CN104490872A

CN104490872A - 2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉治疗神经系统线粒体损伤疾病中的用途

Info

Publication number: CN104490872A
Application number: CN201410763246.4A
Authority: CN
Inventors: 郑荣远; 侯圣陶; 殷为勇; 张元涛; 郑浏璞; 王志强; 徐惠琴
Original assignee: First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2015-04-08

Abstract

本发明提供2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉或其药学上可接受的盐在制备用于治疗神经系统线粒体损伤疾病的药物中的用途。所述神经系统线粒体损伤性疾病包括由线粒体异常引起的全身多器官以及神经系统病变和与中枢神经系统线粒体损伤病理过程有关的疾病。本发明发现，2-BFI对中枢神经系统的线粒体损伤具有很好的保护作用，且能够下调星形胶质细胞CytC和AIF的表达，有效地减轻星形胶质细胞的线粒体损伤，具有促进神经系统炎症修复的能力。

Description

2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉治疗神经系统线粒体损伤疾病中的用途

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉或其药学上可接受的盐治疗神经系统线粒体损伤疾病中的用途。

背景技术

线粒体的主要功能是进行氧化磷酸化，合成ATP，为细胞生命活动提供能量。线粒体是糖类、脂肪和氨基酸等物质最终氧化释能的场所。线粒体对中枢神经细胞的生存和死亡有重要的调节作用，其内膜呼吸链的氧化磷酸化是细胞内ATP和活性氧的主要来源，它对中枢神经细胞在氧化应激、离子平衡和能量代谢方面有重要调节作用。

此外，线粒体在细胞凋亡的过程中也起着枢纽作用。主要途径是通过线粒体膜通透性改变，导致细胞色素C(Cytochrome C,CytC)、调亡诱导因子(Apoptosis-inducing factor,AIF)、多种降解酶前体的释放和膜电位下降、活性氧产生及线粒体基质肿胀，最终导致细胞裂解。线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件。

线粒体与人的疾病、衰老和细胞凋亡有关。线粒体异常会影响整个细胞的正常功能，从而导致病变，最典型的是线粒体脑肌病，因为线粒体异常先后或同时引起全身多器官以及神经系统病变。此外，已有研究表明，神经系统急性危重症如各种感染性脑膜炎或脑炎(包括细菌性、病毒性、真菌性、寄生虫性和梅毒性脑膜炎或脑炎)、缺氧性脑病、中毒性脑病、急性脑血管病和颅脑外伤等，或神经系统慢性退行性疾病如帕金森氏症、阿尔兹海默病、多系统萎缩、遗传性共济失调、运动神经元病和亨汀顿舞蹈病等疾病的发生发展病理进程中，均与线粒体功能的异常有关。

线粒体与免疫反应密切相关，如当神经系统发生炎性反应时，早期即有线粒体呼吸链复合体Ⅰ和复合体Ⅳ的氧化性损伤，进而引起呼吸链解偶联、ATP合成减少和线粒体膜电位降低并最终导致神经系统内大量神经细胞凋亡，这些均早于中枢神经系统内炎症细胞浸润。

CytC和AIF是线粒体损伤后释放的重要的凋亡信号分子。正常情况下，CytC主要位于线粒体内膜和外膜之间间隙中，炎症反应、氧化应激、钙超载、能量代谢障碍等可引起线粒体膜电位降低导致线粒体通透性转化孔开放，引起CytC和AIF从线粒体通透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore,MPTP)释放进入细胞质，一方面CytC和凋亡蛋白酶活化因子-1结合后形成凋亡复合体，继而激活凋亡蛋白酶3引起细胞凋亡；另一方面AIF可直接激活核酸内切酶引起细胞凋亡。

发明内容

本发明的发明目的是提供化合物2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉或其药学上可接受的盐治疗神经系统线粒体损伤疾病中的用途。

本发明通过如下技术方案实现：

2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉或其药学上可接受的盐在制备用于治疗神经系统线粒体损伤疾病的药物中的应用，其中，所述2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉的结构式如下：

