CN103239472A - 褐藻多糖硫酸酯的药物新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种褐藻多糖硫酸酯的药物新用途。该用途是其在制备下述产品中的应用:1)预防和/或治疗糖尿病视网膜病变的产品;2)抑制视网膜新生毛细血管的产品;3)抑制视网膜组织VEGF蛋白表达的产品;4)抑制视网膜组织HIF-1α蛋白表达的产品。上述褐藻多糖硫酸酯优选LMWF,其重均分子量为3-30KD。药效学实验表明,LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠的视网膜病变具有改善作用,而该作用与改善视网膜微血管功能,改善视网膜缺血缺氧状态,从而使VEGF以及HIF-1α表达下调有关。由于LMWF分子量较小,口服可吸收,副作用少等优点,对防治糖尿病视网膜病变具有潜在的应用意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种褐藻多糖硫酸酯的药物新用途。
背景技术
褐藻多糖硫酸酯是一类富含岩藻糖的天然硫酸多糖。目前报道,该物质具有多种生物学功能,如抗氧化、抗凝、抗血栓、抗增殖、抗粘附、抗病毒作用等。
硫酸化墨角藻多糖(Fucans)是一类来源于海洋有机体的阴离子聚糖,多来源于褐藻,因藻类生长环境,地域,和种类的不同,表现为结构多样,但具有基本保守结构。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)为首先从硫酸化墨角藻分离提取出的多糖。1913年,Kylin首先从褐藻中获取并命名,在接下来的几十年,褐藻多糖硫酸酯的提取工艺不断优化,其多种生物学功能也相继被发现。
早期结构研究结果来源于墨角藻(Fucus vesiculosus)。墨角藻多糖硫酸酯主要成分是α-L-岩藻糖,以1,3糖苷键连接,且硫酸化位点在C4位。目前,虽然该类多糖结构研究没有终止,但它们的结构极其复杂并难以阐明。多数研究资料表明,海带褐藻多糖硫酸酯主要是以α-1,3连接的L-岩藻糖,硫酸化发生在C4或C2位,存在部分1,2连接的L-岩藻糖作为侧链。另外,分子中还含有半乳糖、木糖、鼠李糖等单糖,半乳糖可能参与了主链的组成,而木糖、鼠李糖等是以侧链形式存在(Pomin VH,Paulo ASM.Structure,biology,evolution,and medical importance of sulfated fucans and galactans.Glycobiology2008;18:1016-27)。
根据不同分子量可将其分为褐藻多糖硫酸酯和低分子量褐藻多糖硫酸酯(Lowmolecular weight Fucoidan,LMWF,分子量小于10000D)。根据各组分含量及不同的化学修饰,可分为合成硫酸化、胺化、磷酸化、乙酰化和苯甲酰化修饰等(Jing Wang,LiLiu,Quanbin Zhang,Zhongshan Zhang,Huimin Qi,Pengcheng Li.Synthesizedoversulphated,acetylated and benzoylated derivatives of fucoidan extracted from Laminariajaponica and their potential antioxidant activity in vitro.Food Chemistry114(2009)1285-1290)。不同种类的褐藻多糖硫酸酯在生物活性上基本一致,但不同分子量不同修饰后的褐藻多糖硫酸酯存在很大差异。
目前研究表明,褐藻多糖硫酸酯具有多种生物学功能和药理学价值,如抗氧化、抗凝血、抗血栓、抗增殖、抗粘附、抗病毒和重金属离子吸附等作用,且其作用机制也逐渐被阐述。目前尚未有文献报道褐藻多糖硫酸酯在治疗糖尿病视网膜病变方面的用途。
糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病后期严重的微血管并发症,是由于糖代谢紊乱所致全身各组织器官微血管发生改变,是临床病人视力减弱或丧失的重要因素,该病致盲率高而治愈率低,严重危害换患者生活质量。在欧美国家,DR是20-64岁人群首要致盲疾病(Cai J,Kehoe O,Smith GM,et al.The angiopoietin/Tie-2system regulatespericyte survival and recruitment in diabetic retinopathy[J].Invest Ophthalmol VisSci,2008,49(5):2163-2171.)。在我国,糖尿病(DM)发病率逐年激增,其中糖尿病性视网膜病变的患者率达44%-51.3%,给予胰岛素降低血糖的患者DR发病率更高(Rossing,P.,2005.The changing epidemiology of diabetic microangiopathy in type1diabetes.Diabetologia48,1439-1444.),其引起致盲和视力下降的影响已日益严重,成为防盲的重要课题。因此,早期及时给予DR必要的治疗是防止糖尿病病人视力丧失的可靠方法,也是目前新药研究的热点。
