÷13.4％*
(*羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％)
试验结果
生化检测结果：
四氯化碳致大鼠慢性肝损伤后，血清中转氨酶ALT、AST、G均出现显著性升高(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05)，ALB、A/G均出现显著性下降(P＜0.01、P＜0.01)，肝组织出现纤维化，肝组织中羟脯氨酸、唾液酸以及肝胶原出现显著性升高(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01)。结果见表3、表4
低分子量褐藻多糖硫酸酯A、B、C组连续口服给药2月后，200mg/kg剂量使升高的转氨酶ALT、AST显著降低(P＜0.05、P＜0.01)，200mg/kg剂量使降低的ALB显著升高(P＜0.05)，显著升高A/G倒转的比例(P＜0.01)，200mg/kg剂量显著降低升高的唾液酸含量(P＜0.05)，200mg/kg剂量显著降低升高的羟脯氨酸含量(P＜0.05)。表明低分子量褐藻多糖硫酸酯对四氯化碳致慢性肝损伤有显著的治疗作用；其治疗作用为C组＞B组＞A组。结果见表3、表4
病理检查结果：
CCl4慢性肝损害模型组：CCl4慢性肝损害组中14/14例肝细胞脂肪变性，8/14例肝细胞坏死，8/14例肝纤维组织增生，7/14例灶状炎细胞浸润。CCl4慢性肝损害模型组表现为轻中度肝细胞脂肪变性，灶状肝细胞坏死，不同程度的肝纤维组织增生，可见假小叶形成，同时伴有灶状的炎细胞浸润。具备CCl4慢性肝损伤后的病理变化。
低分子量褐藻多糖硫酸酯A组：低分子量褐藻多糖硫酸酯组中10/10例肝细胞脂肪变性，1/10例肝细胞坏死，6/10例肝纤维组织增生，其余肝脏组织未见肝细胞水变性、肝细胞坏死、肝纤维组织增生及炎细胞浸润。
低分子量褐藻多糖硫酸酯B组：低分子量褐藻多糖硫酸酯组中10/10例肝细胞脂肪变性，1/10例肝细胞坏死，3/10例肝纤维组织增生，其余肝脏组织未见肝细胞水变性、肝细胞坏死、肝纤维组织增生及炎细胞浸润。
低分子量褐藻多糖硫酸酯C组：低分子量褐藻多糖硫酸酯组中10/10例肝细胞脂肪变性，其余肝脏组织未见肝细胞坏死、肝细胞水变性、肝纤维组织增生、肝细胞坏死、及炎细胞浸润。
联苯双酯组：联苯双酯组中12/12例肝细胞脂肪变性，2/12例肝细胞坏死，6/12例肝纤维组织增生，其余肝脏组织未见肝细胞水变性、肝细胞坏死、肝纤维组织增生及炎细胞浸润。联苯双酯对CCl4慢性损伤后的肝脏病变有一定的治疗作用。
结论：病理检查提示受试物低分子量褐藻多糖硫酸酯和联苯双酯在灌胃给药60天后对受试动物SD大鼠CCl4慢性肝损伤后肝脏病变有一定的治疗作用，低分子量褐藻多糖硫酸酯的作用效果为C组＞B组＞A组。
表1低分子量褐藻多糖硫酸酯对CCL4致小鼠急性肝损伤模型的作用
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | A/G | ALT(U/L) | AST(U/L) | ALB(g/L) |
| 正常对照组 | - | 8 | 1.598±0.106 | 31.7±5.5 | 91.0±16.1 | 29.3±2.2 |
| 模型对照组 | - | 10 | 1.389±0.324△ | 80.0±55.3△ | 115.6±38.6△ | 23.9±2.9△ |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯A组 | 200 | 10 | 1.585±0.248* | 42.3±22.5 | 100.6±23.2 | 25.5±2.3* |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯B组 | 200 | 10 | 1.587±0.215* | 31.3±19.8* | 93.2±24.9* | 26.9±2.5* |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯C组 | 200 | 10 | 1.596±0.125** | 30.9±21.7* | 91.4±13.4* | 30.6±1.7** |
| 联苯双酯组 | 280 | 10 | 1.584±0.208* | 34.6±14.4* | 91.0±17.1* | 26.6±4.1* |
与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表2低分子量褐藻多糖硫酸酯对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的作用
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | A/G | ALT(U/L) | AST(U/L) | ALB(g/L) |
| 正常对照组 | - | 8 | 1.652±0.091 | 29.3±6.3 | 98.5±18.3 | 28.6±3.8 |
| 模型对照组 | - | 10 | 1.435±0.227△ | 100.6±88.0△ | 119.9±24.8△ | 24.5±3.4△ |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯A组 | 200 | 10 | 1.642±0.140* | 46.3±5.8* | 100.6±15.1* | 25.3±3.7 |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯B组 | 200 | 10 | 1.653±0.158* | 30.6±5.5* | 98.4±19.4* | 26.1±4.8 |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯C组 | 200 | 10 | 1.668±0.076** | 25.3±3.4** | 94.7±10.6** | 28.0±3.7* |
| 联苯双酯组 | 280 | 10 | 1.644±0.172* | 29.0±10.9* | 94.1±17.4* | 27.5±2.2* |
与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表3低分子量褐藻多糖硫酸酯对CCL4致大鼠慢性肝损伤血生化的影响
| 剂量(mg/kg) | 动物数 | ALB(g/L) | ALT(U/L) | AST(U/L) | |
| 正常对照组 | - | 8 | 35.1±4.9 | 45.7±7.8 | 151.8±20.6 |
| 模型对照组 | - | 14 | 27.6±4.6△△ | 337.9±282.2△△ | 530.0±298.7△△ |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯A组 | 200 | 10 | 31.3±2.2* | 133.0±108.0* | 386.1±174.2* |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯B组 | 200 | 10 | 32.0±2.6* | 124.8±99.7* | 280.6±103.3** |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯C组 | 200 | 10 | 34.9±1.8** | 67.9±21.0** | 196.1±26.5** |
| 联苯双酯组 | 200 | 12 | 32.3±3.5** | 53.7±13.9** | 206.8±34.9** |
| 剂量(mg/kg) | 动物数 | G(g/L) | A/G | ||
| 正常对照组 | - | 8 | 29.9±5.8 | 1.215±0.268 | |
