CN107722132A - 一种从海藻中联产海藻多糖和海藻蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从海藻中联产海藻多糖和海藻蛋白的方法，包括以下步骤：（1）原料预处理；（2）海藻蛋白的提取和纯化；（3）海藻多糖的提取和纯化。本发明所得的海藻多糖和海藻蛋白是直接从海藻中经过一步提取得到的，大大提高了海藻的利用率。

Description

一种从海藻中联产海藻多糖和海藻蛋白的方法
技术领域
本发明属于海藻综合利用技术领域，具体涉及一种从海藻中联产海藻多糖和海藻蛋白的方法。
背景技术
海藻储量丰富且海藻中含有多种有效成分，在食品、药品、日化、肥料、饲料等领域有重要的应用。因此海藻的综合利用越来越受到人们的关注。海藻中主要含有脂质、蛋白质、多糖等多种有效成分，若能将海藻中的有效成分分别分离纯化，则能大大提高海藻的利用率。在海藻所含的成分中以海藻多糖及海藻蛋白的含量最高，其应用也最为广泛。海藻多糖主要来源可分为褐藻多糖、红藻多糖、绿藻多糖3大类。海藻多糖具有免疫调节作用、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、能与金属离子络合、抗菌消炎专利等作用，在食品、化妆品、药物等方面有重要的作用。海藻蛋白在海藻中的含量为20％左右，在一些食用藻类如紫菜、掌藻、石莼中含量更高，海藻蛋白具有免疫调节、抗肿瘤、做药物载体、凝集、护肤润肤等作用，在护肤品、医药、饲料等领域有广泛的应用。CN 104403018A公开了一种在高压下提取海藻多糖的方法，专利CN 04892785A公开了一种在超高压下提取海藻多糖的方法，这两种方法均在高压下进行，对设备要求高，成本较高；专利CN105580975A公布了一种利用微生物发酵提取海藻蛋白的方法，该方法利用微生物发酵提取海藻中的蛋白质，需要微生物培养，操作条件严格、复杂；专利CN104341536A公布了一种提取海藻中营养物质的方法，该方法以复合酶对海藻进行预处理提取褐藻酸钠，成本较高；专利CN103951737A公布了一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法，该方法只从海藻中提取亲糖蛋白；专利CN103739726A公布了一种提取海藻多糖的方法，在常压下提取多糖以sevage法去蛋白，以流水透析纯化多糖，该方法虽然操作简便但是流水透析并不能将多糖中的小分子的杂质完全除去且sevage试剂毒性较强。已公布的方法中只涉及到一种提取海藻多糖或海藻蛋白的方法，不能同时得到高纯度的海藻多糖和海藻蛋白。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的弊端，提供一种从海藻中同时提取海藻多糖与海藻蛋白的方法，经分离纯化后能够同时得到产率和纯度较高的海藻多糖和海藻蛋白。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下所述：
一种从海藻中联产海藻多糖和海藻蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理
称取一定量的海藻粉末加入5-15倍体积的乙醇溶液，回流2-3h，除去海藻中含有的脂类、单糖及其他醇溶性成分(生物碱、黄酮苷、多酚、氨基酸等)；
(2)海藻蛋白的提取和纯化
将预处理后的海藻原料按固液比1：20～40(g/mL)加入提取剂，微波浸提若干次，浸提后合并滤液，并浓缩；采用盐析、等电点沉淀或醇沉的方法将浓缩滤液中的蛋白质析出，待沉淀完全后，过滤，得粗蛋白和滤液；向粗蛋白中加水，流水透析1～2天，透析液浓缩后进行冷冻干燥得到精制后的海藻蛋白；
其中，所述提取剂为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液；
(3)海藻多糖的提取和纯化
向分离出粗蛋白的滤液中加入3～4倍体积的无水乙醇，静置沉淀后过滤，得到固体，向固体中加水，流水透析1～2天，透析液浓缩后进行冷冻干燥得粗多糖；向粗多糖中加水溶解用色谱柱分离纯化，得到精制后的海藻多糖。
本发明还提供采用上述方法制备得到的海藻蛋白和海藻多糖产品，海藻蛋白的纯度为92-93％；海藻多糖的纯度为94-95％。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明所得的海藻多糖和海藻蛋白是直接从海藻中经过一步提取得到的，大大提高了海藻的利用率。
