CN111116771B - 裙带菜提取多糖及其在制备α-葡萄糖苷酶活性抑制药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种裙带菜多糖及其在制备α‑葡萄糖苷酶活性抑制药物中的应用。本发明制备的两种多糖Up‑3和Up‑4，其特点分子量分别为78～282kDa和41～314kDa；Up‑3主要由葡萄糖醛酸，甘露糖和岩藻糖组成，Up‑4主要由鼠李糖，葡萄糖醛酸和岩藻糖组成；对α‑葡萄糖苷酶抑制活性IC₅₀值分别为113.40±3.02μg/mL和50.53±3.47μg/mL，且具有显著性抑制口服麦芽糖导致的血糖升高。这说明硫酸化多糖Up‑3和Up‑4通过抑制肠道内α‑葡萄糖苷酶活性，从而降低餐后血糖的水平，而达到降血糖效果。

Description

裙带菜提取多糖及其在制备α-葡萄糖苷酶活性抑制药物中的 应用

技术领域

本发明涉及裙带菜来源的两种硫酸化多糖及在制备α-葡萄糖苷酶活性抑制药物中的应用。

背景技术

糖尿病是一种由胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足导致高血糖的慢性代谢混乱近年来，在世界上糖尿病人数逐年增多。世界糖尿病人数已经到4.25亿并且这个数量估计在2040年达到4.62亿(IDF Diabetes Atlas)，其中WHO(2018)报道糖尿病病人约有90％被诊断为2型糖尿病。2型糖尿病主要表现为胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗，发病前期由于肝脏葡萄糖生成增多和外周葡萄糖的摄取减少，最后导致高血糖。

α-葡萄糖苷酶是重要的消化酶，主要用于消化食物中的麦芽糖和蔗糖。α-葡萄糖苷酶位于小肠粘膜，通过与膜结合水解终端非还原1,4-糖苷键葡萄糖残基释放游离的α-葡萄糖苷酶，以调节肠道内葡萄糖浓度。α-葡萄糖苷酶抑制剂是用于治疗2型糖尿病的一类药物。

裙带菜(Undaria pinnatifida)是一种可食用褐藻。在韩国，中国和日本是备受喜爱的食物之一。硫酸化多糖是裙带菜中最主要的活性化合物之一。在近年来，从裙带菜中提取的硫酸化多糖的多种生物学活性被广泛研究，包括抗氧化，抗炎，抗癌和抗肥胖活性。然而，裙带菜来源硫酸化多糖在制备降血糖活性药物中的应用还未见报道。本发明发现裙带菜来源的两种硫酸化多糖在降血糖方面具有显著功效。

发明内容

为了寻找裙带菜中降血糖的活性物质，本发明从裙带菜分离纯化出两种裙带菜提取多糖，即硫酸化多糖，这两种硫酸化多糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制效果比阿卡波糖要强，且具有显著性抑制口服麦芽糖导致的血糖升高，说明这两种多糖可以降低2型糖尿病患者餐后血糖水平。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种裙带菜提取多糖，所述多糖按如下方法制备：

(1)脱脂：将裙带菜粉末与体积浓度70～100％乙醇水溶液混合，煮沸浸提2～4h，过滤，滤饼干燥(优选50～70℃)，获得脱脂裙带菜粉；

(2)微波辅助热水提取：向步骤(1)脱脂裙带菜粉中加去离子水并静置(优选 20-30min)，在微波功率600-700W、温度70～80℃条件下微波浸提20～40min，离心，收集上清液；

(3)除海藻胶：将步骤(2)中的上清液浓缩5-10倍体积，获得浓缩液；向浓缩液中缓慢加入CaCl₂水溶液(优选质量浓度0.04g/ml)使CaCl₂终浓度为0.015～ 0.025g/ml，搅拌后静置不少于15min，离心，收集上清液；