根据本发明，2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(以下简称2-BFI)药学上可接受的盐包括有机酸盐或无机酸盐，例如(包括但不限于)盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、亚磷酸盐、磷酸二氢盐、氢溴酸盐、硼酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、乳酸盐、油酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、棕榈酸盐、山梨酸盐、水杨酸盐等。优选盐酸盐。

根据本发明，2-BFI及其药学上可接受的盐有可以以光学异构体或互变异构体的形式存在，本发明包括其各种存在形式。

根据本发明的应用，所述神经系统线粒体损伤性疾病包括由线粒体异常引起的全身多器官以及神经系统病变，例如：线粒体脑肌病的多种临床类型；和与中枢神经系统线粒体损伤病理过程有关的疾病，例如：神经系统急性危重症，如各种感染性脑膜炎或脑炎(包括细菌性、病毒性、真菌性、寄生虫性和梅毒性脑膜炎或脑炎)、缺氧性脑病、中毒性脑病、急性脑血管病和颅脑外伤；或神经系统慢性退行性疾病如帕金森氏症、阿尔兹海默病、多系统萎缩、遗传性共济失调、运动神经元病和亨廷顿舞蹈病等疾病。

本发明中，2-BFI或其可药用的盐是本发明治疗神经系统线粒体损伤疾病的药物的活性组份，在制备药物时，还可以加入一种或多种例如赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂和乳化剂等的常规的可药用辅料，制成可供临床使用的药物剂型。

根据本发明，所述药物以药物制剂的形式提供。优选地，所述制剂可以是经胃肠道、皮肤、粘膜、腔道或注射途径给药的剂型。其中，经胃肠道给药的剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸剂、混悬剂、颗粒剂等；经皮肤给药剂型包括贴剂、软膏剂等；经粘膜给药剂型包括粘贴片、贴膜剂、舌下片剂等；经腔道给药剂型包括泡腾片等；经注射给药剂型包括注射用乳剂、注射用粉针剂、注射用纳米粒、注射用脂质体、注射用水针剂等。优选的药物剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、贴膜剂。制备药物剂型所需的辅料包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、乙醇、聚乙二醇、植物油、卵磷脂、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、滑石粉、硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠等。

在通常情况下，2-BFI或其药学上可接受的盐的有效剂量为0.001-200mg/kg/日，优选0.05-50mg/kg/日。成人日剂量在0.06-12000mg，优选3.0-3000mg范围内施用本化合物。优选0.1～10mg/kg/日，更优选0.25～5.0mg/kg/日，最优选0.5～3mg/kg/日，每天1次或多次(例如2次或3次)进行给药。具体的给药剂量应根据疾病的症状、患者的体重、年龄、给药方法及剂型而有所不同。

我们研究发现，2-BFI的神经保护作用的有效剂量范围：小鼠慢性给药2-BFI5mg/10mg/20mg/40mg/kg呈剂量-效应关系。以20mg/kg剂量组作用最佳。大鼠急性给药2-BFI：0.5mg/1.5mg/3.0mg/kg呈剂量-效应关系。以1.5mg/kg剂量组作用最佳。

附图说明

图1透射电子显微镜下大脑皮层神经细胞超微结构及线粒体变化比较

图2脊髓实质内CytC阳性细胞数和AIF阳性细胞数变化比较

图3脊髓实质内CytC和AIF阳性细胞荧光面积比较

具体实施方式

下面通过下述实施例用于进一步说明本发明。但本领域技术人员理解，下述实施例不应被理解为对本发明的限制。任何在本发明基础上做出的改进和变化，都在本发明的保护范围之内。

实验例1:2-BFI对神经系统线粒体的保护作用

1.神经系统线粒体受损小鼠模型的制作

C57BL/6小鼠20只，称重。随机选取其中的16只，每只小鼠用0.5％戊巴比妥麻醉之后，使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)和完全弗氏佐剂(CFA)混合而成的抗原乳剂，在尾根部、两侧肋腹部、颈部分四点作皮内注射，共注射0.2ml。免疫后即刻和第48小时分别腹腔注射百日咳毒素(PT 500ng)，制作具有神经系统炎症反应并同时存在神经系统线粒体受损伤的小鼠模型。