(2)本发明利用海藻同时直接提取海藻多糖和蛋白质，与原先的方法相比本方法成本低、操作简便。
(3)使用本发明方法所提取的多糖和蛋白质纯度高、产量大，所得蛋白质的产率高达11％以上，纯度高达92％以上；多糖产率高达8％以上，纯度高达94％以上。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术中所介绍的，针对海藻类原料，现有技术中缺乏一种有效的同时提取海藻多糖和海藻蛋白的方法，为了解决如上的技术问题，本发明提出一种从海藻中联产海藻多糖和海藻蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理
将收集来的海藻用流水冲洗，除去海藻的表面杂质，然后烘干粉碎过80目筛，保存备用；称取一定量的海藻原料加入5-15倍体积的乙醇溶液(g/mL)，回流2-3h，除去海藻中含有的脂类、单糖及其他醇溶性成分(生物碱、黄酮苷、多酚、氨基酸等)；
(2)海藻蛋白的提取和纯化
将预处理后的海藻原料按固液比1：20～40(g/mL)加入提取剂，微波浸提若干次，浸提后合并滤液，并浓缩；采用盐析、等电点沉淀或醇沉的方法将浓缩滤液中的蛋白质析出，静置36～48h，待沉淀完全后，过滤，冷水洗涤滤饼2～3次，乙醇洗涤1～2次，得粗蛋白和滤液；向粗蛋白中加水，流水透析1～2天，透析液浓缩至原体积的1/4-1/3后进行冷冻干燥得到精制后的海藻蛋白；
其中，所述提取剂为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液；
(3)海藻多糖的提取和纯化
向分离出粗蛋白的滤液中加入3～4倍体积的无水乙醇，在2～4℃静置24～28h沉淀后过滤，得到固体，将固体用水洗涤3～5次，向固体中加水，流水透析1～2天，透析液浓缩后进行冷冻干燥得粗多糖；向粗多糖中加水溶解用色谱柱分离纯化，得到精制后的海藻多糖。
在本发明优选的实施方案中，所述海藻包括但不限于绿藻(如：浒苔、石莼等)、褐藻(如：海带、裙带菜、巨澡等)、红藻(如：紫菜、石花菜等)。进一步优选的，所述海藻原料为浒苔、石莼或裙带菜。
在试验研究过程中，发现针对海藻原料，由于海藻蛋白和海藻多糖与海藻中的糖胶、纤维等成分存在着复杂而紧密的连接，因此目前同时高提取率的提取海藻蛋白和海藻多糖存在一定的难度。针对这一难题，本发明人经过试验研究选择磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液作为提取剂，加入磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液的目的是从预处理后的海藻原料中同时高效的溶出海藻蛋白和海藻多糖。本发明在试验研究过程中，还选择了其它提取剂，比如水、碱液等，但是发现选择磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液作为提取剂在微波辐射浸提下能够得到高产量的海藻蛋白和海藻多糖，相比其它提取剂，效果差异显著。
在本发明优选的实施方案中，所述乙醇溶液的体积分数为95％，用95％的乙醇回流是为了除去浒苔中含有的脂类、单糖及其他醇溶性成分(生物碱、黄酮苷、多酚、氨基酸)。因为后期在纯化过程中是用色谱柱分离纯化，若不除去这些杂质，会降低柱效，使所得的多糖或蛋白质纯度降低。另外乙醇可以改变细胞膜的通透性，用乙醇预处理原料有利于提高蛋白质和多糖的产率。
在本发明优选的实施方案中，所述磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液是由磷酸氢二钾溶液和磷酸二氢钾溶液混合配制而成，所述磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液的pH为5.8～6.6。磷酸盐缓冲溶液的配制方法如下：pH为5.8的磷酸盐缓冲液：取1mol/L的K2HPO4溶液8.5mL和1mol/L的KH2PO4溶液91.5mL，混匀；
pH为6.2的磷酸盐缓冲液：取1mol/L的K2HPO4溶液13.2mL和1mol/L的KH2PO4溶液80.8mL，混匀；
