TWI666314B - 利用半連續式培養增加矽藻產量的方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種利用特定培養基與半連續式培養系統增加矽藻產量的方法。藉由本發明之方法，不僅能有效增加矽藻乾重，亦能有效提升褐藻黃素(fucoxanthin)及褐藻醣膠(fucoidan)的產量。

Description

利用半連續式培養增加矽藻產量的方法

本發明係關於一種增加矽藻產量的方法。更特別地，本發明係關於利用特定培養基與半連續式培養系統增加矽藻生長量及褐藻黃素(fucoxanthin)與褐藻醣膠(fucoidan)產量的方法。

矽藻為單細胞藻類，是海洋重要的能源之一，提供海洋初級生產力約40%，碳循環上貢獻約20%，扮演碳、矽、磷等元素循環的重要角色。隨著人口不斷增長，自然資源漸漸供不應求，為了克服資源的不足，已經開始深入研究替代的藥物、食品、高價值分子和能源。其中藻類佔據極大潛力，藻類能透過光合作用將光能轉化為化學能，如葉綠素透過光能把二氧化碳和水轉化為碳水化合物。還有二次代謝產物，如脂質及類胡蘿蔔素，可以在健康食品、化妝品、能源或製藥行業有重要應用。

矽藻由光合作用後產生藻多醣，根據其細胞內分布位置分為結構性多醣、貯存性多醣與分泌性多醣，其中貯存性多醣的主鏈結構為β(1,3)，並有β(1,6)、β(1,2)的分支，由於結構類似於金褐藻的多醣laminarin，因而被稱為chrysolaminarin。分子量依藻種不同而有所差異，約為1-40kDa。

藻類的結構性多醣中有海藻酸(alginate)、幾丁質(chitin)等多醣存在。海藻酸廣泛分布在褐藻的細胞壁中的陰離子多醣，顏色可從白色到黃色，分子量介於32-400kDa。以α-1,4-醣甘鍵連接之線性共聚物，由β-D-mannuronic acid(M)與α-L-guluronic acid(G)組成，單體可能為連續的M或G組成，或是以M及G互相交錯。海藻酸通過與二價陽離子，如Ca²⁺，在pH值高於6時形成凝膠球，可以用於藥物的微膠囊化技術，在低pH 值下，海藻酸會水合形成高黏度的酸性凝膠，可針對使用時的酸鹼性選擇適合形式使用。幾丁質存在於蝦、蟹、昆蟲等甲殼動物的外殼和真菌、酵母及藻類的細胞壁中，分子量約為2000kDa。以β(1,4)醣甘鍵形成無支鏈的螺旋直線結構，由N-acetyl-D-glucosamine組成，主要的功用是保護、抑制病原菌的入侵(J.A.Elias等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology 116(3)：497-500,2005)。

分泌性多醣由矽藻殼縫排出，伴隨著蛋白質、醣蛋白與脂質形成胞外聚合基質(EPS)黏附在矽殼表面。其主要成分以大量的醣醛酸(uronic acids)和硫酸化醣為主，包含有鼠李糖(rhamnose)、岩藻糖(fucose)、半乳糖(galactose)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、木糖(xylose)和少部分的阿拉伯糖(arabinose)，但至今為止還沒有完整結構(B.Gügi等人，Marine drugs 13(9)：5993-6018,2015)。主要功用在於保護矽藻避免迫害、使矽藻群聚生長，並提高水中養分的競爭。

為使於大量培養階段提高矽藻的產量，本發明首先測試將矽藻於不同培養基條件下靜置培養，測試可供矽藻大量、長期培養的培養基，並於擴大規模培養期，選用半連續式光反應器進行大量培養，並分析矽藻產量及總矽藻色素與總多醣產量。

本發明基於以上之目的發現，以5f培養基培養可以增加AQ4的胞內多醣產量，也較適合長期培養，進一步將培養基濃度提升到10f，並啟用半連續式系統，以及額外饋20mL 0.1M Na₂CO₃，週期為三天進行矽藻之生產，乾藻產率可提高到0.20g/L/天，多醣產率可提升至6.64mg/L/天，相較靜置培養的乾藻產率提升了13倍、多醣產率提高了99倍。