2.动物分组与药物干预

将上述16只模型小鼠随机分成2组，生理盐水组(NS组)8只和2-BFI干预组8只。另4只为正常对照组。2-BFI干预组于注射抗原乳剂后当天腹腔注射2-BFI 20mg/kg，2次/d，连续20d。正常对照组和NS组同时腹腔注射等量生理盐水。

3.实验动物行为学评分

免疫当天开始每天两次观察并记录小鼠的体重和神经功能评分的变化，连续观察至小鼠发病达症状高峰期(20d)被处死。神经功能评分标准采用较为敏感的Weaver 15分法，双盲进行评分:(1)尾巴：无异常0分，尾半瘫1分，尾全瘫2分；(2)四肢:无异常0分，步态改变1分，轻瘫2分，全瘫3分；(3)死亡，15分。

4.神经病理学取材与检测：

取三组实验小鼠脑组织，切取大脑皮质约0.2mm×0.2mm×0.2mm新鲜组织,放入戊二醛中固定、超薄切片及染色，制作透射电子显微镜的标本，用于在透射电子显微镜下观察大脑皮层神经元线粒体超微结构的病理变化；取三组实验小鼠脊髓组织迅速放入液氮中，然后再转移到-80℃冰箱冻存，供制作冰冻切片进行免疫荧光染色辅佐激光共聚焦显微镜检测所用。

5.脊髓CytC、AIF和GFAP免疫荧光检测

使用激光共聚焦显微镜检测脊髓实质内表达细胞色素C(CytC)或凋亡诱导因子(AIF)的荧光染色阳性细胞数目，是一项能够客观地反映中枢神经系统中组织细胞早期线粒体损伤的灵敏的生物学指标。具体的步骤为：在冰冻脊髓组织切片上滴加CytC(1:50)，AIF(1:50)的混合一抗，冲洗3次，再滴加TRITC(红光)标记的驴抗兔的二抗(1:100)进行免疫荧光标记,然后在激光共聚焦显微镜下观察，计算脊髓实质内表达CytC、或AIF荧光染色阳性的细胞数目。

星形胶质细胞约占中枢神经组织细胞的80％，其特异性表面标记物是胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。使用GFAP标识免疫荧光染色阳性显示星形胶质细胞，同时进行CytC或AIF免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下，可以清楚显示星形胶质细胞胞浆线粒体受损的程度范围；进一步采用IPP6.0分析软件计算GFAP阳性细胞分别与CytC和AIF的共同染色荧光面积(平均值)，暨CytC-GFAP和AIF-GFAP的共染荧光面积，是选择性测量星形胶质细胞线粒体损伤程度的指标。

6.实验结果：

(1)图1为透射电子显微镜下大脑皮层神经细胞的超微结构(大图X10000倍；右下小图X20000倍)，其中：正常对照组的神经细胞核膜及核仁完整，存在双层膜结构，核内染色质密度均匀；线粒体嵴存在，无肿胀。NS对照组的神经细胞边界不清，核膜固缩，核内染色质聚集；线粒体肿胀。2-BFI干预组的神经细胞核膜双层膜结构存在，线粒体肿胀减轻。2-BFI干预组与NS对照组相比，大脑皮层神经细胞线粒体损伤明显减轻。

(2)图2显示免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下脊髓组织CytC阳性细胞和AIF阳性细胞的数量变化(图中浅灰色光亮点)。CytC和AIF主要位于线粒体间隙中，在正常脊髓组织仅有少许表达(正常对照组)。当炎症反应导致线粒体受损伤时，CytC和AIF由线粒体释放入胞浆，此时在激光共聚焦显微镜下可见大量TRITC(红光)标记的阳性细胞表达(NS对照组)。实验发现：注射抗原乳剂诱发中枢神经系统炎症反应时，NS对照组小鼠脊髓实质内CytC阳性细胞数和AIF阳性细胞数均明显增多，表明小鼠的脊髓实质内线粒体受损伤严重；2-BFI干预组小鼠脊髓实质内CytC和AIF荧光染色阳性细胞数量较NS对照组明显减少，这表明2-BFI能够下调神经系统中CytC和AIF的表达，明显减轻线粒体损伤。

