CN101969915A - 皮肤美白方法以及皮肤斑形成抑制和/或除去因子的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供皮肤美白方法,包括对皮肤的含有黑素的角质形成细胞的增殖和/或分化进行选择性活化的工序。
Description
技术领域
本发明涉及皮肤美白方法以及皮肤斑形成抑制和/或除去因子的筛选方法。
背景技术
斑随着年龄增长而产生,给人以衰老的印象,经常成为严重的皮肤问题,因此针对斑的化妆品形成较大市场。人们认为为了开发针对斑的化妆品,需要弄清楚与暂时性晒伤不同的、持续在局部连续产生的这种斑的产生机制。斑存在几种临床类型,本发明以其中作为许多人随着年龄增长而发作的典型斑的日光性色素斑为对象。虽然日光性色素斑在一定程度上存在细微差别,但是也被称为老年性色素斑(senile lentigo,lentigo senilis)和/或日光性黑子(solar lentigo),是指在脂溢性部位(除手足的背面以外的具有毛囊皮脂腺系统的部位)的慢性紫外线暴露部位后天出现的色素斑。其中包括在老人的鬓角等处清楚可见的、大且边界清晰的典型斑。以下为了方便起见将该日光性色素斑称为斑。
迄今为止,以解决斑为目标,已经报告了基于斑部位的分析而获得的斑形成容易性的评价法和以此为基础的预防法、采用控制与斑相关的因子的斑消除法等。为了提供可以在形成斑之前预知是否为容易形成斑的状态的方法,有采集斑表皮部位和正常部位的样品,分别检测NT-3、ADAM9或HB-EGF作为指标来进行上述评价的报告(参照特开2004-205246号公报)。此外,也有通过阻断c-KIT和/或ET来应对斑的报告(参照特开2004-83551号公报)。
然而,在仅仅着眼于这些少数基因来进行与斑形成相关的判断和/或处理时,在是否能完全解决问题这方面令人担忧。因此,提出了检测大范围的基因变化、将它们作为诊断指标的报告(参照特开2003-245097号公报)。然而,由于该报告提供的是检测将皮肤暴露于日光而导致的变异基因的方法,因此要求基于对斑本身的广范分析来确立判断和/或处理方法。
因此,本发明者们从16名志愿者采集了作为斑的代表例的日光性色素斑,并采用基因表达谱分析与附近部位进行了比较(参照特开2007-289063号公报)。由其结果可知,在斑部位除了发生黑素合成基因的活化之外,还发生炎症相关的基因的活化、角化相关的基因的表达降低和角质形成细胞的增殖降低。
斑部位的黑素量与健常部位相比大幅度增加。然而,报告了产生该黑素的黑素细胞的数目即使在斑部位也只是健常部位的1倍~2倍左右(参照Cario-Andre M,Lepreux S,Pain C et al.Perilesional vs.lesional skin changes in senile lentigo(老年性色素斑的病灶内部与周围的皮肤变化).J Cutan Pathol.,31:441-7(2004),Noblesse E,Nizard C,Cario-Andre M et al.Skin ultrastructure in senile lentigo(老年性色素斑的皮肤超微结构).Skin Pharmacol Physiol,19:95-100(2006),Unver N,Freyschmidt-Paul P,Horster S et al.Alterations in the epidermal-dermal melanin axis and factor XIIIa melanophages in senile lentigo and ageing skin(老年性色素斑和老化皮肤的表皮-真皮黑素轴和噬黑素细胞因子XIIIa的变化).Br J Dermatol.,155:119-28(2006))。此外,如果观察斑部位的组织图像,就会观察到黑素细胞是透明的,其周围的基底层的角质形成细胞含有大量黑素(参照下述图1(b)和(c))。即,斑部位着色大部分是由于从黑素细胞转移出黑素并储存的黑色角质形成细胞引起的。在通过更新不断新生的表皮中为何该黑色角质形成细胞在斑部位持续存在这方面存在较大疑问。
作为储存了黑素的角质形成细胞持续滞留的原因,考虑到是否是由于在斑部位表皮的更新降低。事实上,迄今为止,虽然有报告指出了斑部位中的角质形成细胞的分裂降低的看法(参照特开2004-205246号公报、特开2007-289063号公报、Noblesse E,Nizard C,Cario-Andre M et al.Skinultrastructure in senile lentigo(老年性色素斑的皮肤超微结构).Skin Pharmacol Physiol,19:95-100(2006),Unver N,Freyschmidt-Paul P,Horster S et al.Alterations in the epidermal-dermal melanin axis and factor XIIIa melanophages in senile lentigo and ageing skin(老年性色素斑和老化皮肤的表皮-真皮黑素轴和噬黑素细胞因子XIIIa的变化).Br J Dermatol.,155:119-28(2006)),但是,与黑素的关系等细节还不清楚。
此外,迄今为止,作为除去斑的方法,有提高更新的方法(参照特开平6-72842号公报、特开平6-145038号公报、特开2006-45084号公报、特开2004-51544号公报、特开2001-302454号公报)。然而,如果单纯通过增强更新,则可能引起皮肤粗糙、甚至严重时会引发炎症性色素沉着等副作用,还未发现能够除去斑的有效的应用方法。
此外,有采用化学剥脱术、视黄酸治疗、激光治疗等的祛斑美容医疗手术(参照特开2003-277251号公报),但是这些是通过促进增殖和/或光吸收所引起的放热来破坏并除去含有黑素的细胞的医疗行为,虽然可期望一定的效果,但是会出现疼痛、红、肿等严重副作用,且还存在由于炎症后色素沉着等而高频率地复发,以及伴随去医院和/或费用等所产生的问题。
发明内容
鉴于上述课题,本发明的目的在于,提供可以在抑制副作用的同时有效地预防皮肤斑形成和/或改善皮肤斑的皮肤美白方法,同时提供可以高精度地选定副作用较少的皮肤斑形成抑制和/或除去因子的筛选方法。
本发明者们为了解答上述现有皮肤美白方法所涉及的问题、和/或色素沉着现象的疑问,通过从16名志愿者采集到的日光性色素斑的基因表达谱分析和/或免疫抗体染色的分析,来彻底研究斑部位与附近的正常部部位相比有何不同。结果发现如下实际情况:观察到斑部位的基底层角质形成细胞并非一律地增殖和/或分化(在本说明书中将其适当简称为“增殖·分化”。)降低,而是只有储存了黑素的角质形成细胞增殖·分化显著降低。