於是，本發明之一方面係關於，一種大量培養增加矽藻產量之方法，其特徵在於包含：將經過小量種源培養之矽藻以初始密度為2.0-2.5x10⁴細胞/mL，接種於含有f/2培 養基的10-20倍之高濃度營養成分的培養基之大型攪拌式培養槽，培養基pH值調整為8-9，以3-4天為一週期，取出一部分培養液作為產物，並回補等體積的新鮮培養液與額外Na₂CO₃(作為補充碳源)的方式於光源40-60μmol/m^-2s^-1及12hr：12hr光暗週期，於22-24℃進行半連續式培養達14-20天；及離心收取矽藻及上清液。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之高濃度營養成分的培養基為5f培養基。於本發明之一項具體實施態樣，所述之高濃度營養成分的培養基為10f培養基。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之種源培養包含：將矽藻以f/2培養基於24℃靜置培養約12天；將矽藻靜置沉澱並去除上清液，重複直到藻液濃縮至50-100mL；將濃縮的藻液轉移到含有5f培養基的攪拌式培養瓶(spinner flask)，以較佳通氣量為0.0625vvm、攪拌轉速為90~100rpm進行培養至最終細胞密度約2.x10⁶細胞/mL。

本發明之另一方面，係關於一種藉由本發明之方法培養之矽藻用於製備高產量褐藻黃素的用途。根據本發明之方法培養之矽藻產生的褐藻黃素具有高強度的自由基清除力及毒殺細胞能力。

本發明之另一方面，係關於一種藉由本發明之方法培養之矽藻用於製備高產量褐藻醣膠的用途。根據本發明之方法培養之矽藻產生的褐藻醣膠分子量係約於8200KDa。

圖1為用於本發明實例一之矽藻半連續式培養系統的8L攪拌式培養槽設計圖。

圖2為矽藻萃取物之官能基組成測定圖。

圖3係顯示經DEAE純化後的多醣分層利用分子篩層析法(size-exclusion chromatographic；SEC)進行分子量的檢測結果。

圖4為HPLC針對褐藻黃素之定量分析圖。(A)從乾藻中純化之褐藻黃素，約在3~4分鐘出來，其偵測訊號最大值為1400000μv。(B)褐藻黃素標準品，約在3~4分鐘出來，其偵測訊號最大值為260000μv。(C)標準品和樣品之混合spike。

圖5係顯示LC-MS鑑定分子量結果。(A)經純化過之褐藻黃素經由質譜儀分析後結果。(B)經(Song Xia.2013)等人分析褐藻黃素分子量結果，約在659及681m/z位置有最大訊號，以此佐證圖A所示為褐藻黃素。

圖6係顯示DPPH抗氧化能力測試結果。(A)純化之褐藻黃素。(B)已知具有抗氧化能力之維他命C。

圖7為MTT分析結果圖。(A)24hr MTT分析。(B)48hr MTT分析。其中：Y為收集管1、2之物質，BG為收集管3~15之物質，Fx為收集管25~32之褐藻黃素，M為只接種細胞沒有加藥，0為沒有接種細胞。數值代表施用濃度，皆以μg/500μL為單位。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

實施例一、半連續式系統

本實例係選用垂直式圓柱型光反應器，比起其他兩種反應器，大量化生產較容易，且不佔空間。雖然受光照的面積不及平板式、管道式反應器高，但是不管是溫度還是養份在水中的均勻程度都方便實驗進行調控，受環境影響也較低。圖1為用於本實例進行矽藻半連續式培養系統的8L攪拌式培養槽之設計圖。玻璃槽體為8L圓柱體，中心軸底部帶有扇葉。左邊設置進氣口與出氣口，以兩個sparger進氣至槽體內。右側設置取樣口與饋料口，取樣口以Y字管連接針頭，以針頭將取樣時殘留在管路的液體排出，另一端的取樣口則浸泡在酒精裡。

矽藻培養之光強度的範圍可從1,000lux到10,000lux(約20-200μmol/m^-2s^-1)，照度的強度取決於細胞密度的多寡與培養時培養槽體的透光度而定，例如1,000lux適合用在小型錐形瓶培養，5,000lux以上則使用在更大的體積。過強的光照度會造成光抑制效應，如Amphora屬矽藻之光飽和約為1000μmol/m^-2s^-1，超過此限度會抑制固碳速率(D.W.Gerber,J.E.Burris,Plant Physiology 68(3)699-702,1981)。

