CN102319256B - 紫菜多糖在制备肾脏疾病治疗药物或预防保健品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分子量范围在1-2000kDa的紫菜多糖在制备肾病治疗药物及肾病预防保健品方面的作用。本发明中的紫菜多糖可以从红藻门红毛菜科紫菜属坛紫菜、条斑紫菜、甘紫菜等藻类的一种或几种提取得到,也可以是上述提取物的降解产物。该紫菜多糖可有效地降低血液中尿素氮含量和肌酐含量。
Description
技术领域
本发明涉及紫菜多糖的制药用途,特别涉及低分子量紫菜多糖在制备肾病治疗药物和肾病预防类保健食品方面的用途。
背景技术
紫菜多糖是一种硫酸化的多糖,广泛地存在于紫菜属的植物中,占紫菜干重的20-40%。它的主要结构单元是→3)β-D-半乳糖-(1→4)-α-L-6-硫酸基-半乳糖-(1→,其中部分α-L-6-硫酸基-半乳糖被L-3,6-内醚半乳糖代替,形成结构单元(2):→3-β-D-半乳糖-(1→4)-α-L-3,6内醚半乳糖-(1→。紫菜多糖具有抗凝血、降血糖、调血脂、抗血栓、抑制肿瘤及增强细胞免疫功能等多种生物活性,广泛地用于食品和医药等行业。自上世纪50年代以来,研究人员就对紫菜多糖的化学组分和生物活性进行过大量的研究。
肾脏是人体的重要排泄器官,具有排泄体内代谢产物、药物和毒物,以及调节体内水、电解质、酸碱平衡的功能,它在维持人体内环境的稳定性中起着重要的作用。当各种病因引起肾功能障碍时,人体内环境就会发生紊乱,导致糖尿病、冠心病及以高血压等疾病的产生。因此,肾功能的保护显得尤为重要。
之前的研究表明,硫酸化的褐藻类多糖由于具有P-选择素抑制作用、抗氧化作用、抗肾间质纤维化作用以及延缓肾小球硬化的作用,已被用于肾病的治疗。而紫菜多糖在肾病治疗中的应用尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供紫菜多糖制备肾病治疗药物及肾病预防类保健品方面的用途。所述肾脏疾病包括急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、尿毒症、肾病综合症和糖尿病肾病。
本发明提供了含紫菜多糖的药物组合物。所述组合物包含治疗上有效量的紫菜多糖和至少一种药学上可接受的载体。该组合物的给药方式可以是但不限于静脉注射、口服、肌肉、皮下、皮肤表面、直肠骨、局部注射等方式,其剂型可以但不限于是注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、滴丸剂、凝胶剂、贴片或膏剂。
本发明中的紫菜多糖包括从紫菜中提取得到的紫菜多糖及其降解产物——低分子量的紫菜多糖和紫菜寡糖。多糖的降解方式可以是超声波降解、微波降解、辐照降解、酸降解及自由基氧化降解中的任意一种或几种。多糖的分子量范围可以是1-2000kD,优选是1-10kDa。紫菜多糖的来源是红藻门红毛菜科紫菜属坛紫菜、条斑紫菜、甘紫菜等藻类的一种或几种。
本发明的组合物中,单位制剂中低分子量紫菜多糖的含量可以是10-1000mg,优选是10-100mg。
本发明中的紫菜多糖可按以下方法提取和纯化:
目前文献中常以热水法提取紫菜多糖,也有以超声或微波辅助提取的报道。向提取液中加入乙醇或季胺盐都可以使多糖沉淀出来。为减少蛋白及色素的溶出,提取前可先以高浓度的醇类或甲醛溶液处理藻体。以水粗提得到的紫菜多糖中含有部分水溶性的盐类及色素等,需要进一步纯化。常采用透析或者超滤的方法除去小分子杂质。
将紫菜多糖降解从而制备低分子量的紫菜多糖或寡糖的方法可采用以下几种:
1.酸降解法。酸性溶液可以引起糖苷键的断裂,从而获得分子量较低的紫菜多糖。调节反应液中酸的浓度、反应时间及反应温度可获得不同分子量大小的降解产物。
2.物理降解法,包括辐射法、超声波和微波等方法。物理法是通过超声波或微波等引起分子链上化学键的断裂,从而获得低分子量的产物。
3.自由基氧化降解法。此法主要是利用羟自由基与糖环中碳上的氢原子反应,即氢抽提反应,使糖苷键断裂。自由基氧化降解法可在酸性、碱性及中性环境下进行,通过调控溶液pH值、过氧化氢用量、反应时间和温度以得到不同分子量的产物。
在本发明的一个具体实施方式中,低分子量的紫菜多糖通过以下方法制备:将干紫菜剪碎后,以高浓度的乙醇溶液反复回流。弃去乙醇后,以沸水提取。提取液以硅藻土助滤过滤,滤液先以自来水流水透析一天,然后以蒸馏水透析,将透析液浓缩,加乙醇沉淀,沉淀干燥得紫菜多糖。取适量多糖,溶于硫酸溶液中,在一定条件下搅拌反应。反应结束后加入氢氧化钡以除去硫酸。离心后,将上清液浓缩后,冷冻干燥。
附图说明
图1ARF各实验组大鼠血清中尿素氮含量,*与模型组II相比较,P<0.05**P<0.01;
图2ARF各实验组大鼠血清中肌酐含量,*与模型组II相比较,P<0.05**P<0.01;
图3ARF实验组VI皮细胞图;
图4ARF实验组VI髓质细胞图;
图5ARF实验组VII皮细胞图;
图6ARF实验组VII髓质细胞图;
图7CRF各实验组大鼠血清中尿素氮含量,*与模型组II相比较,P<0.05**P<0.01;
图8CRF各实验组大鼠血清中肌酐含量,*与模型组II相比较,P<0.05**P<0.01。
以下将通过具体实施方式对本发明进行进一步的说明。
具体实施方式
实施例1紫菜多糖的制备
将干的条斑紫菜剪碎后,在质量浓度90%的乙醇中回流3h,重复3次。弃去乙醇后,将紫菜在室温下晾干后,置于高压锅中,加水量为40倍紫菜重量,以120℃的沸水提取4h,提取液以硅藻土过滤,滤液浓缩后,以自来水流水透析一天,然后以蒸馏水透析一天,将透析液浓缩,加乙醇至其终质量浓度为75%,使紫菜多糖沉淀。干燥后得到紫菜多糖P,其重均分子量为237KDa,总糖含量为79.8%,3,6-内醚半乳糖含量为7.46%,硫酸基含量17.2%。
低分子量紫菜多糖LPA的制备
称取紫菜多糖,溶于蒸馏水中配成质量浓度为1.5%的溶液;向该溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢,使它们的终浓度分别达到30mmol/L,混合均匀后,室温下反应2小时,反应完毕后,透析,以除去抗坏血酸和过氧化氢。所得溶液浓缩后,冷冻干燥,得到低分子量紫菜多糖LP。经检测,其数均分子量为6.5kDa,峰位分子量为7.2kDa,重均分子量为8kDa。化学组分分析结果:总糖质量含量81.2%,硫酸基质量含量17.3%.
低分子量紫菜多糖LPB的制备
称取紫菜多糖,溶于蒸馏水中配成质量浓度为2.5%的溶液。向该溶液中加入浓硫酸,使其终浓度达到0.5mol/L,混合均匀,在80℃下搅拌反应4小时,反应完毕后,向反应液中加入饱和氢氧化钡溶液至中性。离心除去沉淀,浓缩上清液后,冷冻干燥,制得低分子量的紫菜多糖LB。经检测,其数均分子量为1.4KDa,峰位分子量为1.6KDa,重均分子量为2KDa,分子量范围为1KDa-4KDa。化学组分分析结果为:总糖含量75.4%,硫酸基含量16.2%。
实施例2紫菜多糖胶囊的制备
取紫菜多糖50g,加入微晶纤维素30g,,混合,装胶囊,每粒胶囊汗紫菜多糖50-100mg。
实施例3低分子量紫菜多糖注射剂的制备
取低分子量紫菜多糖50g,加入注射用水500mL,甘露醇50g,调pH至7.0,无菌过滤后,分装,冷冻干燥。
实施例4紫菜多糖抗急性肾衰活性的测试实验
实验动物:标准SD大鼠
动物模型:甘油致ARF模型——SD大鼠禁水24h后,以甘油(质量浓度50%,生理盐水配制)10ml/Kg体重分别在两侧后肢肌肉注射,之后实验动物自由进食和饮水,48h即成稳定ARF模型,可持续1周。
药物配制:将未经降解的紫菜多糖P(实施例1制备)低分子量紫菜多糖(LP,实施例2制备)以注射用水按2mg/ml和6mg/ml两种浓度各配制100ml,0.22μm滤膜过滤除菌后4℃保存,使用时5ml/Kg体重腹腔注射(10mg/Kg和30mg/Kg体重);地塞米松以生理盐水配制为0.02mg/ml 100ml,5ml/Kg体重腹腔注射(0.1mg/Kg体重)。