图3显示，NS对照组小鼠脊髓内CytC阳性细胞荧光面积(53.91±8.24μm²)和AIF阳性细胞荧光面积(68.52±7.98μm²)分别明显高于正常对照组小鼠脊髓内CytC阳性细胞荧光面积(27.84±7.38μm²)和AIF阳性细胞荧光面积 (28.65±5.76μm²)，两组间相比有显著性差异(P＜0.01)，表明中枢神经系统线粒体存在严重的损伤。而2-BFI干预组小鼠脊髓内CytC阳性细胞荧光面积(40.30±8.71μm²)和AIF阳性细胞荧光面积(51.15±6.26μm²)分别较NS对照组明显减少(P＜0.01)，表明2-BFI对中枢神经系统的线粒体损伤具有很好的保护作用。

(3)免疫荧光双标激光共聚焦显微镜下检测脊髓组织内GFAP阳性细胞分别与CytC或AIF共染荧光面积，揭示了2-BFI对中枢神经系统中星形胶质细胞线粒体损伤的保护作用(见下表1)：与NS对照组相比，2-BFI干预组脊髓中GFAP标识(星形胶质细胞)分别与CytC和AIF标识的共染荧光面积均明显减小(P＜0.05)，这表明，2-BFI能够下调星形胶质细胞CytC和AIF的表达，有效地减轻星形胶质细胞的线粒体损伤，具有促进神经系统炎症修复的能力。

表1免疫荧光双抗体染色激光共聚焦显微镜下检测GFAP分别与CytC或AIF共染荧光面积的比较分析

注：与NS对照组相比，*P＜0.05**P＜0.01 。

Claims

1.2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉或其药学上可接受的盐在制备用于治疗神经系统线粒体损伤疾病的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述神经系统线粒体损伤疾病为中枢神经系统线粒体损伤疾病。

3.如权利要求2所述的用途，其中，所述中枢神经系统线粒体损伤疾病选自神经系统急性危重症或神经系统慢性退行性疾病，如各种感染性脑膜炎或脑炎(包括细菌性、病毒性、真菌性、寄生虫性和梅毒性脑膜炎或脑炎)、缺氧性脑病、中毒性脑病、急性脑血管病、颅脑外伤、帕金森氏症、阿尔兹海默病、多系统萎缩、遗传性共济失调、运动神经元病或亨廷通舞蹈病。

4.如权利要求1所述的用途，其中，所述中枢神经系统线粒体损伤疾病是线粒体脑肌病。

5.如权利要求1-4任一项所述的用途，其中，药学上可接受的盐包括有机酸盐或无机酸盐，例如(包括但不限于)盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、亚磷酸盐、磷酸二氢盐、氢溴酸盐、硼酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、乳酸盐、油酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、棕榈酸盐、山梨酸盐、水杨酸盐等。优选盐酸盐。

6.如权利要求1-5任一项所述的用途，其中，所述2-BFI及其药学上可接受的盐可以以光学异构体或互变异构体的形式存在。

7.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中，所述药物还包括加入一种或多种赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂和乳化剂等的常规的可药用辅料。

8.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中，所述药物以药物制剂的形式提供。优选的药物剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、贴膜剂。优选地，所述制剂可以是经胃肠道、皮肤、粘膜、腔道或注射途径给药的剂型。

9.根据权利要求8的用途，其特征在于，所述经胃肠道给药的剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸剂、混悬剂、颗粒剂；所述经皮肤给药剂型包括贴剂、软膏剂；所述经粘膜给药剂型包括粘贴片、贴膜剂、舌下片剂；所述经腔道给药剂型包括泡腾片；所述经注射给药剂型包括注射用乳剂、注射用粉针剂、注射用纳米粒、注射用脂质体、注射用水针剂。

10.根据权利要求8或9的用途，其特征在于，所述剂型的辅料包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、乙醇、聚乙二醇、植物油、卵磷脂、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、滑石粉、硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠。