CN103230411B - 褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种褐藻多糖硫酸酯的药物新用途。该用途是其在制备下述产品中的应用：1)预防和/或治疗糖尿病心肌病的产品；2)抑制糖尿病心肌氧化应激的产品；3)抑制糖尿病心肌中PKCβ的表达和激活的产品；4)减轻糖尿病患者的心肌间质纤维化的产品。上述褐藻多糖硫酸酯优选LMWF，其重均分子量为3-30KD。药效学实验表明，LMWF能通过增强心肌收缩功能和减轻心脏纤维化来对糖尿病心肌病病情的发展产生有利的影响。更重要的是，LMWF能通过调节抗氧化酶的活性有效抑制氧化应激，还能有效抑制蛋白激酶Cβ亚型(PKCβ)的表达。由于LMWF来源于天然存在的海带之中，其易得性与安全性均有利于其作为一种潜在的临床治疗药物，预防糖尿病心肌病。

Description

褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的应用。

背景技术

糖尿病心肌病所引起的心脏功能障碍与冠状动脉粥样硬化或高血压的发病无关。通过测量超声心动图检测的早发舒张功能障碍和迟发收缩功能障碍是两个突出的心脏机械性损伤。心脏功能的障碍主要表现为收缩舒张速度的减少和心肌收缩性和顺应性的下降。尽管糖尿病心肌病的的发病机制很多，但许多机制相关的研究都提示其与心脏能量代谢的改变[An，D.and B.Rodrigues，Role of changes in cardiac metabolism indevelopment of diabetic cardiomyopathy.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006.291(4)：p.H1489-506.]、钙平衡受损和钙释放通道的故障[Turan，B.and G.Vassort，Ryanodinereceptor：a new therapeutic target to control diabetic cardiomyopathy.Antioxid RedoxSignal，2011.15(7)：p.1847-61.]以及活性氧(ROS)积累[Giacco，F.and M.Brownlee，Oxidative stress and diabetic complications.Circ Res，2010.107(9)：p.1058-70.]等有关。其中，氧化应激被认为是糖尿病心肌病起始和发展过程中的重要因素[Aksakal，E.，et al.，The role of oxidative stress in diabetic cardiomyopathy：an experimental study.Eur RevMed Pharmacol Sci，2011.15(11)：p.1241-6.]。

长期的高血糖通过生成过量的ROS来产生有害作用。ROS由一系列的包括自由基在内的高活性氧分子(超氧化物)和能产生自由基的化合物(如过氧化氢)组成。氧化应激产生于ROS的生成大于消除时，而消除ROS的抗氧化防御系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、血红素加氧酶-1(HO-1)和硫氧还蛋白(Trx)[Halliwell，B.，Biochemistry of oxidative stress.Biochem Soc Trans，2007.35(Pt 5)：p.1147-50.]等。研究表明，糖尿病的高血糖和高血脂会引发ROS生成增多和抗氧化防御降低，反过来会引起下游信号通路的激活导致糖尿病并发症的发生[Davi，G.，A.Falco，and C.Patrono，Lipid peroxidation in diabetes mellitus.Antioxid Redox Signal，2005.7(1-2)：p.256-68.]。糖尿病心肌病表现为氧化应激和ROS的高表达，从而通过对细胞分子(如DNA、蛋白质)的直接氧化损伤、扰乱钙平衡和增加心肌细胞凋亡等来引起心脏功能障碍。近年来，越来越多的证据显示PKCβ表达和活性的异常与糖尿病并发症相关[Koya，D.and G.L.King，Protein kinase C activation and the development of diabeticcomplications.Diabetes，1998.47(6)：p.859-66.]。PKCβ通过增加氧化应激在糖尿病心肌病中发挥重要作用，抑制其活性能提高糖尿病大鼠心脏功能[Nagareddy，P.R.，et al.，Selective inhibition of protein kinase C beta(2)attenuates inducible nitric oxidesynthase-mediated cardiovascular abnormalities in streptozotocin-induced diabetic rats.Diabetes，2009.58(10)：p.2355-64.]。

越来越多的抗氧化剂应用于改善糖尿病心肌病的结构和功能，如金属硫蛋白、维生素E、普罗布考、他汀类药物和血管紧张素转化酶抑制剂等。最近，SOD/CAT的类似物和高表达Trx-1因其在动物模型中的有效作用而受到越来越多的关注[Salvemini，D.，et al.，A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase with therapeutic activity in rats.Science，1999.286(5438)：p.304-6.]。尽管针对减少ROS和增加抗氧化物质活性的药理学抗氧剂对糖尿病心肌病已表现出较好的治疗效果，但由于临床试验不充分以及其副作用，将药理学抗氧化剂应用于糖尿病患者仍有争议。因此，具备潜在抗氧化作用的低毒天然产物成为了药物开发的热点。

褐藻多糖硫酸酯(fucoidan)是从褐藻中分离得到的一类富含岩藻糖的天然硫酸多糖，其生物活性的强弱与来源种属、分子量、组成和结构等相关[Fitton，J.H.，Therapiesfrom fucoidan；multifunctional marine polymers.Mar Drugs，2011.9(10)：p.1731-60.]。从海带中提取出的低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)具有抗氧化、抗炎、抗凝血等作用。褐藻多糖硫酸酯及其片段来源广泛，其多种生物活性和天然产物的口服无毒性，使其在治疗骨性关节炎、肝纤维化、肾脏疾病及辐射损伤的保护等方面成为有希望的治疗药物。近期研究发现，LMWF能保护肾脏的缺血再关注损伤[Chen，J.，et al.，LowMolecular Weight Fucoidan against Renal Ischemia-Reperfusion Injury via Inhibition of theMAPK Signaling Pathway.PLoS One，2013.8(2)：p.e56224.]，而LMWF对糖尿病心肌病是否有保护作用并未研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种褐藻多糖硫酸酯的新用途。

本发明所提供的褐藻多糖硫酸酯的新用途是其在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病的产品中的应用。所述产品包括药物和保健品。

更进一步的，本发明还提供了褐藻多糖硫酸酯在制备抑制糖尿病心肌氧化应激的产品中的应用；在制备抑制糖尿病心肌中PKCβ的表达和激活的产品中的应用；以及在制备减轻糖尿病心肌间质纤维化的产品中的应用。

所述褐藻多糖硫酸酯是从任何一种或多种褐藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯，例如，可以来源于海带(Laminaria japonica)(包括人工养殖的海带)，也可以来源于其他褐藻，例如马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻或墨角藻等的一种或多种。作为一种优选方案，优选来源于海带中的褐藻多糖硫酸酯，其中岩藻糖含量为31％，硫酸基含量为32％，重均分子量为180KD。

为了达到更好的治疗效果，所述褐藻多糖硫酸酯的重均分子量为3-30KD(低分子量)，优选为6-8KD，尤其优选为7KD。所述褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量为25-35％，硫酸基含量为25-35％。

所述褐藻多糖硫酸酯的主要成分是L-褐藻糖-4-硫酸酯，还含有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸、蛋白质、K、Na、Ca、Mg等金属离子，它的结构特征是1，2-联结的聚α-L吡喃褐藻糖，而硫酸酯主要是在C-4位的羟基上。所以不论是何种褐藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯，其主要成分相同，基本结构相同，都具有相同的药理功效。

从褐藻中提取褐藻多糖硫酸酯的方法为本领域的现有技术。作为一种优选方法可参考本发明实施例从海带中提取褐藻多糖硫酸酯的方法进行制备。本发明中所用的低分子量褐藻多糖硫酸酯是通过将褐藻多糖硫酸酯降解得到的。具体降解方法可参考专利ZL200410083685.7的方法。

以褐藻多糖硫酸酯为有效成分制备的预防和/或治疗糖尿病心肌病的药物，也属于本发明的保护范围。

所述预防和/或治疗糖尿病心肌病的药物可通过口服、注射、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

以褐藻多糖硫酸酯为有效成分的药物，需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。所述药物的给药方式可以是但不局限于口服、静注、肌注等方式，其剂型可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

药效学实验表明，低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)能通过增强心肌收缩功能和减轻心脏纤维化来对糖尿病心肌病病情的发展产生有利的影响。更重要的是，LMWF能通过调节抗氧化酶的活性有效抑制氧化应激，还能有效抑制蛋白激酶Cβ亚型(PKCβ)的表达，进一步说明PKCβ亚型在LMWF介导的抑制糖尿病心肌的氧化应激中发挥着重要的作用。由于低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量较小，口服可吸收，副作用少等优点，对防治糖尿病心肌病具有潜在的应用意义。

附图说明

图1为低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)对GK糖尿病大鼠离体心脏收缩力的影响；A为左心室压(LVP)峰值的结果；B为左室发展压(LVDP)在基础水平和用异丙肾上腺素(ISO，10-5M)刺激的结果；C和D分别为心肌收缩舒张最大压力变化率(±dp/dt)在基础水平和ISO刺激后的结果。每组例数N＝5-7，^*p＜0.05和^**p＜0.01，代表与正常对照组的统计学差异；#p＜0.05，代表与糖尿病组的统计学差异。