pH为6.6的磷酸盐缓冲液：取1mol/L的K2HPO4溶液38.1mL和1mol/L的KH2PO4溶液61.9mL，混匀。
针对海藻原料，本发明经过试验筛选和试验优化，筛选得到微波辐射浸提能够辅助提取剂更好的溶出海藻蛋白和海藻多糖，相比于其他方法浸提，效果差异较大。进一步的，本发明筛选优化得到微波条件为：微波功率为1700W，处理3～5次，间隔3～5min，每次2～10min，提取温度为80～100℃。
在本发明优选的实施方案中，采用盐析的方法将浓缩滤液中的蛋白质析出。具体方法是：向浓缩滤液中加入固体硫酸铵至饱和，静置，过滤。
在本发明优选的实施方案中，所用色谱柱为DEAE-52纤维素柱、凝胶柱或氨基柱。
在本发明优选的实施方案中，采用色谱柱分离纯化时，用两倍柱体积的洗脱剂淋洗，流速为0.6-0.8mL/min，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至原体积的1/3～1/2；所用洗脱剂为蒸馏水。
采用比色法检验多糖与蛋白质的纯度，得到的海藻蛋白的纯度为92-93％；海藻多糖的纯度为94-95％；海藻蛋白的产率为11-15％，海藻多糖产率为8-10％。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详和对比例细说明本发明的技术方案。
实施例1
一种联产海藻多糖及海藻蛋白的方法，按照以下步骤进行：
(1)将浒苔去杂质洗净，干燥后粉碎，过80目筛；
(2)称取15g浒苔粉末，加75mL95(v/v)％的乙醇，回流2.5h，过滤，加入300mL提取剂微波提取3次，微波功率为1700W，间隔5min，每次5min，提取温度为80℃，过滤，合并滤液并浓缩至100mL，加入硫酸铵固体至饱和，静置36h，过滤，滤液保存备用。将过滤出的固体加水溶解，流水透析2天，将透析液在80℃下浓缩至原体积的1/4，冷冻干燥得浒苔蛋白2.12g，纯度为93％；
所述提取剂为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液，它是由磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制而成，所述磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液的pH为5.8；
(3)向步骤(2)中分离出粗蛋白的滤液中加入400mL无水乙醇，放入4℃的冰箱中静置24h，过滤，冷水洗涤滤饼5次，将过滤后的固体加100mL水溶解，流水透析2天，透析液在80℃下浓缩至50mL左右，上纤维素柱分离，用两倍柱体积的蒸馏水洗脱剂淋洗，流速为0.6ml/min,收集洗脱液，将洗脱液在80℃下浓缩至50mL左右，冷冻干燥，得浒苔多糖1.38g，纯度为94.8％。
实施例2
一种联产海藻多糖及海藻蛋白的方法，按照以下步骤进行：
(1)将石莼去杂质洗净，干燥后粉碎，过80目筛；
(2)称取15g石莼粉末，加75mL95％的乙醇，回流2.5h，过滤，加入300mL提取剂微波提取3次，微波频率为1700W，间隔4min，每次8min提取温度为80℃，合并滤液并浓缩至100mL，加入硫酸铵固体至饱和，静置36h，过滤，滤液保存备用。将过滤出的固体溶解，流水透析2天，将透析液在80℃下浓缩至原体积的1/4，冷冻干燥得海藻蛋白2.00g，纯度为92.3％；
所述提取剂为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液，它是由磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制而成，所述磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液的pH为6.2；
(3)向步骤(2)中分离出粗蛋白的滤液中加入400mL无水乙醇，放入4℃的冰箱中静置24h，过滤，冷水洗涤滤饼5次，将过滤后的固体加100mL水溶解，流水透析2天，透析液在80℃下浓缩至50mL左右，上凝胶柱分离，用两倍柱体积的蒸馏水洗脱剂淋洗，流速为0.8ml/min，收集洗脱液，将洗脱液在80℃下浓缩至50mL左右，冷冻干燥，得石莼多糖1.63g，纯度为93.8％。
实施例3
一种联产海藻多糖及海藻蛋白的方法，按照以下步骤进行：