在矽藻培養過程中pH值變化範圍控制於pH 7-9，過高的pH值會造成矽殼溶解，過低的pH值也會抑制矽藻生長。藻類最佳培養範圍為8.1-8.5，通常培養矽藻時會進行通氣，以適量的CO₂進行pH值調控在適當範圍內。

常見的藻類容忍溫度的範圍為16-27℃，低於16℃會造成生長緩慢，而高於35℃可能造成部分藻種死亡。矽藻之最適當培養溫度約為22-24℃，常以空調或是在表面通過冷水來恆溫。

培養液配方

f/2培養基為以之常用於藻類培養之培養基，其配方列於下表一(參照Guillard,1975)。配製3.5%海水，每1L加入表一所列之儲存液A、儲存液B、儲存液D各1mL，經過滅菌後存放，在使用前每1L加入1mL儲存液C。5f培養基之製備係於每1L之3.5%海水加入各10mL的儲存液A、B、C及D。10f培養基之製備係於每1L之3.5%海水加入各20mL的儲存液A、B、C及D。

於進入大量半連續式培養之前，可預先將矽藻進行種逐步源培養。首先矽藻以f/2培養基於24℃靜置培養約12天。接著將矽藻靜置沉澱並去除上清液，重複直到藻液濃縮至50-100mL。再將濃縮的藻液轉移到含有5f培養基的攪拌式培養瓶(spinner flask)，以通氣量為0.0625vvm、攪拌轉速為90~100rpm進行培養，至最終細胞密度約2.x10⁶細胞/mL。

本實例為測試半連續培養的較佳條件，遂將半連續培養過程分為4個部分(sets)，set 1：Day 106-Day 139，3天收集2L；set 2：Day 140-Day 157，3天收集3L；set 3：Day 158-Day 190，3天收集1L；set 4：Day 191-Day 202，3天收集1L並同時饋入20mL 0.1M Na₂CO₃。

實施例二、產量分析

矽藻產量

冷凍乾燥後的乾重(g)÷收取藻液體積(L)即為乾藻產量(g/L)。乾藻產率(g/L/Day)為乾藻產量(g/L)÷培養天數(Day)。

多醣萃取及分析

多醣萃取方法係參考T.J.Yoon等人(International immunopharmacology 8(1)：36-42,2008)，取0.1g乾藻粉浸泡於40mL DDH₂O中一小時，於3500rpm離心10分鐘。上清液加入200mL 95%乙醇，並置於-20℃下12小時進行酒精沉澱，之後以12,000rpm離心10分鐘收集沉澱物，獲得貼附性多醣(C)。將沉澱物加入20mL 95%乙醇，清洗色素，離心3500rpm、10分鐘，此步驟重複2-3次，直到上清液澄清。接著以2mL DDH₂O清洗沉澱物，於3500rpm離心10分鐘，此步驟重複2次。加入50mL 0.05M H₂SO₄並加熱至60-70℃，2小時，接著於3500rpm離心10分鐘。上清液加入200mL 95%乙醇，並置於-20℃下12小時進行酒精沉澱，離心12,000rpm、10分鐘收集沉澱物，而獲得胞內多醣(D)。剩下的矽藻沉澱物加入1mL DDH₂O回沖，測量回沖物中是否有殘留的多醣，確保萃取效果。

首先分析矽藻在不同培養基下的平均比生長速率、及乾藻產量。結果如表二所示。

由上表所列之結果顯示，於14天後計算兩者平均比生長速率，5f培養基組為0.2703Day-1，比f/2培養基組約高1.2倍。5f培養基組之矽藻乾藻產量為0.2095g/L，高出f/2培養基組約2倍。5f培養基組培養的多醣產量為4.4704mg/g，比f/2培養基組培養高出約2倍。5f培養基組之總醣產率為0.0669mg/L/Day，比f/2培養基組高約3倍。在5f與f/2培養基組，矽藻之初期比生長速率相似，但是培養14天的平均比生長速率，以5f培養基組卻能比f/2培養基組高，原因在於第5天之後，以f/2培養基培養之矽藻呈現不再生長，而以5f培養基培養之矽藻能持續生長至第11 天，表示長時間的培養以高濃度的培養基為佳，而且不論是細胞密度還是乾藻重都是以5f培養基組較高，矽藻的多醣產量也以5f培養基組較多。