此外,通过使培养角质形成细胞吞噬黑素来制造斑的基底层的状态以研究其增殖·分化性,结果发现,同样地观察到增殖·分化降低、细胞周期蛋白等减少。由这些结果认为,在斑部位,储存了黑素的基底层角质形成细胞的增殖·分化降低、不能以正常的更新被排出而留在基底层一面是引起斑部位的色素沉着慢性化的原因。
为了除去斑,在单纯地增强表皮更新的情况下,进一步增加了维持肌肤厚度的正常角质形成细胞的过量增殖·分化的倾向,会引起皮肤粗糙、甚至严重时会引起炎症性色素沉着等副作用。与此相对,认为如果只特异性地增强作为斑部位的色素沉着和其慢性化的原因的、增殖·分化停滞了的黑色角质形成细胞的更新以使其正常化,排出积存的黑素,就可以在抑制副作用的同时有效地除去斑。
基于以上认识,本发明者们完成了本发明。
作为第1观点,本发明提供一种皮肤美白方法,包括对皮肤的含有黑素的角质形成细胞的增殖和/或分化进行选择性活化的工序。
根据优选的实施方式,上述选择性活化工序是通过向对象给药包含皮肤斑形成抑制和/或除去因子的药剂而进行的。
根据更优选的实施方式,上述皮肤斑形成抑制和/或除去因子选自艾草提取物、茵陈蒿提取物和桃叶提取物。
作为第2观点,本发明提供筛选皮肤斑形成抑制和/或除去因子的方法,包括以下工序:使培养角质形成细胞含有微粒,从而制作增殖和/或分化降低了的状态的角质形成细胞团簇的工序;以及以该团簇的增殖和/或分化的选择性活化能力作为指标来评价候选化合物,从而选定具有该活化能力的化合物作为皮肤斑形成抑制和/或除去因子的工序。
根据优选的实施方式,上述微粒是天然或合成的黑素、黑素体或性质均匀的微珠。
根据优选的实施方式,上述增殖的活化能力通过下述方法进行测定,所述方法选自细胞数计数法、阿尔玛蓝测定法、MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑)测定法、Hoechst测定法、BrdU(5-溴-2’-脱氧尿苷)摄取量测定法和采用了与细胞增殖、细胞分裂或细胞周期相关的抗体的免疫组织学测定法。
根据优选的实施方式,上述分化的活化能力通过选自细胞形态观察法、以及采用了与细胞分化相关的抗体的免疫组织学测定法中的方法进行测定。
根据优选的实施方式,该方法还包括以下工序:将具有该活化能力的化合物用于以含有黑素的角质形成细胞为构成要素的皮肤模型,从而选定具有皮肤斑形成抑制和/或除去效果的化合物的工序。
根据优选的实施方式,该方法还包括采用上述增殖和/或分化降低了的状态的角质形成细胞团簇来构建三维皮肤模型的工序,同时通过采用该三维皮肤模型来评价上述候选化合物,从而选定具有皮肤斑形成抑制和/或除去效果的化合物。
根据本发明的皮肤美白方法,可以在抑制副作用的同时有效地预防皮肤中的斑的形成、和/或改善已有的斑。
此外,根据本发明的皮肤斑形成抑制和/或除去因子的筛选方法,可以高精度地选定副作用较少的皮肤斑形成抑制和/或除去因子。
附图说明
图1(a)~图1(c)均是皮肤组织的显微镜照片。图1(a)是健常部位的皮肤组织的HE染色图像的实例,图1(b)是日光性色素斑部位的皮肤组织的HE染色图像的实例,图1(c)是日光性色素斑部位的皮肤组织的透射光图像与利用黑素细胞标记(TRP-1)的免疫组织染色图像的重叠图像的实例。
图2(a)~图2(c)均是皮肤的斑部位的组织的分裂细胞的染色图像。图2(a)是将分裂细胞核进行Ki67染色(绿色)后的斑部位组织的免疫组织染色图像的实例。图2(b)是将细胞核进行DAPI染色(蓝色)、将分裂细胞的核进行Ki67染色(绿色)、将黑素进行假彩色染色(红色)后的斑部位组织的3色染色图像的实例。图2(c)和图2(d)分别是将图2(b)中的不包含黑素的基底层角质形成细胞的实例和包含黑素的基底层角质形成细胞的实例局部放大显示的图。
图3(a)~图3(c)均是用于说明含有黑素的角质形成细胞的增殖降低的图。图3(a)是添加黑素源3天后的角质形成细胞的相差显微镜图像的实例。图3(b)是与图3(a)同视场的透射光显微镜图像,黑素以黑色表示。图3(c)是显示添加黑素源后第0天、第2天、第4天和第7天在各黑素浓度下的增殖指标(阿尔玛蓝测定值)的图。
图4(a)、图4(b)均是显示向含有黑素的角质形成细胞添加艾草提取物所产生的影响的图。具体而言,图4(a)是显示向不含有黑素的角质形成细胞添加艾草提取物时的增殖指标(阿尔玛蓝测定)的值的图,图4(b)是显示向含有黑素的角质形成细胞添加艾草提取物时的增殖指标的值的图。
图5是显示茵陈蒿提取物和桃叶提取物对含有微粒(微珠)的角质形成细胞的影响的增殖指标(阿尔玛蓝测定)的图。图中,a显示不包含微珠的角质形成细胞的结果,b~d显示对于含有微珠的角质形成细胞,不添加药剂的情况(b)、添加0.2%茵陈蒿提取物的情况(c)、添加0.2%桃叶提取物的情况(d)的结果。
具体实施方式
以下,列举具体的实施方式详细地说明本发明,但是本发明不限于这些实施方式,只要不脱离本发明的要旨,就可以进行任意变化来实施。
1.皮肤美白方法:
本发明的皮肤美白方法包括对皮肤中的含有黑素的角质形成细胞(适当简称为“含有黑素的角质形成细胞”。)的增殖·分化进行选择性活化的工序。另外,在本说明书中,所谓“皮肤美白方法”,是指通过预防皮肤中的斑的形成、和/或改善已有的斑,来预防和/或除去皮肤的过量色素沉着的方法。
根据本发明者们的认识,如上所述,推测在皮肤的基底层角质形成细胞中,含有黑素的角质形成细胞的增殖·分化特异性地降低、不能以正常的更新被排出而留在基底层一面是引起斑部位的色素沉着慢性化的原因。然而,如果仅仅非选择性地增强斑部位的各种细胞的更新,则可能会促进黑素细胞的过量增殖·分化,不仅不能抑制斑,而且会导致斑扩大等。此外,在使基底层角质形成细胞的更新一律地增强的情况下,也可能会促进维持肌肤厚度的正常角质形成细胞的过量增殖·分化,从而引起皮肤粗糙和/或炎症性色素沉着等副作用。
与此相对,在本发明的美白方法中,不会增强黑素细胞和/或正常角质形成细胞等的更新,只对作为斑部位的色素沉着和其慢性化的原因的、增殖·分化停滞了的含有黑素的角质形成细胞的增殖·分化进行选择性活化,从而只特异性地增强含有黑素的角质形成细胞的更新从而使其正常化。因此,可以排出蓄积在斑部位的黑素,在抑制副作用的同时预防皮肤中的斑形成、和/或改善已有的斑。
对用于选择性活化皮肤的基底层的含有黑素的角质形成细胞的增殖·分化的具体方法没有特别的限制,作为实例,可列举向对象给药包含具有选择性活化含有黑素的角质形成细胞的增殖·分化的能力的化合物(下述的皮肤斑形成抑制和/或除去因子)的药剂这样的方法。上述皮肤斑形成抑制和/或除去因子可以通过本发明的筛选方法有效地选定。关于皮肤斑形成抑制和/或除去因子的具体例和本发明的筛选方法的细节,在下栏“2.皮肤斑形成抑制和/或除去因子的筛选方法”中说明。此外,关于含有皮肤斑形成抑制和/或除去因子的药剂(下述的美白组合物)及其给药法,在更下栏“3.美白用组合物”中说明。