通过近年的研究,多数理论认为糖尿病视网膜病变是一种以微血管功能障碍和新生血管为特点的高糖引起的缺血性疾病。缺血、缺氧刺激产生的各种新生血管生长因子是刺激新生血管形成的主要因素,视网膜新生血管就是在视网膜病理情况下,相关组织所分泌的一组细胞因子相互关系失衡的结果。血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,能使血管内皮细胞变形、移动、分裂增殖;能增加血管的通透性,对血管形成具有重要作用(KeckPJ,Hanser SD,Kivi G,et al.Vascular Permeability factor,an endothelial cell mitogenrelated to PDGF.Seience,1989,246(4935):1309-1312.)。VEGF的发现可以追溯到1989年,Ferrara等从脑垂体滤泡-星状细胞培养基中提取出一种分子量为45kD,能与肝素结合的二聚体糖蛋白。目前至少已发现5种VEGF分子:VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206,已经明确促内皮细胞分裂的主要是VEGF165和VEGF121。研究表明,在糖尿病视网膜病变中,眼内VEGF的表达明显增高,说明VEGF是促使新生血管形成的关键因素之一(Ray D,Mishra M,Ralph S,et al.Associationof the VEGF gene with proliferative diabetic retinopathy but not proteinuria indiabetes[J].Diabetes,2004,53(3):861-864.),因此,VEGF作为糖尿病微血管病变中的关键因子成为预防治疗DR的热点。
近年来的研究发现,VEGF在缺氧组织中的转录活化主要受缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)调节,并保持VEGF mRNA的稳定性。HIF-1α能抑制缺血、缺氧诱导的新生血管形成,且仅与氧代谢有关。HIF-1是一个异源二聚体,它是由120kD的α亚基和91一94kD的β亚基组成。HIF-1α受缺氧诱导,只有在缺氧状态下,细胞中的HIF-1α与HIF-1β通过自身的HLH及PAS结构域形成二聚体,后者的碱性区域可特异性的与多种缺氧诱导基因启动子或增强子上的缺氧反应元件(hypoxia response elements,HRE)5’-TACGTG-3’结合,从而发挥其特异性转录激活活性。因此,HIF-1的活性主要是由HIF-1α决定的。体外实验中,Lukiw等(HughesS,Yang H,Chan-Ling T.Vascularization of the human fetal retina:roles of vasculogenesisand angiogenesis.Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41:1217-1228.)将猴脉络膜-视网膜内皮细胞置于低氧环境培养,发现HIF-1的mRNA及蛋白质表达均上调。体内实验中,Luhmann等(Chan-Ling T,McLeod DS,Hughes S,et al.Astrocyte-endothelial cellrelationships during human retinal vascular development.Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45:2020-2032.)研究Ndph基因敲除鼠发现随着视网膜新生血管的生长,HIF-1α的表达也相应增高。因此,以HIF-la和VEGF为靶点的药物治疗将为有效抑制视网膜新生血管的生长从而改善糖尿病视网膜病变提供新的途径。
目前,临床上治疗DR的药物主要分为两类:一种是改善视网膜微循环药物,比如羟苯磺酸钙和阿司匹林等;另一种是VEGF拮抗剂,比如Avastin和Lucentis等通过直接与VEGF结合,抑制VEGF受体而起到良好作用(赵明威糖尿病性视网膜病变的现代治疗北京中医药[J]2008,27(5):326-327)。羟苯磺酸钙是有效的抗氧化剂,特异性的对抗自由基损伤,从而稳定糖尿病视网膜血眼屏障,改善眼底微循环,缓解进一步病变(Brunet,J.,Farine,J.C.,Garay,R.P.,Hannaert,P.,1998a.In vitro antioxidantproperties of calcium dobesilate.Fundam.Clin.Pharmacol.12,205-212.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种褐藻多糖硫酸酯的新用途。
本发明所提供的褐藻多糖硫酸酯的新用途是其在制备预防和/或治疗糖尿病视网膜病变的产品中的应用。所述产品包括药物和保健品。
更进一步的,本发明还提供了褐藻多糖硫酸酯在制备抑制视网膜新生毛细血管产品中的应用;在制备抑制视网膜组织血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达产品中的应用;以及在制备抑制视网膜组织缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达产品中的应用。
所述褐藻多糖硫酸酯是从任何一种或多种褐藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯,例如,可以来源于海带(Laminaria japonica)(包括人工养殖的海带),也可以来源于其他褐藻,例如马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻或墨角藻等的一种或多种。作为一种优选方案,优选来源于海带中的褐藻多糖硫酸酯,其中岩藻糖含量为31%,硫酸基含量为32%,重均分子量为180KD。
为了达到更好的治疗效果,所述褐藻多糖硫酸酯的重均分子量为3-30KD(低分子量),优选为6-8KD,尤其优选为7KD。所述褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量为2535%,硫酸基含量为2535%。
