CN103320490B - 一种利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，含以下步骤：(1)正常人原代细胞的分离、培养和鉴定；(2)受试物的毒性检验；(3)受试物的配制及其浓度的确定；(4)紫外线诱导辐射剂量的确定；(5)受试物抗氧化效果的确认。本发明通过体外标准化培养的正常人皮肤细胞，其分裂增殖能力强、标准化程度高、批间差异小，具有与体内相同的活性和功能；本发明利用正常健康人皮肤细胞比动物或人源的细胞系获得的结果更可信；本发明可以从定性和定量两方面评价待测物质的毒性作用和抗氧化功效。本发明方法可以代替活体动物和人类皮肤，直接用于化学品、化妆品、药品等产品中抗氧化物质的毒性和功效试验。
Description
技术领域
本发明属于个人皮肤护理用品抗氧化性安全功效评价和分析检测技术领域，具体涉及一种利用正常人多种皮肤细胞筛查（screen）皮肤疑似抗氧化剂安全和功效的方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，是外源化学因素（化学品、药品、化妆品等）或物理机械因素（紫外线、微波等）毒性作用的主要器官。随着现代工业的发展，环境污染日益严重，日常生活中皮肤接触的氧化应激源的种类和频率较之前有大幅增加。各种不同来源的氧化应激源对皮肤细胞及其蛋白、细胞脂质甚至DNA产生攻击，造成细胞氧化损伤，直接或间接的导致各种皮肤亚健康和皮肤病理反应的出现，如加速皮肤衰老过程，加速色素沉着，加剧紫外线引起的损伤，使皮肤创伤难以愈合。此外，皮肤氧化应激还与红斑狼疮、变应性皮肤疾病、银屑病等密切相关。
皮肤抗氧化成为皮肤科治疗药品和护肤化妆产品研究的热点，市场上出现很多宣称可以清除氧化自由基，延缓皮肤衰老的产品，但对其是否能达到宣称的效果至今尚无标准化的评价体系，这不仅为消费者辨别产品质量的好坏设立了障碍，也使检测机构对化妆品市场的监管造成一定困难。而建立标准化的细胞氧化损伤快速检测体系和方法有利于对化学物或化妆品的功效进行评价。
利用适宜的生物学系统（细胞、动物或人体组织）进行皮肤毒性检测和功效测试是化妆品、药品、食品添加剂及原料、农药、生物制品、化学品健康安全评价的常规检测项目。传统的皮肤安全性评价实验常用动物进行，不仅试验周期长，成本高，会给动物造成极大的痛苦，而且鉴于动物皮肤结构功能与人皮肤有的差异，动物试验的结果与人的相关性较差。近20年来，化妆品和个人护理产品的皮肤安全和效果测试逐渐转向不再以动物模式为基础的毒理学系统进行，例如来源于正常人的皮肤细胞或组织，或利用人的皮肤细胞体外重建的皮肤模型。
传统的皮肤氧化效果测试可分为化学法、动物模型和人体试验三类。化学检测法主要针对应激过程中起关键作用的自由基，把检测自由基水平的降低或清除自由基的能力作为抗氧化功效的证据，这些抗氧化剂的化学检测方法通常以易于氧化的底物为测试系统，加入氧化物质发生化学反应形成氧化产物（如各种活性氧和自由基），然后加入抗氧化剂检测其自由基清除能力作为判断依据。例如自由基清除能力测试（DPPH）是一种化学方法，测试体系由DPPH与抗氧化剂混合，30min孵育后比较吸光度，以DPPH去色百分比表示抗氧化剂自由基的清除效率（Thaiponga K,Boonprakoba U,Crosby K,et al.Comparison of ABTS,DPPH,FRAP,and ORAC assays forestimating antioxidant activity from guava fruit extracts,Journal of Food Composition and Analysis,2006,19:669-675）。化学检测法是在实验室人工模拟环境中进行，反应体系单一，依赖反应体系中化学反应产生的自由基类型分别测定铁金属离子清除活性（FRAP）、过氧化氢清除活性、超氧阴离子自由基清除活性，受底物的限制不可能同时检测多种氧化损伤效应，从而也不可能从总体上定量抗氧化剂的效果。由于不涉及活的生物体系，化学测试结果与体内实际应用效果存在差异。
传统动物模式的抗氧化试验主要用于皮肤疾病发病机制和药物治疗的研究，以阐明氧化损伤与疾病的关系。局部氧化损伤动物模型多采用紫外线照射，如UVB照射可造成皮肤老化和紫外线损伤；也可采用皮肤直接涂抹化学物质，如不同浓度的变应原二硝基氯苯造成变应性皮肤炎症；也有的采用腹腔注射黄嘌呤氧化酶加次黄嘌呤造成氧化应激，或使动物暴露于过高温度下，或造成局部皮瓣缺血。这些模型易造成动物较大痛苦和情绪应激，而且动物皮肤与人体皮肤差异太大，试验结果可信度不高。现在这些模型已很少用于化妆品的抗氧化功效测试过程。
皮肤抗氧化与保湿、光损伤、老化密切相关，基于志愿者的抗氧化产品功效试验方法主要用于终产品的评价，通过试用产品后总体皮肤功能改善情况综合反应产品抗氧化的性能，其优点表现在能够在宏观的水平监测皮肤氧化的结果，缺点是特异性不强。
当前，各种功能性化妆品已成为人们日常生活必需品，在满足消费者改善肤质愿望的过程中，也给消费者带来了精神上的愉悦。越来越多的来源于合成化工产品、天然动植物提取物、生物活性因子等被开发利用为抗氧化物质，同时，也应注意到各种具有抗氧化功效的化学物质的广泛使用可能给消费者带来一定程度的潜在健康风险，而建立一种既安全、高效又人道（既替代动物实验）的毒性和功效的评估方法则是我们此发明中所解决的问题。
利用生物系统的抗氧化试验最好采用皮肤相关的细胞或组织，皮肤相关细胞包括永生化的角质细胞（如HaCat细胞）、成纤维细胞（L929，3T3），也可以采用人原代成纤维细胞和角质细胞。细胞系与正常人体来源的细胞在形态和基因结构方面存在一定差异。所以原代分离的皮肤细胞更能有效代表人体使用的实际情况。
利用体外重建的组织工程化皮肤是进行抗体氧化剂毒性和功效评价的另一途径，如欧莱雅公司的研发人员用体外重建的皮肤模型Episkin研究皮肤暴露于臭氧引起氧化应激的剂量关系和研究抗氧化剂的防护作用。美国科学家Grazul-Bilska用EpiDerm皮肤模型检测含抗氧化剂的保湿剂的总抗氧化能力(TAC)，体外孵育24h后检测培养基和组织中TAC和谷胱甘肽过氧化物酶活性（Grazul-Bilska AT,Bilski JJ,Redumer DA.Antioxidant capacity of3Dhuman skin EpidermTM model:effects of skin moisturizers.Int.jour.of cosmetic science.2009,31,201-208.）等，这些三维重建的组织工程化皮肤少数已实现商业化供应，为皮肤抗氧化剂的功效评价提供了材料来源，但其价格昂贵，短期无法实现大规模应用。
正常皮肤氧化和抗氧化是复杂的平衡体系，氧化损伤与皮肤功能的许多方面密切相关，目前针对某一个点建立检测方法的文献较多，例如免疫染色法，western blotting法，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，衰老相关的β-牛乳糖实验，谷胱甘肽S转移实验，活性氧族检测，分子探针法和线粒体损伤检测等方法。但是这些实验耗时长、费用高、操作难度大，实验室间变异高，不利于对疑似抗氧化物质进行高通量筛查和实验室间推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，该方法快速、简便、成本低，灵敏度高，可以对抗氧化物质进行快速有效的筛查并能广泛应用。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，含以下步骤：
(1)正常人原代细胞的分离、培养和鉴定以离体包皮为原料，经分离、培养和鉴定，获得正常人皮肤原代细胞；
(2)受试物的毒性检验将受试物配置一组具有浓度梯度的溶液，当正常人皮肤原代细胞的细胞密度长至80%～90%时，在多个正常人皮肤原代细胞中分别加入上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，在各组中分别加入MTT和DMSO溶液，用酶标法分别测各组的吸光度，并根据下述公式，计算细胞活性抑制率，细胞活性抑制率=[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷（阴性对照吸光度值－空白吸光度值）]×100%，根据细胞活性抑制率曲线，计算出皮肤抗氧化剂的20%抑制浓度（IC20）、半数致死抑制浓度（IC50）、70%抑制浓度（IC70），抗氧化剂的毒性判断过程如下：
（一）经口毒性预测：根据下述公式预测急性经口毒性试验的LD50，log(LD50[mmol/kg])=0.435×log(IC50[mmol/L])+0.625，如LD50＞5000mg/kg，预测该受试物实际无毒，可用于食品、药品抗氧化的进一步研究，如LD50＜500mg/kg，预测该受试物中等毒性，不适宜进一步开发，如500mg/kg＜LD50且＜5000mg/kg，预测该受试物可能微毒性，建议在该受试物的安全剂量范围内进行下一步研究；
（二）细胞毒性判定：选择受试物的可溶解最大浓度测试，如细胞活性抑制率IC＜30%时，表明在此浓度下该受试物可认为无细胞毒性，该受试物可用于皮肤抗氧化剂功效的进一步测试；
(3)受试物的配制及受试物浓度的确定将受试物配制一组具有浓度梯度的溶液；当正常人原代细胞的细胞密度长至80%时，将该组具有浓度梯度的受试物，分别加入多个正常人原代细胞中形成受试物组，并分别设置阳性对照、空白对照以及阴性对照，按照MTT法，测试细胞的活性，用酶标法测试各组的吸光度，按照公式：细胞活性=（受试物吸光度值—空白对照吸光度值）/（阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值），皮肤抗氧化功效的研究需要在外界因素造成皮肤细胞氧化损伤后的情况下进行，其中外界因素包括紫外线照射或化学试剂损伤，应选取细胞活性＞90%的受试物浓度为最高试验浓度；
(4)紫外线诱导辐射剂量的确定
正常人原代细胞的细胞密度长至80%时，设置具有梯度的UVA及UVB辐照量，按具有梯度的UVA及UVB辐照量分别照射多个正常人原代细胞形成正常人原代细胞组，并设置空白对照和阴性对照，利用酶标仪分别测试正常人原代细胞组、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：细胞活性=（紫外线照射正常人原代细胞组吸光度值—空白对照吸光度值）/（阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值），选取细胞活性在70%的辐照剂量进行抗氧化效果试验；