图2为LMWF减轻GK糖尿病大鼠的心肌病理改变。结果展示每组心肌组织切片，并选取有代表性部位放大，A为HE染色。B为天狼星红染色，(例数N＝3，标尺100μm)。I代表正常对照组，II代表糖尿病组，，III和IV分别代表用50mg/kg和100mg/kg的LMWF治疗组(F50和F100)。B中黑线框为天狼星红染色切片上高分辨率放大部分。心肌间纤维被染成红色。^*p＜0.05代表与正常对照组的统计学差异；#p＜0.05代表与糖尿病组的统计学差异。

图3为LMWF减少GK糖尿病大鼠的氧化应激。A 50和100mg/kg LMWF治疗组的糖尿病大鼠心肌组织中MDA含量显著减少；B 50和100mg/kg LMWF治疗组的糖尿病大鼠心肌组织中SOD活性显著增强；C 100mg/kg LMWF治疗组的糖尿病大鼠心肌组织中CAT活性未见显著改变。^*p＜0.05代表与正常对照组的统计学差异；#p＜0.05代表与糖尿病组的统计学差异。每组例数N＝8-10。D用Western bloting检测每组心肌中PKCβ1、PKCβ2和PKCα三种亚型的表达情况。GAPDH作为内参，排除因上样带来的误差。统计学分析后，数据用平均数±标准误表示。^*p＜0.05代表与正常对照组的统计学差异；#p＜0.05代表与糖尿病组的统计学差异。每组例数N＝9。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的褐藻多糖硫酸酯为低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMWF)，其按照下述方法制备得到：

1)提取褐藻多糖硫酸酯：

取海带粉碎后添加蒸馏水，沸水提取，提取液以硅藻土助滤过滤，滤液先以自来水流水透析一天，然后以蒸馏水透析一天，将透析液浓缩，向浓缩液中加乙醇至终浓度为75％沉淀，干燥沉淀，得粗褐藻多糖硫酸酯。将粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl₂存在下20％乙醇沉淀除去水溶性褐藻胶，滤液透析、浓缩后75％乙醇沉淀，干燥后即得纯化的褐藻多糖硫酸酯。经分析，海带褐藻多糖硫酸酯主要由岩藻糖、半乳糖组成的硫酸多糖，其中岩藻糖含量为31％，硫酸基含量为32％，重均分子量180KD。

2)制备低分子量褐藻多糖硫酸酯：

取上述海带褐藻多糖硫酸酯50g配成质量浓度为1.5％的水溶液，在该溶液中加入终浓度为30mM的抗坏血酸和终浓度为30mM的过氧化氢，常温反应2小时。将该反应液用截留分子量为3600Da的透析袋依次在自来水和蒸馏水透析，之后浓缩，冻干，得到低分子量褐藻多糖硫酸酯样品。对其进行化学分析结果表明岩藻糖含量为30％，测定方法参照下述文献：(K.A.G.Michel Dubois，J.K.Hamilton，P.A.Rebers，FredSmith，Colorimetric method for determination of sugars and related substances，AnalyticalChemistry28(1956)350-357)，硫酸基含量为31％，测定方法参照下述文献：(Y.Kawai，N.Seno，K.Anno，A modified method for chondrosulfatase assay，Analytical Biochemistry32(1969)314-321.)。

3)分子量测定

分析条件：Shiamdzu LC-20AT HPLC，TSK G3000PWxl色谱柱，流动相2.84％Na₂SO4溶液，流速1ml/min，检测器：示差检测器RID 10A。结果：Mn：5765(number-average，数均)；Mw：7102(weight-average，重均)，Mw/Mn：1.23。重均分子量为3-30KD范围内的其它低分子量褐藻多糖硫酸酯，可通过调节上述步骤2)降解反应体系中抗坏血酸和过氧化氢的摩尔比获得。

实施例1、

材料与方法

1.实验动物的分组与给药

实验选取Goto-Kakizaki(GK)大鼠作为2型糖尿病动物模型。GK鼠具有的病理学特点与人类2型糖尿病非常相似，如空腹血糖轻度增高，进食后血糖升高，具有稳定的葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损与葡萄糖不耐受特点，基础血压升高，晚期出现糖尿病并发症[33.Falcao-Pires，I.and A.F.Leite-Moreira，Diabetic cardiomyopathy：understanding the molecular and cellular basis to progress in diagnosis and treatment.HeartFail Rev，2012.17(3)：p.325-44.]。12周龄雄性GK大鼠和年龄性别匹配的Wistar大鼠购买后，在实验动物部适应性饲养一周后，随机分组。实验分为正常对照组(Con，Wistar大鼠)；糖尿病组(DM，GK大鼠)，药物治疗组(DM+F50、DM+F100、DM+F200，GK大鼠分别通过灌胃给予50、100、200mg/kg/Day剂量的LMWF药物)5个组别。其中DM+F200组，到饲养结束时例数少，前期实验表明其效果不好，故没有做进一步实验。

2、糖尿病心肌病指标检测

血糖检测：大鼠血糖测定方法：在大鼠末麻醉状态下，采用尾尖取血，取血前挤搓鼠尾末端数次，用沾有75％乙醇的棉球对尾尖和手术机械进行擦拭消毒，手术剪迅速在剪破尾尖部，挤血1滴，用Roche血糖仪进行全血血糖检测。

超声心动测定：先将大鼠以3％异氟烷进行诱导麻醉后，胸部脱毛，平卧放置在加热板上，采用Vevo770超声仪(Visualsonics公司)，30MHz探头测胸骨旁左室短轴切面，降低麻醉剂量至1％～1.5％进行持续麻醉，待心律稳定后，于短轴面乳头肌水平，记录左心室前后壁运动曲线。分析测量连续三个心动周期参数，计算平均值，记录：舒张末期左室前壁厚度(LVAWd)、舒张末期左室后壁厚度(LVPWd)、舒张末期左室内径(LVIDd)、收缩末期左室前壁厚度(LVAWs)、收缩末期左室后壁厚度(LVPWs)、收缩末期左室内径(LVIDs)、舒张末左室容积(LV Vol；d)，收缩末左室容积(LV Vol；s)，后根据测量值用分析软件计算心输出量(CO)，射血分数(％EF)，左室短轴缩短率(％FS)。

3、Langendorff灌流与心脏功能记录

大鼠腹腔注射10％的水合氯醛(300mg/kg)麻醉，然后迅速剪开胸腔，分离取下心脏，经主动脉将心脏悬挂于Langendorff灌流装置(Radnoti公司)上，用预先通入95％O₂+5％CO₂的混合气的37℃恒温Krebs-Henseleit缓冲液(mM：NaCl 118，KCl 4.7，CaCl₂2.0，MgSO₄ 1.2，KH₂PO₄ 1.2，EDTA 0.5，NaHCO₃ 25，葡萄糖11，pH 7.4)恒压灌流。在左心耳下方剪开小口，插入与传感器相连的球囊，用Powerlab软件测定左心室压力。球囊与微量注射器相连，其体积根据实验起始时左心室舒张末压(LVEDP)为5-10mmHg来调整。左室收缩压(LVP)的峰值，左室发展压(LVDP)和最大压力变化率(±dp/dt)都通过Powerlab软件(ADInstruments，NSW，Australia)分析和计算得到。

4、HE染色和胶原染色

HE染色：取4％甲醛液固定的心室组织，按常规石蜡切片过程进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，7μm厚度切片。石蜡切片用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、HARRIS苏木精染色、0.5％盐酸分色、0.5％-1％氨水快速蓝化、0.5％伊红水溶液染色、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，37℃，24h烘片。显微镜下观察，细胞核被苏木精(带阳离子，呈碱性)染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红(带阴离子，呈酸性)染成粉红色。每组选3只大鼠左心室做石蜡切片。

胶原染色：4％甲醛液固定心室组织，同样按常规石蜡切片处理，切片厚度4～6μm，脱蜡至水后，入天青石蓝液5～10min，蒸馏水冲洗3次，天狼星红(Polyscience，Inc，Warrington，PA)饱和苦味酸液15～30min，直接用无水乙醇分化与脱水，二甲苯透明、光学树胶封固。显微镜(Leica DM 4000B，Wetzlar，GER)下观察，胶原纤维呈红色，其他成分呈黄色。心肌纤维化的程度由纤维化染色阳性的区域与整个心肌区的比值得到。每组选3只大鼠左心室做石蜡切片。