所述褐藻多糖硫酸酯的主要成分是L-褐藻糖-4-硫酸酯,还含有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸、蛋白质、K、Na、Ca、Mg等金属离子,它的结构特征是1,2-联结的聚αL吡喃褐藻糖,而硫酸酯主要是在C4位的羟基上。所以不论是何种褐藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯,其主要成分相同,基本结构相同,都具有相同的药理功效。
从褐藻中提取褐藻多糖硫酸酯的方法为本领域的现有技术。作为一种优选方法可参考本发明实施例从海带中提取褐藻多糖硫酸酯的方法进行制备。本发明中所用的低分子量褐藻多糖硫酸酯是通过将褐藻多糖硫酸酯降解得到的。具体降解方法可参考专利ZL200410083685.7的方法。
以褐藻多糖硫酸酯为有效成分制备的预防和/或治疗糖尿病视网膜病变的药物,也属于本发明的保护范围。
所述预防和/或治疗糖尿病视网膜病变的药物可通过口服、注射、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织;或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
以褐藻多糖硫酸酯为有效成分的药物,需要的时候,在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。所述药物的给药方式可以是但不局限于口服、静注、肌注等方式,其剂型可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
药效学实验表明,低分子量褐藻多糖硫酸酯对STZ(链脲佐菌素)诱导糖尿病小鼠的视网膜病变具有改善作用,而该作用与改善视网膜微血管功能,改善视网膜缺血缺氧状态,从而使VEGF以及HIF-1α表达下调有关。由于低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量较小,口服可吸收,副作用少等优点,对防治糖尿病视网膜病变具有潜在的应用意义。
附图说明
图1为低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)对STZ诱导糖尿病小鼠体重(A)及血糖(B)的影响其中,Con-正常对照组,DM-糖尿病组,CD-阳性药羟苯磺酸钙对照组(通过灌胃给予羟苯磺酸钙,剂量是200mg/kg/Day),F50-糖尿病腹腔灌胃低剂量LMWF(50mg/kg/Day),F100-中剂量LMWF(100mg/kg/Day)和F200-高剂量LMWF(200mg/kg/Day)组。
图2为LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠足底血流阻断后反应性充血血流恢复峰值(A)及恢复时间(B)的影响(n=5~7)。
图3为LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠视网膜微血管病变的影响;其中,(A-H)正常小鼠,糖尿病小鼠和糖尿病小鼠药物治疗4个月后得到视网膜荧光素血管造影图。正常小鼠的视网膜图像低和高倍数放大后分别为(A,E);未经治疗的糖尿病小鼠为(B,F);糖尿病小鼠给予羟苯磺酸钙(200毫克/kg)治疗为(C,G);糖尿病给予LMWF(100mg/kg)治疗为(D,H)。注:红色的箭头显示低灌注的毛细血管。白色箭头显示微动脉瘤。黄色箭头描述荧光素渗漏。在图(A-D)中,比例尺=500μm;在图(E-F)中,比例尺=200μm;(每组小鼠取4到5个例数进行统计)。CD是羟苯磺酸钙,F代表LMWF。
图4为LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠视网膜新生血管的影响。图4是视网膜血管的横截面苏木精-伊红染色光镜下观察并拍照。正常对照组小鼠(A);未经治疗的糖尿病小鼠(B);糖尿病小鼠给予羟苯磺酸钙(200毫克/公斤体重)治疗阳性药对照组(C);糖尿病小鼠分别给予低,中,高剂量LMWF(50毫克/公斤,100毫克/公斤,200毫克/公斤)治疗组(D-F)。黄色的箭头说明内丛状层和外丛状层之间出现大量的毛细血管血管点。(G)对以上各组小鼠视网膜新生血管计数的统计分析。每只眼睛取五张切片统计取平均数分析。每组数据由平均数±标准误代表(每组取4~5只小鼠统计)。在图(A-F),比例尺=100μm;*P<0.05,**P<0.01代表与正常对照组统计差异;#P<0.05,##P<0.01代表与糖尿病组统计差异。
图5为LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠视网膜VEGF的影响。图5是通过荧光显微镜观察视网膜VEGF的免疫荧光染色。正常对照组(A);糖尿病组(B);糖尿病小鼠给予羟苯磺酸钙(200毫克/公斤)治疗阳性药对照组(C);糖尿病小鼠分别给予低,中,高剂量LMWF(50毫克/公斤,100毫克/公斤,200毫克/公斤)治疗组(D-F)。注:白色箭头表示在STZ诱导的糖尿病视网膜内丛状层和外丛状层增加的血管内皮生长因子的免疫反应。在图(A-F),比例尺=50μm。(G)在上述各组小鼠视网膜VEGF水平进行检测和统计分析。(H)通过实时PCR技术检测在各组小鼠视网膜的VEGF的mRNA表达水平。统计分析每个样本的VEGF mRNA表达时与管家基因β-肌动蛋白标准化。每组数据由平均数±标准误代表(每组取4~5只小鼠统计)。*P<0.05,**P<0.01代表与正常对照组统计差异;#P<0.05,##P<0.01代表与糖尿病组统计差异。