2.皮肤斑形成抑制和/或除去因子的筛选方法:
本发明的皮肤斑形成抑制和/或除去因子的筛选方法(适当简称为“本发明的筛选方法”)包括以下工序:使培养角质形成细胞含有微粒,从而制作增殖·分化降低了的状态的角质形成细胞团簇的工序;以及以该团簇的增殖·分化的选择性活化能力作为指标来评价候选化合物,从而选定具有该活化能力的化合物作为皮肤斑形成抑制和/或除去因子的工序。
另外,在本说明书中,将具有抑制皮肤中的斑形成的作用、和/或除去皮肤中已有的斑的作用的因子简称为“皮肤斑形成抑制和/或除去因子”等。
微粒通常选自天然或合成的黑素、黑素体或性质均匀的微珠。
作为黑素或黑素体,可列举从人、小鼠、乌贼等的培养黑素细胞提取·纯化出的黑素或黑素体等。作为市售的黑素的实例,可列举例如Sigma社制Sepia melanin(来源于乌贼)。
此外,所谓的“性质均匀的微珠”,是指质量、粒径、硬度等物理性质和表面反应性、凝聚性等化学性质均匀的合成珠。对性质均匀的微珠的材料没有特别限制,作为实例,可列举选自聚苯乙烯、聚乙烯等树脂中的一种或二种以上的材料。
对微珠的形状和/或尺寸也没有特别的限制,一般是其平均直径通常为0.1μm以上、优选为1μm以上、而且通常为10μm以下、优选为3μm以下的球状或近似球状。作为市售的性质均匀的微珠的实例,可列举例如Polyscience社的Polybead等。
对微粒的形态没有特别的限制,通常是相对于细胞的大小充分小的(例如直径通常为2μm以下的)粒子。
此外,对微粒的使用比例也没有特别的限制,通常为能观察到细胞的明显增殖·分化降低、而且不产生显著的细胞毒性(例如,细胞剥落、观察不到呼吸活性等)的范围。具体而言,在使用黑素作为微粒的情况下,黑素相对于细胞培养液的比例通常为0.0001质量%以上,尤其优选为0.001质量%以上,而且通常为0.1质量%以下,尤其优选为0.04质量%以下。
作为测定增殖的活化能力的方法,可列举细胞数计数法、阿尔玛蓝测定法、MTT测定法、Hoechst测定法、BrdU摄取量测定法、以及采用了与细胞增殖、细胞分裂或细胞周期相关的抗体(例如,BrdU、Ki67、PCNA等)的免疫组织学测定法等。这些测定法的条件和步骤是本领域技术人员公知的。
作为测定分化的活化能力的方法,可列举细胞形态观察法和采用了与细胞分化相关的抗体(例如,角蛋白1、角蛋白10、丝聚蛋白(filaggrin)、套膜蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)、谷氨酰胺转胺酶等)的免疫组织学测定法等。这些测定法的条件和步骤也是本领域技术人员公知的。
此外,本发明的筛选方法优选还包括以下工序:将具有该活化能力的化合物应用于皮肤模型,从而选定具有皮肤斑形成抑制和/或除去效果的化合物的工序。作为皮肤模型,可列举以含有黑素的角质形成细胞作为构成要素的皮肤细胞的单层培养物、共培养物、或三维培养物、斑模型小鼠(参照特开2005-106745号公报)等,其中优选皮肤细胞的单层培养物。另外,这些皮肤模型的构建方法和利用方法也是本领域技术人员公知的。
特别是,本发明的筛选方法优选还包括采用上述的增殖·分化降低了的状态的角质形成细胞团簇来构建三维皮肤模型的工序,同时通过采用该三维皮肤模型来评价上述候选化合物,从而选定具有皮肤斑形成抑制和/或除去效果的化合物。作为三维皮肤模型,在上述皮肤模型中,可列举三维培养物、斑模型小鼠等,其中优选三维培养物。
本发明的筛选方法具体可以按照例如下述步骤来实施。
(1)采用适当的培养液(例如,Defined Keratinocyte-SFM培养液(Invitrogen社制Gibco)等),在适当的培养条件(例如,在含有5%的CO2气体的空气气氛下,在温度为37℃、湿度为95%的培养箱内培养数天)下培养人正常角质形成细胞。
(2)在灭菌下使微粒扩散至适当的缓冲液(例如PBS缓冲液等)中,从而制作适当浓度的悬浮液。
(3)将(1)的细胞培养液与包含适当浓度的(2)的悬浮液的培养液(例如,黑素相对于培养液的最终浓度为0.001~0.04%W/V)交换,进行孵育(例如在上述培养条件下培养2~3天),使角质形成细胞吞噬黑素。作为此时的对照,还准备不添加微粒的细胞。
(4)通过(3)的操作将处于增殖·分化降低状态的角质形成细胞的单层培养物根据需要供给至皮肤模型的构建中,然后将该单层培养物或皮肤模型的培养液与包含被验成分(候选化合物)的培养液交换,再继续培养(例如在单层培养时,在上述培养条件下培养2~3天)。作为此时的对照,还可以准备不添加被验成分的细胞。
(5)测定(4)的操作后的细胞的增殖率。
(6)通过(5)的测定来选择出促进吞噬了微粒而增殖·分化降低了的角质形成细胞的增殖的成分(化合物)。此外,还考虑了该成分对于不添加微粒的正常角质形成细胞的增殖率的效果,从而选择出对正常细胞的增殖促进效果较低或无效果的成分。
(7)测定(4)的操作后的细胞的分化指标。
(8)通过(7)的测定来选择出促进吞噬了微粒而增殖·分化降低了的角质形成细胞的分化的成分。此时,还考虑了该成分对于不添加微粒的正常角质形成细胞的分化指标增强率的效果,从而选择出对正常细胞的分化促进效果较低或无效果的成分。
作为促进角质形成细胞的增殖或分化的判断基准,通常以不添加被验成分的情况作为基准,在添加被验成分使增殖率或分化率在统计处理上显著上升了的情况下,判断为该成分促进了增殖或分化。然而,添加被验成分应在不引起显著细胞毒性的浓度范围内进行。
根据以上说明的本发明的筛选方法,可以通过以增殖·分化降低了的状态的角质形成细胞团簇的增殖·分化的选择性活化能力作为指标来评价候选化合物,从而高精度地选定副作用较少的皮肤斑形成抑制和/或除去因子。此外,可以通过组合使用了多个皮肤模型的评价,来高精度地选定副作用较少的具有皮肤斑形成抑制和/或除去效果的化合物。
根据本发明的筛选方法,认为如果采用选定为皮肤斑形成抑制和/或除去因子的成分(化合物),则可以特异性地使储存了黑素而增殖·分化降低了的、作为斑部位的色素沉着慢性化的主要原因的黑色角质形成细胞的增殖·分化回归正常,释放积存的黑素,从而可以副作用少且有效地预防、改善斑。此外,认为可以除去已有的斑(即,黑色的角质形成细胞),这是通过酪氨酸酶抑制剂等难以实现的。因此,通过本发明的筛选方法选定的皮肤斑形成抑制和/或除去因子可期待作为美白有效成分的用途。
本发明者们按照上述本发明的筛选方法进行了皮肤斑形成抑制和/或除去因子的选定,结果发现,艾草提取物、茵陈蒿提取物和桃叶提取物具有促进含有黑素的角质形成细胞的增殖·分化的效果。
艾草(学名Artemisia princeps)和茵陈蒿(学名Artemisia capillaris)均是菊科艾属的多年生草本植物。
“桃叶”是指蔷薇科桃属的落叶小乔木桃树(桃,学名Amygdalus persica)的叶。
艾草、茵陈蒿和桃叶的“提取物”可以通过常规方法获得,例如可以将这些植物与提取溶剂一起浸渍或加热回流,然后过滤、浓缩而获得。作为提取溶剂,只要是提取通常使用的溶剂,就可以使用任意溶剂。作为实例,可以将水、甲醇、乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、甘油等醇类,含水醇类、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等有机溶剂等分别单独使用或者二种以上组合使用。用上述溶剂提取获得的提取物可以直接使用,或者可以使用将浓缩后的提取物采用吸附法、例如离子交换树脂来除去杂质而获得的产物,和/或使用通过多孔聚合物(例如アンバ一ライトXAD-2)柱进行吸附、然后用甲醇或乙醇溶出、浓缩而成的产物。此外,也可以使用通过分配法、例如用水/乙酸乙酯提取得到的提取物等。
3.美白用组合物:
通过本发明的筛选方法选定的皮肤斑形成抑制和/或除去因子(例如,上述的艾草提取物、茵陈蒿提取物和桃叶提取物等)通常可以作为美白用组合物(或美白用皮肤外用剂)的美白有效成分在上述的本发明的皮肤美白方法中使用。另外,含有通过本发明的筛选方法选定的皮肤斑形成抑制和/或除去因子作为美白有效成分的美白用组合物在本说明书中被适当称为“本发明的美白用组合物”。
皮肤斑形成抑制因子和/或皮肤斑除去因子相对于本发明的美白用组合物的比例根据其形态和/或剂型不同而不同,没有限制,通常为0.001质量%以上、尤其优选为0.01质量%以上、更优选为0.1质量%以上、而且通常为10质量%以下、尤其优选为5%质量%以下、更优选为1%质量%以下的范围。
根据所需的剂型,本发明的美白用组合物中可以适当配合现在公知的赋形剂和/或香料等,以及油脂类、表面活性剂、防腐剂、螯合剂、水溶性高分子、增稠剂、颜料等粉末成分、紫外线防御剂、保湿剂、抗氧化剂、pH调节剂、洗涤剂、干燥剂、乳化剂等。此外,只要是在不破坏所期望的效果的范围内,还可以将其它药效成分配合至本发明的美白用组合物中。
本发明的美白用组合物可以以例如水溶液、油液、其它溶液、乳液、乳膏、凝胶、悬浮液、微胶囊、粉末、颗粒、胶囊、固体制剂等形态应用。可以通过现在公知的方法配制成这些形态,然后制成洗剂、乳液剂、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、贴剂、气雾剂、水-油2层体系、水-油-粉末3层体系、注射剂、内服剂(例如锭剂、散剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、片剂等)、栓剂等,在身体上涂布、粘贴、喷雾、注射、饮用、插入等,从而向人和/或动物等对象进行给药。
在这些剂型中,本发明的美白用组合物制成洗剂、乳液剂、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、贴剂、气雾剂等皮肤外用剂适合本发明的目的。在本发明的美白用组合物中,特别地将作为皮肤外用剂的剂型在本说明书中适当称为“本发明的美白用皮肤外用剂”。
另外,此处记载的皮肤外用剂包括药品、准药品(软膏剂等)、化妆品[洗面奶、乳液、乳膏、胶冻剂、精华(美容液)、面膜(pack·mask)等基础化妆品;粉底、口红等彩妆化妆品;口腔化妆品、芳香化妆品、毛发化妆品、身体化妆品等]。特别是本发明的美白用组合物优选用作预防皮肤斑形成、和/或改善皮肤斑的化妆品。
通过采用本发明的美白用组合物(特别是本发明的美白用皮肤外用剂),以与其剂型相应的适当方法向对象进行给药,可以在抑制副作用的同时有效地预防皮肤斑形成、和/或改善皮肤斑。
实施例
以下,使用实施例更详细地说明本发明,但是本发明不限于这些实施例。
实施例1
人斑组织的分析结果
日光性色素斑部位组织样品
组织样品如下获得:在知情同意的16名40岁以上的男性志愿者的背部的斑中,通过皮肤科医生的诊断来选定日光性色素斑,在局部麻醉下通过3mm活组织检查来采集该日光性色素斑部位的表皮和真皮上层的组织。采集时按照资生堂伦理委员会的指导原则来进行。还从除了日光性色素斑部位以外的同一人的背部附近的健常部位和臀部(非暴露部位)的健常部位同样地采集表皮和真皮上层的组织作为比较部位。
皮肤组织切片的染色
为了对斑部位相对于比较部位的变异蛋白质在皮肤组织内的分布和/或表达进行观察,使采集组织形成冷冻块从而制作薄切片,进行以下所示的HE染色和/或免疫组织染色等各种细胞染色。为了防止不均匀,将同一人的3个部位(日光性色素斑部位、健常部位、非暴露部位)的组织作为一组包埋在1个块中,在1个载玻片上安放切片同时进行染色操作。
另外,免疫组织染色中合并使用酪胺敏化法(参照TSA-plus Fluorescein System:Perkin Elmer Life and Analytical Sciences,Boston,MA,U.S.A),采用了抗TRP-1抗体(参照Mel-5:Signet Laboratories Inc.,Dedham,MA,U.S.A.)和Ki-67抗体(参照BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA,U.S.A.)。作为阳性细胞数,数出表皮的每1mm长度中的阳性细胞的个数。
分析结果
首先,对各部位进行HE(苏木精·曙红)染色。图1(a)是健常部位的皮肤组织的HE染色图像的实例,图1(b)是日光性色素斑部位的皮肤组织的HE染色图像的实例。图1(a)和(b)均是上下重复地显示倍率不同的2个图像,各图像中的黑线段的长度相当于50μm。
接下来,为了证实斑部位中的黑素细胞相关基因增强,采用使用了抗TRP-1抗体的免疫组织染色法来研究作为黑素细胞标记的TRP-1蛋白质在组织中的表达模式。发出TRP-1阳性的荧光信号的细胞在基底膜的黑素细胞中被检测出,可以证实在9例中的9例中,日光性色素斑部位中的角质层的每单位长度发出荧光信号的细胞数比附近健常部位多2倍左右。这与上述“背景技术”栏中记载的现有报告的结果组一致。
图1(c)是由此获得的日光性色素斑部位的皮肤组织的利用黑素细胞标记(TRP-1)的免疫组织染色图像与相同部位的皮肤组织的透射光图像重叠而成的图像的实例。在图1(c)中,黑线段的长度相当于50μm。箭头尖表示TRP-1阳性黑素细胞(绿色),*表示含有黑素的基底层角质形成细胞(黑色)。由图1(c)可知,黑素细胞是透明的,而基底层角质形成细胞呈黑色,含有黑素。
接下来,采用作为细胞分裂标记的Ki67抗体来检测增殖中的细胞并同样地进行比较。其结果与上述相反,观察到日光性色素斑部位的阳性细胞数与附近健常部位相比为0.58倍(n=10,p=0.021),有减少倾向。另外,这些阳性细胞大部分为角质形成细胞。图2(a)是斑部位组织的免疫组织染色(Ki67染色)图像的实例,分裂细胞核被染色成绿色。图2(a)中,白线段的长度相当于100μm。
由于作为在斑部位阳性细胞较少的原因,考虑到了黑素产生的荧光信号的遮光效果,因此仔细地观察了该Ki67阳性细胞图像。其结果是,由于Ki67的信号在细胞核中被检测,而黑素分布在细胞核周围的细胞质中,因此可知荧光信号的遮光并不严重。相反,如果仔细地观察应该分布在阳性细胞内的核的周围的黑素,则观察到根本Ki67阳性细胞、即分裂细胞的大部分如图2(a)所示,细胞内(被染色成绿色的核的周围)几乎不含有黑素。
接下来,为了研究该现象是否为斑部位特有的现象、并研究其实际情况,进行以下测定。
首先,为了判断在斑部位的组织切片中的细胞的位置,通过将核用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚,4’,6-diamidino-2-phenylindole)染色以染成蓝色、将分裂细胞用Ki67染色以染成绿色、将黑素用假彩色以染成红色,从而制作可以识别它们的3色染色图像。在由此获得的斑部位组织的3色染色图像中,计数每单位角质层长度的包含黑素的基底层细胞的总数和不包含黑素的基底层细胞的总数。此外,通过计数其中Ki67阳性的分裂细胞的个数,将其分别除以包含黑素的基底层细胞和不包含黑素的基底层细胞各自的总数,从而计算出各自的分裂细胞的比例。
图2(b)是斑部位组织的3色染色图像的实例。不包含黑素的基底层细胞以白圆圈记号表示,包含黑素的基底层细胞以粉红圆圈记号表示。此外,在图2(b)中,将以白框线表示的部分(不包含黑素的基底层角质形成细胞的实例,和包含黑素的基底层角质形成细胞的实例)的局部放大图分别作为图2(c)和(d)显示。在图2(c)和(d)中,角质形成细胞的轮廓以白虚线表示。
作为不包含黑素的细胞和包含黑素的细胞的判断基准,将几乎观察不到黑素的细胞(例如图2(c)所示的细胞)判断为不包含黑素的细胞,将其它的细胞(例如图2(d)所示的细胞)判断为包含黑素的细胞。此外,Ki67阳性细胞除了上述特性以外,有时严格来说不是在基底层而是在基底层的更上一层中被检测出,这些也看作是在基底层中检测到的来计算。
包含黑素的基底层细胞和不包含黑素的基底层细胞中各自的Ki67阳性细胞的比例分别按照下述的式(1)和(2)来计算。
Rm=Dm/Bm (1)
在上述式(1)中,Rm表示包含黑素的基底层细胞(melanin)中的Ki67阳性细胞的比例(Ratio),Dm表示包含黑素的基底层细胞中的Ki67阳性的分裂细胞数(Divide),Bm表示包含黑素的总基底层细胞数(Basal)。
Rc=Dc/Bc (2)
在上述式(2)中,Rc表示不包含黑素的基底层细胞(clear)中的Ki67阳性细胞的比例,Dc表示不包含黑素的基底层细胞中的Ki67阳性的分裂细胞数,Bc表示不包含黑素的总基底层细胞数。
按照以上的步骤,计数包含黑素的基底层细胞和不包含黑素的基底层细胞各自的细胞数(在图2(b)中,白圆圈记号和粉红圆圈记号各自的细胞数),计算出包含黑素的情况和不包含黑素的情况下各自的分裂细胞(在图2(b)中,具有被染色成绿色的核的细胞)的比例(Rm、Rc)并进行比较。这样,包含黑素的基底层细胞中的分裂细胞的比例与不包含黑素的基底层细胞中的分裂细胞的比例相比非常少,因此可判明含有黑素的角质形成细胞的分裂大幅度降低(Rm/Rc=0.16倍,N=14,P=0.007)。
即,认为斑部位的储存了黑素的基底层角质形成细胞陷入了增殖·分化显著降低的状态。如果该黑色角质形成细胞非常不容易分裂,则与通过在基底层进行的分裂和更新而不断更换的通常角质形成细胞的状态不同,从而长期持续分布在基底层。其结果是,从黑素细胞转移黑素的物理时间也会增加,从而保持高的黑素含量。认为这样的陷入了增殖·分化降低状态的黑色角质形成细胞存在于基底层一面是斑部位的色素沉着慢性化的主要原因。事实上,观察用TRP-1染色后的组织图像(参照上述的图1(b)和(c))可知,含有黑素的角质形成细胞分布在基底层一面,承担着斑部位的主要着色。
实施例2
采用了培养人正常角质形成细胞的分析结果
为了证实采用斑部位的组织(in vivo)分析观察到的含有黑素的角质形成细胞的增殖·分化的降低现象是否在培养细胞(in vitro)系中也可观察到,使培养人正常角质形成细胞吞噬微粒,造成与斑部位基底层相似的状态,进行分析。
细胞培养和微粒的添加
(1)将人正常角质形成细胞在含有5%的CO2气体的空气气氛下,在温度为37℃、湿度为95%的培养箱内采用Defined Keratinocyte-SFM培养液(Invitrogen社制Gibco)进行培养。
(2)采用黑素(Sepia melanin(来源于乌贼),粉末状,Sigma社制)作为微粒,使其在灭菌下扩散至PBS缓冲液中,从而制作适当浓度的悬浮液。
(3)将(1)的细胞培养液与添加了(2)的悬浮液的培养液(黑素相对于培养液的最终浓度为0.001、0.02和O.04%W/V)交换并进行孵育,使角质形成细胞吞噬黑素。此后,在上述培养条件下培养1~3天后,更换成不包含黑素的新鲜培养液,洗掉多余的黑素。然后,再一边定期更换(每隔2~3天)培养基,一边继续培养。此时,还准备了不添加黑素的细胞作为对照。
分裂的观察和增殖率的测定
(1)添加黑素后,定期拍摄细胞状态的相差显微镜图像和无相差透射光显微镜图像(用于清楚观察黑素分布),观察细胞的分裂情况。
(2)添加黑素后,定期地通过阿尔玛蓝测定法来测定细胞增殖率。阿尔玛蓝测定法如下进行:向细胞培养液添加1/10容量的阿尔玛蓝溶液(Bio Source社),然后在培养用培养箱内静置1小时,然后采集培养上清液的一部分并转移至96孔板等,通过荧光酶标仪在544nm下进行激发,在590nm下进行测定。将添加阿尔玛蓝溶液测定结束后的细胞培养溶液立即更换成新鲜培养液,继续培养。
添加黑素的细胞的变异基因的分析
(1)通过ISOGEN(日本ジ一ン社,制造商推荐方案)从添加黑素而分裂降低了的状态的人正常角质形成细胞和不添加黑素的对照中提取RNA,通过RNeasy(Qiagen社)来纯化。将所得的RNA用生物分析仪(アジレントテクノロジ一社)进行电泳,从而证实其品质和纯化度。
(2)使用所配制的RNA,通过DNA微阵列来进行基因表达谱分析。样品的配制和杂交依据アジレント社推荐方案来进行。采用Low RNAInput线性扩增&标记试剂盒(アジレント社)由总量为100~300ng的RNA来合成标签cRNA。采用RNeasy(Qiagen社,制造商推荐方案)进行纯化,然后与Whole Human Genome寡核苷酸阵列(アジレント社,G4112A)进行杂交并洗涤,通过アジレント社扫描仪进行数据读取。
添加黑素的细胞的变异蛋白质的分析
从添加黑素而分裂降低了的状态的人正常角质形成细胞和不添加黑素的对照中提取蛋白质,通过蛋白质印迹法来比较目标蛋白质的量。
分析结果