(4)透析：将步骤(3)中的上清液浓缩2-5倍体积，获得浓缩液；将浓缩液在透析袋内室温透析24～48h，收集截留液；

(5)乙醇沉淀：步骤(4)截留液浓缩2-5倍体积，加入无水乙醇，在0～4℃下静置沉淀12～24h；离心，收集沉淀，烘干(优选50～70℃)，得到裙带菜粗多糖；

(6)纯化：将步骤(5)裙带菜粗多糖用去离子水溶解，离心，取上清过 DEAE-Sepharose快速阴离子交换柱，分别用纯水，0.2M NaCl水溶液，0.3M NaCl 水溶液和0.4MNaCl水溶液进行洗脱，收集0.3M NaCl水溶液和0.4M NaCl水溶液的流出液，分别用透析袋(截留分子量为14kDa)室温透析24～48h，取截留液，冻干，获得裙带菜提取多糖，分别记为裙带菜提取多糖Up-3和裙带菜提取多糖Up-4。

进一步，所述离心均为8000rpm离心10min。

进一步，步骤(1)中裙带菜粉末是将质量含水量3-4％的裙带菜粉碎，过80目筛，得到裙带菜粉。

进一步，步骤(1)中体积浓度70～100％乙醇水溶液体积用量以裙带菜粉末重量计为20-30ml/g，优选30ml/g。乙醇水溶液浓度优选为95％。

进一步，步骤(2)中去离子水体积用量以脱脂裙带菜粉质量计为20-40ml/g，优选30ml/g；所述微波条件优选为：在微波功率700W、温度75℃条件下微波浸提 25min。

进一步，步骤(3)中CaCl₂终浓度为0.02g/ml。

进一步，步骤(4)中所述透析袋截留分子量为14kDa。

进一步，步骤(5)所述无水乙醇与截留液体积比为3:1；静置沉淀条件为4℃沉淀12h。

进一步，步骤(6)去离子水加入量以裙带菜粗多糖质量计为10ml/g；洗脱流速为3mL/min。

进一步，本发明所述裙带菜提取多糖为硫酸化多糖，其中所述裙带菜提取多糖Up-3和裙带菜提取多糖Up-4分子量分别为78～282kDa和41～314kDa；所述裙带菜提取多糖Up-3主要由葡萄糖醛酸，甘露糖和岩藻糖组成，裙带菜提取多糖Up-4主要由鼠李糖，葡萄糖醛酸和岩藻糖组成。Up-3和Up-4硫酸基含量分别为10.4±0.8％和8.7±0.9％，糖醛酸含量分别为17.4±2.4％和9.1±1.2％。

本发明还提供一种裙带菜提取多糖在制备α-葡萄糖苷酶活性抑制药物中的应用。

本发明还提供一种裙带菜提取多糖在制备降血糖药物或保健品中的应用。

本发明还提供一种裙带菜提取多糖在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用。

本发明所述裙带菜提取多糖Up-3和裙带菜提取多糖Up-4可以单独、混合或与其他药物联，可制成为注射剂或口服制剂。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

(1)本发明裙带菜提取多糖硫酸基含量为8～12％，裙带菜提取多糖Up-3主要由葡萄糖醛酸，甘露糖和岩藻糖组成，裙带菜提取多糖Up-4主要由鼠李糖，葡萄糖醛酸和岩藻糖组成。

(2)本发明的制备方法快速提取多糖，能耗低，操作容易，工艺成本低等特点。

(3)本发明提供裙带菜来源的两种硫酸化多糖Up-3和Up-4对α-葡萄糖苷酶具有强的抑制作用，且可以降低餐后血糖水平，可用于制备预防或治疗糖尿病的降血糖药物和保健品。

(4)所述裙带菜提取多糖具有降血糖活性，其对α-葡萄糖苷酶抑制活性IC₅₀值分别为113.40±3.02μg/mL和50.53±3.47μg/mL，且具有抑制口服麦芽糖导致的血糖升高。

附图说明

图1为裙带菜提取多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性曲线图。

图2为小鼠口服麦芽糖耐受实验(OMTT)。

图3为小鼠口服麦芽糖耐受的AUC，注：“***”表示P＜0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：微波辅助水提硫酸化多糖

1、多糖提取

(1)将质量含水量3％-4％裙带菜，粉碎，过80目筛，得裙带菜粉。随后称取裙带菜粉130g，加入5L圆底烧瓶中，按照料液比1:30(g/ml)加入3.9L的体积浓度95％乙醇水溶液，摇晃混匀后，使其煮沸冷凝回流3小时，冷却后过滤，保留滤渣，将滤渣在65℃下烘干，得到脱脂的裙带菜粉110.4g，备用。

(2)随后称取脱脂的裙带菜粉20g，加入1L规格的微波反应瓶中，按照料液比1:30(g/ml)加入0.6L去离子水，混匀后静置30min，在微波反应萃取仪中进行微波萃取，微波萃取条件为700W，75℃，25min，获得萃取液。采用相同方法再将80g 脱脂的裙带菜粉分4次进行微波萃取，最后将所有萃取液在8000rpm离心10min，收集上清液2.2L。

(3)用旋转蒸发仪将步骤(2)所有上清液2.2L于55℃浓缩至400ml，向浓缩液中缓慢加入质量浓度0.04g/mL的CaCl₂水溶液280mL，并在加入过程中以300rpm 搅拌，静止30min以便沉淀海藻酸纳，再以8000rpm的速度离心10分钟，收集上清液588ml。

(4)随后将步骤(3)上清夜用中速滤纸过滤，55℃抽真空浓缩至180ml。将浓缩液180ml装入透析袋(截留分子量为14kDa)中，在4℃条件透析48h，得到截留液205ml。

(5)将步骤(4)截留液205ml再次55℃抽真空浓缩到90ml，加入无水乙醇 270ml，搅匀后4℃放置12小时，使裙带菜多糖充分沉淀。将沉淀以8000rpm的速度离心10分钟，留沉淀，在65℃下烘干12小时，得到4.03g裙带菜粗多糖，记为粗多糖Up。

(6)将1g粗多糖Up溶于10ml去离子水中，以8000rpm的速度离心10分钟，然后将上清液添加到DEAE-Sepharose快速流动柱(35mm×550mm)中，以0、0.2、 0.3、0.4M氯化钠水溶液依次进行梯度洗脱，流速均为3ml/min，并由自动收集器以 10mL/管的速度收集，依次收集0.3M和0.4M氯化钠水溶液的洗脱液，记为Up-3洗脱液和Up-4洗脱液。收集Up-3洗脱液210ml和Up-4洗脱液280ml，分别用旋转蒸发仪在55℃下分别浓缩至50ml和80ml，分别将浓缩液加入透析袋(截留分子量为 14kDa)中，在4℃条件透析48h，随后将截留液分别用旋转蒸发仪在55℃下浓缩至18ml和21ml，在-65℃条件下冻干干燥，分别获得60mg多糖Up-3和95.2mg多糖Up-4。

2、多糖结构鉴定

对步骤1所述制备的多糖Up-3和多糖Up-4进行多糖的理化性质分析，包括总糖含量测定、糖醛酸测定、蛋白质含量测定、硫酸根含量，分子量分布和单糖组成测定。

(1)总糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定样品中总糖含量：精确称量110℃烘干至恒重的葡萄糖岩藻糖10mg，溶于去离子水中，用容量瓶定容至100ml，配成0.1mg/ml的葡萄糖标准液，分别移取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml葡萄糖标准液并用去离子水补水至1ml，然后加入5％苯酚0.5ml及浓硫酸(质量浓度98％)2.5ml，充分混匀后，避光静置 20min，用酶标仪在490nm处测定其吸光值A490。以葡萄糖浓度为横坐标，以A490 为纵坐标，绘制标准曲线，曲线方程为y＝3.5589x+0.0052，R²＝0.9981，y为A490 nm 吸光值，x为糖浓度(mg/ml)。