| 模型对照组 | - | 14 | 36.8±9.2△ | 0.796±0.224△△ | |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯A组 | 200 | 10 | 31.4±4.9* | 0.951±0.247* | |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯B组 | 200 | 10 | 28.0±5.5** | 1.152±0.200** | |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯C组 | 200 | 10 | 27.9±4.8** | 1.209±0.198** | |
| 联苯双酯组 | 200 | 12 | 28.4±3.0** | 1.146±0.137** |
与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
表4低分子量褐藻多糖硫酸酯对CCL4致大鼠慢性肝损伤纤维化的影响
| 组别 | 剂量(mg/g) | 动物数(只) | 唾液酸(mg/L) | 羟脯氨酸(ug/mg) | 肝胶原(ug/mg) |
| 正常对照组 | - | 8 | 1177.06±118.87 | 0.108±0.020 | 0.802±0.148 |
| 模型对照组 | - | 14 | 1520.97±167.14△△ | 0.268±0.056△△ | 2.000±0.417△△ |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯组A | 200 | 10 | 1321.74±210.73* | 0.206±0.067* | 1.724±0.334* |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯组B | 200 | 10 | 1287.89±189.81** | 0.191±0.051* | 1.536±0.449* |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯组C | 200 | 10 | 1159.36±168.99** | 0.164±0.036** | 1.136±0.227** |
| 联苯双酯组 | 200 | 12 | 1334.57±155.33** | 0.155±0.046** | 1.329±0.341** |
与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例7低分子量褐藻多糖硫酸酯溶血性试验
取试管17支，1-5管分别加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5m配制后的低分子量褐藻多糖硫酸酯A溶液(10mg/ml)，6-10管分别加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5m配制后的低分子量褐藻多糖硫酸酯B溶液(10mg/ml)；11-15管分别加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5m配制后的低分子量褐藻多糖硫酸酯C溶液(10mg/ml)，并用生理盐水注射液稀释至2.5ml，16号、17号试管中分别加入生理盐水注射液2.5ml、蒸馏水2.5ml(完全溶血对照)。最后每管均加入2％兔红细胞悬液2.5ml，轻轻摇匀，置37℃水浴中，分别记录1h、2h、4h、6h、8H各管的溶血和凝集情况。
溶血结果判断标准为：
完全溶血：溶液澄清，红色，管底无红细胞残留。
部分溶血：溶液澄清，红色或棕色，管底尚有少量红细胞残留。
不溶血：红细胞全部下沉，上层液无色澄明。
凝集：虽不溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不能分散，或出现药物沉淀。
实验结果
低分子量褐藻多糖硫酸酯A、B、C在4小时内对家兔血红细胞均无溶血和凝集作用，但在8小时内，低分子量褐藻多糖硫酸酯A、B分别出现了部分溶血现象，低分子量褐藻多糖硫酸酯C则没有出现溶血现象，说明如果低分子量褐藻多糖硫酸酯做成注射剂，低分子量褐藻多糖硫酸酯疗C的安全性更高。实验结果见表5。
表5低分子量褐藻多糖硫酸酯的溶血试验结果
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | |
| 低分子量褐藻多糖硫酸酯(ml) | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0 | 0 | |
| 生理盐水注射液(ml) | 2.4 | 2.3 | 2.2 | 2.1 | 2.0 | 2.4 | 2.3 | 2.2 | 2.1 | 2.0 | 2.4 | 2.3 | 2.2 | 2.1 | 2.0 | 2.5 | 0 | |
| 蒸馏水(ml) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2.5 | |
| 2％红细胞(ml) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | |
| 溶血情况 | 1h | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ++ |
| 2h | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ++ | ||
| 4h | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ++ | ||
| 6h | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ++ | ||
| 8h | - | - | - | + | + | - | - | + | + | - | - | - | - | - | - | ++ | ||
| 凝集情况 | 1-17管均无红细胞凝集现象 | |||||||||||||||||
注：-不溶血；+部分溶血；++完全溶血
Claims (10)
1 低分子量褐藻多糖硫酸酯在制备治疗肝损害疾病的药物中的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯是将褐藻多糖硫酸酯通过降解而制得的硫酸化多糖或寡糖类物质。
2 根据权利要求1的用途，其中所述的肝损害疾病选自肝炎、脂肪肝、肝纤维化和肝硬化中的一种或几种。
3 根据权利要求2的用途，其中所述的肝炎选自病毒性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、重金属中毒性肝炎中的一种或几种。
4 根据权利要求1～3中任一项权利要求的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量为15000～200000。
5 根据权利要求4的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量为15000～100000。
6 根据权利要求5的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量为15000～80000。
7.根据权利要求6的用途，其中其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸分子量为15000～30000。
8 根据权利要求1的用途，其中所述的降解方式选自酸降解法、碱降解法、酶降解法、物理降解法、自由基氧化降解法。
9 根据权利要求8的用途，其中的褐藻多糖硫酸酯来源于海带。
10 根据权利要求1的用途，其中的低分子量褐藻多糖硫酸酯的剂型为注射剂、口服制剂、局部给药制剂或鼻腔给药制剂。
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