图6为LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠视网膜HIF-1α的影响。图6是通过荧光显微镜观察视网膜HIF-1α的免疫荧光染色。正常对照组(A);糖尿病组(B);糖尿病小鼠给予羟苯磺酸钙(200毫克/公斤)治疗阳性药对照组(C);糖尿病小鼠分别给予低,中,高剂量LMWF(50毫克/公斤,100毫克/公斤,200毫克/公斤)治疗组(D-F)。在图(A-F),比例尺=50μm。(G)在上述各组小鼠视网膜冰冻切片中对HIF-1α免疫荧光强度(绿色荧光信号)水平进行检测和统计分析。每组数据由平均数±标准误代表(每组取9只小鼠统计)。*P<0.05,**P<0.01代表与正常对照组统计差异;#P<0.05,##P<0.01代表与糖尿病组统计差异。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和生物材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的褐藻多糖硫酸酯为低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF),其按照下述方法制备得到:
1)提取褐藻多糖硫酸酯:
取海带粉碎后添加蒸馏水,沸水提取,提取液以硅藻土助滤过滤,滤液先以自来水流水透析一天,然后以蒸馏水透析一天,将透析液浓缩,向浓缩液中加乙醇至终浓度为75%沉淀,干燥沉淀,得粗褐藻多糖硫酸酯。将粗品重溶于水,在0.05mol/L MgCl2存在下20%乙醇沉淀除去水溶性褐藻胶,滤液透析、浓缩后75%乙醇沉淀,干燥后即得纯化的褐藻多糖硫酸酯。经分析,海带褐藻多糖硫酸酯主要由岩藻糖、半乳糖组成的硫酸多糖,其中岩藻糖含量为31%,硫酸基含量为32%,重均分子量180KD。
2)制备低分子量褐藻多糖硫酸酯:
取上述海带褐藻多糖硫酸酯50g配成质量浓度为1.5%的水溶液,在该溶液中加入终浓度为30mM的抗坏血酸和终浓度为30mM的过氧化氢,常温反应2小时。将该反应液用截留分子量为3600Da的透析袋依次在自来水和蒸馏水透析,之后浓缩,冻干,得到低分子量褐藻多糖硫酸酯样品。对其进行化学分析结果表明岩藻糖含量为30%,测定方法参照下述文献:(K.A.G.Michel Dubois,J.K.Hamilton,P.A.Rebers,FredSmith,Colorimetric method for determination of sugars and related substances,AnalyticalChemistry28(1956)350-357),硫酸基含量为31%,测定方法参照下述文献:(Y.Kawai,N.Seno,K.Anno,A modified method for chondrosulfatase assay,Analytical Biochemistry32(1969)314-321.)。
3)分子量测定
分析条件:Shiamdzu LC-20AT HPLC,TSK G3000PWxl色谱柱,流动相2.84%Na2SO4溶液,流速1ml/min,检测器:示差检测器RID10A。结果:Mn:5765(number-average,数均);Mw:7102(weight-average,重均),Mw/Mn:1.23。重均分子量为3-30KD范围内的其它低分子量褐藻多糖硫酸酯,可通过调节上述步骤2)降解反应体系中抗坏血酸和过氧化氢的摩尔比获得。
下述实施例中实验用溶液的成分与配制如下:
1)30mg/ml链脲佐菌素-柠檬酸盐缓冲液
A液:柠檬酸(FW210.14)2.1g加入双蒸水至100ml溶解
B液:二水合柠檬酸三钠(FW294.10)2.94g加入双蒸水至100ml溶解
A、B液以1∶1比例混合,调pH为4.5,0.22μm滤膜过滤后,配制STZ,浓度为30mg/ml,冰上避光保存,30min内使用完。
2)LMWF灌胃剂
称取一定量LMWF溶于三蒸水中,终浓度为25mg/ml,灌胃剂量为每千克体重2ml(50mg/kg)、4ml(100mg/kg)、8ml(200mg/kg)。化学组成为:岩藻糖含量31.0%,硫酸酯含量32.0%。
3)Calcium Dobesilate(羟苯磺酸钙)灌胃剂
取一粒羟苯磺酸钙胶囊溶于10ml双蒸水中,终浓度为25mg/ml,灌胃剂量为每千克体重8ml(200mg/kg)。
4)PBS溶液
称取NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g,溶解于1000ml三蒸水,pH=7.35-7.40。
5)10%水合氯醛
称取水合氯醛固体10g,溶于100ml三蒸水中配制成10%麻醉剂。
6)50mg/ml FITC-dextran(异硫氰酸荧光素)灌注液
称取异硫氰酸荧光素50mg,溶于1ml三蒸水中配制成50mg/ml的异硫氰酸荧光素注射液。
7)4%多聚甲醛-NaH2PO4/NaOH
称取多聚甲醛4g,NaH2PO4.2H2O1.69g,NaOH0.386g,加水溶解至100ml。
8)免疫荧光封闭液
3%牛血清白蛋白(Bull Serum Albumin,BSA)+0.1%Triton X-100,PBS配制9)免疫荧光一抗
VEGF一抗是由VEGF与0.1%BSA按照1∶200的比例配置
HIF-1α一抗是由HIF-1α与0.1%BSA按照1∶100的比例配置
10)免疫荧光二抗
来源于山羊种属的抗小鼠的二抗是由抗体原液与与0.1%BSA按照1∶200的比例配置
11)蛋白裂解液
取原矾酸钠1mM原液1ml,焦磷酸钠0.25M原液0.02ml,氟化钾原液1M0.5ml,加入10mL蛋白裂解液中。
实施例1、低分子量褐藻多糖硫酸酯对STZ诱导糖尿病小鼠视网膜病变的作用及其机制研究
1.1、STZ诱导糖尿病小鼠模型的建立与鉴定
1)模型建立