由半連續式培養set 1-4之分析結果顯示，未加入碳源(Na2CO3)的set 1-3，單位萃取總多醣相差不大，所以多醣產量取決於乾藻產量的多寡。Set 2每一批次總收取乾藻較高，因此每一批次所獲得的多醣也較多，但是依照產率來看，set 1單位藻液的產量最多，所以產率較高。而於set 4中，由於持續添加碳源，不論是乾藻產量還是多醣產量皆有大幅度增加的現象，相較於set 3其乾藻產量多出了1.5倍，多醣產量多出了1.8倍(表三)。

實施例三、褐藻醣膠(Fucoidan)之萃取及定量分析分法

本實驗使用DEAE陰離子膠體交換層析法，將胞內可溶性碳水化合物(多醣的混合物)進一步分離純化，以區分不帶離子多醣(中性醣)及帶陰離子多醣(酸性醣)。陰離子膠體離子交換層析法(DEAE anion exchange chromatography)係利用交換介質帶有正電的特性，吸附樣品內帶負電之物質，而將不帶電及帶正電的 物質流出，之後利用與交換介質結合力更強的高鹽離子溶液，將負電物質沖提出。將胞內可溶性碳水化合物加入DEAE-Sephacel管柱，起初收集到的液體即是FT(Flow through)，再用不同梯度(0.1M、0.5M、1M、2M)的NaCl進行沖提，收集單位10ml/tube，沖提體積為3倍管柱體積(3CV=3Column volume)。後續以phenol-sulfuric acid method檢測收集管內容物的含醣量，並以不同梯度的NaCl代替水作背景值找出經DEAE-saphacel管柱純化所得胞內可溶性碳水化合物集中於哪一NaCl梯度。X軸：不同的沖提體積；Y軸：波長490nm下之吸光值。

純化後的多醣分層，經由phenol-sulfuric acid method測定，將含醣收集管集中。將樣品倒入10k濃縮管後，每次離心3500rpm/10min(Swinging-Bucket Rotor)，直到上層液體體積小於1mL，再加入10mL去離子水離心3500rpm/10min(Swinging-Bucket Rotor)，重複三次，之後將上層液移到新的微量離心管並補水至體積1mL。將純化及透析過後的多醣分層置於15mL離心管，以封口膜封住瓶口並用針頭搓出數個小洞，利用液態氮進行預冷凍，最後置於冷凍乾燥機使其乾燥，以方便樣品的存放和後續化學結構鑑定。

利用干涉光譜做傅利轉換(FT(t))得到有機光譜。以紅外線當作工作光源，光源通過樣品時，分子會產生振動，若振動頻率與紅外光頻率相同，使入射紅外光的某特定頻率將會被吸收，再經由干涉器得到吸收強度對時間作圖的干涉波譜(interferogram)，透過傅立葉轉換的數學處理，將干涉波譜轉換成對頻率作圖的頻率範圍光譜。不同官能基的振動頻率不同，造成不同頻率位置的紅外光被吸收，使光譜塗上出現不同的波峰，進而可分析不同物質的結構。取1mg的固態多醣及適量的溴化鉀(KBr)粉末，以1：40的比例混合打壓成錠片，測量範圍400-4000cm-1，解析度為4cm^-1，共掃描十六次。

圖2之FTIR系統測定結果顯示，1M多醣分層具有： OH-特徵峰3500-3000cm^-1、C-H特徵峰2940-2920cm^-1、C=O特徵峰1650-1600cm^-1、COO-特徵峰1419cm^-1、褐藻醣膠(Fucoidan)帶有S=O之特徵峰1260cm^-1、C-O-C特徵峰1040-1050cm^-1以及昆布多醣(Laminarin)帶有β 1,3鍵結之特徵峰。因此，純化所得之1M多醣分層含有褐藻醣膠。

而由標準品昆布多醣(laminarin)和1M多醣分層之分子篩層析結果圖(圖3)可得知，樣品於第12mL第24分鐘收到Laminarin；於第10mL第20分鐘收到1M fraction。所以，經本發明方法培養之矽藻所純化得到之褐藻醣膠的分子量大於市售之Laminarin的分子量，其分子量約為8200KDa。

實施例四、褐藻黃素(fucoxanthin)之萃取及定量分析

色素萃取及濃縮：將經由實施例一所述方法培養、收取之矽藻冷凍乾燥成粉末備用。將冷凍乾燥的矽藻粉先用去離子水洗去貼覆性多醣及鹽類，以避免影響後續萃取色素有干擾。將經去離子水洗過的矽藻粉以1g/40ml乙醇裝在離心瓶中，在40℃下放置於超音波震器內，萃取1小時。之後經由離心機離心後倒出上清液(萃取液)，條件為轉速3500rpm、10分鐘殘餘物再用100ml乙醇潤洗之後離心收集上清液，將上清液收集一起，此動作重複3次以減少殘留在殘餘物中的色素，萃取步驟全程需避光，以免色素被光解。將全部上清液移至原底燒瓶，利用迴旋減壓濃縮機濃縮，由於溶劑使用的為乙醇，濃縮機一開始壓力設定在180mbar、溫度為40℃，避免有突沸的情形發生，隨著溶劑體積減少將壓力降至約70mbar，濃縮約2小時，之後將壓力降至1~5mbar，濃縮約30分鐘，將其濃縮至無溶劑無水氣的乾粉。

管柱層析術分析：本實例採用正相矽膠填充至4x40公分玻璃管柱，純化經濃縮過的粗萃物。流動相溶劑使用的是正相薄層層析(TLC)分析後的流動相組合，即正己烷-丙酮(3：2)混合溶液。矽膠填充管柱高度為20cm，流動相為正己烷：丙酮(3：2)混合溶液。將粗萃物以流動相溶液以10~15毫升回溶，載入管柱上層緩衝層中，接著設定幫浦數值為450rpm進行沖提。將在層析過程中 分別收集沖提出來的溶液，每15ml收集一管，所收集得到的分層溶液經由TLC分析乾淨程度，再以旋轉濃縮機抽乾濃縮，再取定量乾物配置成適當濃度進行HPLC褐藻黃素濃度與含量分析。

褐藻黃素純度及含量分析：先將經過管柱層析後的色素進行TLC分析，。根據顏色及流出時間進行正相薄層層析(TLC Silica gel 60 F254,4x8cm)點片分析，並在每片TLC點上標準品以鑑定褐藻黃素，並檢視所得之純化結果是否已分離達到純化效果，但由於色素易被光解，標準品的位置可以參考不同片的標準品點。由結果可以看到，1、2點為黃色的未鑑定類胡蘿蔔素，3~21為藍綠色的未鑑定色素，21~24為不純的褐藻黃素，25~32為純化較乾淨的褐藻黃素，之後將25~32的收集管進行濃縮，以利後續實驗。25~32管中色素濃縮後乾重約為45mg(圖4)。

將經由TLC分析之色素抽乾後完全溶解在甲醇中製備樣品。以高效能液相層析儀(HPLC)定量樣品中褐藻黃素含量。分析管柱為(Mightysil,RP-18 GP 250-4.6,5μm)，偵測器為PDA檢測器進行分析，標準品配置為5μg/20μL，樣品配置為36μg/20μL，流動相為去離子水和95%乙醇(1：1)，第0分鐘到第15分鐘皆以相同之流動相組成沖提樣品溶液(Isocratic)，流速為1ml/min，管柱溫度控制在303K。流過管柱後再經紫外光偵測器進行分析。偵測器主要吸收波長設定於445nm。偵測時間設定為15分鐘。分別進樣為標準品、樣品、標準品和樣品之混和spike，結果可以看見經管柱層析後之褐藻黃素樣品純度高達90%以上，其訊號強度為標準品的5.38倍。

通過LC-MS分析純化的褐藻黃素。基於分別對應於[M+H]+和[M+Na]+的m/z 659.8和681.9的片段模式，鑑定了褐藻黃素分子量及其對應的分子質譜，顯示紫外-可見光譜(445nm處的λ max)的純化的褐藻黃素與褐藻黃素標準物，證實了色素的分子鑑定(圖5)。

將來自Prep-HPLC的純化的褐藻黃素(10mg)溶於1mL的CD₃OD中，並用於NMR光譜。將1H和13C NMR信號用具有碳增強冷探針(1H，400MHz，13C，126MHz)的Varian Inova 400MHz NMR系統(Vernon Hills，IL，USA)記錄。化學位移係以δ(ppm)表示，參照CD 3的溶劑峰δ H3.31和δ C49.2。結果與文獻記載95%褐藻黃素標準品的分析結果相符。