添加黑素3天后的角质形成细胞的相差显微镜图像的实例示于图3(a)。此外,与图3(a)同视场的透射光显微镜图像示于图3(b)。在图3(b)中,黑素以黑色表示。在图3(a)和(b)中,黑线段的长度相当于100μm。如图3(a)和(b)所示,如果向人正常角质形成细胞中添加黑素,人正常角质形成细胞就会迅速吞噬黑素,然后积聚在核的周围。此后,从培养第2天以后开始,通过显微镜图像观察到细胞分裂停滞。
图3(c)是显示添加黑素后第0天、第2天、第4天和第7天的各黑素浓度下的细胞增殖指标(阿尔玛蓝测定值)的图。如图3(c)所示,在不添加黑素(黑素浓度为0.00%)的情况下,直到培养第7天都能观察到细胞增殖,但在黑素浓度为0.01%的情况下,从第4天开始观察到细胞增殖降低,如果黑素浓度提高至0.04%,则观察到依赖于浓度地从添加第2天开始细胞增殖显著降低。此外,在黑素浓度为0.04%的情况下,第2天以后的阿尔玛蓝值几乎无变化,基本上保持添加黑素时的值。由于阿尔玛蓝用于检测细胞的呼吸活性,因此可知并不是细胞死亡了。即,认为细胞既不增殖也不分化,以停止状态生存。
另外,为了证实添加黑素不会产生培养液的成分吸附于黑素等影响,将培养液与黑素一起预先孵育(3天),然后使用除去了黑素的培养液来培养细胞并进行观察,结果在细胞增殖中未出现这样的影响。
此外,采用微珠(平均径为2μm的聚苯乙烯珠,从Polyscience社购入)和黑素体(通过超速离心分离法由人正常黑素细胞制备)作为微粒进行了与上述同样的实验,结果观察到仍产生了同样的现象。
为了更详细地分析吞噬了黑素而分裂降低了的角质形成细胞的状态,从分裂降低的角质形成细胞和正常角质形成细胞两者提取总RNA,比较它们的基因表达谱。分析中采用收录了人的全基因的DNA微阵列。其结果可知,在细胞分裂所需的细胞周期蛋白相关基因中,多数基因的表达降低。作为细胞增殖标记的PCNA也降低至0.53倍。进一步观察细胞周期蛋白抑制剂组群,则判明了这些细胞周期蛋白抑制剂组群相反地表达增强。
为了研究这些细胞周期蛋白的降低是否也在蛋白质水平发生,采用蛋白质印迹法来研究细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白B的蛋白质表达。其结果证实,这些细胞周期蛋白在蛋白质水平也发生表达降低。
由上述结果暗示出,储存了黑素的角质形成细胞的分裂降低与其说仅仅是毒性,不如说是与细胞周期决定机制相关的主动增殖降低现象。
这样,吞噬了黑素的培养角质形成细胞的分裂降低这样的结果与斑部位的储存了黑素的基底层角质形成细胞的分裂降低这样的上述观察结果完全吻合。即,认为在斑组织观察到的含有黑素的角质形成细胞的增殖分化降低现象在培养细胞系也被重现。这样,认为储存了黑素且既不增殖也不分化、陷入了增殖分化降低状态的黑色角质形成细胞存在于基底层一面是斑部位的色素沉着慢性化的主要原因。
实施例3
含有黑素的角质形成细胞的分裂正常化药剂的筛选
通过与实施例2同样的步骤,使培养人正常角质形成细胞吞噬微粒,以制造细胞分裂降低的状态,并以其正常化、即促进细胞分裂为指标进行药剂筛选体系的构建,尝试采用该体系进行药剂筛选。
筛选体系的构建
(1)将人正常角质形成细胞在含有5%的CO2气体的空气气氛下,在温度为37℃、湿度为95%的培养箱内采用Defined Keratinocyte-SFM培养液(Invitrogen社制Gibco)进行培养。此外,将人正常黑素细胞在与上述相同环境下采用Medium254+HMGS培养液(KURABO)进行培养。
(2)使用黑素(Sigma社制Sepia melanin(来源于乌贼),粉末状)作为微粒,在灭菌下扩散至PBS缓冲液中,从而制作适当浓度的悬浮液。
(3)将添加了(2)的悬浮液的培养液(黑素相对于培养液的最终浓度为0.001~0.04%W/V,细胞数增殖至一半左右的浓度)与(1)细胞培养液交换进行孵育,吞噬黑素3天(另外,通过与实施例2同样的方法来预先证实添加黑素不会产生培养液的成分吸附于黑素等影响)。此后,更换不包含黑素的新鲜培养液,洗去多余的黑素。以各种浓度(0.1~0.8%W/V)向其中添加作为评价对象的后述药剂(候选化合物),在上述培养条件下再继续培养2~3天。此时,还准备了不添加黑素的细胞作为对照,同样地进行处理。
(4)在添加药剂后第2~3天,通过阿尔玛蓝测定来测定细胞增殖指标。阿尔玛蓝测定如下进行:向细胞培养液中添加1/10容量的阿尔玛蓝溶液(Bio Source社),然后在培养用培养箱内静置1小时,然后采集培养上清液的一部分将其转移至96孔板,通过荧光酶标仪在544nm下进行激发,在590nm下进行测定。
药剂筛选
对于各种植物提取液等约200种药剂,采用上述的筛选体系实际进行筛选。其结果发现,艾草提取物、茵陈蒿提取物和桃叶提取物具有促进含有黑素的角质形成细胞的分裂的效果(将这些药剂适当称为“选定药剂”。)。
将选定药剂中的艾草提取物添加至不含有黑素的角质形成细胞时的增殖指标(阿尔玛蓝测定)图示于图4(a),添加至含有黑素的角质形成细胞时的增殖指标图示于图4(b)。可知,艾草提取物即使添加至不含有黑素的角质形成细胞也不会增强增殖,但是对含有黑素的角质形成细胞具有增强细胞增殖的效果。
图5是作为其它选定药剂的茵陈蒿提取物和桃叶提取物显示对含有微珠作为微粒的角质形成细胞的影响的增殖指标(阿尔玛蓝测定)的图。图中,a表示对于不含有微珠的角质形成细胞,以不添加选定药剂的状态培养的情况下的增殖指标(阿尔玛蓝测定)的值。b、c和d显示对于采用微珠(φ2μm,相对于培养液为2.2×107个/ml)作为微粒获得的含微珠的角质形成细胞,不添加药剂的情况(b)、添加0.2%茵陈蒿提取物的情况(c)、以及添加0.2%桃叶提取物的情况(d)的增殖指标(阿尔玛蓝测定)的值。由图8可知,茵陈蒿提取物和桃叶提取物对吞噬了微珠而增殖降低的角质形成细胞具有增强增殖的效果。
由以上的结果可知,采用上述筛选体系获得的选定药剂在使含有黑素而分裂降低了的角质形成细胞特异性地分裂的同时,不会对正常的角质形成细胞和/或黑素细胞产生这样的影响,即,可以将增殖增强作用局限于作为斑部位的色素沉着慢性化的主要原因的含有黑素的角质形成细胞。因此,认为如果使用这些选定药剂,则可以在抑制副作用的同时有效地应对斑。
产业可利用性
本发明优选用于与药品和/或化妆品相关的领域、特别是预防皮肤斑形成和/或改善皮肤斑的药品和/或化妆品的领域。
Claims (7)
1.一种皮肤美白方法,包括对皮肤的含有黑素的角质形成细胞的增殖和/或分化进行选择性活化的工序。
2.一种皮肤斑形成抑制和/或除去因子的筛选方法,包括以下工序:使培养角质形成细胞含有微粒,从而制作增殖和/或分化降低了的状态的角质形成细胞团簇的工序;以及以该团簇的增殖和/或分化的选择性活化能力作为指标来评价候选化合物,从而选定具有该活化能力的化合物作为皮肤斑形成抑制和/或除去因子的工序。