(1)将裙带菜去杂质洗净，干燥后粉碎，过80目筛；
(2)称取15g裙带菜粉末，加75mL95％的乙醇，回流2.5h，过滤，加入300mL提取剂微波提取3次，微波频率为1700W，间隔3min，每次6min，提取温度为80℃，合并滤液并浓缩至100mL，加入硫酸铵固体至饱和，静置36h，过滤，滤液保存备用。将过滤出的固体溶解，流水透析2天，将透析液在80℃下浓缩至原体积的1/4冷冻干燥得海藻蛋白1.28g，纯度为92％；
所述提取剂为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液，它是由磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制而成，所述磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液的pH为6.6；
(3)向步骤(2)中分离出粗蛋白的滤液中加入400mL无水乙醇，放入4℃的冰箱中静置24h，过滤，冷水洗涤滤饼3次，将过滤后的固体加100mL水溶解，流水透析2天，透析液在80℃下浓缩至50mL左右，上纤维素柱分离，用两倍柱体积的蒸馏水洗脱剂淋洗，流速为0.6ml/min，收集洗脱液，将洗脱液在80℃下浓缩至50mL左右，冷冻干燥，得海藻多糖3.42g，纯度为94％。
实施例4
一种联产海藻多糖及海藻蛋白的方法，按照以下步骤进行：
(1)将浒苔去杂质洗净，干燥后粉碎，过80目筛；
(2)称取15g浒苔粉末，加80mL95(v/v)％的乙醇，回流2h，过滤，加入350mL提取剂微波提取4次，微波频率为1700W，间隔5min，每次4min，提取温度为80℃，过滤，合并滤液并浓缩至100mL，加入硫酸铵固体至饱和，静置48h，过滤，滤液保存备用。将过滤出的固体加水溶解，流水透析1天，将透析液在80℃下浓缩至原体积的1/4，冷冻干燥得浒苔蛋白2.34g，纯度为92.6％；
所述提取剂为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液，它是由磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配制而成，所述磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液的pH为5.8；
(3)向步骤(2)中分离出粗蛋白的滤液中加入400mL无水乙醇，放入4℃的冰箱中静置24h，过滤，冷水洗涤滤饼5次，将过滤后的固体加100mL水溶解，流水透析1天，透析液在80℃下浓缩至50mL左右，上纤维素柱分离，用两倍柱体积的蒸馏水洗脱剂淋洗，流速为0.8ml/min,收集洗脱液，将洗脱液在80℃下浓缩至50mL左右，冷冻干燥，得浒苔多糖1.44g，纯度为94.5％。
对比例1
一种联产海藻多糖及海藻蛋白的方法，按照以下步骤进行：
(1)将浒苔去杂质洗净，干燥后粉碎，过80目筛；
(2)称取15g浒苔粉末，加75mL95％的乙醇，回流2.5h，过滤，加入300mL水超声提取3次，提取温度为80℃，每次30min，过滤，合并滤液并浓缩至100mL，加入硫酸铵固体至饱和，静置36h，过滤，滤液保存备用。将过滤出的固体溶解，流水透析2天，将透析液在80℃下浓缩至原体积的1/4，冷冻干燥得浒苔蛋白0.95g；
(3)向步骤(2)中分离出粗蛋白的滤液中加入400mL无水乙醇，放入4℃的冰箱中静置24h，过滤，冷水洗涤滤饼3次，将过滤后的固体加100mL水溶解，流水透析2天，透析液在80℃下浓缩至50mL左右，上纤维素柱分离，用两倍柱体积的蒸馏水洗脱剂淋洗，流速为0.6ml/min，收集洗脱液，将洗脱液80℃浓缩至50mL左右，冷冻干燥，得浒苔多糖0.64g。
对比例2
一种联产海藻多糖及海藻蛋白的方法，按照以下步骤进行：
(1)将浒苔去杂质洗净，干燥后粉碎，过80目筛；
(2)称取15g浒苔粉末，加75mL95％的乙醇，回流2.5h，过滤，加入300mLpH＝9的氢氧化钠溶液超声提取3次，提取温度为80℃，每次30min过滤，合并滤液并浓缩至100mL，加入硫酸铵固体至饱和，静置36h，过滤，滤液保存备用。将过滤出的固体溶解，流水透析2天，将透析液80℃浓缩至原体积的1/4冷冻干燥得浒苔蛋白1.56g；
