CN101912408A - 褐藻多糖硫酸酯在制备预防和治疗糖尿病血管疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种褐藻多糖硫酸酯的新用途。该用途是其在制备预防和治疗糖尿病血管疾病药物中的应用。本发明所述褐藻多糖硫酸酯优选低分子量褐藻多糖，其重均分子量为3-30KD；所述褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量为25-35％，硫酸基含量为25-35％。所述低分子量褐藻多糖硫酸酯是通过降解褐藻多糖硫酸酯得到的。通过I型糖尿病模型大鼠在体动物实验以及离体组织试验和蛋白水平研究表明，褐藻多糖硫酸酯对糖尿病血管并发症具有一定治疗作用，其机制与褐藻多糖硫酸酯降低糖尿病氧化应激水平，降低血管平滑肌环氧酶-2表达进而影响前列腺素类物质形成有关。

Description

褐藻多糖硫酸酯在制备预防和治疗糖尿病血管疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种褐藻多糖硫酸酯在制备预防和治疗糖尿病血管疾病药物中的应用。

背景技术

褐藻多糖硫酸酯是一类富含岩藻糖的天然硫酸多糖。目前报道，该物质具有多种生物学功能，如抗氧化、抗凝、抗血栓、抗增殖、抗粘附、抗病毒作用等。

硫酸化墨角藻多糖(Fucans)是一类来源于海洋有机体的阴离子聚糖，多来源于褐藻，因藻类生长环境，地域，和种类的不同，表现为结构多样，但具有基本保守结构。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)为首先从硫酸化墨角藻分离提取出的多糖。1913年，Kylin首先从褐藻中获取并命名，在接下来的几十年，褐藻多糖硫酸酯的提取工艺不断优化，其多种生物学功能也相继被发现。

早期结构研究结果来源于墨角藻(Fucus vesiculosus)。墨角藻多糖硫酸酯主要成分是α-L-岩藻糖，以1，3糖苷键连接，且硫酸化位点在C4位。目前，虽然该类多糖结构研究没有终止，但它们的结构极其复杂并难以阐明。多数研究资料表明，海带褐藻多糖硫酸酯主要是以α-1，3连接的L-岩藻糖，硫酸化发生在C4或C2位，存在部分1，2连接的L-岩藻糖作为侧链。另外，分子中还含有半乳糖、木糖、鼠李糖等单糖，半乳糖可能参与了主链的组成，而木糖、鼠李糖等是以侧链形式存在(Pomin VH，Paulo ASM.Structure，biology，evolution，and medical importance of sulfated fucans and galactans.Glycobiology 2008；18：1016-27)。

根据不同分子量可将其分为褐藻多糖硫酸酯和低分子量褐藻多糖硫酸酯。根据各组分含量及不同的化学修饰，可分为合成硫酸化、胺化、磷酸化、乙酰化和苯甲酰化修饰等(Jing Wang，Li Liu，Quanbin Zhang，Zhongshan Zhang，Huimin Qi，PengchengLi.Synthesized oversulphated，acetylated and benzoylated derivatives of fucoidan extractedfrom Laminaria japonica and their potential antioxidant activity in vitro.Food Chemistry114(2009)1285-1290)。不同种类的褐藻多糖硫酸酯在生物活性上基本一致，但不同分子量不同修饰后的褐藻多糖硫酸酯存在很大差异。

目前研究表明，褐藻多糖硫酸酯具有多种生物学功能和药理学价值，如抗氧化、抗凝、抗栓、抗增殖、抗粘附、抗病毒和重金属离子吸附等作用，且其作用机制也逐被阐述。目前尚未有文献报道褐藻多糖硫酸酯在治疗糖尿病血管疾病方面的用途。

糖尿病(DM)是一种以胰岛素相对或绝对不足为直接致病原因引起的以血糖升高为基本特征的代谢紊乱性疾病，包括糖类、脂肪、蛋白质代谢异常。糖尿病患者可出现多种并发症，如心脏、血管、眼、肾、神经等多种组织病变。目前认为，糖尿病的合并症是糖尿病病人致死的主要原因，其中心血管合并症最为重要。由于导致糖尿病各种病变的机制不清，临床可使用的治疗糖尿病血管病变药物极少。血管紧张素受体阻断剂具有一定疗效，但还远未达到理想效果。2009年糖尿病国际论坛上首次公布了我国最新的大中城市糖尿病患病率调查结果，城市患病率已高达9.7％。近20年来，中国糖尿病患病率成倍增长，目前中国约有2000多万糖尿病患者。据世界卫生组织预计，到2025年全球成人糖尿病患者人数将增至3亿，中国仍为糖尿病大国。随着糖尿病发病人数的逐年增加，因此，开发治疗糖尿病及其合并症的有效药物具有重要意义。

糖尿病血管病变可分为大血管病变和微血管病变，后者主要表现为糖尿病视网膜病变及肾血管病变，而大血管病变主要表现为动脉粥样硬化及舒缩功能障碍。目前认为，糖尿病发生后血管反应性改变，表现为血管舒张功能降低和收缩功能增强。机制研究表明，该异常表现可能与糖尿病高氧化应激状态和血管活性物质分泌异常有关，而血管活性物质可能为血管合成前列腺素类异常(Seok Man Son.Role of vascularreactive oxygen species in development of vascular abnormalities in diabetes.DiabetesResearch and Clinical Practice 77S(2007)S65-S70)。

发明内容

本发明的目的是提供一种褐藻多糖硫酸酯的新用途。

本发明所提供的褐藻多糖硫酸酯的新用途是其在制备预防和/或治疗糖尿病血管疾病产品中的应用。所述产品包括药物和保健品。

所述褐藻多糖硫酸酯是从任何一种或多种褐藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯，例如，可以来源于海带(Laminaria japonica)(包括人工养殖的海带)，也可以来源于其他褐藻，例如马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻或墨角藻等的一种或多种。作为一种优选方案，优选来源于海带中的褐藻多糖硫酸酯，其中岩藻糖含量为31％，硫酸基含量为32％，重均分子量为180KD。

为了达到更好的治疗效果，所述褐藻多糖硫酸酯的重均分子量为3-30KD(低分子量)，优选为6-8KD，尤其优选为7KD。所述褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量为25-35％，硫酸基含量为25-35％。

所述褐藻多糖硫酸酯的主要成分是L-褐藻糖-4-硫酸酯，还含有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸、蛋白质、K、Na、Ca、Mg等金属离子，它的结构特征是1，2-联结的聚α-L吡喃褐藻糖，而硫酸酯主要是在C-4位的羟基上。所以不论是何种褐藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯，其主要成分相同，基本结构相同，都具有相同的药理功效。

从褐藻中提取褐藻多糖硫酸酯的方法为本领域的现有技术。作为一种优选方法可参考本发明实施例从海带中提取褐藻多糖硫酸酯的方法进行制备。本发明中所用的低分子量褐藻多糖硫酸酯是通过将褐藻多糖硫酸酯降解得到的。具体降解方法可参考专利ZL200410083685.7的方法。

以褐藻多糖硫酸酯为有效成分制备的预防和/或治疗糖尿病血管疾病的药物，也属于本发明的保护范围。所述糖尿病血管疾病包括糖尿病血管反应性异常、糖尿病高血压和糖尿病血管病理改变。

所述预防和/或治疗糖尿病血管疾病的药物可通过口服、注射、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

以褐藻多糖硫酸酯为有效成分的药物，需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。所述药物的给药方式可以是但不局限于口服、静注、肌注等方式，其剂型可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

根据大鼠有效剂量及大鼠与人的体表折算系数换算，褐藻多糖硫酸酯用于治疗糖尿病患者出现血管病变的临床参考用量为9.00-18.05毫克/千克体重/天

本发明具有以下优点：

1、安全性高，可长期服用。糖尿病通常为长期慢性进行性疾病，用药周期较长。褐藻多糖硫酸酯为来源于食用海藻的天然多糖产物，安全性高，副作用少，可满足糖尿病人长期服用。

2、疗效显著，可治疗糖尿病血管合并症相关症状，降低糖尿病性高血压，尤其是舒张压的降低更加具有治疗意义。

附图说明

图1为实施例2中苯肾上腺素(PE)诱导去内皮胸主动脉环收缩量效曲线。

图2为实施例2中苯肾上腺素(PE)诱导尾动脉环收缩量效曲线。

图3为实施例3中去内皮主动脉平滑肌GSH表达水平(n＝3-6)。

图4为实施例3中去内皮主动脉平滑肌SOD活性(n＝3-6)。

图5为实施例3中去内皮主动脉平滑肌COX-1表达水平(n＝3-6)。

图6为实施例3中去内皮主动脉平滑肌COX-2表达水平(n＝3-6)。

图7为实施例3中各组大鼠给药12周后主动脉石蜡包埋横切HE染色照片(放大倍数40倍)，其中，A为对照组，B为糖尿病组，C为低剂量F组。

图8为低分子量褐藻多糖硫酸酯的GPC图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的褐藻多糖硫酸酯为低分子量褐藻多糖硫酸酯，其按照下述方法制备得到：

1)提取褐藻多糖硫酸酯：

取海带粉碎后添加蒸馏水，沸水提取，提取液以硅藻土助滤过滤，滤液先以自来水流水透析一天，然后以蒸馏水透析一天，将透析液浓缩，向浓缩液中加乙醇至终浓度为75％沉淀，干燥沉淀，得粗褐藻多糖硫酸酯。将粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl₂存在下20％乙醇沉淀除去水溶性褐藻胶，滤液透析、浓缩后75％乙醇沉淀，干燥后即得纯化的褐藻多糖硫酸酯。经分析，海带褐藻多糖硫酸酯主要由岩藻糖、半乳糖组成的硫酸多糖，其中岩藻糖含量为31％，硫酸基含量为32％，重均分子量180KD。

2)制备低分子量褐藻多糖硫酸酯：

取上述海带褐藻多糖硫酸酯50g配成质量浓度为1.5％的水溶液，在该溶液中加入终浓度为30mM的抗坏血酸和终浓度为30mM的过氧化氢，常温反应2小时。将该反应液用截留分子量为3600Da的透析袋依次在自来水和蒸馏水透析，之后浓缩，冻干，得到低分子量褐藻多糖硫酸酯样品。对其进行化学分析结果表明岩藻糖含量为30％，测定方法参照下述文献：(K.A.G.Michel Dubois，J.K.Hamilton，P.A.Rebers，FredSmith，Colorimetric method for determination of sugars and related substances，AnalyticalChemistry28(1956)350-357)，硫酸基含量为31％，测定方法参照下述文献：(Y.Kawai，N.Seno，K.Anno，A modified method for chondrosulfatase assay，Analytical Biochemistry32(1969)314-321.)。

测定所制备的低分子量褐藻多糖硫酸酯的分子量。

分子量测定分析条件：Shiamdzu LC-20AT HPLC，TSK G3000PWxl色谱柱，流动相2.84％ Na₂SO4溶液，流速1ml/min，检测器：示差检测器RID 10A。

所测定的GPC图谱如图8所示。

结果：Mn：5765(number-average，数均)；Mw：7102(weight-average，重均)Mw/Mn：1.23。

重均分子量为3-30KD范围内的其它低分子量褐藻多糖硫酸酯，可通过调节上述步骤2)降解反应体系中抗坏血酸和过氧化氢的摩尔比获得。

实施例1、褐藻多糖硫酸酯对I型糖尿病模型大鼠的血管疾病的治疗效果

1)模型建立与分组

I型糖尿病是糖尿病中最典型也是最重类型，因此，本实验选用I型糖尿病模型研究褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan，下面简称F)对糖尿病血管功能及结构的改变是否具有防治作用及其机制。

实验选取Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体重为160～180g。实验分为正常对照组(Con)，糖尿病组(Diabetes)，糖尿病腹腔灌胃低剂量F(50mg/kg/Day)(FL)和高剂量F(100mg/kg/Day)(FH)组，和非诺贝特(Fenofibrate，100mg/kg/Day)对照药组，该药通过抑制氧化应激在临床用于高血脂症治疗。用链脲菌素制成I型糖尿病模型，糖尿病及给药组血糖值大于16.5mmol/L认为造模成功，入选实验。给药时程为4周和12周。

2)基本疾病指标测定

分别在成模第4周和第12周，对实验动物进行基本情况的描述和糖尿病基本疾病指标的测定，包括测定体重，血糖、血压、血脂。结果分别见表1和2。

    表1 褐藻多糖硫酸酯对糖尿病大鼠体重，血糖，血压的影响(n＝4～8)

^*p＜0.05；^**p＜0.01；^***p＜0.001.Student’s t test，与同龄非糖尿病组比较

#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001.Student’s t test，与同龄糖尿病组比较

     表2 褐藻多糖硫酸酯对糖尿病大鼠血清胆固醇、甘油三酯、

          低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的影响(n＝4～11)

^*p＜0.05；^**p＜0.01；^***p＜0.001.Student’s t test，与同龄非糖尿病组比较

#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001.Student’s t test，与同龄糖尿病组比较

由表1和表2结果可知，给药4周后，糖尿病，低剂量和高剂量给药组均出现典型的糖尿病特征，表现为多饮、多尿、血糖升高、体重减轻，部分血脂异常和大鼠皮毛光滑度较正常组差。给药12周后，糖尿病组、小剂量F和高剂量F血糖和血脂值均高于正常组，糖尿病组血压显著升高。F对糖尿病血糖升高无影响，但对糖尿病胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白升高有一定改善作用，对高密度脂蛋白影响不大。F高低剂量组对同龄糖尿病高血压症状也具有改善作用，均可显著降低舒张压，高剂量组同时也可降低收缩压。此外，F高低剂量组对血管高反应性具有改善作用，且呈剂量依赖性。

实施例2、褐藻多糖硫酸酯对I型糖尿病模型大鼠的血管反应性研究

模型的建立与分组同实施例1。

1)分别在成模第4周和12周测定各组实验大鼠去内皮胸主动脉血管环及尾动脉血管环对收缩剂苯肾上腺素(PE)量效关系，并同时称量血管环重。具体实验结果见表3，图1，图2。

       表3 褐藻多糖硫酸酯对糖尿病大鼠去内皮胸主动脉血管环

           及尾动脉血管环对苯肾上腺素反应的影响(n＝4～8)

由表3结果可知，糖尿病组主动脉和尾动脉对苯肾上腺素刺激表现为收缩高反应性。尾动脉改善作用具有统计学意义。

2)为深入了解褐藻多糖硫酸酯改善糖尿病血管高反应性的机制，用环氧酶COX抑制剂Asprin，TXA2受体抑制剂SQ29548，NADPH氧化酶抑制剂DPI(diphenyleneiodonium)和通过螯合铁离子而抑制羟自由基生成的DFO(Deferoxamine)预先孵育血管环后，PE刺激血管，观察收缩情况。具体实验结果见表4。

     表4 褐藻多糖硫酸酯对糖尿病大鼠血管高反应性收缩机制研究(n＝4～8)

^*p＜0.05；^**p＜0.01；^***p＜0.001.Student’s t test，与同龄非糖尿病组比较

#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001.Student’s t test，与同龄糖尿病组比较

由表4结果可知，环氧酶COX抑制剂Asprin，TXA2受体抑制剂SQ29548，NADPH氧化酶抑制剂DPI和通过螯合铁离子而抑制羟自由基生成的DFO预先孵育血管环后，均使糖尿病血管高反应性有所改善，证明糖尿病血管收缩高反应性与COX信号通路及氧化应激信号通路相关，给药组改善糖尿病高反应性通过降低氧化应激水平和抑制前列腺素类血管活性物质有关。

实施例3、褐藻多糖硫酸酯对I型糖尿病模型大鼠的血管反应性相关机制研究

模型的建立与分组同实施例1。

测定第12周大鼠主动脉平滑肌氧化还原酶的活性，包括SOD，GSH等，结果见图3和图4；主动脉平滑肌环氧酶的表达水平，结果见图5和6；血管横切面HE染色以观察显微结构的改变及待测药物治疗作用，结果见图7。

1)由图3和图4可知，给药12周主动脉平滑肌总蛋白提取液测定氧化应激通路相关还原酶的活性显示，糖尿病血管平滑肌相关还原酶活性降低，褐藻多糖硫酸酯可增加糖尿病大鼠SOD和GSH活性，改善糖尿病高氧化应激状态。

2)由图5和图6可知，给药12周主动脉平滑肌总蛋白提取液测定显示，糖尿病血管平滑肌环氧酶-2(COX-2)表达增加，F可降低糖尿病COX-2的表达量；环氧酶-1(COX-1)无改变。表明，F下调糖尿病致诱导型环氧酶表达的增加，调节前列腺素类血管活性物质的释放。

3)给药12周后主动脉石蜡包埋横切HE染色显示，糖尿病组弹力板弯曲度增加，褐藻多糖硫酸酯具有改善作用。此外，糖尿病血管环重量减轻，褐藻多糖硫酸酯具有提高和改善重量减轻作用。

Claims (9)

1.一种褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗糖尿病血管疾病产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯是从下述至少一种褐藻中提取得到的：海带、马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻和墨角藻。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯是从海带中提取得到的。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯为低分子量褐藻多糖硫酸酯，其重均分子量为3-30KD，优选为6-8KD，最优选为7KD；所述褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量为25-35％，硫酸基含量为25-35％。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述低分子量褐藻多糖硫酸酯是通过褐藻多糖硫酸酯降解得到的。

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述糖尿病血管疾病包括糖尿病血管反应性异常、糖尿病高血压和糖尿病血管病理改变。

7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或保健品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物包含有效治疗量的所述褐藻多糖硫酸酯和药学上可接受的载体。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为口服制剂或注射剂。

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