3.根据权利要求2所述的方法,所述微粒是天然或合成的黑素、黑素体或性质均匀的微珠。
4.根据权利要求2所述的方法,所述增殖的活化能力通过下述方法进行测定,所述方法选自细胞数计数法、阿尔玛蓝测定法、MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑)测定法、Hoechst测定法、BrdU(5-溴-2’-脱氧尿苷)摄取量测定法、以及采用了与细胞增殖、细胞分裂或细胞周期相关的抗体的免疫组织学测定法。
5.根据权利要求2所述的方法,所述分化的活化能力通过选自细胞形态观察法、以及使用与细胞分化相关的抗体的免疫组织学测定法中的方法进行测定。
6.根据权利要求2所述的方法,还包括以下工序:将具有该活化能力的化合物应用于以含有黑素的角质形成细胞为构成要素的皮肤模型,从而选定具有皮肤斑形成抑制和/或除去效果的化合物。
7.根据权利要求2所述的方法,还包括采用所述的增殖和/或分化降低了的状态的角质形成细胞团簇来构建三维皮肤模型的工序,同时通过采用该三维皮肤模型进行所述候选化合物的评价,从而选定具有皮肤斑形成抑制和/或除去效果的化合物。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104080434A (zh) * | 2012-02-10 | 2014-10-01 | 宝洁公司 | 用于展现化妆品组合物的美白有益效果的套盒和方法 |
CN105190315A (zh) * | 2013-03-13 | 2015-12-23 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 筛选具有美白功效的物质的方法 |
CN108203705A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-06-26 | 山西农业大学 | 小鼠黑色素细胞与角化细胞的共培养方法 |
CN112334772A (zh) * | 2018-04-12 | 2021-02-05 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的筛选方法以及用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的组合物 |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011219403A (ja) * | 2010-04-08 | 2011-11-04 | Pola Chemical Industries Inc | 細胞賦活剤 |
EP2636737B1 (en) | 2010-11-01 | 2018-01-17 | Kao Corporation | Skin and hair color-controlling factor |
US8927517B2 (en) * | 2012-04-27 | 2015-01-06 | Kao Corporation | Factors controlling skin and hair color |
JP2014019683A (ja) * | 2012-07-23 | 2014-02-03 | Ichimaru Pharcos Co Ltd | メラニン含有ケラチノサイト分裂促進剤 |
JP2014141475A (ja) * | 2012-12-27 | 2014-08-07 | Daiichi Sankyo Co Ltd | 新規美白剤 |
US20160000696A1 (en) * | 2013-03-14 | 2016-01-07 | Avon Products, Inc. | Sargassum muticum extracts and methods of use |
JP2014207874A (ja) * | 2013-03-28 | 2014-11-06 | ポーラ化成工業株式会社 | 肌の色調改善剤のスクリーニング法 |
IL227890A0 (en) * | 2013-08-08 | 2014-01-30 | Galderm Therapeutics Ltd | Antiaging compounds containing bile acid and fatty acid conjugates |
JP6583704B2 (ja) * | 2014-09-25 | 2019-10-02 | ポーラ化成工業株式会社 | 色素沈着改善剤のスクリーニング法 |
WO2019098352A1 (ja) * | 2017-11-17 | 2019-05-23 | ロート製薬株式会社 | 美容組成物、スクリーニング方法及び美容方法 |
JP2020164486A (ja) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | 丸善製薬株式会社 | 抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、及び美白剤、並びに、化粧料 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08104646A (ja) * | 1993-11-18 | 1996-04-23 | Noevir Co Ltd | チロシナーゼ生合成阻害剤及びこれを配合して成る美白剤 |
JPH11349435A (ja) * | 1998-06-03 | 1999-12-21 | Noevir Co Ltd | 紫外線による色素沈着症状の防止,改善に有効な皮膚外用剤 |
JP2003342155A (ja) * | 2002-05-28 | 2003-12-03 | Noevir Co Ltd | 皮膚外用剤 |
JP2006176436A (ja) * | 2004-12-22 | 2006-07-06 | Kao Corp | Scf発現阻害剤 |
JP4497853B2 (ja) * | 2003-07-04 | 2010-07-07 | 株式会社ノエビア | 皮膚外用剤 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3133508B2 (ja) | 1992-08-26 | 2001-02-13 | 鐘紡株式会社 | 美白剤および美白化粧料 |
JP2731329B2 (ja) | 1992-11-05 | 1998-03-25 | 鐘紡株式会社 | 皮膚化粧料 |
JP4383630B2 (ja) | 2000-04-26 | 2009-12-16 | 株式会社サンギ | 化粧料 |