(5)受试物抗氧化效果的确认根据步骤(3)确定的受试物浓度和步骤(4)中确定的UVA及UVB辐照剂量，待正常人原代细胞长至80%时，分别设立未辐照组、辐照后加受试物组以及辐照后不加受试物组，以正常人原代皮肤细胞经紫外线照射后添加维生素C为阳性对照，测试各组的细胞凋亡、细胞周期、ROS水平以及SOD水平，并根据测试结果，判断各皮肤抗氧化剂的抗氧化效果。
本发明步骤(1)中所述的正常人皮肤原代细胞为正常人原代角质细胞、正常人原代人成纤维细胞、正常人黑色素细胞和正常人表皮干细胞中的一种或几种。
本发明步骤(2)中所述的受试物为皮肤疑似抗氧化剂。
本发明所述皮肤疑似抗氧化剂优选为维生素C、维生素E、原花青素、白藜芦醇、红石榴提取物、槲皮素提取物、淡竹叶提取物、虎杖提取物、何首乌提取物、淫羊藿提取物、姜黄素、丹参酮、2,6-二氯-3-硝基吡啶胺、阿魏酰哌啶类化合物、二羟基苯甲酰腙铜、曲酸、熊果苷、多元醇类、透明质酸或神经酰胺。
即本发明可以为已知的抗氧化活性物质，包括维生素C、维生素E、原花青素（可从葡萄籽中提取或直接购买）、白藜芦醇（可从植物中提取或直接购买）、其它植物提取物（如红石榴、槲皮素、淡竹叶等）、中药提取物（如虎杖、何首乌、淫羊藿等）和合成化合物（如姜黄素、丹参酮等），但由于不清楚他们在皮肤中应用是否也具有相似的作用，需要对其安全性和功效进行验证，所以也称之为皮肤疑似抗氧化剂，也可为预测具有抗氧化作用的物质（如2,6-二氯-3-硝基吡啶胺基等硫醇类衍生物、阿魏酰哌啶类化合物、二羟基苯甲酰腙铜等）；也可为预期通常无抗氧化性物质的筛查，如美白剂（曲酸、熊果苷）、保湿剂（多元醇类、透明质酸、神经酰胺）或其它未知化合物。
本发明步骤(2)-(3)中所述的溶剂优先顺序为DMEM培养基、PBS、无血清培养基、二甲基亚砜DMSO或无水乙醇。实际上，并不对这些溶剂进行限定，只是提供一些常用的优选试剂，应用时根据具体采用的抗氧化剂而进行选择即可。
本发明步骤(2)、(3)和(4)中用酶标法优选在550nm～570nm处分别测各组的吸光度。
本发明步骤(2)-步骤(3)中所述的阳性对照中含有已知的抗氧化剂、正常人原代细胞和正常人皮肤原代细胞的培养液，所述的受试物中含有受试物、正常人原代细胞和正常人皮肤原代细胞的培养液，所述的阴性对照中含有正常人原代细胞和正常人皮肤原代细胞的培养液，所述的空白对照中仅含有正常人皮肤原代细胞的培养液。
本发明步骤(4)中所述的阳性对照为正常人原代皮肤细胞经紫外线照射；所述的阴性对照为正常人原代细胞不经紫外线照射；所述的空白对照指仅含培养液并不经紫外线照射。
本发明步骤(4)中受试物的UVA辐射强度优选为5～6J/cm2，UVB辐照强度优选为0.6～0.8J/cm2。
本发明步骤(5)所述的中利用流式细胞仪测试各组的细胞凋亡、细胞周期和ROS水平，用酶标法测试各组的SOD水平。
本发明步骤(5)中根据各组的细胞凋亡、细胞周期、ROS水平以及SOD水平测试结果，经统计学分析，判断受试物抗氧化性程序如下：
（一）抗氧化作用：与阳性对照中紫外线造成的氧化损伤细胞相比，辐照后加受试物组细胞内ROS水平显著降低或SOD水平升高，和/或细胞凋亡和细胞周期各指标改善明显，具有统计学意义；
（二）抗氧化能力：与阳性对照中维生素C相比，得出ROS、SOD、细胞凋亡和细胞周期各指标改善的相对能力，预测其抗氧化能力。
本发明步骤(1)中正常人原代细胞的分离、培养和鉴定以离体包皮为原料，经分离、培养和鉴定，获得正常人原代细胞；
其中正常人原代细胞为正常人原代角质细胞、正常人原代人成纤维细胞、正常人黑色素细胞和正常人表皮干细胞中的一种或几种，其中正常人原代角质细胞、正常人原代人成纤维细胞、正常人黑色素细胞和正常人表皮干细胞的分离、培养和鉴定如下：
1、原代人角质细胞的分离和培养：
1.1基础培养基：商业化可购买的角质细胞无血清培养基K-SFM（Keratinocyte Serum-Free Medium）。
1.2细胞培养瓶的包被：将每毫升含50微克的胶原蛋白的Ⅳ型胶原包被液2～3mL加入一个新的25mL塑料培养瓶中，使包被液覆盖在培养瓶的底部，过夜或室温孵育2～3小时，将包被液吸出之后，或是将塑料培养瓶在室温下放置约2～3小时晾干，或是将已经包被好的培养瓶放在4℃保存备用；
1.3原代人角质细胞的分离：
1.3.1将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2～3次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织；将清洗干净的包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25%的裂解酶(DispasesⅡ)中分离表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小时或是4℃过夜12-18小时；
1.3.2将分离的皮片从裂解酶(DispasesⅡ)中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，将表皮收集在含有双抗（100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素）的0.01mol/L的PBS中；将表皮用此PBS液彻底清洗2-3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将表皮组织剪碎，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA彻底消化真皮，并用吸头反复吹打3分钟；加入血清中止消化，将所得的表皮细胞混悬液通过100目的滤器过滤，去除未消化分离的组织细胞；将得到的细胞悬液离心，室温下1200rpm/min，5分钟，得到的沉淀即为多种表皮细胞（黑色素细胞，表皮干细胞，角质形成细胞，以及少量的成纤维细胞）；将细胞沉淀用PBS清洗2次，随后用K-SFM培养基重悬；细胞悬液接种于包被过的细胞瓶中。
2、原代人成纤维细胞的分离和培养
2.1基础培养基：商业化可购买的粉剂，配制成DMEM培养基，其中加入3.7g NaHCO3，过滤除菌后添加青霉素100u/mL，链霉素100u/mL，分装后置于4℃冰箱保存，使用前将培养基与新生牛血清以9:1的比例混合制成。
2.2原代人成纤维细胞的分离：
2.2.1将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2-3次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织；将清洗干净的包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25%的裂解酶(DispasesⅡ)中分离表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小时或是4℃过夜12～18小时；
2.2.2将分离的皮片从裂解酶(DispasesⅡ)中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，将真皮收集在含有双抗（100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素）的0.01mol/L的PBS中；将真皮用此PBS液彻底清洗2～3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将真皮组织剪碎；
2.2.3将剪碎的真皮组织放入培养瓶中，均匀铺开，加入少量的培养基，待成纤维细胞爬出后去除组织碎片，加入含10%新生牛血清DMEM培养基培养。
3、人类皮肤原代黑色素细胞的培养
3.1人类皮肤黑色素细胞培养液的配置
3.1.1配制人类黑色素细胞培养液
A．完全培养液：将角质细胞无血清培养液K-SFM（Keratinocyte Serum-Free Medium）与胎牛血清按体积比9：1混合，并添加以下辅助因子：氢化可的松（Hydrocortisone），其终浓度为0.4ug/ML；牛胰岛素（insuilin），其终浓度为10ug/mL；L-谷氨酰胺（L-glutamine），其终浓度为6mmol；12-o-十四烷酰佛波醋酸酯-13（简写TPA，英文名12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate），其终浓度为81.06nmol/L；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（简写为IBMX，即3-isobutyl-1-methylxanthine），其终浓度为0.1nmol/L；转铁蛋白（transferrin），其终浓度为10ug/mL；霍乱毒素（cholera toxin，CT），其终浓度为10ng/mL；碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和表皮生长因子（EGF），两者的终浓度均为10ng/mL；
B．基础培养液：K-SFM与10%胎牛血清按体积比9：1混合，仅添加终浓度为6mmol的L-谷氨酰胺和终浓度为10ug/ML的胰岛素；
3.1.2细胞培养瓶的包被：将每毫升含50微克的胶原蛋白的Ⅳ型胶原包被液2～3mL加入一个新的25mL塑料培养瓶中，使包被液覆盖在培养瓶的底部，过夜或室温孵育2～3小时，将包被液吸出之后，或是将塑料培养瓶在室温下放置约2～3小时晾干，或是将已经包被好的培养瓶放在4℃保存备用；
3.2人类原代黑色素细胞的分离与培养
3.2.1将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2～3次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织；将清洗干净的包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25%的裂解酶(DispasesⅡ)中分离表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小时或是4℃过夜12～18小时；
3.2.2将分离的皮片从裂解酶(DispasesⅡ)中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，将表皮收集在含有双抗（100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素）的0.01mol/L的PBS中；将表皮用此PBS液彻底清洗2～3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将表皮组织剪碎，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA彻底消化真皮，并用吸头反复吹打3分钟；加入血清中止消化，将所得的表皮细胞混悬液通过100目的滤器过滤，去除未消化分离的组织细胞；将得到的细胞悬液离心，室温下1200rpm/min，5分钟，得到的沉淀即为多种表皮细胞（黑色素细胞，表皮干细胞，角质形成细胞，以及少量的成纤维细胞）；用K-SFM培养液清洗一次细胞后，将其用已经配置好的黑色素细胞培养液按照1×105cell/cm2～2×105cell/cm2重悬细胞，并将其接种到已经用collageⅣ包被好的细胞培养瓶中；隔天换一次培养液，大约10-14天，黑色素细胞即可长满培养瓶；
4、原代表皮干细胞的分离培养：
将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织，将包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；用质量浓度0.25%的裂解酶(Dispases)分离表皮和真皮，然后用生理盐水或D-Hanks液清洗3-5次；
表皮部分用质量浓度0.25%胰酶+0.02%EDTA(按1∶1体积比例混合)，4℃消化2±0.5小时，消化成单细胞悬液，然后接种于铺布有质量浓度为0.4%的Ⅳ型胶原包被的培养皿中，置5%CO2、37℃培养箱内快速黏附10～15min后，弃去未粘附细胞。将粘附细胞吹打脱离培养壁，按1×104个/cm2置于第2步1）制备的铺布有人羊膜的培养皿上继续培养，培养基为无LIF的ES完全培养基；或将细胞接种于用5μg/mL丝裂霉素C处理的小鼠3T3成纤维细胞滋养层上继续培养，所用培养基为全层皮肤专用培养基。
5、细胞鉴定
原代人角质细胞、成纤维细胞、表皮干细胞和黑色素细胞可以通过显微镜下观察、特征性蛋白免疫组化或基因学方法进行鉴定。
5.1角质细胞免疫组化鉴定
上述方法分离制备的角质细胞以鼠抗人广谱角质蛋白（P-CK）阳性和鼠抗人角蛋白17(CK17)单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈P-CK阳性和CK17阳性。
5.2成纤维细胞免疫组化鉴定
上述方法分离制备的成纤维细胞以鼠抗人波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈Vimentin阳性。
5.3表皮干细胞免疫组化鉴定
上述方法分离制备的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19(CK19)单克隆抗体和鼠抗人β1整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和β1整合素阳性。
5.4人类黑色素细胞的鉴定
可以采用以下三种方法中的一种或同时采用2-3种进行黑色素细胞鉴定：
5.4.1制备细胞爬片：将培养的原代人类黑色素细胞按照4×104cell/cm2密度接种于放置盖玻片的六孔板中，24小时后贴壁生长到70%时终止培养，制备爬片；
5.4.2L-DOPA染色鉴定：将步骤(1)所得细胞爬片经4℃PBS洗2次，5%甲醛固定30min，加入0.2%L-dopa，37℃染色5小时，结束染色后用PBS洗3次，10%甲醛后固定20min，甘油封片后在显微镜下观察，黑色素细胞中含有大量被L-dopa染色的黑色素颗粒；
5.4.3人类黑色素细胞特异性抗体MART-1免疫荧光染色：将步骤（1）所得细胞爬片，4℃PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30min，4℃PBS洗3次，每次5分钟，用正常山羊血清封闭30min，加一抗（MART-1用PBS按照1：100-1：200倍稀释），4度冰箱保湿过夜；4℃PBS洗3次，每次5分钟，加入二抗（德克萨斯红，用PBS按照1：200稀释），室温保湿避光孵育1小时；0.1%DAPI染液复染细胞核，室温避光孵育10min，PBS洗3次，每次5分钟，缓冲甘油封片，在绿光激发下，相差荧光显微镜观察可见黑色素细胞呈强烈红色荧光；
5.4.4电镜照片：按常规方法收集细胞，制备扫描电镜照片，观察到细胞中大量黑色素颗粒。
其中用质量浓度0.25%裂解酶(Dispases)分离表皮和真皮，是将表皮和真皮在37℃的温度下经质量浓度0.25%裂解酶消化3±0.5小时；或在4℃的温度下经质量浓度0.25%裂解酶消化12-18小时。
Ⅳ型胶原为商品，主要成份为来源于人胎盘的Ⅳ型胶原粉末。
角质细胞无血清培养基KSM（Keratinocyte Serum-Free Medium）为商业化购自国外公司，如美国BioWhittaker公司的KBM(Keratinocyte Basal Medium)或GIBCO公司的DK-SFM（Defined Keratinocyte Serum FreeMedium）。
0.25%胰酶/0.02%EDTA为商业化购买自GIBCO公司。
黑色素细胞培养液中的辅助因子：insulin，TPA，IBMX,transpferrin，CT均商业化购自sigma公司；L-谷氨酰胺商业化购自invitrogen公司；碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子商业化购自peprotech公司。
MTT英文全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料，MTT比色法是一种常用检测细胞存活和生长的方法。
本发明中所用的多种原代皮肤细胞的培养技术，该培养技术成熟，培养容易周期短，重复性好，而且价格低廉。
本发明中因为细胞来源于正常人体皮肤，故试验结果能真实地反映正常人皮肤组织中的多种细胞（成纤维细胞、角质细胞）对受测试物质的反应效果，因而能满足化妆品领域对抗体氧化剂安全性和功效性评价的要求。该组合方法快速、简便、成本低，可以对抗氧化物质进行快速有效的筛查。
本发明步骤(2)中的受试物的毒性检验，具体可以包括以下步骤：
1.受试物贮备溶液的配制
根据受试物的溶解特性，选择溶剂，顺序为培养基、无血清培养基、DMSO和无水乙醇，此处仅为列举，可根据受试物的情况进行具体的选择；对于溶解在DMSO或者无水乙醇的化学物，用于细胞试验时，在空白对照组或全部测试浓度组中最终的DMSO或者乙醇的浓度应为0.5%(v/v)，根据溶解性试验确定的化学物的最大可溶解浓度制备该测试化学物的母液，以该母液为基准，可以以一个log单位为基础进行连续的稀释。
可以维生素C作为美白化学物质毒性试验的对照参考标准品，也可以采用其它已知的具有抗氧化作用的物质作为参考标准品，用培养基溶解，先配制维生素C的贮备溶液，浓度为1mg/mL，并用0.22μm滤器过滤除菌，分装，-200C保存；
2.将生长至80%-90%融合的多种皮肤细胞（角质细胞、成纤维细胞、表皮干细胞或黑色素细胞）用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化，1200rpm/min，5min离心，得到的细胞沉淀，用相应细胞的完全培养液制成密度为1×104细胞/孔的悬液，每孔100ul，接种于96孔板，37度，5%的CO2培养箱中培养2天；
3.用不同细胞的相应完全培养液将待测受试物稀释成不同终浓度的溶液，将96孔板中原培养液移走，加入新鲜的含有受试物的培养液（每孔100μL，80μL基础培养液，20μL含不同浓度的待测抗氧化剂），同时设立阳性对照孔（有细胞及其培养液，加入维生素C），阴性对照孔(仅有细胞及其培养液)和空白孔（无细胞，仅有培养液），每个浓度设置6个复孔，37度，5%的CO2培养箱中培养24小时；
4.加入MTT溶液和DMSO溶液：在每孔中加入已经配置好的5mg/mL的MTT溶液20μL，在37度孵化4小时，移走上清液，每孔中加入DMSO150μL，37度孵化30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度；
5.结果的分析：细胞活力抑制率=[1－(受试物各浓度平均吸光度值－空白孔平均吸光度值)÷（阴性对照组平均吸光度值－空白孔平均吸光度值）]×100%；根据细胞活性抑制率曲线，计算得出待测化合物的20%抑制剂量（IC20）、半数致死剂量（IC50）、70%抑制剂量（IC70）。抗氧化剂的毒性判断过程如下：
（一）经口毒性预测：根据角质细胞和成纤维细胞的结果，依据下述公式预测急性经口毒性试验的LD50：log(LD50[mmol/kg])=0.435x log(IC50[mmol/L])+0.625。如果LD50＞5000mg／kg，预测该化合物实际无毒，可用于食品、药品抗氧化的进一步研究，如果LD50＜500mg／kg，预测该化合物中等毒性，不适宜进一步开发，如果LD50＞500mg／kg，且＜5000mg／kg，预测该化合物可能微毒性，建议在该化合物的安全剂量范围内进行下一步研究。
（二）细胞毒性判定：细胞活性抑制率（IC）＜30%的浓度可认为无细胞毒性，在这个浓度范围内可用于皮肤抗氧化剂功效的测试。
本发明步骤(3)中皮肤抗氧化剂的配制及皮肤抗氧化剂浓度的确定，将皮肤抗氧化剂溶于溶剂中，并按照浓度梯度进行稀释后，获得一组具有浓度梯度的皮肤抗氧化剂；当正常人原代细胞的细胞密度长至80%时，将该组具有浓度梯度的皮肤抗氧化剂，分别加入多个正常人原代细胞中形成皮肤抗氧化剂组，并分别设置空白对照以及阴性对照，按照MTT法，测试细胞的活性，用酶标法测试各组的吸光度，按照公式：细胞活性=（皮肤抗氧化剂组吸光度值—空白对照吸光度值/阴性对照吸光度值，选取细胞活性在90%以上的皮肤抗氧化剂浓度进行抗氧化效果试验。
例如待细胞在细胞瓶中密度长至80%时，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时，根据皮肤抗氧化剂理化特性设定浓度范围，将稀释的皮肤抗氧化剂添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个副孔。如使用DMSO，乙醇等细胞毒性物质，其在稀释液中的终浓度不得高于0.5%。添加皮肤抗氧化剂后放入培养箱中继续孵化18～24小时，结束后每孔加20μL，5mg/ml MTT溶液，作用4小时后，加入DMSO溶解结晶物，混匀震荡10min，用酶标仪波长在570nm处测量每孔读数。
细胞活性计算：