精确称取适量多糖样品，用去离子水配成0.1mg/ml多糖溶液，准确吸取1ml多糖溶液，按上述操作步骤测定吸光值，用标准曲线计算多糖样品中的糖含量，结果见表1。

(2)糖醛酸测定

采用间羟基联苯法测定多糖样品中糖醛酸含量。准确称取葡萄糖醛酸7.5mg，用去离子水配制0.15mg/ml葡萄糖醛酸标准溶液50ml，分别移取0.02、0.04、0.06、0.08、 0.1ml的葡萄糖醛酸标准液并用去离子水补水至0.1ml，然后在冰水浴中条件下加入试剂A摇匀，100℃水浴5min，然后在冰水浴条件下冷却至室温，加入试剂B摇匀，室温放置15min，使用酶标仪在520nm处测定其吸光值A520。以葡萄糖醛酸浓度为横坐标，以A520吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，曲线方程为y＝3.7151x+0.0017， R²＝0.9972，y为A520 nm吸光值，x为糖醛酸浓度(mg/ml)。

精确称取适量多糖样品，用去离子水配成1mg/ml多糖溶液，准确吸取0.1ml多糖溶液，按上述操作步骤测定吸光值，用标准曲线计算多糖样品中的糖醛酸含量，结果见表1。

试剂A：准确称取硼砂(NaB₄O₇.10H₂O)1.1925g，加入浓硫酸(质量浓度98％) 40ml，摇晃溶解后，加入浓硫酸定溶至250ml得到试剂A。

试剂B：准确称取0.25g的NaOH，加30ml去离子水溶解，然后加入间羟基联苯 75mg，摇晃溶解后加去离子水定容至50ml，得到试剂B。

(3)蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法测定多糖样品中蛋白质含量。精确称量牛血清蛋白10mg，用去离子水配成100μg/ml标准蛋白溶液100ml，分别移取0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 ml蛋白标准液并用去离子水补至0.5ml，然后加入2.5ml考马斯亮蓝溶液，充分混匀后，避光反应10min，使用酶标仪在595nm处测定其吸光值A595。以蛋白质浓度为横坐标，以A595吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，曲线方程为y＝3.5396x+0.0212， R²＝0.9905，y为A595 nm吸光值，x为蛋白浓度(mg/ml)。

精确称取适量多糖样品，用去离子水配成2mg/ml多糖溶液，准确吸取0.5ml多糖溶液，按上述操作步骤测定吸光值，用标准曲线计算多糖样品中的蛋白含量，结果见表1。

(4)硫酸根含量测定

将硫酸钾粉末在110℃条件下烘干至恒重，准确称取35mg硫酸钾用离子水配置0.35mg/ml硫酸钾(也就是0.193mg/ml硫酸根)标准溶液100ml。分别移取0.5ml， 1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，加去离子水定容至3ml，加0.2M HCl水溶液3.8ml，明胶-氯化钡溶液1ml，充分摇匀，室温反应30min，使用酶标仪在500nm测吸光度。以硫酸根浓度为横坐标，以A500吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，曲线方程为 y＝0.6774x+0.0849，R²＝0.9914，y为A500 nm吸光值，x为硫酸根浓度(mg/ml)。

精确称取25mg多糖样品溶于6ml 2.0M盐酸水溶液中，110℃烘箱中水解6h，取出冷却至室温、随后中速滤纸过滤，滤液用去离子水定容于25ml容量瓶中得到水解多糖溶液。准确吸取3ml水解多糖溶液，按上述操作步骤测定吸光值，用标准曲线计算多糖样品中的硫酸根含量，结果见表1。

明胶-氯化钡溶液的配制：称取0.5g明胶，加入60ml水，在70℃下溶解后，4℃静置过夜得到明胶溶液。称取烘干的0.5g氯化钡，并转移到配好的明胶溶液中，静置2h后即为明胶-氯化钡溶液。