實施例五、褐藻黃素(fucoxanthin)之抗氧化及細胞毒殺能力分析

抗氧化能力測試

將2mL甲醇褐藻黃素溶液(0.02-0.2mg mL-1)與2mL 0.16mM DPPH的甲醇溶液混合。將混合物劇烈振搖並在黑暗中在室溫下反應30分鐘。在517nm處測量吸光度。將抗壞血酸作為陽性對照。自由基清除能力計算如下：DPPH自由基清除活性(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100，其中A0是DPPH試劑加上樣品溶劑所偵測的吸光值(使用甲醇代替褐藻黃素)，A1為DPPH試劑加上褐藻黃素的吸光值，A2是甲醇褐藻黃素溶液為一背景值(使用甲醇代替DPPH)的吸光度。可以看到褐藻黃素在低濃度就具有高強度的自由基清除力，與維他命C相比非常接近(圖6)。

巨噬細胞之MTT細胞毒性測試

分別將純化後色素進行四大類，進行對細胞的毒性測試：Y(Yellow層)為收集管1、2之物質，BG(Blue-Green層)為收集管3~15之物質，Fx(Fucoxanthin)為收集管25~32之褐藻黃素、M為只接種細胞而無任何藥物處理、0為沒有接種細胞。濃度如圖所示，單位皆為μg/500μL。分別以24小時及48小時做藥物對細胞之時間依賴性。

取足夠細胞密度的巨噬細胞(Macrophage RAW264.7)(P17)取100μl細胞懸浮液(總細胞數=1×105cell)接種到96-well內，於37℃、5% CO2培養3小時使細胞貼附。之後，移除培養基，再加入100μL不同濃度的樣品(EtOH佔培養基的五百分之一，樣品體積為2μL)和不同濃度之前述不同層的色 素(Yellow、Blue-Green、Fucoxanthin)，於37℃、5% CO₂培養24hr及48hr。於每個well加入10μL MTT(5mg/ml in PBS)，培養4hr。之後移除上清液，加入100μL DMSO溫和震盪30min，以溶解細胞膜釋放出formazan。於ELISA reader上測量550nm吸光值，因為formazan結晶的生成量與活細胞數目成正比(死細胞中的琥珀酸脫氫酶會消失，但不能將MTT還原)，故測得之吸光值越高代表活細胞數越多。

從圖7之結果得知，Y色素層及BG色素層對細胞並無明顯的傷害，而褐藻黃素在濃度為4μg/100μL，即具致死一半細胞之能力。由此得知，本發明製造及純化得之褐藻黃素，確實具有開發成殺死癌細胞藥物之潛力。

由前述實施例所提供之實驗結果顯示，本發明利用高營養成分培養基(f5或f10)及半連續性培養程序，可有效增加大量、長期培養矽藻的乾藻產量，且可提升矽藻色素(如褐藻黃素(fucoxanthin)及矽藻多醣(如褐藻糖膠fucoidan)的產量。

Claims (4)

1. 一種用於大量培養增加矽藻產量之方法，其特徵在於包含：將經過小量種源培養之矽藻以初始密度為2.0-2.5x10⁴細胞/mL，接種於含有f/2培養基的10-20倍之高濃度營養成分的培養基之大型攪拌式培養槽，培養基pH值調整為8-9，以3-4天為一週期，取出一部分培養液作為產物，並回補等體積的新鮮培養液與額外Na₂CO₃(作為補充碳源)的方式於光源1,000-10,000lux及12hr：12hr光暗週期，於22-24℃進行半連續式培養達14-20天；及離心收取矽藻及培養物上清液。
2. 如請求項1所述之方法，其中該高濃度營養成分的培養基為5f培養基。
3. 如請求項1項所述之方法，其中該高濃度營養成分的培養基為10f培養基。
4. 如請求項1項所述之方法，其中該種源培養包含：將矽藻以f/2培養基於24℃靜置培養約12天；將矽藻靜置沉澱並去除上清液，重複直到藻液濃縮至50-100mL；將濃縮的藻液轉移到含有5f培養基的攪拌式培養瓶(spinner flask)，以攪拌轉速為90~100rpm進行通氣培養至最終細胞密度約2.x10⁶細胞/mL。