细胞活性=（皮肤抗氧化剂孔OD值—空白对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值）；
选取细胞活性在90%以上的皮肤抗氧化剂浓度进行实验。
细胞包括皮肤角质细胞、成纤维细胞、黑色素细胞和表皮干细胞中的一种或多种。
本发明步骤(4)中紫外线诱导辐射剂量的确定时，可以建立紫外线诱导多种皮肤细胞氧化损伤模型。待细胞在细胞瓶中密度长至80%时，以1×104/孔将细胞铺96孔板中，放入培养箱中孵育24小时，使用PBS替换培养基，将96孔板置于4℃平整冰袋上，开启日光模拟仪，使用照度计测量UVA及UVB辐照强度，每个辐照剂量设6个副孔。辐照后将PBS更换为新培养基，后放入培养箱中继续孵化18～24小时，孵化结束后每孔加5mg/mLMTT溶液20μL，作用4小时，加入DMSO溶解结晶物，混匀震荡10min，用酶标仪波长在570nm处测量每孔读数。
细胞活性计算：细胞活性=（紫外线照射正常细胞OD值—空白对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值）。选取细胞活性在70%的辐照剂量进行抗氧化效果试验。
建议原代角质细胞、成纤维细胞、黑色素细胞和表皮干细胞照射剂量：UVA及UVB照射强度分别为（5～6）J/cm2及（0.6～0.8）J/cm2。
本发明步骤(4)中皮肤抗氧化剂抗氧化效果的确认根据步骤(2)确定的皮肤抗氧化剂浓度和步骤(3)中确定的UVA及UVB辐照剂量，待正常人原代细胞长至80%时，设立未辐照组、辐照后加皮肤抗氧化剂组以及辐照后不加皮肤抗氧化剂组，开启UVA及UVB辐射后，测试各组的细胞凋亡、细胞周期、ROS水平以及SOD水平，并根据测试结果，判断各皮肤抗氧化剂的抗氧化效果。
细胞水平抗氧化过程具体可以采用如下过程：待细胞在75cm2的细胞瓶中密度长至80%时，以400×104/孔将细胞铺于直径为75mm的细胞培养皿中，放入培养箱中孵育24小时，设未辐照皿，辐照后加皮肤抗氧化剂皿，及辐照后不加皮肤抗氧化剂皿。开启日光模拟仪，预热仪器15分钟，使用照度计测量UVA及UVB辐照强度，辐照前使用常温PBS清洗培养皿1次，未辐照皿与辐照皿处理一致，辐照皿使用PBS替代培养基，未辐照皿更换新培养基后放于培养箱中。辐照皿放置于平整的4℃冰袋上，辐照后添加皮肤抗氧化剂，避光，于细胞培养箱中继续孵化18-24小时。日光模拟仪为商业化购买的Honle SOL500紫外线模拟仪及滤光片。细胞包括皮肤角质细胞、成纤维细胞、黑色素细胞和表皮干细胞中的一种或多种。
本发明利用紫外线诱导皮肤细胞的氧化损伤模型，模拟人体皮肤暴露于紫外线的情况，通过加入抗氧化物质，判定其能否保护受诱导的细胞免于氧化损伤或后续的凋亡发生。该模拟方法能够较为直观的反应紫外线氧化损伤及抗氧化物对于皮肤的作用，敏感程度高，能满足常规的氧化物质筛检试验。
细胞凋亡测定：用试剂盒中Binding buffer 1mL重悬调整细胞密度为100×104个，取100μL至流式管，加入5μLFITC和5μLPI，避光染色15分钟，再加400μL的Binding buffer，混匀，使用流式细胞仪定量检测反应细胞凋亡的FITC荧光的变化。
流式细胞仪的结果直接反映细胞凋亡情况，依据细胞生物学相关理论，将晚期凋亡细胞列为死亡细胞，其占流式细胞仪所收集细胞的百分比为细胞凋亡率。
具体为：将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，离心，用40℃PBS清洗2次，用试剂盒中Binding buffer 1ml重悬调整细胞密度为100×104个，取100μL至流式管，加入5μL FITC和5μLPI，避光染色15分钟，再加400μL的Binding buffer，混匀，使用流式细胞仪定量检测反应细胞凋亡的FITC荧光的变化。所用试剂盒为BD公司细胞凋亡试剂盒，可商业化购买。所用流式细胞仪为检测细胞功能的仪器，如BD公司的FACSCanto II流式细胞仪或贝克曼库尔特有限公司的EPICS ALTRA。
细胞周期测定：调整细胞密度为100×104个，参考细胞周期试剂盒说明进行清洗，染色。用流式细胞仪检测。其结果用DNA multicycle for windows软件分析，划分其G0/G1期，S期，G2期细胞分布情况。
具体为：将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，离心，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，参考细胞周期试剂盒说明进行清洗，染色。用流式细胞仪检测。所用试剂盒为用BD公司细胞周期试剂盒。
ROS水平的测定：将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，离心，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用ROS试剂盒进行探针装载孵化。用流式细胞仪检测。所用ROS试剂盒可多商业化购买。
ROS抑制水平=[1-（各化合物浓度孔的吸光度值－化合物孔蛋白浓度）÷(阴性对照孔的吸光度值－阴性对照组蛋白浓度)]×100%。
SOD水平的测定：将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，离心，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用超声细胞破碎仪粉碎细胞，离心，取上清液，用SOD（WST法）试剂盒染色，用酶标仪在490nm处读取OD值。所用SOD试剂盒可多商业化购买。
SOD抑制率（%）={[（A对照-A对照空白）-（A测定-A测定空白）]÷（A对照-A对照空白）}×100%
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明体外标准化培养的正常人皮肤细胞分裂增殖能力强、标准化程度高、批间差异小，具有与体内相同的活性和功能；
(2)本发明利用正常健康人皮肤细胞比动物或人源的细胞系获得的结果更可信；从定性和定量两方面评价待测物质的毒性作用和抗氧化功效；
(3)本发明建立的方法可以代替活体动物和人类皮肤，直接用于化学品、化妆品、药品等产品中抗氧化物质的毒性和功效试验；
(4)本发明利用多种正常人原代皮肤细胞分析受试物毒性和功效性，既能满足活性原料潜在的毒性检测的需要，又能分析其抗体氧化功能的强弱及可能机制。
附图说明
图1是实施例1-4中用于抗氧化测试的试验系统；其中A图是实施例1中采用的角质细胞，B图是实施例2中采用的成纤维细胞，C图是实施例3中采用的黑色素细胞，D图是实施例4中采用的表皮干细胞；
图2是实施例1中不同处理的角质细胞，其中A：照射后的细胞，B：未经照射的空白对照，C：照射后加维生素C；
图3是实施例2中不同处理的成纤维细胞，A：紫外线照射后的细胞，B：紫外线照射后维生素C，B：紫外线照射后加花青素；
图4是实施例3中不同处理的黑色素细胞，A：曲酸浓度与细胞活性关系；B：紫外线照射后的黑色素细胞（多巴染色），C：紫外线照射后加曲酸的黑素细胞
图5是实施例4中不同处理的表皮干细胞，A：紫外线照射后的表皮干细胞；B：紫外线照射后的加维生素C，C：紫外线照射后加白藜芦醇；
图6是实施例1中紫外线辐照组流式细胞凋亡结果图；
图7是实施例1中紫外线辐照后加维生素C组流式细胞凋亡结果图；
图8是实施例2中紫外线辐照组流式细胞周期结果图；
图9是实施例2中紫外线辐照后加原花青素组流式细胞周期结果图；
图10是实施例3中照射组流式细胞凋亡结果图；
图11是实施例4中对照组流式细胞周期结果图；
图12是实施例4中辐照加白藜芦醇组流式细胞周期结果图。
具体实施方式
实施例1角质细胞检测维生素C的细胞毒性及抗氧化功效
1、原代人角质细胞的分离、培养和鉴定：
1）将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2～3次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织；将清洗干净的包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25%的裂解酶(DispasesⅡ)中分离表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小时或是4℃过夜12～18小时；
2）将分离的皮片从裂解酶(DispasesⅡ)中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，将表皮收集在含有双抗（100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素）的0.01mol/L的PBS中；将表皮用此PBS液彻底清洗2～3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将表皮组织剪碎，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA彻底消化真皮，并用吸头反复吹打3分钟；加入血清中止消化，将所得的表皮细胞混悬液通过100目的滤器过滤，去除未消化分离的组织细胞；将得到的细胞悬液离心，室温下1200rpm/min，5分钟，得到的沉淀即为多种表皮细胞（黑色素细胞，表皮干细胞，角质形成细胞，以及少量的成纤维细胞）；将细胞沉淀用PBS清洗2次，随后用K-SFM培养基重悬；细胞悬液接种于用Ⅳ型胶原蛋白包被液包被过的细胞瓶中。
3）人原代角质细胞的鉴定：
原代角质细胞不铺生长，呈多角形（图1中A图）。将分离制备的角质细胞以鼠抗人广谱角质蛋白（P-CK）阳性和鼠抗人角蛋白17(CK17)单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈P-CK阳性和CK17阳性。
2、细胞毒性测定
（1）受试物浓度的确定及配制：根据维生素C的理化特性，用分析天平称取0.0176g维生素C，用DMEM培养基为溶剂制备成0.1mol/L的母液，待用。
（2）铺板：待角质细胞在细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，加入新的培养基重悬，在40×显微镜下计数，调整浓度，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时。