实验分组:
I:空白对照组
II:单纯ARF模型组
III:ARF+地塞米松(0.1mg/kg)
IV:ARF+LP(10mg/Kg)
V:ARF+LP(30mg/Kg)
VI:ARF+P(10mg/Kg)
VII:ARF+P(30mg/Kg)
实验方法:
健康成年标准SD大鼠随即均分为7组,每组13只。除I组(注射生理盐水10ml/Kg)外其余各组均用10ml/Kg50%的甘油肌肉注射造ARF模型,IV-VII组于48h时按分组要求分别于腹腔注射LP各1次,72h、96h和120h时分别重复注射提取物一次,I-II组则在相同时间点注射5ml/Kg生理盐水,III组在相同时间点注射地塞米松0.1mg/kg,144h时处死动物取血和肾脏进行检测。
检测指标:
1.动物死亡率,尿量
2.血生化(BUN、Scr、白蛋白、K+、Na+、Ca2+等)检测
3.形态学检查:光镜肾脏结构检查(石蜡包埋切片2μm,二甲苯脱腊和梯队酒精水化后行HE染色:苏木素8min,流水冲洗1min,蒸馏水浸1min,加伊红5min,流水冲洗30s,烤干,透明后用中性树胶封片。)
实验结果:
血生化检测的结果见图1、2及表1,模型组大鼠血清中肌酐和尿素氮的含量远高于正常组。而P及LP治疗可有效地降低肌酐和尿素氮的含量。对肌酐含量的降低程度,P组及LP组优于阳性对照组,而LP组的效果更佳。而对于血清中尿素氮含量以及各离子的影响,给药组与阳性对照无显著性差异。
表1各实验组大鼠血液检测结果
实验组大鼠肾脏细胞的检测表明,正常组大鼠肾脏皮髓质分界清楚,肾小球、肾小管大致正常。而模型组的大鼠的肾小球毛细血管攀扩张、淤血,皮、髓质肾小管明显扩张,部分肾小管内可见蛋白管型,间质血管扩张、淤血伴少量淋巴细胞浸润。阳性对照组及给药组的大鼠虽有少量的肾小管扩张,但肾脏皮髓质分界清楚,肾小球大致正常(见图3-6)。
结论:紫菜多糖P及LP对急性肾衰具有显著治疗作用,可有效降低急性肾衰动物血清肌酐和尿素氮含量,对肾衰动物的肾脏病理学有明显改善作用。
实施例5紫菜多糖抗慢性肾衰活性的测试实验
实验动物:成年SPF级雄性Wisteria大鼠
动物模型:腺膘呤致CRF模型——Wisteria大鼠以普通饲料饲养并观察一周,状态良好后,以腺嘌呤300mg/Kg体重灌胃给药,每天一次,连续21天即成稳定CRF模型。
实验分组:
I:空白对照组
II:单纯CRF模型组
III:CRF+海昆肾喜胶囊(150mg/kg)
IV:CRF+LP(50mg/Kg)
V:CRF+LP(150mg/Kg)
实验方法:
健康成年标准Wisteria大鼠随即均分为5组,每组10只。除I组(注射生理盐水10ml/Kg)外其余各组均用腺嘌呤300mg/Kg体重灌胃给药造CRF模型,III、IV和V组称重后按设计方法灌胃给药28天,每天一次。III组则在相同时间点灌胃5ml/Kg生理盐水,III组在相同时间以海昆肾喜胶囊150mg/kg灌胃。28天结束后,以10%水合氯醛4mL/kg麻醉后心脏穿刺采血3mL。所得血液室温静置半小时自然凝血。之后以30000rpm离心10min,取血清4℃保存,用于测定生化指标。
取血后将大鼠处死,摘取两侧肾脏,除去肾上腺和其他非肾脏组织,用生理盐水冲洗,医用纱布吸去表面水分,称其湿重,计算肾脏指数。同时观察肾脏体积,颜色及质地变化。
检测指标:
1.大鼠生长状况的观察
2.血生化(BUN、Scr)检测
3.肾脏形态学的观察
4.大鼠体重及双湿肾重的称量
实验结果:
正常组大鼠生长良好,活动正常,体重也会逐日增加,体毛有光泽。而其它组以腺嘌呤灌胃后摄食量下降。造模期间,大鼠逐渐消瘦,精神萎靡,背毛竖起,干枯无光泽,活动减少,耳廓略显苍白,并伴有多饮、多尿现象。按照预定剂量给灌胃给药后,各组大鼠体重逐渐增加,摄食量也渐增并和正常组近似,精神和体毛状态均有所好转。