(5)分子量分布

多糖的平均分子量(Mw)通过配备有折射率检测器(RID)的高效凝胶渗透色谱仪(HPGPC)测定。使用的色谱柱为TSK-GEL G5000 PWXL(7.8×300mm)和 G3000 PWXL(7.8×300mm)。

将多糖Up-3和多糖Up-4分别配制成15mg/ml的水溶液，0.22μm水膜过滤获得检测样品。不同分子量的葡聚糖标准品(4kDa，12.6kDa，60.6kDa，420kDa， 820kDa)分别配制成5mg/ml的水溶液，分别通过0.22μm水膜过滤获得标准样品。色谱柱保持在25℃，进样20μl，使用0.1M NaNO₃水溶液以0.5ml/min的流速洗脱。根据葡聚糖标准品的不同分子量对数值和保留时间的关系绘制标定曲线，曲线方程为y＝-0.1961x+10.996，R²＝0.9902，y为分子量对数值，x为保留时间(分钟)。根据标准曲线计算出样品中分子量大小，结果见表1。

(6)单糖组成

单糖的分析是利用PMP衍生化方法。将5mg的样品(多糖Up-3和多糖Up-4) 溶解在5ml的4M三氟乙酸(TFA)水溶液中，在110℃下水解8h，得到样品水解液。随后用蒸发器55℃把样品水解液浓缩至干，加入1ml甲醇，再用蒸发器55℃将样品-甲醇液浓缩至干，以此重复3次以除去残留的TFA。然后用1mL的离子水去溶解最后浓缩至干的样品。将300μL样品与0.3M的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液200μL，0.3M的NaOH水溶液200μL混合，在60℃下衍生化1h，然后冷却至室温。随后，通过添加0.3M的HCl水溶液200μL终止反应，加入2ml的氯仿摇晃2min后，除去下层的氯仿，再加入2ml的氯仿摇晃2min后，除去下层的氯仿，将上层水相通过0.45μm膜过滤，并利用Eclipse XDB-C18色谱柱，柱温25℃，流动相为乙腈：0.1M的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾缓冲液(pH＝6.8)＝83:17(V/V)，上样体积20μL，在HPLC上进行紫外254nm波长分析。

同样条件下，用混合标准品水溶液(含岩藻糖2.12mg/ml、鼠李糖1.84mg/ml、阿拉伯糖1.72mg/ml、半乳糖1.8mg/ml、葡萄糖1.64mg/ml、木糖1.8mg/ml、甘露糖1.88mg/ml、半乳糖醛酸1.68mg/ml、葡萄糖醛酸1.92mg/ml)代替样品，测试254 nm处的各个吸收峰的面积。以单糖浓度为横坐标，以吸收峰的面积为纵坐标，绘制标准曲线，曲线方程分别为甘露糖(Man)y＝38.379x+1.3512，R²＝0.9943；鼠李糖(Rha) y＝32.328x+0.4433，R²＝0.9986；葡糖糖醛酸(GlcA)y＝32.815x-0.7003，R²＝0.998；半乳糖醛酸(GalA)y＝29.545x-1.2668，R²＝0.9949；葡糖糖(Glc)y＝31.321x+0.4255， R²＝0.999；半乳糖(Gal)y＝45.105x+0.5559，R²＝0.9995；木糖(Xyl)y＝42.929x+1.6734， R²＝0.9966；阿拉伯糖(Ara)y＝53.276x+0.1705，R²＝0.9986；岩藻糖(Fuc) y＝37.261x+1.7099，R²＝0.9956；y为不同单糖吸收峰的面积(mAV*s)，x为不同单糖浓度(mg/ml)。根据标准曲线计算出样品中单糖的组成，结果见表1。