实验选用常规链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠模型研究低分子量褐藻多糖硫酸酯(Low Molecular Weight Fucoidan,LMWF)对糖尿病视网膜病变的作用及其机制。选取C57BL/6雄性小鼠,体重为18~20g。造模前实验室适应性喂养3天之后,禁食不禁水14小时,以60mg/kg体重剂量腹腔注射链脲佐菌素-柠檬酸盐缓冲液,之后给予5%葡萄糖水溶液防止低血糖发生并保证充足水量,连续诱导5天。约1周后小鼠出现多饮多尿现象,分别测定随机血糖和禁食14小时血糖,根据禁食血糖值大于16.5mmol/L标准确定入选动物(Like AA,Rossini AA.Streptozotocin-induced pancreaticinsulitis:new model of diabetes mellitus.Science1976;193.),未达到此标准值的补充注射链脲佐菌素-柠檬酸盐缓冲液进行二次造模。
2)模型分组
STZ诱导糖尿病模型如上所述,以禁食血糖值大于16.5mmol/L标准确定入选实验动物。实验分为正常对照组(Control),糖尿病组(STZ),糖尿病腹腔灌胃低剂量LMWF即STZ-F(50mg/kg/Day),中剂量LMWF即STZ-F(100mg/kg/Day)和高剂量LMWF,即STZ-F(200mg/kg/Day)组,和羟苯磺酸钙(Calcium Dobesilate,200mg/kg/Day)阳性药组,该药品通过调节微血管壁的生理功能,降低血浆粘稠度,减少血小板聚集等机制,调节微循环功能,从而起到治疗糖尿病引起的视网膜微循环病变的作用,在临床用于糖尿病视网膜病变治疗。每天上午9:00给药,时程为16周。由于血糖升高即给药,此时并未出现血管并发症,因此将其称为糖尿病血管并发症预防组。
1.2基础代谢指标测量
1)体重
小鼠造模成功,分组,开始给药,此时记为第0周,之后逐周称量各组小鼠体重,记录并绘制小鼠生长曲线。比较各组小鼠体重生长情况。
2)血糖
小鼠血糖测定采用尾尖取血法,取血前反复挤搓鼠尾数次以加快尾部血液循环,用75%乙醇棉球对鼠尾尖进行擦拭消毒,手术剪迅速剪下尾尖部皮肤,挤血1滴,用Roche血糖仪进行检测。
空腹血糖:小鼠禁食不禁水14小时后的血糖值。
随机血糖:小鼠在24小时内自由饮食饮水情况下的血糖值。
1.3足底血流阻断后反应性充血实验
将小鼠麻醉后以固定姿势(俯卧位)放置在加热板上,加热板温度设定在37℃以保持动物体温,将合适大小的袖带放置在右下肢股动脉处,将探头座(Probe407-1,thefiber spacing:0.25mm,Perimed,Sweden)通过生物胶固定于小鼠右下肢足底表面肉垫中心处,皮肤血流通过单点激光多普勒血流仪测定(single-point laser Dopplerflowmetry,LDF,Periflux System5000,780nm laser diode,Perimed,Sweden).首先记录3分钟基础血流值,之后通过对放置在右下肢的袖带打气加压,使压力值超过200毫米汞柱,完全阻断下肢足底血流,时间维持3分钟,之后突然释放压力,记录血流变化值,进行统计。
1.4FITC-dextran荧光造影视网膜铺片
动物喂养四个月后,从各组中随机取出3~5只小鼠,10%水合氯醛300mg/kg腹腔内麻醉小鼠,快速打开胸腔,暴露心脏,用1ml注射器抽取配制好的FITC-dextran(50mg∶1ml三蒸水)0.2ml,从心尖部进针行左心室灌注,灌注后期,用镊子轻轻挤压心脏帮助灌注,是造影充分。摘除眼球放入4%多聚甲醛中固定90min后将其置于PBS中,在解剖显微镜下沿角巩缘剪开眼球,去除角膜、晶状体,轻轻剥离出视网膜,以视盘为中心放射状剪开,用载玻片将其捞出,展开铺平,滴一滴抗荧光淬灭封片剂,开上盖玻片,置于宏观显微镜下观察拍照,比较各组视网膜血管形态变化。
1.5视网膜石蜡切片HE染色
1)小鼠视网膜石蜡切片
动物喂养四个月后,从各组中随机取出3~5只小鼠,处死后摘取眼球在4%多聚甲醛中固定24h,酒精梯度脱水、透明、浸蜡,石蜡包埋,矢状面平行视神经进行连续切片,片厚5μm,每隔十张切片取一张切片,每只眼球取5张切片常规脱蜡后进行HE染色,于高倍镜下观察切片中视网膜血管病变情况,并对视网膜血管点数进行计数。计数由两个与本实验不相关的人员进行,并遵守随机双盲原则。
2)石蜡切片HE染色
HE染色步骤:
石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,苏木素液染色8min,自来水洗涤,1%盐酸乙醇分化20s,洗涤,伊红染色5min,洗涤。再经酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
1.二甲苯脱蜡
2.乙醇洗二甲苯:100%乙醇2min x2;95%乙醇2min x2;80%乙醇1min x1;70%乙醇1min x1。
3.水洗:洗1min去掉乙醇
4.苏木精染色8min
5.流水洗去苏木精
6.1%盐酸乙醇分化20s
6.1%盐酸乙醇分化20s
7.流水冲洗
8.伊红染色5min
9.流水冲洗
10.分色,脱水:70%乙醇20s;80%乙醇30s;95%乙醇1min x2;100%乙醇1min x2;
11.二甲苯洗酒精,透明:2min x3
12.中性树胶封片
13.显微镜下观察,拍照
1.6视网膜冰冻切片免疫荧光染色检测VEGF蛋白的表达
1)小鼠视网膜冰冻切片
动物喂养四个月后,从各组中随机取出3~5只小鼠,颈椎脱臼处死,摘取眼球,立即置于4%多聚甲醛中4℃固定2h,取出“沉糖”30%蔗糖脱水过夜。OCT包埋后立即置于液氮中冷却冰冻成块,在-70℃下可保存2~3个月,矢状面平行视神经连续切片,片厚8μm。
2)冰冻切片免疫荧光染色
1.将冰冻切片取出烤干:室温:30min;45℃:20min
2.加入PBS洗涤3次(OCT洗掉)5min×3
3.封闭+融膜打孔:为了封闭内源性非特异性蛋白,用3%BSA+0.1%Triton封闭液室温下浸泡60min。