5、Western blotting

取将液氮速冻后冻于-80℃的左心室组织，用研钵研磨碾碎成粉末后，用RIPAbuffer[20mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1％Triton X-100，1mM Na3VO4，1mg/mL aprotinin，leupeptin and pepstatin，1mM Phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)]裂解。4℃，12000rpm离心15min，将上清转移到新的预冷EP管中，弃去沉淀。采用BCA试剂盒，对蛋白溶液进行定量。将定好量的蛋白裂解液与上样缓冲液混合后100℃加热5分钟，然后用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并用湿转法转移到PVDF膜上，然后将膜在含5％奶粉的TBS缓冲液中室温封闭1h。用anti-PKCα，anti-PKCβ(购自泰科兰博(北京)生物技术有限公司，货号sc-208、sc-210)(1∶1000稀释)的多克隆抗体对膜进行孵育，4℃过夜。用TBST缓冲液(含0.01％Tween20的TBS)洗膜3次，每次10min，然后用1∶2000稀释的二抗室温孵育1h，用TBS缓冲液洗膜3次，每次10min。向膜滴上发光液(PIECE)并进行曝光拍片。条带强度用Quantity one软件进行定量分析。

6、氧化还原酶活性和丙二醛水平的检测

将心脏组织称重后在pH＝7.4的0.9％的生理盐水(1∶10，w/v)中匀浆。心脏组织中MDA水平和SOD及CAT的活性用紫外-可见分光光度计(UV-2550，Shimadzu，Japan)测定。具体操作方法与结果计算方法参看南京建成科技有限公司试剂盒说明书(A003-1、A001-1和A007)。

7、统计学方法

采用SPSS统计软件对所得数据进行处理。数据均以均数±标准差(X±SD)表示，两组数据进行独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

实验结果

1、糖尿病大鼠心脏功能障碍的鉴定

GK大鼠为自发非肥胖型II型糖尿病自交系模型，整个实验过程中，根据血糖＞16.6mM来确定糖尿病的发病。如表1中的超声心动参数所示，7个月大的GK大鼠表现出明显的心脏功能障碍，特别体现在大幅度受损的心输出量(CO)、射血分数(EF)以及左心室短轴缩短率(FS)增加。用100mg/kg/Day剂量的LMWF灌胃三个月后，心脏功能障碍显著缓解，说明LMWF对在体心脏功能有保护作用。但是，LMWF对糖尿病大鼠的血糖几乎没有影响，如数据所示，正常对照和糖尿病组的血糖水平分别是6.5±0.4mM和16.2±3.9，而LMWF对血糖水平没有显著的影响，分别是18.2±4.2mM(F50)和17.7±4.5mM(F100)。这说明LMWF通过其他机制提高了心脏的收缩力而不是通过调节血糖。

表1.各组大鼠超声心动的参数

LVAW；d舒张末期左室前壁厚度、LVPW；d舒张末期左室后壁厚度、

LVAW；s收缩末期左室前壁厚度、LVPW；s收缩末期左室后壁厚度、

LVID；d舒张末期左室内径、LVID；s收缩末期左室内径、

LVVol；d舒张末左室容积LV Vol；s收缩末左室容积，

CO心输出量，％EF射血分数，％FS左室短轴缩短率，。

LVMass左心室重量LVM/HM％左心室重量/体重

^*p＜0.05和^**p＜0.01代表与正常对照组的统计学差异；

#p＜0.05和##p＜0.01代表与糖尿病组的统计学差异。

2、体外心脏灌流中LMWF能减轻糖尿病大鼠的左心室功能障碍

超声心动的数据反映出，在体情况下糖尿病大鼠的左心室功能和心脏顺应性显著降低，用100mg/kg/Day剂量的LMWF长期治疗后，能显著改善以上功能。为了进一步在离体心脏中研究左心室的功能障碍，我们用Langendorff灌流系统，在基础水平和加入异丙肾上腺(ISO)刺激两个水平，评估左心室的功能。左心室压力(LVP)的峰值是用来评估左心室收缩性的指标，在基础水平，糖尿病大鼠与对照大鼠相比，LVP明显降低；DM+F组的心脏收缩性与DM组相比有显著提高(P＜0.05，如图1A)。此外，DM组与Con组相比，其左心室发展压(LVDP)和收缩舒张最大压力变化率(±dP/dtmax)也显著下降。LVP的峰值和dp/dt以及LVDP被认为是心脏收缩功能既敏感又有说服力的指标。在基础水平，LMWF的治疗对糖尿病心脏功能障碍有改善的趋势但不显著，可能与LVP在基础水平变化较少以及离体心脏的数量(N＝6-8)有限有关(如图1B和C)。为了产生较大的变化来比较LMWF的治疗效果，将ISO加入到灌流液中。ISO是非选择性的beta肾上腺素受体激动剂，对心脏有正性频率、正性肌力和正性传导的作用。ISO刺激后，DM组的LVDP和±dp/dt明显下降，而DM+F组则显著改善(如图1B和D)。总的来说，LMWF能通过提高左心室的收缩性和顺应性部分恢复左心室的血流动力学参数。