表1多糖Up-3和Up-4理化性质分析

由表1可知多糖Up-3和多糖Up-4分子量分别为78～282kDa和41～314kDa。 Up-3主要由葡萄糖醛酸(GlcA)，甘露糖(Gal)和岩藻糖(Fuc)组成，Up-4主要由鼠李糖(Rha)，葡萄糖醛酸(GlcA)和岩藻糖(Fuc)组成。Up-3和Up-4硫酸基含量分别为10.4±0.8％和8.7±0.9％，糖醛酸含量分别为17.4±2.4％和9.1±1.2％，蛋白含量分别3.3±0.3％和1.9±0.2％。说明两种多糖Up-3和Up-4都为硫酸化多糖。

实施例2：硫酸化多糖Up-3和硫酸化多糖Up-4对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

分别将10μL、0.15U/ml的α-葡萄糖苷酶，10μL各种浓度(0.0001，0.001，0.01，0.03，0.05，0.08，0.1，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，5.0mg/ml)的多糖或阿卡波糖水溶液，80μL磷酸盐缓冲盐溶液(0.02mol/L，pH 6.8)和10μL 5mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)水溶液在96孔板中混合反应，在37℃下孵育30分钟，使用酶标仪在340nm处检测吸光值，记为A2。

分别将10μL 0.15U/ml的α-葡萄糖苷酶，80μL磷酸盐缓冲盐溶液(0.02mol/L，pH6.8)和10μL 5mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)水溶液在96孔板中混合反应，在37℃下孵育30分钟，使用酶标仪在340nm处检测吸光值，记为A1。

分别将10μL 0.15U/ml的α-葡萄糖苷酶，10μL各种浓度(0.01-3mg/ml)的多糖或阿卡波糖水溶液，80μL磷酸盐缓冲盐溶液(0.02mol/L，pH 6.8)在96孔板中混合反应，在37℃下孵育30分钟，使用酶标仪在340nm处检测吸光值，记为A0。

阿卡波糖(Acarbose)用作阳性对照。

α-葡萄糖苷酶的相对活性计算如下：

相对活性(％)＝(A2-A0)/(A1-A0)

其中A0是反应混合液中不含PNPG反应后的吸光度，A1是反应混合溶液中不含多糖或阿卡波糖反应后的吸光度，其他条件保持上述一致。

表2硫酸化多糖Up-3和Up-4对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

结果图1和表2可得，Up-3和Up-4具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC₅₀值分别为113.40±3.02μg/mL和50.53±3.47μg/mL，分别比常用的阳性对照阿卡波糖的IC₅₀值低3倍和6倍。

实施例3：硫酸化多糖Up-3和Up-4降餐后血糖活性

雄性C57BL/6小鼠(6周大，20-24g)29只，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。所有动物均在24±1℃的环境中进行12小时照明和12小时黑暗循环，并提供食物和水，适应1周后，将所有小鼠分为阴性对照组，阳性对照组和多糖处理组。禁食 12小时后，对小鼠进行了麦芽糖耐性试验，具体如下：

阴性组(Control)：给小鼠胃内注射100μL的生理盐水，然后灌胃给予用生理盐水配置的0.6g/ml的麦芽糖溶液，按照2g/kg(麦芽糖质量:小鼠体重)的剂量(8只小鼠)。

阳性组(Acarbose 50mg/kg)：小鼠灌胃给予用生理盐水配置的12.5mg/ml的阿卡波糖溶液，按照50mg/kg(麦芽糖质量:小鼠体重)的剂量。然后灌胃给予用生理盐水配置的0.5g/ml的麦芽糖溶液，按照2g/kg(麦芽糖质量:小鼠体重)的剂量(7 只小鼠)。

多糖治疗组：将小鼠分为Up-3和Up-4组，每组7只，分别给小鼠灌胃生理盐水配置的12.5mg/ml的Up-3和Up-4溶液，按照50mg/kg(多糖质量：小鼠体重)的剂量。然后灌胃给予用生理盐水配置的0.5g/ml的麦芽糖溶液，按照2g/kg(麦芽糖质量:小鼠体重)的剂量。