4.加入Mouse anti-VEGF一抗1∶200(0.1%BSA配制)置于4℃冰箱内,孵育过夜。
5.置于37℃孵箱内复温1h后,加入PBS洗涤3次。
6.加入GoatAnti-Mouse Fluor488(Molecular Probes)二抗1∶400(0.1%BSA配制)置于37℃孵箱内孵育1-2h,加入PBS洗涤3次。
7.Hoechst(1μg/ml)染核10min,加入PBS洗涤3次。
8.抗淬灭封片剂封片后,荧光显微镜下观察,拍照。
1.7ELISA检测视网膜组织VEGF蛋白的表达
1)视网膜组织蛋白提取
动物喂养四个月后,从各组中随机取出5~7只小鼠,颈椎脱臼处死,摘取眼球在冰上迅速剥离视网膜组织,PBS冲洗吸干后放入1.5mlEP管中,每片加入100μl裂解液及0.5μl PMSF,冰上匀浆超声,低温高速离心机14000转下4℃离心15min,后收集上清分装,BCA法测定总蛋白浓度,小鼠VEGF ELISA试剂盒测上清VEGF水平。
2)蛋白浓度测定
BCA法测定总蛋白浓度。配置蛋白标准品,逐级稀释得到标准曲线样品,配置A、B液混合工作液,将200μL工作液加入96孔板中,每孔加10μL上述提取的样品蛋白或标准蛋白,混匀,37℃孵育30min,570nm下测定吸光度,计算蛋白浓度。
3)视网膜组织VEGF水平测定
VEGF ELISA试剂盒检测上清VEGF水平。
1.从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条,未用的板条和干燥剂放同铝箔袋内封存于4℃。
2.留空白孔。
3.分别将标本或不同浓度标准品(0pg/ml孔加试剂稀释液)加入相应孔中(100μl/孔),用封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱孵育90分钟。
4.提前30分钟制备生物素化抗体工作液。
5.洗板5次。
6.除空白孔外,加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱孵育60分钟。
7.提前30分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置。
8.洗板5次。
9.除空白孔外,加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔,37℃孵箱孵育30分钟。
10.洗板5次。
11.加入显色底物(包括空白孔)100μl/孔,37℃孵箱,避光孵育15分钟。
12.加入终止液(包括空白孔)100μl/孔,混匀后即刻测量OD450值(10分钟内)。
1.8Real-time PCR检测视网膜VEGF mRNA的表达
1)引物设计及合成
根据引物设计的原则,设计针对小鼠VEGF和β-actin的特异性引物:
VEGF-MOUSE-F 5’-CCCTTCCTCATCTTCCCTTC-3’(见序列表序列1)
VEGF-MOUSE-R 5’-CACCGATCTGGGAGAGAGAG-3’(见序列表序列2)
Beta-actin-F 5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’(见序列表序列3)
Beta-actin-R 5’-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3’(见序列表序列4)
2)提取视网膜总RNA
1.组织匀浆:在冰上1.5ml的EP管中加入200μl的TRIzol试剂,直接从液氮中取出一片视网膜放入TRIzol中,小棒研碎,震荡溶解。
2.相分离:室温放置5min后加入40μl氯仿,盖好,大力摇管15s(20下),室温静置2-3min,然后低温高速(4℃,12000g)离心15min,离心后可见液体分为三层,上层为无色水相(RNA),中层乳白色,下层红色(蛋白、DNA)。
3.RNA沉淀:将上一步的水相转移到新的EP管中,100μl异丙醇沉淀RNA,室温静置10min(或-20℃静置20min),然后低温高速(4℃,12000g)离心15min,极少量的RNA沉淀可见。
4.洗涤:200μl75%乙醇洗涤,振荡,低温高速(4℃,7500g)离心10min
5.重新溶解:离心后弃掉上清置冰上,空气干燥RNA(吹5~10min)至无酒精味,10μlDEPC水溶解。
6.RNA浓度定量:NanoDrop ND-1000Spectrophotometer测定提取的总RNA浓度。
3)逆转录合成cDNA
1.EP管内加入下列试剂,轻轻混匀,离心3~5s
2.65℃×5min,冰上骤冷1min,短暂离心30s
3.加
4.25℃×10min,50℃×60min,终止85℃×5min,chill on ice,-80℃冻存。
4)聚合酶链式反应(PCR)
1.PCR反应体系
2.PCR仪扩增程序设计
95℃×10min(预变性)
95℃×1min(变性)
55℃×1min(退火)
72℃×30s(延伸)
共循环40次
2统计学方法
统计原则:
实验所得数据的表示方式为平均值±标准误(平均值±SE),两组间差异比较采用两独立样本t检验,三组或三组以上多组间的差异比较采用单因素方差分析(One-Way-ANOVA),三组或三组以上两两间比较采用L-S-D法。P<0.05具有统计学意义。
具体到本实验:
各组与同龄Control组相比差异统计学方法为两独立样本t检验;同龄STZ,STZ-F(50mg/kg,100mg/kg,200mg/kg),STZ-CD三(四)组之间差异的比较采用ANOVA(LSD)。
若同组不同年龄鼠间比较,采用两独立样本t检验。
3.实验结果
3.1实验造模及入选情况
如2.5.2所述进行STZ诱导糖尿病小鼠造模,一次成模率为:83.8%
二次成模率(即空腹血糖未达标准补注STZ):90%