3、LMWF能减轻间质纤维化

糖尿病伴随心肌纤维化显著增加，为了检测LMWF对心肌结构是否有影响，我们对石蜡包埋的组织切片进行HE染色和天狼星红染色。结果显示，DM组心脏的间质出现扩大并有明显的纤维化，进一步放大后发现，间质和血管附近纤维显著积累。但这种心肌间质纤维化在DM+F组中得到显著的改善(如图2)。进一步对50和100mg/kgLMWF治疗组(DM+F50和DM+F100)的心肌间质纤维化进行统计分析，发现LMWF能显著减少心肌中的胶原纤维含量((P＜0.05)，而胶原纤维能导致心脏重塑并影响心肌的机械性质。

4、LMWF通过调节抗氧化酶和PKC的表达抑制氧化应激

高血糖通过ROS介导损伤作用。当ROS产生比被抗氧化酶消除多时，氧化应激就会发生，多余的ROS会对钙平衡产生干扰、导致心肌纤维化和心肌细胞凋亡[Falcao-Pires，I.and A.F.Leite-Moreira，Diabetic cardiomyopathy：understanding themolecular and cellular basis to progress in diagnosis and treatment.Heart Fail Rev，2012.17(3)：p.325-44.]。SOD是一类将超氧化物催化成氧气和过氧化氢的酶，CAT能催化过氧化氢形成水和氧气，两者都是重要的抗氧化酶。如图3所示，糖尿病大鼠的MDA水平升高，说明有脂质过氧化物的积累。与之一致的是，抗氧化的SOD的酶活性也显著降低(p＜0.05)。LMWF治疗后，SOD的活性显著增强，MDA的水平显著被抑制(p＜0.05)。CAT也表现出相同的趋势，但没有统计学意义(P＞0.05)。高血糖能使二酰甘油(DAG)的生成增加，从而使PKCβ被激活并且活性异常。活性异常的PKCβ能通过正反馈的形式使糖尿病心肌的ROS产物增加[Nagareddy，P.R.，et al.，Selective inhibition of proteinkinase C beta(2)attenuates inducible nitric oxide synthase-mediated cardiovascularabnormalities in streptozotocin-induced diabetic rats.Diabetes，2009.58(10)：p.2355-64.]。我们用Western blotting检测各组动物心脏中PKCβ的表达和活性，进一步研究LMWF对PKCβ影响。如图3D所示，PKCβ1和PKCβ2两种PKCβ亚型在糖尿病心脏中具有显著增加，并且LMWF能显著减少糖尿病大鼠心脏中PKCβ的表达，而PKCα亚型有类似的趋势但无统计学意义(P＞0.05)。

上述研究显示，长期使用LMWF治疗II型糖尿病GK大鼠能对其心脏功能障碍有保护作用。我们的结论来自以下研究发现：1)在体超声心动和离体心脏灌流的结果显示，LMWF能通过提高心肌的收缩力和顺应性来改善心脏功能障碍(如图1)；2)LMWF能通过调节胶原及其聚集形成的纤维的分布来减轻心脏的重构(如图2)；3)LMWF能通过调节抗氧化酶和PKCβ来减少氧化应激(如图3)。总体来说，LMWF能通过减少氧化应激来对糖尿病大鼠的心脏功能紊乱有一定的改善作用。考虑到LMWF来源于天然存在的海带之中，其易得性与安全性均有利于其作为一种潜在的临床治疗药物，预防糖尿病心肌病。

Claims (8)

1.一种褐藻多糖硫酸酯在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病的产品中的应用；所述褐藻多糖硫酸酯为低分子量褐藻多糖硫酸酯，其重均分子量为3-30KD；所述褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖含量为25-35％，硫酸基含量为25-35％。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯是从下述至少一种褐藻中提取得到的：海带、马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻和墨角藻。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯是从海带中提取得到的。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述褐藻多糖硫酸酯的重均分子量为6-8KD。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述低分子量褐藻多糖硫酸酯是通过褐藻多糖硫酸酯降解得到的。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或保健品。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物包含有效治疗量的所述褐藻多糖硫酸酯和药学上可接受的载体。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为口服制剂或注射剂。