(3)向步骤(2)中分离出粗蛋白的滤液加入400mL无水乙醇，放入4℃的冰箱中静置24h，过滤，冷水洗涤滤饼5次，将过滤后的固体加100mL水溶解，流水透析2天，透析液在80℃下浓缩至50mL左右，上纤维素柱分离，用两倍柱体积的蒸馏水洗脱剂淋洗，流速为0.6ml/min，收集洗脱液，将洗脱液80℃浓缩至50mL左右，冷冻干燥，得浒苔多糖0.9g。
对比例3
一种联产海藻多糖及海藻蛋白的方法，按照以下步骤进行：
(1)将裙带菜去杂质洗净，干燥后粉碎，过80目筛；
(2)称取15g裙带菜粉末，加75mL95％的乙醇，回流2.5h，过滤，加入300mLpH＝9的氢氧化钠溶液超声提取3次，提取温度为80℃，每次1h过滤，合并滤液并浓缩至100mL，加入硫酸铵固体至饱和，静置36h，过滤，滤液保存备用。将过滤出的固体溶解，流水透析2天，将透析液在80℃下浓缩至原体积的1/4冷冻干燥得海藻蛋白0.96g；
(3)向步骤(2)中分离出粗蛋白的滤液加入400mL无水乙醇，放入4℃的冰箱中静置24h，过滤，冷水洗涤滤饼5次，将过滤后的固体加100mL水溶解，流水透析2天，透析液80℃浓缩至50mL左右，上纤维素柱分离，收集洗脱液，用两倍柱体积的蒸馏水洗脱剂淋洗，流速为0.6ml/min，将洗脱液在80℃下浓缩至50mL左右，冷冻干燥，得海藻多糖2.45g。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一种从海藻中联产海藻多糖和海藻蛋白的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）原料预处理
称取一定量的海藻原料加入5-15倍体积的乙醇溶液，回流2-3h；
（2）海藻蛋白的提取和纯化
将预处理后的海藻原料按固液比1：20~40（g/mL）加入提取剂，微波浸提若干次，浸提后合并滤液，并浓缩；采用盐析、等电点沉淀或醇沉的方法将浓缩滤液中的蛋白质析出，待沉淀完全后，过滤，得粗蛋白和滤液；向粗蛋白中加水，流水透析1~2天，透析液浓缩后进行冷冻干燥得到精制后的海藻蛋白；
其中，所述提取剂为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液；
（3）海藻多糖的提取和纯化
向分离出粗蛋白的滤液中加入3~4倍体积的无水乙醇，静置沉淀后过滤，得到固体，向固体中加水，流水透析1~2天，透析液浓缩后进行冷冻干燥得粗多糖；向粗多糖中加水溶解用色谱柱分离纯化，得到精制后的海藻多糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述海藻包括但不限于绿藻、褐藻或红藻。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述提取剂为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲溶液，pH5.8~6.6。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是：微波条件为：微波功率1700W，处理3~5次，间隔3~5min，每次2~10min，提取温度为80~100℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是：采用盐析的方法将浓缩滤液中的蛋白质析出。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是：具体方法是：向浓缩滤液中加入固体硫酸铵至饱和，静置，过滤。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是：所用色谱柱为DEAE-52纤维素柱、凝胶柱或氨基柱。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是：采用色谱柱分离纯化时，用两倍柱体积的洗脱剂淋洗，流速为0.6-0.8mL/min，收集洗脱液，将洗脱液浓缩至原体积的1/3~1/2；所用洗脱剂为蒸馏水。
9.采用权利要求1~8中任一项所述的方法制备得到的海藻蛋白和海藻多糖产品。
10.如权利要求9所述的产品，其特征是：海藻蛋白的纯度为92-93%；海藻多糖的纯度为94-95%。
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