US20030170739A1 (en) | 2001-11-08 | 2003-09-11 | Unilever Home & Personal Care Usa, Division Of Conopco, Inc. | Gene expression for analyzing photodamage |
JP2003277251A (ja) | 2002-03-19 | 2003-10-02 | Cosmo Products Kk | 新規美白化粧品。 |
JP2004083551A (ja) | 2002-07-02 | 2004-03-18 | Kao Corp | 美白用組成物 |
JP2004051544A (ja) | 2002-07-19 | 2004-02-19 | Naris Cosmetics Co Ltd | シミ改善化粧料 |
JP3943490B2 (ja) | 2002-12-24 | 2007-07-11 | 花王株式会社 | シミの状況分析方法およびシミに対する効能評価方法 |
JP3898175B2 (ja) | 2003-10-01 | 2007-03-28 | 株式会社資生堂 | しみ部位亢進遺伝子群を指標とした皮膚しみ形成予知方法、皮膚しみ形成抑制剤のスクリーニング方法 |
JP4426919B2 (ja) | 2004-08-02 | 2010-03-03 | 花王株式会社 | β4インテグリン産生促進剤及び美白化粧料。 |
JPWO2007078009A1 (ja) * | 2006-01-06 | 2009-06-11 | 株式会社アトムジャパン | 化粧料 |
JP2007289063A (ja) * | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Shiseido Co Ltd | しみ部位亢進遺伝子群を指標とした皮膚しみ形成予知方法、皮膚しみ形成抑制剤のスクリーニング方法 |
EA017935B1 (ru) * | 2006-05-19 | 2013-04-30 | Мэри Кэй Инк. | Композиция для ухода за кожей и ее применение |
-
2009
- 2009-03-05 EP EP09719717A patent/EP2250993A4/en not_active Withdrawn
- 2009-03-05 JP JP2010502788A patent/JP5872158B2/ja active Active
- 2009-03-05 KR KR1020107020262A patent/KR20100138918A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-03-05 CN CN200980108386.5A patent/CN101969915B/zh active Active
- 2009-03-05 WO PCT/JP2009/054199 patent/WO2009113446A1/ja active Application Filing
- 2009-03-05 US US12/922,021 patent/US20110008273A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-04-06 HK HK11103500.4A patent/HK1149480A1/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08104646A (ja) * | 1993-11-18 | 1996-04-23 | Noevir Co Ltd | チロシナーゼ生合成阻害剤及びこれを配合して成る美白剤 |
JPH11349435A (ja) * | 1998-06-03 | 1999-12-21 | Noevir Co Ltd | 紫外線による色素沈着症状の防止,改善に有効な皮膚外用剤 |
JP2003342155A (ja) * | 2002-05-28 | 2003-12-03 | Noevir Co Ltd | 皮膚外用剤 |
JP4497853B2 (ja) * | 2003-07-04 | 2010-07-07 | 株式会社ノエビア | 皮膚外用剤 |
JP2006176436A (ja) * | 2004-12-22 | 2006-07-06 | Kao Corp | Scf発現阻害剤 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104080434A (zh) * | 2012-02-10 | 2014-10-01 | 宝洁公司 | 用于展现化妆品组合物的美白有益效果的套盒和方法 |
CN104080434B (zh) * | 2012-02-10 | 2017-11-07 | 宝洁公司 | 用于展现化妆品组合物的美白有益效果的套盒和方法 |
CN105190315A (zh) * | 2013-03-13 | 2015-12-23 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 筛选具有美白功效的物质的方法 |
CN105190315B (zh) * | 2013-03-13 | 2017-05-17 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 筛选具有美白功效的物质的方法 |
CN108203705A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-06-26 | 山西农业大学 | 小鼠黑色素细胞与角化细胞的共培养方法 |
CN112334772A (zh) * | 2018-04-12 | 2021-02-05 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的筛选方法以及用于恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的组合物 |
CN112334772B (zh) * | 2018-04-12 | 2023-12-15 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 能够恢复由微尘引起的皮肤角质形成细胞分化抑制的物质的筛选方法及组合物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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