每只小鼠在灌胃麦芽糖溶液后分别在0、15、30、60和120分钟时从尾静脉抽取血液样品，并通过血糖仪测定血浆中血糖浓度，绘制口服麦芽糖耐受曲线OGTT，使用模型评估指标计算葡萄糖利用度AUC(Area under the curve)。

结果如图2和图3，多糖Up-3和多糖Up-4可以明显抑制由于口服麦芽糖导致的葡糖糖的上升，这说明多糖Up-3和多糖Up-4通过抑制肠道内α-葡萄糖苷酶活性，从而降低餐后血糖的水平。

本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变，替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种裙带菜多糖，其特征在于所述多糖按如下方法制备：

(1)脱脂：将裙带菜粉末与体积浓度70～100％乙醇水溶液混合，煮沸浸提2～4h，过滤，滤饼干燥，获得脱脂裙带菜粉；

(2)微波辅助热水提取：向步骤(1)脱脂裙带菜粉中加去离子水并静置，在微波功率600-700W、温度70～80℃条件下微波浸提20～40min，离心，收集上清液；

(3)除海藻胶：将步骤(2)中的上清液浓缩5-10倍体积，获得浓缩液；向浓缩液中缓慢加入CaCl₂水溶液使CaCl₂终浓度为0.015～0.025g/ml，搅拌后静置，离心，收集上清液；

(4)透析：将步骤(3)中的上清液浓缩2-5倍体积，获得浓缩液；将浓缩液在透析袋内室温透析24～48h，收集截留液；所述透析袋截留分子量为14kDa；

(5)乙醇沉淀：步骤(4)截留液浓缩2-5倍体积，加入无水乙醇，在0～4℃下静置沉淀12～24h；离心，收集沉淀，烘干，得到裙带菜粗多糖；

(6)纯化：将步骤(5)裙带菜粗多糖用去离子水溶解，离心，取上清过DEAE-Sepharose快速阴离子交换柱，分别用纯水，0.2M NaCl水溶液，0.3M NaCl水溶液和0.4M NaCl水溶液进行洗脱，流速均为3ml/min，并由自动收集器以10mL/管的速度收集，依次收集0.3M和0.4M氯化钠水溶液的洗脱液，记为Up-3洗脱液和Up-4洗脱液；每收集Up-3洗脱液210ml和Up-4洗脱液280ml，分别用旋转蒸发仪在55℃下分别浓缩至50ml和80ml，分别将浓缩液加入截留分子量为14kDa透析袋中，在4℃条件透析48h，随后将截留液分别用旋转蒸发仪在55℃下浓缩至18ml和21ml，在-65℃条件下冻干干燥，获得裙带菜多糖，分别记为裙带菜多糖Up-3和裙带菜多糖Up-4。

2.如权利要求1所述裙带菜多糖，其特征在于所述离心均为8000rpm离心10min。

3.如权利要求1所述裙带菜多糖，其特征在于步骤(1)中裙带菜粉末是将质量含水量3-4％的裙带菜粉碎，过80目筛，得到裙带菜粉。

4.如权利要求1所述裙带菜多糖，其特征在于步骤(1)中体积浓度70～100％乙醇水溶液体积用量以裙带菜粉末重量计为20-30ml/g。

5.如权利要求1所述裙带菜多糖，其特征在于步骤(2)中去离子水体积用量以脱脂裙带菜粉质量计为20-40ml/g；所述微波条件为：在微波功率700W、温度75℃条件下微波浸提25min。

6.如权利要求1所述裙带菜多糖，其特征在于步骤(5)所述无水乙醇与截留液体积比为3:1；静置沉淀条件为4℃沉淀12h。

7.如权利要求1所述裙带菜多糖，其特征在于步骤(6)去离子水加入量以裙带菜粗多糖质量计为10ml/g；洗脱流速为3mL/min。

8.一种权利要求1所述裙带菜多糖在制备α-葡萄糖苷酶活性抑制药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述药物为降血糖药物。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述药物为预防或治疗糖尿病药物。

Images