（3）受试物的添加：将稀释的维生素C添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个副孔。使用多通道移液器以减少空间差异。添加维生素C后放入培养箱中继续孵化18～24小时，孵育结束后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入20μL，5mg/mL MTT溶液，置于培养箱中继续孵化4h，加入DMSO溶解结晶物，每孔加入100μL，置于振荡器上，混匀震荡10min。
（4）酶标仪测量及细胞活性计算：用酶标仪在570nm处测量步骤（3）加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值，并根据下述公式，计算细胞活性抑制率，细胞活性抑制率=[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷（阴性对照吸光度值－空白吸光度值）]×100%，根据细胞活性抑制率曲线，通过公式计算IC50（半数抑制浓度）、IC10（10%细胞抑制浓度）：
也可以根据细胞活性公式：细胞活性=（受试物孔OD值—空白对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值）×100%，计算出细胞活性为50%以及细胞活性为90%时的IC50（半数抑制浓度）、IC10（10%细胞抑制浓度），其中细胞活性为90%时的IC10也为细胞抑制率为10%时的IC10。
（5）细胞毒性分析：从IC50的结果，根据下述公式预测急性经口毒性试验的LD50：log(LD50[mmol/kg])=0.435×log(IC50[mmol/L])+0.625。如果LD50＞5000mg／kg，则该化合物实际无毒，可用于化妆品的开发。
经计算维生素C的IC50为763.5μmol/L，通过公式得出LD50＞5000mg／kg，表明维生素C无细胞毒性。
选取细胞活性在90%以上的皮肤抗氧化剂浓度进行实验，在此浓度下进行抗氧化特性的研究，经测试VC的IC10为100μmol/L。
3、抗氧化功效测定
（1）紫外线诱导人原代角质细胞氧化损伤模型
待角质细胞在细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时，使用PBS替换细胞培养基（为避免紫外线对培养基成份的影响，紫外线照射时应换成磷酸缓冲液），将96孔板置于4℃平整冰袋上，开启日光模拟仪，使用照度计测量UVA及UVB辐照强度，每个辐照剂量设6个副孔。设辐照剂量为0J、2J、5J、10J、15J五组。辐照后将PBS更换为新培养基，后放入培养箱中继续孵化18～24小时，孵化结束后每孔加5mg/ml MTT溶液20μL，作用4小时，加入DMSO溶解结晶物，混匀震荡10min。
用酶标仪在570nm处测量步骤（1）加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值。细胞活性=（受试物孔OD值—空白对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值）×100%。选取细胞活性在70%的辐照剂量进行试验。此时，UVA及UVB照射强度分别为5J/cm2及0.6J/cm2。
经紫外线照射后的角质细胞形态如图2中A图所示。
（2）细胞模拟太阳光辐照
待细胞在75cm2的细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以400×104/皿将细胞铺于直径为75mm的细胞培养皿中，放入培养箱中孵育24小时，设未辐照皿，辐照后加皮肤抗氧化剂皿（100μmol/L），及辐照后不加皮肤抗氧化剂皿。开启日光模拟仪，预热仪器15分钟，使用照度计测量UVA及UVB辐照强度（5J/cm2及0.6J/cm2），辐照前使用常温PBS清洗培养皿1次，未辐照皿与辐照皿处理一致，辐照皿使用PBS替代培养基，未辐照皿更换新培养基后放于培养箱中。辐照皿放置于平整的4℃冰袋上，辐照后添加维生素C，另一皿辐照后更换培养基，避光，于细胞培养箱中继续孵化18～24小时。
未经紫外线照射的空白对照细胞形态如图2B所示，添加VC后的细胞形态如图2C所示，经抗氧化修复后细胞形态恢复正常。
（3）细胞凋亡的测定：
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用4℃PBS清洗2次，使用BD公司的FACSCanto II流式细胞仪在FITC荧光通道测量。所用试剂盒为BD公司细胞凋亡试剂盒，可商业化购买。经测定角质细胞在氧化损伤后添加VC，细胞凋亡率各项指标，Q2（中晚期凋亡和死亡细胞率）为6.6%，Q3（存活细胞率）为70.8%，Q4（早期凋亡细胞率）为18.0%。照射组Q2、Q3、Q4分别为45.6%、37.4%和12.6%。
紫外线照射组流式细胞调亡结果见图6，添加VC后流式细胞调亡结果见图7。
（4）细胞周期的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用BD公司细胞周期试剂盒进行清洗，染色。用流式细胞仪检测。经测定角质细胞在氧化损伤后添加VC，细胞周期分别为：G0/G1（DNA合成前期）为69.3%，S（DNA合成期）为20.0%，G2（DNA合成后期）为2.7%。照射组G0/G1、S和G2期分别为80.7%、12.9%和0.8%。
（5）ROS水平的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用北京普利莱生物科技有限公司的ROS试剂盒进行探针装载孵化。用流式细胞仪检测。经测定角质细胞在氧化损伤后添加VC，细胞内ROS水平为110.9。照射组细胞内ROS水平为798.1。
（6）SOD水平的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用超声细胞破碎仪粉碎细胞，离心，取上清液，用南京建成生物科技有限公司的SOD（WST法）试剂盒染色，用酶标仪在490nm处读取OD值。经测定角质细胞在氧化损伤后添加VC，细胞内SOD水平为47.13U·mg prot-1。照射组细胞内SOD水平为23.4U·mg prot-1。
经统计学分析，细胞氧化损伤后添加VC，细胞内ROS水平显著下降，SOD水平显著升高，中晚期调亡细胞显著减少，存活细胞明显上升，进入DNA合成期的细胞增多，细胞活性恢复明显。结果表明VC是一种活性比较强的抗氧化剂。
实施例2成纤维细胞检测原花青素细胞毒性及抗氧化功效
1、原代人成纤维细胞的分离、培养和鉴定
(1)将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2～3次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织；将清洗干净的包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25%的裂解酶(DispasesⅡ)中分离表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小时或是4℃过夜12～18小时；
(2)将分离的皮片从裂解酶(DispasesⅡ)中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，将真皮收集在含有双抗（100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素）的0.01mol/L的PBS中；将真皮用此PBS液彻底清洗2～3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将真皮组织剪碎；将剪碎的真皮组织放入培养瓶中，均匀铺开，加入少量的培养基，待成纤维细胞爬出后去除组织碎片，加入培养基培养。
（3）成纤维细胞免疫组化鉴定
制备的成纤维细胞呈长梭形生长，将上述方法分离制备的成纤维细胞以鼠抗人波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈Vimentin阳性。
制成的成纤维细胞的结构图如图1B中所示。
2、人原代成纤维细胞对原花青素细胞毒性测定
（1）受试物浓度的确定及配制：根据原花青素的理化特性，用分析天平称取50mg原花青素，用无血清培养基为溶剂制备储备液，配制成5g/L的母液，待用。
（2）铺板：待成纤维细胞在细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时。
（3）受试物的添加：将原花青素母液，用培养液稀释成终浓度为500mg/L、250mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、10mg/L的6个浓度梯度的使用液。将稀释的原花青素添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个副孔。使用多通道移液器以减少孔间差异。置于培养箱中孵育18～22小时。孵育结束后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入20μl，5mg/mL MTT溶液，避光。置于培养箱中继续孵化4h。孵化后，加入DMSO，每孔加入100μL，置于振荡器上，振荡10min后。
（4）酶标仪测量及细胞活性计算：用酶标仪在570nm处测量步骤（3）加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值。通过公式计算IC50（半数抑制浓度，即50%细胞活性时受试物浓度）、IC10（10%细胞抑制浓度，即90%细胞活性时受试物浓度）：
细胞活性=（受试物孔OD值—空白对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值×100%—空白对照孔OD值）。
（5）细胞毒性分析
根据下述公式预测急性经口毒性试验的LD50，log(LD50[mmol/kg])=0.435x log(IC50[mmol/L])+0.625。如果LD50＞5000mg／kg，则该化合物实际无毒，可用于化妆品的开发。
得到试验结果为：500mg/L时细胞存活率为0.1%、250mg/L时为1.2%、100mg/L为60.35%、50mg/L时为91.25%、25mg/L时为95.83%、10mg/L时为98.97%。经统计得到原花青素的IC50为77.4mg/L。经公式计算LD50＞5000mg／kg，表明该化合物无细胞毒性。
选取细胞活性在90%的皮肤抗氧化剂浓度进行实验，即以50mg/L为原花青素测试浓度，在此浓度下进行抗氧化特性的研究。
3、原花青素抗氧化功效测定
（1）紫外线诱导人原代成纤维细胞氧化损伤模型
待成纤维细胞在细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时，使用PBS替换培养基，将96孔板置于4℃平整冰袋上，开启日光模拟仪，使用照度计测量UVA及UVB辐照强度，每个辐照剂量设6个副孔。设辐照剂量为0J、2J、5J、10J、15J五组。辐照后将PBS更换为新培养基，后放入培养箱中继续孵化18-24小时，孵化结束后每孔加5mg/mL MTT溶液20μL，作用4小时，加入DMSO溶解结晶物，混匀震荡10min，用酶标仪波长在570nm处测量每孔读数。用酶标仪在570nm处测量步骤（1）加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值。
细胞活性=（受试物孔OD值—空白对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值）×100%
所得结果为0J时细胞存活率为100%、2J（UVA）/0.24（UVB）时细胞存活率为123.5%、5J（UVA）/0.6（UVB）时细胞存活率为74.3%、10J（UVA）/0.1.2（UVB）时细胞存活率为55%、15J（UVA）/1.8（UVB）时细胞存活率为20.37%。选取细胞活性在70%的辐照剂量进行试验。经测定用于成纤维细胞的UVA及UVB照射强度分别为5J/cm2及0.6J/cm2。经紫外线照射后的成纤维细胞形态如图3A所示。
（2）细胞模拟太阳光辐照
待细胞在75cm2的细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以400×104/皿将细胞铺于直径为75mm的细胞培养皿中，放入培养箱中孵育24小时，设未辐照皿，辐照后加皮肤抗氧化剂皿，及辐照后不加皮肤抗氧化剂皿。开启日光模拟仪，预热仪器15分钟，使用照度计测量UVA及UVB辐照强度，辐照前使用常温PBS清洗培养皿1次，未辐照皿与辐照皿处理一致，辐照皿使用PBS替代培养基，未辐照皿更换新培养基后放于培养箱中。辐照皿放置于平整的4℃冰袋上，辐照后添加原花青素，另一皿辐照后更换培养基，避光，于细胞培养箱中继续孵化18-24小时。
经抗氧化剂原花青素保护的皮肤成纤维细胞如图3C中所示。图3B是添加阳性对维生素C的成纤维细胞图。
（3）细胞凋亡的测定：
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，用40C PBS清洗2次，用试剂盒中Binding buffer 1mL重悬调整细胞密度为100×104个，使用BD公司细胞凋亡试剂盒进行染色，使用BD公司的FACSCanto II流式细胞仪在FITC荧光通道测量。经测定成纤维细胞在氧化损伤后添加原花青素，细胞凋亡率各项指标，Q2（中晚期凋亡和死亡细胞率）为2.2%，Q3（存活细胞率）为69.2%，Q4（早期凋亡细胞率）为20.4%。照射组Q2、Q3、Q4分别为45.5%、41.4%和13.2%。
紫外线照射组流式细胞调亡结果见图8，添加原花青素后流式细胞调亡结果见图9。
（4）细胞周期的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用BD公司细胞周期试剂盒进行清洗，染色。用流式细胞仪检测。经测定成纤维细胞在氧化损伤后添加原花青素，细胞周期分别为：G0/G1（DNA合成前期）为65.6%，S（DNA合成期）为13.2%，G2（DNA合成后期）为11.9%。照射组G0/G1、S和G2期分别为88.3%、3.2%和8.2%。
（5）ROS水平的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用北京普利莱生物科技有限公司的ROS试剂盒进行探针装载孵化。用流式细胞仪检测。经测定成纤维细胞在氧化损伤后添加原花青素，细胞内ROS水平为189.4。照射组细胞内ROS水平为1194.3。
（6）SOD水平的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用超声细胞破碎仪粉碎细胞，离心，取上清液，用南京建成生物科技有限公司的SOD（WST法）试剂盒染色，用酶标仪在490nm处读取OD值。经测定成纤维细胞在氧化损伤后添加原花青素，细胞内SOD水平为48.98U·mg prot-1。照射组细胞内SOD水平为35.7U·mg prot-1。
经统计学分析，细胞氧化损伤后添加原花青素，细胞内ROS水平显著下降，SOD水平显著升高，中晚期调亡细胞显著减少，存活细胞明显上升，进入DNA合成期的细胞增多，细胞活性恢复明显。结果表明原花青素是一种活性比较强的抗氧化剂。
实施例3皮肤黑色素细胞检测曲酸的细胞毒性及抗氧化功效
1、人类原代黑色素细胞的分离与培养
1.1将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.01mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2-3次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织；将清洗干净的包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；将皮片展开，表皮朝向上方浸泡于质量浓度0.25%的裂解酶(DispasesⅡ)中分离表皮和真皮，方式有37℃消化2±0.5小时或是4℃过夜12～18小时；
1.2将分离的皮片从裂解酶(DispasesⅡ)中取出，用镊子轻轻将表皮和真皮分离，将表皮收集在含有双抗（100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素）的0.01mol/L的PBS中；将表皮用此PBS液彻底清洗2～3次，用已经灭菌的眼科手术剪彻底将表皮组织剪碎，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA彻底消化真皮，并用吸头反复吹打3分钟；加入血清中止消化，将所得的表皮细胞混悬液通过100目的滤器过滤，去除未消化分离的组织细胞；将得到的细胞悬液离心，室温下1200rpm/min，5分钟，得到的沉淀即为多种表皮细胞（黑色素细胞，表皮干细胞，角质形成细胞，以及少量的成纤维细胞）；用K-SFM培养液清洗一次细胞后，将其用已经配置好的黑色素细胞培养液按照1×105cell/cm2～2×105cell/cm2重悬细胞，并将其接种到已经用collageⅣ包被好的细胞培养瓶中；隔天换一次培养液，大约10～14天，黑色素细胞即可长满培养瓶；
1.3人类黑色素细胞的鉴定
1.3.1制备细胞爬片：将培养的原代人类黑色素细胞按照4×104cell/cm2密度接种于放置盖玻片的六孔板中，24小时后贴壁生长到70%时终止培养，制备爬片；
1.3.2L-DOPA染色鉴定：将步骤(1)所得细胞爬片经4℃PBS洗2次，5%甲醛固定30min，加入0.2%L-dopa，37℃染色5小时，结束染色后用PBS洗3次，10%甲醛后固定20min，甘油封片后在显微镜下观察，黑色素细胞中含有大量被L-dopa染色的黑色素颗粒；
1.3.3电镜照片：按常规方法收集细胞，制备扫描电镜照片，观察到细胞中大量黑色素颗粒。
黑色素细胞鉴定图片如图1C。
2、细胞毒性测定
（1）皮肤抗氧化剂浓度的确定及配制：先用分析天平在无菌环境下称取曲酸（kojic acid），用过滤除菌的PEH液（先将2-丙二醇，无水乙醇和超纯水按5：3：2配制，再用0.01mol/L的PBS稀释10倍）溶解，使其终浓度达到40mg/ml，分装，4℃保存。实验过程中的操作尽量做到避光。
（2）铺板：待黑色素细胞在细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，加入新的培养基重悬，在40×显微镜下计数，调整浓度，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时。
（3）受试物的添加：取曲酸储备液，用黑色素细胞培养液配制6个浓度梯度的使用液，即0.25mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL，4mg/mL和8mg/mL。将稀释的曲酸添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个副孔。使用多通道移液器以减少空间差异。添加皮肤抗氧化剂后放入培养箱中继续孵育18～22小时。孵育结束后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入20μl，5mg/mL MTT溶液，避光。置于培养箱中继续孵化4h。孵化后，加入DMSO，每孔加入100μL，置于振荡器上，振荡10min。
（4）酶标仪测量及细胞活性计算：用酶标仪在570nm处测量步骤（3）加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值。通过公式计算IC50（半数抑制浓度）、IC10（10%细胞抑制浓度）：
细胞活性=（受试物孔OD值—空白对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值）×100%
（5）细胞毒性分析
根据下述公式预测急性经口毒性试验的LD50，log(LD50[mmol/kg])=0.435x log(IC50[mmol/L])+0.625。如果LD50＞5000mg／kg，则该化合物实际无毒，可用于化妆品的开发。
经统计得到曲酸的IC50为1.24mg/L。经公式计算LD50＞5000mg／kg，表明该化合物无黑色素细胞毒性。
选取细胞活性在90%以上的皮肤抗氧化剂浓度进行实验，在此浓度下进行抗氧化特性的研究。经测试曲酸的IC90为0.637±0.051mg/mL。
黑色素细胞活性与曲酸浓度的效应关系如图4A所示。
3、曲酸抗氧化功效测定
（1）紫外线诱导黑色素细胞氧化损伤模型
待黑色素细胞在细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，准确计数后，调整浓度，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时，使用PBS替换培养基，将96孔板置于4℃平整冰袋上，开启日光模拟仪，使用照度计测量UVA及UVB辐照强度。设辐照剂量为0J、2J、5J、10J、15J五组。辐照后将PBS更换为新培养基，后放入培养箱中继续孵化18-24小时，孵化结束后每孔加5mg/mL MTT溶液20μL，作用4小时，加入DMSO溶解结晶物，混匀震荡10min，用酶标仪波长在570nm处测量每孔读数。用酶标仪在570nm处测量步骤（1）加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值。
细胞活性=（受试物孔OD值—空白对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值）×100%
所得结果为0J时细胞存活率为97%、2J时细胞存活率为81.7%、5J时细胞存活率为72.5%、10J时细胞存活率为26.4%、15J时细胞存活率为9.7%。选取细胞活性在70%的辐照剂量进行试验。经测定用于黑色素细胞的UVA及UVB照射强度分别为5J/cm2及0.6J/cm2。紫外线照射后表皮干细胞形态如图4B所示。
（2）细胞模拟太阳光辐照
待黑色素细胞在75cm2的细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以500×104/皿将细胞铺于直径为75mm的细胞培养皿中，放入培养箱中孵育24小时，设未辐照皿，辐照后加皮肤抗氧化剂皿（100μmol/L），及辐照后不加皮肤抗氧化剂皿。开启日光模拟仪，预热仪器15分钟，使用照度计测量UVA及UVB辐照强度（5J/cm2及0.6J/cm2），辐照前使用常温PBS清洗培养皿1次，未辐照皿与辐照皿处理一致，辐照皿使用PBS替代培养基，未辐照皿更换新培养基后放于培养箱中。辐照皿放置于平整的4℃冰袋上，辐照后添加维生素C，另一皿辐照后更换培养基，避光，于细胞培养箱中继续孵化18-24小时。
紫外线照射后添加曲酸的细胞形态如图4C所示。
（3）细胞凋亡的测定：
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，用40C PBS清洗2次，用试剂盒中Binding buffer 1mL重悬调整细胞密度为100×104个，使用BD公司细胞凋亡试剂盒进行染色，使用BD公司的FACSCanto II流式细胞仪在FITC荧光通道测量。经测定黑色素细胞在氧化损伤后添加曲酸，细胞凋亡率各项指标，Q2（中晚期凋亡和死亡细胞率）为47.5%，Q3（存活细胞率）为38.3%，Q4（早期凋亡细胞率）为15.9%。照射组Q2、Q3、Q4分别为%40.5%、38.4%和18.2%。
紫外线照射组添加曲酸流式细胞调亡结果见图10。
（4）细胞周期的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用BD公司细胞周期试剂盒进行清洗，染色。用流式细胞仪检测。经测定黑色素细胞在氧化损伤后添加曲酸，细胞周期分别为：G0/G1（DNA合成前期）为71.7%，S（DNA合成期）为16.2%，G2（DNA合成后期）为3.1%。照射组G0/G1、S和G2期分别为80.8%、12.1%和1.0%。
（5）ROS水平的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用北京普利莱生物科技有限公司的ROS试剂盒进行探针装载孵化。用流式细胞仪检测。经测定黑色素细胞在氧化损伤后添加曲酸，细胞内ROS水平为665.1。照射组细胞内ROS水平为790.5。
（6）SOD水平的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用超声细胞破碎仪粉碎细胞，离心，取上清液，用南京建成生物科技有限公司的SOD（WST法）试剂盒染色，用酶标仪在490nm处读取OD值。经测定黑色素细胞在氧化损伤后添加曲酸，细胞内SOD水平为26.4U·mg prot-1。照射组细胞内SOD水平为23.8U·mg prot-1。
经统计学分析，细胞氧化损伤后添加曲酸，细胞内ROS水平未见下降，SOD水平变化不明显，与照射组相比中晚期调亡细胞未见减少，存活细胞率变化不明显，进入DNA合成期的细胞比例较少，细胞活性恢复缓慢。结果表明曲酸不具有明显的抗氧化特性。
实施例4表皮干细胞细胞检测白藜芦醇的细胞毒性及抗氧化功效
1、原代表皮干细胞的分离培养：
1.1将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.1mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织，将包皮剪切成约2.0mm×3.0mm的皮片；用质量浓度0.25%的裂解酶(Dispases)分离表皮和真皮，然后用生理盐水或D-Hanks液清洗3-5次；
1.2表皮部分用质量浓度0.25%胰酶+0.02%EDTA(按1∶1比例混合)，4℃消化2±0.5小时，消化成单细胞悬液，然后接种于铺布有质量浓度为0.4%的Ⅳ型胶原包被的培养皿中，置5%CO2、37℃培养箱内快速黏附10～15min后，弃去未粘附细胞。将粘附细胞吹打脱离培养壁，按1×104个/cm2置于第2步1）制备的铺布有人羊膜的培养皿上继续培养，培养基为无LIF的ES完全培养基；或将细胞接种于用5μg/mL丝裂霉素C处理的小鼠3T3成纤维细胞滋养层上继续培养，所用培养基为全层皮肤专用培养基。
1.3表皮干细胞免疫组化鉴定
上述方法分离制备的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19(CK19)单克隆抗体和鼠抗人β1整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和β1整合素阳性。
培养后经β1整合素免疫组化鉴定的表皮干细胞形态如图1D所示。
2、细胞毒性测定
（1）皮肤抗氧化剂浓度的确定及配制：白藜芦醇为在弱碱性条件下直接从虎杖中药饮片中采用超声波法提取粗提物，层析分离提纯，经HPLC检测其纯度为84.7%。先用分析天平称取白藜芦醇提取物，用无血清培养基为溶剂制备储备液，配制成0.1mol/L的母液，待用。
（2）铺板：待表皮干细胞在细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，加入新的培养基重悬，在40×显微镜下计数，调整浓度，以5×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时。
（3）受试物的添加：将虎白藜芦醇母液用培养液再稀释成终浓度为800μmol/L、400μmol/L、200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L的6个浓度梯度的使用液，将稀释的白藜芦醇添加于96孔板中，设空白对照，阴性对照，每种浓度设6个副孔。使用多通道移液器以减少空间差异。添加皮肤抗氧化剂后放入培养箱中继续孵育18-24小时。孵育结束后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入20μl，5mg/mL MTT溶液，避光。置于培养箱中继续孵化4h。作用4小时后，加入DMSO，每孔加入100μl，置于振荡器上，振荡10min后。
（4）酶标仪测量及细胞活性计算：用酶标仪在570nm处测量步骤（3）加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值。通过公式计算IC50（半数抑制浓度）、IC10（10%细胞抑制浓度）：
细胞活性=（受试物孔OD值—空白对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值）×100%
（5）细胞毒性分析
根据下述公式预测急性经口毒性试验的LD50，log(LD50[mmol/kg])=0.435x log(IC50[mmol/L])+0.625，如果LD50＞5000mg／kg，则该化合物实际元素，可用于化妆品的开发。
经统计得到白藜芦醇的IC50为329.5μmol/L。经公式计算LD50＞5000mg／kg，表明该化合物无表皮干细胞毒性。
选取细胞活性在90%以上的皮肤抗氧化剂浓度进行实验，在此浓度下进行抗氧化特性的研究。经测试白藜芦醇的IC90约为100μmol/L。
3、白藜芦醇抗氧化功效测定
（1）紫外线诱导表皮干细胞氧化损伤模型
待表皮干细胞在细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，准确计数后，调整浓度，以1×104/孔将细胞铺于96孔板中，放入培养箱中孵育24小时，使用PBS替换培养基，将96孔板置于4℃平整冰袋上，开启日光模拟仪，使用照度计测量UVA及UVB辐照强度。设辐照剂量为0J、2J、5J、10J、15J五组。辐照后将PBS更换为新培养基，后放入培养箱中继续孵化18-24小时，孵化结束后每孔加5mg/mL MTT溶液20μL，作用4小时，加入DMSO溶解结晶物，混匀震荡10min，用酶标仪波长在570nm处测量每孔读数。用酶标仪在570nm处测量步骤（1）加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的存活细胞的吸光度值。
细胞活性=（受试物孔OD值—空白对照孔OD值）/(阴性对照孔OD值—空白对照孔OD值）×100%
所得结果为0J时细胞存活率为100%、2J时细胞存活率为78.3%、5J时细胞存活率为67.7%、10J时细胞存活率为28.5%、15J时细胞存活率为11.2%。选取细胞活性在70%的辐照剂量进行试验。经测定用于表皮干细胞的UVA及UVB照射强度分别为5J/cm2及0.6J/cm2。紫外线照射后表皮干细胞形态如图5A所示。
（2）细胞模拟太阳光辐照
待细胞在75cm2的细胞瓶中密度长至80%时，加入0.25%胰酶/0.02%EDTA将细胞自细胞瓶中消化分离，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，加入新的培养基重悬，取1mL细胞悬液稀释至4mL，取10μL滴入细胞计数板上，在40×显微镜下计数，调整浓度，以500×104/皿将细胞铺于直径为75mm的细胞培养皿中，放入培养箱中孵育24小时，设未辐照皿，辐照后加皮肤抗氧化剂皿（100μmol/L），及辐照后不加皮肤抗氧化剂皿。开启日光模拟仪，预热仪器15分钟，使用照度计测量UVA及UVB辐照强度（5J/cm2及0.6J/cm2），辐照前使用常温PBS清洗培养皿1次，未辐照皿与辐照皿处理一致，辐照皿使用PBS替代培养基，未辐照皿更换新培养基后放于培养箱中。辐照皿放置于平整的4℃冰袋上，辐照后添加维生素C，另一皿辐照后更换培养基，避光，于细胞培养箱中继续孵化18～24小时。
经紫外线照射后的表皮干细胞形态如图5A所示，添加白藜芦醇后的表皮干细胞形态如图5C所示，照射后添加阳性对照维生素C后的表皮干细胞形态如图5B所示。
（3）细胞凋亡的测定：
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200rpm/min，5分钟离心，去除胰酶，用40C PBS清洗2次，用试剂盒中Binding buffer 1mL重悬调整细胞密度为100×104个，使用BD公司细胞凋亡试剂盒进行染色，使用BD公司的FACSCanto II流式细胞仪在FITC荧光通道测量。经测定表皮干细胞在氧化损伤后添加白藜芦醇，细胞凋亡率各项指标，Q2（中晚期凋亡和死亡细胞率）为5.7%，Q3（存活细胞率）为77.2%，Q4（早期凋亡细胞率）为13.4%。照射组Q2、Q3、Q4分别为%40.5%、38.4%和18.2%。阳性对照维生素C组Q2、Q3、Q4分别为7.4%、68.7%和17.0%。
紫外线照射组流式细胞调亡结果见图11，添加白藜芦醇后流式细胞调亡结果见图12。
（4）细胞周期的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用BD公司细胞周期试剂盒进行清洗，染色。用流式细胞仪检测。经测定表皮干细胞在氧化损伤后添加白藜芦醇，细胞周期分别为：G0/G1（DNA合成前期）为71.7%，S（DNA合成期）为18.6%，G2（DNA合成后期）为0.9%。照射组G0/G1、S和G2期分别为81.3%、11.7%和1.2%。阳性对照维生素C组G0/G1、S和G2期分别为67.8%、21.4%和31.2%。
（5）ROS水平的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用北京普利莱生物科技有限公司的ROS试剂盒进行探针装载孵化。用流式细胞仪检测。经测定表皮干细胞在氧化损伤后添加白藜芦醇，细胞内ROS水平为161.6。照射组细胞内ROS水平为1097.7。阳性对照维生素C组ROS水平为305.4。
（6）SOD水平的测定
将孵育后的细胞用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化悬浮，1200转，5分钟离心，去除胰酶，用冷PBS清洗2次，调整细胞密度为100×104个，用超声细胞破碎仪粉碎细胞，离心，取上清液，用南京建成生物科技有限公司的SOD（WST法）试剂盒染色，用酶标仪在490nm处读取OD值。经测定表皮干细胞在氧化损伤后添加白藜芦醇，细胞内SOD水平为47.1U·mg prot-1。照射组细胞内SOD水平为21.7U·mg prot-1。阳性对照维生素C组细胞内SOD水平为43.5U·mg prot-1。
经统计学分析，细胞氧化损伤后添加白藜芦醇，细胞内ROS水平显著下降，SOD水平显著升高，中晚期调亡细胞显著减少，存活细胞明显上升，进入DNA合成前期和合成期的细胞增多，细胞活性恢复明显。结果表明白藜芦醇是一种活性比较强的抗氧化剂，其抗氧化能力优于维生素C。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围，例如本发明虽然仅列举了维生素C、原花青素和白藜芦醇可以作为抗氧化剂使用，但本发明中提到的其他物质如维生素E、红石榴提取物（市售或自制备）、槲皮素提取物（市售或自制备）、淡竹叶提取物（市售或自制备）、虎杖提取物（市售或自制备）、何首乌提取物（市售或自制备）、淫羊藿提取物（市售或自制备）、姜黄素（市售或自制备）、丹参酮（市售或自制备）、2,6-二氯-3-硝基吡啶胺（市售或自制备）、阿魏酰哌啶类化合物（市售或自制备）或二羟基苯甲酰腙（市售或自制备）等均经过试验发现，对正常人多种皮肤细胞具有抗氧化作用，此处不再一一列举。
Claims (10)
1.一种利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是含以下步骤：
(1)正常人原代细胞的分离、培养和鉴定 以离体包皮为原料，经分离、培养和鉴定，获得正常人皮肤原代细胞；
(2)受试物的毒性检验 将受试物配置一组具有浓度梯度的溶液，当正常人皮肤原代细胞的细胞密度长至80％～90％时，在多个正常人皮肤原代细胞中分别加入上述具有浓度梯度的受试物形成受试物组，同时设立阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，在各组中分别加入MTT和DMSO溶液，用酶标法分别测各组的吸光度，并根据下述公式，计算细胞活性抑制率，细胞活性抑制率＝[1－(受试物吸光度值－空白吸光度值)÷(阴性对照吸光度值－空白吸光度值)]×100％，根据细胞活性抑制率曲线，计算出皮肤抗氧化剂的20％抑制浓度(IC20)、半数致死抑制浓度(IC50)、70％抑制浓度(IC70)，抗氧化剂的毒性判断过程如下：
(一)经口毒性预测：根据下述公式预测急性经口毒性试验的LD50，log(LD50[mmol/kg])＝0.435×log(IC50[mmol/L])+0.625，如LD50＞5000mg/kg，预测该受试物实际无毒，可用于食品、药品抗氧化的进一步研究，如LD50＜500mg/kg，预测该受试物中等毒性，不适宜进一步开发，如500mg/kg＜LD50且＜5000mg/kg，预测该受试物可能微毒性，建议在该受试物的安全剂量范围内进行下一步研究；
(二)细胞毒性判定：选择受试物的可溶解最大浓度测试，如细胞活性抑制率IC＜30％时，表明在此浓度下该受试物可认为无细胞毒性，该受试物可用于皮肤抗氧化剂功效的进一步测试；
(3)受试物的配制及受试物浓度的确定 将受试物配制一组具有浓度梯度的溶液；当正常人原代细胞的细胞密度长至80％时，将该组具有浓度梯度的受试物，分别加入多个正常人原代细胞中形成受试物组，并分别设置阳性对照、空白对照以及阴性对照，按照MTT法，测试细胞的活性，用酶标法测试各组的吸光度，按照公式：细胞活性＝(受试物吸光度值—空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)，皮肤抗氧化功效的研究需要在外界因素造成皮肤细胞氧化损伤后的情况下进行，其中外界因素包括紫外线照射或化学试剂损伤，应选取细胞活性＞90％的受试物浓度为最高试验浓度；
(4)紫外线诱导辐射剂量的确定
正常人原代细胞的细胞密度长至80％时，设置具有梯度的UVA及UVB辐照量，按 具有梯度的UVA及UVB辐照量分别照射多个正常人原代细胞形成正常人原代细胞组，并设置空白对照和阴性对照，利用酶标仪分别测试正常人原代细胞组、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：细胞活性＝(紫外线照射正常人原代细胞组吸光度值—空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)，选取细胞活性在70％的辐照剂量进行抗氧化效果试验；
(5)受试物抗氧化效果的确认 根据步骤(3)确定的受试物浓度和步骤(4)中确定的UVA及UVB辐照剂量，待正常人原代细胞长至80％时，分别设立未辐照组、辐照后加受试物组以及辐照后不加受试物组，以正常人原代皮肤细胞经紫外线照射后添加维生素C为阳性对照，测试各组的细胞凋亡、细胞周期、ROS水平以及SOD水平，并根据测试结果，判断各皮肤抗氧化剂的抗氧化效果。
2.根据权利要求1中所述的利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是：步骤(1)中所述的正常人皮肤原代细胞为正常人原代角质细胞、正常人原代人成纤维细胞、正常人黑色素细胞和正常人表皮干细胞中的一种或几种。
3.根据权利要求1中所述的利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是：步骤(2)中所述的受试物为皮肤疑似抗氧化剂。
4.根据权利要求3中所述的利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是：所述皮肤疑似抗氧化剂为维生素C、维生素E、原花青素、白藜芦醇、红石榴提取物、槲皮素提取物、淡竹叶提取物、虎杖提取物、何首乌提取物、淫羊藿提取物、姜黄素、丹参酮、2,6-二氯-3-硝基吡啶胺、阿魏酰哌啶类化合物、二羟基苯甲酰腙铜、曲酸、熊果苷、多元醇类、透明质酸或神经酰胺。
5.根据权利要求1中所述的利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是：步骤(2)、(3)和(4)中用酶标法在550nm～570nm处分别测各组的吸光度。
6.根据权利要求1中所述的利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是：步骤(2)-步骤(3)中所述的阳性对照中含有已知的抗氧化剂、正常人原代细胞和正常人皮肤原代细胞的培养液，所述的受试物中含有受试物、正常人原代细胞和正常人皮肤原代细胞的培养液，所述的阴性对照中含有正常人原代细胞和正常人皮肤原代细胞的培养液，所述的空白对照中仅含有正常人皮肤原代细胞的培养液。
7.根据权利要求1中所述的利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是：步骤(4)中所述的阴性对照为正常人原代细胞不经紫外线照射；所述的空白对照指仅含培养液并不经紫外线照射。
8.根据权利要求1中所述的利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是：步骤(4)中受试物的UVA辐射强度为5～6J/cm2，UVB辐照强度为0.6～0.8J/cm2。
9.根据权利要求1中所述的利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是：步骤(5)中利用流式细胞仪测试各组的细胞凋亡、细胞周期和ROS水平，用酶标法测试各组的SOD水平。
10.根据权利要求1中所述的利用正常人多种皮肤细胞筛查皮肤抗氧化剂安全和功效的方法，其特征是：步骤(5)中根据各组的细胞凋亡、细胞周期、ROS水平以及SOD水平测试结果，经统计学分析，判断受试物抗氧化性程序如下：
(一)抗氧化作用：与阳性对照中紫外线造成的氧化损伤细胞相比，辐照后加受试物组细胞内ROS水平显著降低或SOD水平升高，和/或细胞凋亡和细胞周期各指标改善明显，具有统计学意义；
(二)抗氧化能力：与阳性对照中维生素C相比，得出ROS、SOD、细胞凋亡和细胞周期各指标改善的相对能力，预测其抗氧化能力。
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