空腹血糖值≥16.7mmol/L入选实验。
3.2LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠基础代谢指标的作用
给药4周后,STZ,STZ-F(50、100、200mg/kg)和STZ-CD组均出现典型的糖尿病特征,表现为多饮、多尿、血糖升高、体重减轻,部分小鼠皮毛光滑度较正常组差且活动明显迟缓(数据未给出)。继续给药,监测各指标值。
1)体重
从给药第0周开始,每两周测定体重一次,测定时程为16周,由图1可见,随着时间的延长,糖尿病大鼠较正常大鼠出现明显的体重减轻现象,给予LMWF可缓解糖尿病小鼠体重减轻,但还远远小于正常小鼠体重,Calcium Dobesilate对体重的改善作用不明显,见表1。
2)血糖
实验表明,随着给药时程延长,STZ-F(50mg/kg,200mg/kg)组以及STZ-CD组血糖值较STZ组均无明显差异。而STZ-F(100mg/kg)剂量下,连续给药16周,LMWF对糖尿病小鼠血糖略有降低作用。
3)生存状态
实验过程中我们观察到,随着诱导时间的延长,STZ组相对于正常对照组小鼠生存状态明显较差,具体表现在活动非常迟缓,皮毛光滑度明显降低且比正常动物潮湿,而各个给药组症状表现出相对减轻。
CD and F分别代表羟苯磺酸钙和LMWF.*p<0.05,**p<0.01vs对照组;#p<0.05,##p<0.01vs糖尿病组
3.3足底血流阻断后反应性充血实验结果
足底血流阻断后反应性充血实验主要原理是短时间的加压阻断足底血流然后突然间释放压力恢复血流,通过血流恢复时的峰值与静息时的比值以及恢复的时间来反映血管功能的好坏。若血流恢复峰值高,恢复时间迅速,说明血管功能较好,且血液循环通畅;若血流恢复峰值低,恢复时间缓慢,则说明血管功能出现了损伤,血液循环出现障碍。如图2(A)所示,与正常对照组相比,糖尿病组小鼠血流恢复时的峰值与静息时的比值明显降低(P<0.01),而给药组包括阳性药组以及LMWF(100mg/kg)组小鼠血流恢复时的峰值与静息时的比值比糖尿病组明显升高(P<0.01),接近于正常水平。实验结果显示STZ诱导四个月的糖尿病小鼠足底微血管发生了严重的病变,微循环也出现了一定程度的障碍。而给药后包括阳性药组以及LMWF(100mg/kg)组足底微血管功能得到保护,且微循环也得到了很大的改善。
3.4STZ诱导糖尿病小鼠眼底荧光造影观察
FITC-dextran能很好的显示视网膜血管形态,并且没有明显的背景荧光。正常组C57BL/6小鼠视网膜血管(图3A,E):自视盘发出的血管向四周呈放射状均匀分布,直至视网膜周边部,荧光强度均一,无渗透现象,视网膜血管交叉成网状,分深浅多层,浅层毛细血管较细,深层较粗。相对于正常组小鼠模型对照组小鼠视网膜(图3B,F)可见诸多明显血管病变,主要表现在:1.看不见明显向外扩散的大血管分支;2.视网膜周边出现明显的低灌注区(红色箭头1);3.视网膜上出现大量微血管瘤(白色箭头2)并伴随有荧光渗透的情况(黄色箭头3)。STZ-CD组(图3C,G)以及STZ-F组尤其是(100mg/kg)剂量组(图3D,H)表现出明显的改善情况,具体表现在:相对于病变组视盘周围的低灌注区减少,血管迂曲及不规则扩张减轻,微血管瘤及荧光渗漏均有减轻的迹象。
3.5STZ诱导糖尿病小鼠视网膜组织病理学检查结果
视网膜毛细血管新生是糖尿病视网膜病变的主要特点,为了检测LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠视网膜新生血管的影响,我们采用组织石蜡切片HE染色的方法定性的观察其改变。正常组C57BL/6小鼠视网膜HE染色(图4A):视网膜各层清晰可见,在内丛状层和外丛状层之间偶见少量毛细血管点。相对于正常小鼠视网膜,糖尿病小鼠视网膜(图4B)内丛状层和外丛状层之间出现大量的毛细血管血管点,而STZ-CD组(图4C)以及STZ-F组尤其是(100mg/kg)剂量组(图4D,E,F)表现出明显的改善情况,我们通过对视网膜毛细血管点数的计数进行统计分析发现(图4G),给药组(包括LMWF以及阳性药CD对照)对新生血管的抑制作用是有统计学意义的(P<0.01)。
3.6LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠视网膜中VEGF表达的影响
根据大量研究表明,糖尿病视网膜病变血管结构功能的改变以及增生都与VEGF的过表达有关,为了检测Fucoidan对STZ诱导糖尿病小鼠视网膜VEGF表达的影响,我们采用免疫荧光染色法、酶联免疫吸附法以及Real-time PCR,分别从蛋白和分子水平对小鼠视网膜VEGF进行定性和定量分析。如图5,小鼠视网膜冰冻切片免疫荧光染色实验结果表明,相对于正常视网膜组织(图5A),STZ诱导糖尿病视网膜组织内丛状层和外丛状层之间的红色荧光信号明显增强(图5B),而STZ-CD组(图5C)以及STZ-F组尤其是(100mg/kg)剂量组(图5D,E,F)表现出明显的改善情况。小鼠视网膜蛋白ELISA定量检测结果表明(图5G),相对于正常视网膜组织,STZ诱导糖尿病视网膜组织中VEGF表达明显增高,而各给药组中VEGF表达均有不同程度的下调,且差异有统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR检测小鼠视网膜VEGF mRNA表达(图5H),结果表明,相对于正常视网膜组织,STZ诱导糖尿病视网膜组织中VEGF mRNA表达明显增高,而各给药组,尤其是(100mg/kg)组中VEGF表达均有下调,实验结果与蛋白检测结果一致。
3.7LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠视网膜中HIF-1α表达的影响