血生化检测的结果见图7、图8,模型组大鼠血清中肌酐和尿素氮的含量远高于正常组。而LP治疗可有效地降低肌酐和尿素氮的含量。对肌酐和尿素氮含量的降低程度,LP组优于阳性对照组。LP组中两个样品对于血清肌酐和尿素氮的作用并没有剂量依赖性,低剂量组的活性近似于高剂量组。
正常组的肾脏体积较小,呈暗红色,质地坚实有光泽,表面光滑,剖面正常,包膜不易剥离;模型组肾脏明显较大,呈灰白色,无光泽,表面不平,皮质髓质分界不清,包膜易剥离。治疗组的肾脏苍白程度较低,剖面呈红色。
由表2可知,模型组的大鼠体重最轻,LP给药组的体重最重。模型组的双湿肾重最大,治疗组的会稍小,但都高于正常组。而给肾重与体重比值是衡量大鼠肾脏健康程度的一个指标。由表2知,模型组大鼠的比值最大,正常组最小,可见腺嘌呤致大鼠慢性肾衰造成肾脏肿大,而治疗组的比值较小,可见海昆肾喜和LP可在一定程度上缓解肾脏的损伤。从数值上看,LP的效果更佳。
表2各实验组大鼠体重、双湿肾重及肾重与体重的比值
*与模型组II相比较,P<0.05**P<0.01
结论说明:
1.证明紫菜多糖可有效地降低慢性肾衰大鼠中血清尿素氮和肌酐含量,对肾功能具有显著改善作用。
2.紫菜多糖可用于肾功能衰竭的预防和治疗。
Claims (3)
1.紫菜多糖在制备肾脏疾病治疗药物或肾脏疾病预防保健品中的应用;
所述肾脏疾病为急性肾功能衰竭或慢性肾功能衰竭;
所述紫菜多糖为紫菜多糖P、低分子量紫菜多糖LPA或低分子量紫菜多糖EPB;
其中所述紫菜多糖P是通过以下方法制备的:
将干的条斑紫菜剪碎后,在质量浓度90%的乙醇中回流3h,重复3次,弃去乙醇后,将紫菜在室温下晾干后,置于高压锅中,加水量为40倍紫菜重量,以120℃的沸水提取4h,提取液以硅藻土过滤,滤液浓缩后,以自来水流水透析一天,然后以蒸馏水透析一天,将透析液浓缩,加乙醇至其终质量浓度为75%,使紫菜多糖沉淀;干燥后得到紫菜多糖P,其重均分子量为237KDa,总糖含量为79.8%,3,6-内醚半乳糖含量为7.46%,硫酸基含量17.2%;
所述低分子量紫菜多糖LPA是通过以下方法制备的:
称取紫菜多糖P,溶于蒸馏水中配成质量浓度为1.5%的溶液;向该溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢,使它们的终浓度分别达到30mmol/L,混合均匀后,室温下反应2小时,反应完毕后,透析,以除去抗坏血酸和过氧化氢,所得溶液浓缩后,冷冻干燥,得到低分子量紫菜多糖LP,经检测,其数均分子量为6.5KDa,峰位分子量为7.2KDa,重均分子量为8KDa;化学组分分析结果:总糖质量含量81.2%,硫酸基质量含量17.3%;
所述低分子量紫菜多糖LPB是通过以下方法制备的:
称取紫菜多糖P,溶于蒸馏水中配成质量浓度为2.5%的溶液,向该溶液中加入浓硫酸,使其终浓度达到0.5mol/L,混合均匀,在80℃下搅拌反应4小时,反应完毕后,向反应液中加入饱和氢氧化钡溶液至中性,离心除去沉淀,浓缩上清液后,冷冻干燥,制得低分子量的紫菜多糖LB,经检测,其数均分子量为1.4KDa,峰位分子量为1.6KDa,重均分子量为2KDa;化学组分分析结果为:总糖含量75.4%,硫酸基含量16.2%。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:紫菜多糖作为活性成份应用于制备肾脏疾病治疗药物或肾脏疾病预防保健品中。
3.根据权利要求1的应用,其特征在于:所述肾脏疾病治疗药物或预防保健品是以紫菜多糖为活性成份制备的注射剂、口服制剂或局部给药制剂的药物组合物;
该药物组合物包含治疗上有效量的紫菜多糖和至少一种药学上可接受的载体,将药物组合物制备成注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、滴丸剂、凝胶剂、贴片或膏剂。
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