前面我们提到,VEGF主要是由于组织缺氧而引起的HIF-1α高表达进而上调的,我们通过免疫荧光染色、荧光强度定量分析的方法检测HIF-1α的表达情况,实验结果表明,相对于正常视网膜组织(图6A),STZ诱导糖尿病视网膜组织内丛状层和外丛状层之间的绿色荧光信号明显增强(图6B),而STZ-CD组(图6C)以及STZ-F组尤其是(100mg/kg)剂量组(图6D,E,F)表现出明显的HIF-1α表达下调,荧光强度定量分析该差异具有统计学意义(P<0.05)。这提示药物对视网膜缺血缺氧的状态有所改善,与前面视网膜荧光造影血管病变的观察以及VEGF的表达结果一致。
从上述实验结果中我们发现:(1)LMWF能从整体上改善糖尿病动物的病变状态,主要表现在其对体重的保留,血糖的稳定,生存状态的改善,以及对微血管功能的保护。(2)LMWF能从局部改善糖尿病视网膜微血管病变,主要表现在其对微血管形态、结构、功能的保护作用。(3)深入机制方面的探讨,LMWF通过抑制VEGF的主要转录因子HIF-α的表达,进而抑制VEGF的过表达,从而改善高糖引起的一系列血管病变。
链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠模型是常用的研究糖尿病视网膜病变的动物模型(Way,K.J.,Isshiki,K.,Suzuma,K.,Yokota,T.,Zvagelsky,D.,Schoen,F.J.,Sandusky,G.E.,Pechous,P.A.,VIahos,C.J.,Wakasaki,H.,King,G.L.,2002.Expression of connectivetissue growth factor is increased in injured myocardium associated with protein kinase Cbeta2activation and diabetes.Diabetes51,2709-18.),长时程的诱导会产生一系列明显的视网膜微血管病变,包括视网膜血管低灌注区,视网膜微血管瘤,视网膜血管渗漏以及血管增生等。正如本研究中视网膜荧光灌注造影实验和HE染色实验结果(图2,3)显示,图片上都出现了明显的病变特征。从实验统计结果上看,给药组(包括LMWF和阳性药CD)均出现了不同程度的病情缓解的情况,且呈现出一定的剂量依赖性。深入到机制方面的探究,通过免疫荧光染色法,酶联免疫吸附法以及实时定量PCR(图4),我们发现给药(包括LMWF和阳性药CD)后,糖尿病小鼠视网膜血管内皮生长因子,不管是蛋白水平还是mRNA水平的表达都受到抑制。尤其是100mg/kg剂量的LMWF组,其抑制效果与200mg/kg剂量的阳性药CD组相当。此外,通过免疫荧光染色法定性检测HIF-1α,我们发现糖尿病小鼠视网膜HIF-1α的水平有所下调,结合前期的足底血流实验结果以及视网膜荧光造影实验结果,提示给药后视网膜微血管功能得到保护,眼底微循环有所改善,其缺血缺氧的状态出现不同程度的缓解。
综上所述,LMWF对STZ诱导糖尿病小鼠的视网膜病变具有改善作用,而该作用与改善视网膜微血管功能,改善视网膜缺血缺氧状态,从而使VEGF以及HIF-1α表达下调有关。由于低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量较小,口服可吸收,副作用少等优点,对防治糖尿病视网膜病变具有潜在的应用意义。
Claims (9)
1.一种褐藻多糖硫酸酯在制备下述产品中的应用:1)预防和/或治疗糖尿病视网膜病变的产品;2)抑制视网膜新生毛细血管的产品;3)抑制视网膜组织血管内皮生长因子蛋白表达的产品;4)抑制视网膜组织缺氧诱导因子1α蛋白表达的产品。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述褐藻多糖硫酸酯是从下述至少一种褐藻中提取得到的:海带、马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻和墨角藻。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述褐藻多糖硫酸酯是从海带中提取得到的。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用,其特征在于:所述褐藻多糖硫酸酯为低分子量褐藻多糖硫酸酯,其重均分子量为3-30KD,优选为6-8KD,最优选为7KD;所述褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量为25-35%,硫酸基含量为25-35%。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述低分子量褐藻多糖硫酸酯是通过褐藻多糖硫酸酯降解得到的。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用,其特征在于:所述产品为药物或保健品。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述药物包含有效治疗量的所述褐藻多糖硫酸酯和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求6或7所述的应用,其特征在于:所述药物的剂型为口服制剂或注射剂。
9.一种预防和/或治疗糖尿病视网膜病变的药物,其活性成分为权利要求1-5中任一项所述的褐藻多糖硫酸酯。
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US20130272962A1 (en) | Staining agent for corneal staining |
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant |