CN111205259A - 一种柿子低聚原花青素的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柿子低聚原花青素(P‑OPC)的制备方法及其应用。所述柿子低聚原花青素是在氢气存在的条件下，柿子原花青素在高温和Pb/C催化剂的催化作用下降解所得到的产物。细胞实验和动物实验都表明了柿子低聚原花青素可以显著降低UV‑B辐照诱导的细胞和皮肤损伤水平。因此，本发明中的柿子低聚原花青素可以作为具有紫外损伤修复作用的添加剂用于食品、药品、化妆品等领域。

Description

一种柿子低聚原花青素的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及植物功能性成分的降解技术领域，特别是涉及一种柿子低聚原花青素的制备方法及其应用。
背景技术
太阳光中的紫外线(UV)可分为波长320－400nm的长波紫外线(UV-A)；波长为290－320nm的中波紫外线(UV-B)；及波长为180－290nm的短波紫外线(UV-C)。UV-A作用于皮肤深层，可穿透真皮，使皮肤一次性变黑；UV-B作用于皮肤表层，晒伤会导致皮肤变红，如经常被晒伤，则会大大增加皮肤癌发生的概率；UV-C绝大部分被大气臭氧层所吸收，因此对人体健康基本无威胁。
紫外线导致皮肤损伤主要机制是皮肤氧化应激、弹性相关物质降解、细胞炎症和细胞凋亡的发生。小鼠经UV-B照射后，皮肤受到刺激产生活性氧簇(ROS)。ROS作用于皮脂腺，使小鼠皮肤出现红斑。基质金属蛋白酶(MMP)-1，-3和-9的表达增加，胶原和弹性蛋白发生降解，引起皮肤下垂和皮肤皱纹。同时，UV照射增加使透明质酸酶和弹性蛋白酶发生作用，导致透明质酸和弹性蛋白降解，最终使皮肤弹性变性，引起皮肤光老化。此外，紫外线照射还会诱导HaCaT细胞中环氧化酶2(COX-2)的表达，进而引发HaCaT细胞毒性及炎症损伤。最后，UV-B照射后可明显增加HaCaT细胞中的PCNA和p53的mRNA及蛋白表达水平。并且，UV-B会使HaCaT细胞内产生过量的H2O2,大量的H2O2被分解产生·OH，进一步引起DNA的断裂，激活控制细胞凋亡的蛋白酶Caspase-3和-9。同时，嘧啶二聚体的产生引起核苷酸氧化，进一步促使细胞发生凋亡。
近年来，随着大气臭氧层不断被破坏，人们所接触的紫外线的强度越来越大，使得患皮肤癌的人数不断增加。防止UV-B损伤和紫外损伤修复成为人们目前十分关注且亟待解决的问题。紫外损伤修复主要从以上几个机制出发。制作具有抗氧化、抗炎和抑制细胞凋亡功效的食品、药品、化妆品来达到紫外损伤修复的目的。天然植物提取物一般毒副作用小、安全性高，具有一定研究优势。常见的具有紫外损伤修复功效的天然产物有黄酮类化合物、萜类、鞣质类、维生素类、香豆素类和多肽类等。
柿(Diospyros kaki Linn)，柿树科，柿属植物，原产于我国长江流域，具有很高的食用价值和医疗保健价值。近十年来，柿子的产量逐年增加，但柿子不耐贮藏且其深加工技术严重滞后，这些现象严重制约了我国柿子产业的发展。令人高兴的是，柿子中的副产物具有极高的经济附加值。例如：柿单宁。例如抗氧化，减肥等。
柿单宁属于原花青素的一种，原花青素(Proanthocyanidin)是由黄烷-3-醇单体聚合而成不同聚合度的黄酮类物质。按聚合度不同可以分为高聚原花青素、低聚原花青素和单体原花青素。目前已经证实柿单宁具有多种健康功效，柿子原花青素具有抗氧化、减肥、抗癌、抗病毒、解蛇毒和降血压等多种生理活性。然而柿单宁属于高聚原花青素，较难溶于水，并且会与食物中其他大分子如多糖和蛋白质发生强烈的相互作用，进而限制了柿单宁的利用。但是低聚原花青素能有效地解决上述部分问题。
目前关于高聚原花青素的降解有以下方法：主要有酸、碱催化降解，单体黄烷醇降解，生物酶降解，催化加氢降解和微生物降解等。酸、碱催化降解：高聚原花青素在热酸或强碱的条件下，能使C-C连接键发生断裂，从而将高聚体降解为低聚体。常用的酸碱降解剂包括有醋酸、亚硫酸、强酸树脂、氢氧化钠等。缺点是降解效率不高、引入了大量的化学试剂；单体黄烷醇降解：在酸性条件下，高聚体原花青素延伸单元生成相应的碳正离子中间体，黄烷-3-醇作为亲核试剂捕捉碳正离子，从而生成相应的二聚体。然后，使用高速逆流色谱将解聚后的样品分离为二聚体、部分三聚体及相对应的低聚物。不足主要是方法还在探索阶段并不成熟，无法用于生产实际中。微生物降解：借助微生物的正常代谢作用，从而将有机物转化为无机物的技术。该方法还存在许多难题,例如：找不到或难以培养适合降解的微生物。催化加氢降解：选择合适的加氢催化剂，在高温、加氢条件下对原花青素进行降解。目前断裂C-C键的方法主要有酸催化、过渡金属催化和无过渡金属催化等。目前使用较为广泛的催化剂是Pb/C。该方法的不足之处在于操作工艺相对复杂。
低聚原花青素(OPC)指聚合度为2-4的低聚黄酮类物质。此外，研究表明，低聚原花青素(OPC)具有比单体和高聚体更优异的生理学活性。作为一种廉价丰富的植物高附加值资源，柿子低聚原花青素具有十分重要的开发价值和广阔的应用前景。但至今尚未见柿子低聚原花青素在紫外损伤修复方面作用的相关文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种柿子低聚原花青素的制备方法和提供柿子低聚原花青素作为具有紫外损伤修复作用的添加剂用于食品、药品、化妆品等领域。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种柿子低聚原花青素的制备方法，将柿子高聚原花青素(柿单宁)在高温和Pb/C催化剂的催化作用下降解，所述降解在过量氢气存在的条件下进行，得到柿子低聚原花青素。
作为本发明的进一步改进，所述柿子低聚原花青素的制备方法，包括以下步骤：
(1)取柿子高聚原花青素粉末，将其溶于体积分数为40％-70％的乙醇水溶液，配制成质量分数为2-10％的柿子高聚原花青素乙醇溶液；
(2)将柿子高聚原花青素乙醇溶液加入到反应釜中，加入Pb/C催化剂；
(3)通入氮气排尽高压反应釜内的空气，然后，再反复通入氢气2-3次排尽氮气；
(4)升温至60℃-140℃，升温速率20℃/min,通入氢气至0.5MPa-4MPa；
(5)搅拌，1h-4h后结束反应；
(6)冷却，过滤反应产物，回收催化剂；
(7)真空旋转蒸发，回收乙醇，冷冻干燥后乙酸乙酯萃取即可得到柿子低聚原花青素粉末。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中Pb/C催化剂的用量：为每150mL柿子高聚原花青素乙醇溶液加入0.1-0.6gPb/C催化剂。
作为本发明的进一步改进，步骤(5)搅拌速率为300-500rpm。
作为本发明的进一步改进，所述柿子为涩柿品种。
作为本发明的进一步改进，所述柿子包括磨盘柿、镜面柿、牛心柿、恭城水柿、文山火柿、安溪油柿和广东花县大红柿。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中Pb/C催化剂浓度为0.4g/100mL柿子高聚原花青素乙醇溶液。
作为本发明的进一步改进，步骤(4)中温度为120℃。
作为本发明的进一步改进，步骤(4)中压力为3MPa。
作为本发明的进一步改进，步骤(5)中反应时间为3h。
本发明还提供一种所述的柿子低聚原花青素的制备方法制备的柿子低聚原花青素(P-OPC)在制备具有紫外损伤修复作用的药物中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述药物的剂型包括乳剂、水凝胶剂和膏剂。
本发明还提供一种所述的柿子低聚原花青素的制备方法制备的柿子低聚原花青素在制备具有紫外损伤修复作用的化妆品中的应用。
本发明还提供一种所述的柿子低聚原花青素的制备方法制备的柿子低聚原花青素在制备具有紫外损伤修复作用的食品中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述食品包括功能性食品。
作为本发明的进一步改进，所述紫外损伤指UV-B辐射损伤。
本发明公开了以下技术效果：
结合大量药理实验证明，本发明的柿子低聚原花青素可以显著抑制UV-B辐照诱导得细胞凋亡。此外，柿子低聚原花青素还具有强烈的抗氧化作用，可以抑制ROS的产生。总体而言，细胞和动物实验都有力地证明了柿子低聚原花青素具有显著的紫外损伤修复的功效。柿子低聚原花青素毒副作用小、安全性高，可在人体中应用，可以逐步推广到化妆品、食品及药品领域，未来前景广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为压力(A)、温度(B)、催化剂含量(C)和反应时间(D)对柿单宁裂解率的影响；
图2为柿单宁高压催化氢解产物UPLC-Tof-MS图谱；
图3为P-OPC对UV-B介导细胞凋亡的抑制作用，其中A,B,C，D:P-OPC抑制UV-B诱导Hacat细胞损伤和细胞凋亡，E，F：P-OPC抑制UV-B诱导hacat细胞凋亡相关因子；
图4为P-OPC抑制UV-B诱导的细胞自由基的产生及抗氧化系统的破坏，其中A，B，C：P-OPC抑制UV-B诱导Hacat细胞ROS及MDA的产生,D:P-OPC抑制UV-B破坏Hacat抗氧化酶系，E：P-OPC抑制UV-B诱导CPD的产生；
图5为P-OPC改善UV-B诱导的皮肤表皮损伤，其中A：P-OPC抑制UV-B诱导小鼠皮肤损伤直观图，B，C：小鼠损伤皮肤的组织切片和HE染色图，D：P-OPC抑制UV-B诱导小鼠皮肤组织增生；
图6为P-OPC抑制UV-B诱导的皮肤细胞凋亡，其中A，B：P-OPC抑制UV-B诱导的皮肤组织细胞凋亡；C：P-OPC抑制UV-B诱导小鼠皮肤组织Mapk信号传导系统的活化，D：P-OPC抑制UV-B诱导小鼠皮肤组织相关凋亡蛋白的表达；
图7为P-OPC通过抑制NF-κB的活化抑制UV-B诱导的炎症反应，其中A,B:P-OPC抑制UV-B诱导的NF-κB的活化；C:P-OPC抑制UV-B诱导的小鼠皮肤组织炎症的发生。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
术语解释：
本发明所述高聚原花青素指聚合度在20以上的由黄烷醇或其它黄酮类缩合而成的多酚多聚体。
本发明所述低聚原花青素(OPC)指聚合度为2-4的低聚黄酮类物质。
实施例1
一种柿子低聚原花青素的制备方法，包括以下步骤：
(1)取柿子高聚原花青素粉末，将其溶于体积分数为40％的乙醇水溶液，配制成质量分数为2％的柿子高聚原花青素乙醇溶液；
(2)取上述溶液150mL，加入容量为2L的高压反应釜中，加入0.15g Pb/C催化剂；
(3)通入氮气排尽高压反应釜内的空气,然后，再反复通入氢气2-3次直至排尽氮气；
(4)升温至60℃后,通入氢气至0.5MPa；
(5)以400rpm的速率进行搅拌反应，2h后结束反应；
(6)冷却，滤过反应产物，回收催化剂；
(7)真空旋转蒸发，回收乙醇，冷冻干燥后,乙酸乙酯萃取即可得到柿子低聚原花青素粉末。
实施例2
一种柿子低聚原花青素的制备方法，包括以下步骤：
(1)取柿子高聚原花青素粉末，将其溶于体积分数为50％的乙醇水溶液，配制成质量分数为5％的柿子高聚原花青素乙醇溶液；
(2)取上述溶液150mL，加入容量为2L的高压反应釜中，加入0.6g Pb/C催化剂；
(3)通入氮气排尽高压反应釜内的空气，然后，再反复通入氢气2-3次直至排尽氮气；
(4)升温至120℃后,通入氢气至3MPa；
(5)以400rpm的速率进行搅拌反应，3h后结束反应；
(6)冷却，滤过反应产物，回收催化剂；
(7)真空旋转蒸发，回收乙醇，冷冻干燥后乙酸乙酯萃取即可得到柿子低聚原花青素粉末。
实施例3
一种柿子低聚原花青素的制备方法，包括以下步骤：
(1)取柿子高聚原花青素粉末，将其溶于体积分数为60％的乙醇水溶液，配制成质量分数为6％的柿子高聚原花青素乙醇溶液；
(2)取上述溶液150mL，加入容量为2L的高压反应釜中，加入0.6g Pb/C催化剂；
(3)通入氮气排尽高压反应釜内的空气，然后，再反复通入氢气2-3次直至排尽氮气；
(4)升温至80℃后,通入氢气至1MPa；
(5)以500rpm的速率进行搅拌反应，1h后结束反应；
(6)冷却，滤过反应产物，回收催化剂；
(7)真空旋转蒸发，回收乙醇，冷冻干燥后乙酸乙酯萃取即可得到柿子低聚原花青素粉末。
实施例4
一种柿子低聚原花青素的制备方法，包括以下步骤：
(1)取柿子高聚原花青素粉末，将其溶于体积分数为70％的乙醇水溶液，配制成质量分数为1.75％的柿子高聚原花青素乙醇溶液；
(2)取上述溶液150mL，加入容量为2L的高压反应釜中，加入0.3g Pb/C催化剂；
(3)通入氮气排尽高压反应釜内的空气,然后，再反复通入氢气2-3次直至排尽氮气；
(4)升温至100℃后,通入氢气至2MPa；
(5)以500rpm的速率进行搅拌反应，2h后结束反应；
(6)冷却，滤过反应产物，回收催化剂；
(7)真空旋转蒸发，回收乙醇，冷冻干燥后即可得到柿子低聚原花青素粉末。
实施例5
一种柿子低聚原花青素的制备方法，包括以下步骤：
(1)取柿子高聚原花青素粉末，将其溶于体积分数为50％的乙醇水溶液，配制成质量分数为7％的柿子高聚原花青素乙醇溶液；
(2)取上述溶液150mL，加入容量为2L的高压反应釜中，加入0.75g Pb/C催化剂；
(3)通入氮气排尽高压反应釜内的空气,然后，再反复通入氢气2-3次直至排尽氮气；
(4)升温至140℃后,通入氢气至4MPa；
(5)以400rpm的速率进行搅拌反应，4h后结束反应；
(6)冷却，滤过反应产物，回收催化剂；
(7)真空旋转蒸发，回收乙醇，冷冻干燥后即乙酸乙酯萃取可得到柿子低聚原花青素粉末。
本发明采用催化氢解的方法对柿单宁进行裂解，研究考察了反应温度(Tem)、H2压力(P)、催化剂用量(Pb/C)、反应时间(Time)对裂解效率的影响。结果表明在120℃，3h，3Mpa条件下，裂解度最高，主要结果如图1所示。在本实验中，H2是反应物，增加H2的浓度，就可以加快反应速度。图1A结果显示，随着压强的升高，裂解率逐渐增大；压强高于3MPa后，裂解率趋于平稳。因此，单因素考察3MPa为最佳反应压强。温度高低直接影响到能否达到反应能级的要求。图1B表明，温度60℃时，反应进行的较为缓慢，一定时间内很难把高聚物的结构打开，所以裂解产物的裂解率偏低；但如果温度过高,单宁受热羟基易氧化失活，单宁的裂解率有所下滑。在120℃时，有效降解率最大，确定为最佳催化反应温度。这与其他裂解原花青素工艺相比，温度偏高，分析可能因为首先柿单宁原花青素聚合度较高；其次柿单宁富含A型连接，单宁中的A型原花青素结构,多出了一个C2-O-C7，增加了裂解时的化学能。在图1C中，在0.4g/1g单宁的用量之后，增大催化剂的用量，反应产物的平均聚合度变化并不显著。因此，0.4g/100mL的催化剂用量对本试验较为合适。图1D表明随着时间的增加,裂解产物的平均聚合度下降,降解率增加。但反应时间过长，裂解率反倒略有下降，可能是低聚原花青素进一步裂解，致使原花青素含量下降所致。因此反应时间3h为催化裂解的较优条件。综上，柿单宁在120℃,压强3MPa,催化剂用量0.4g/100mL的条件下，反应3h,裂解效率最高(>70％)。通过对其裂解产物平均聚合度进行测定结果表明其平均分子量在900附近，平均聚合度为3.1左右。此工艺达到了降解柿单宁的目的，为柿子的综合利用开发奠定了坚实的基础。
根据实施例2中最佳降解条件制备得到所需的柿子低聚原花青素样品，按照以下试验验证柿子低聚原花青素的紫外损伤修复：
实验例1柿子低聚原花青素修复UV-B诱导的细胞损伤
1.UV-B辐射及加药处理
取70％-75％融合时的HaCaT细胞，设空白组(不做任何处理)、对照组(仅接受UV-B辐射处理)和实验组(加入5μg/mL、10μg/mL的柿子低聚原花青素并接受UV-B辐射处理)。空白组、对照组及实验组在加入二甲基亚砜(DMSO)后预处理6个小时。然后，以30mJ/cm2的辐射剂量进行UV-B照射，继续用原含药培养基培养24h后终止。MTT试验检测细胞活力。
2.柿子低聚原花青素对HaCaT细胞活力的影响
在未照射紫外线时，柿子低聚原花青素对培养的HaCaT细胞活力无明显影响，在UV-B辐射后，细胞活力显著下降，柿子低聚原花青素均可增强辐射细胞的活力，与对照组相比有显著差异性，且呈剂量依赖性(见图3)。
3.流式细胞术检测柿子低聚原花青素对HaCaT细胞凋亡的影响
取上述培养细胞，加胰酶消化，然后离心收集细胞。用预冷的PBS缓冲液洗涤2次。上机前用PBS缓冲液洗涤3次，去上清液，加入碘化丙啶(PI)至终浓度为50μg/mL，混匀，4℃避光PI荧光染色。在流式细胞仪上进行细胞周期分析并检测细胞凋亡情况。
由图3B和C可知，UV-B辐射后细胞凋亡发生率显著增加。柿子低聚原花青素可明显减少UV-B诱导的细胞凋亡，且呈一定的剂量依赖性。
4.柿子低聚原花青素对HaCaT细胞凋亡相关蛋白的作用
首先，使用RIPA裂解液将细胞裂解。然后，按产品试剂盒说明用BCA法检测蛋白浓度。具体操作如下：取等量的蛋白样品(40mg)经10％SDS-PAGE分离胶和80V恒压电泳分离后,转印至PVDF膜上，5％脱脂奶粉加PBST配制成封闭液室温封闭2h，加入鼠抗人抗体，4℃摇床摇动孵育封闭过夜；TBST(洗涤3次后，加入1∶2000稀释的HRP标记羊抗鼠或羊抗兔二抗，在室温下孵育1h，TBST再次洗膜3次，小心吸净洗膜液后加入ECL发光底物，关闭电源，在凝胶成像系统中成像、摄图。重复3次。应用Quantity One软件对HaCaT细胞凋亡相关蛋白的相对表达量进行分析，测定图片上每个特异条带的灰度值，用目的蛋白的灰度值/内参β-Actin的灰度值，所得结果为目的蛋白相对含量。
本发明检测了HaCaT细胞中的促凋亡因子Bax、抑凋亡因子Bcl-2和细胞凋亡的执行蛋白C-Caspase 3，结果如图3所示，UV-B可以诱导HaCaT细胞的大量凋亡，P-OPC处理可以显著抑制UV-B诱导的细胞凋亡(图3B,C,D)，并且可以影响凋亡相关蛋白(BCL-2,Bax和C-Caspase-3)的表达(图3E,F)。这些结果表明P-OPC在细胞层面具有保护表皮细胞免受UV-B辐照损伤的能力，其可以抑制UV-B诱导的细胞凋亡，5μg/ml的P-OPC即具有很强的保护作用。
实验例2.柿子原花青素低聚体改善UV-B诱导细胞氧化应激
1.柿子原花青素低聚体改善UV-B诱导ROS产生
UV-B辐射后30min收集细胞，弃去原培养基；再加入含10mmol/mL DCFH-DA的无血清培养基，于37℃、5％CO2条件的培养箱孵育25min；再用无血清培养液冲洗4次，使未进入细胞的DCFH-DA得到充分去除。采用488nm激发波长和525nm发射波长对氧化型二氯荧光素(DCF)的荧光强度进行检测。
由附图4A和B可知，与空白对照组相比，模型组细胞内氧自由基ROS含量极显著升高(P<0.001)，几乎达到了5倍的水平。与模型组比较，柿子低聚原花青素各处理组可明显降低细胞内ROS含量，均达到显著性差异(P<0.05或P<0.01)，且各组呈剂量依赖性关系。
2.检测细胞中SOD，GSH和GSH-Px活性及MDA含量
给药24h后，收集6孔板中各组细胞，用预冷PBS清洗2次，超声破碎，严格按照试剂盒说明书操作，检测SOD，GSH和GSH-Px活性及MDA含量。
3.柿子低聚原花青素对HaCaT细胞中SOD，GSH和GSH-Px活性及MDA含量的影响
图4结果显示，与空白组相比，对照组SOD，GSH和GSH-Px活性明显降低，MDA含量明显升高(P＜0.01)(图4C,D,E)。与对照组相比，加入P-OPC组SOD，GSH-Px和CAT活性显著升高，MDA含量显著降低(P＜0.05，P＜0.01)。表明UVB 30mJ/cm2照射HaCaT细胞造成了氧化损伤，柿子低聚原花青素对UV-B诱导的HaCaT细胞损伤有抑制作用。
实验例3紫外损伤修复动物实验
1.实验分组
小鼠于实验前适应环境一周，饲养温度22-25℃，背部脱毛后随机分成2个小组：
空白对照组和实验组。根据“实验动物护理和使用指南”中建立的NIH标准饲养和维持动物。
2.UV-B辐射及加药处理
将小鼠固定在特制的木板上，用铝箔纸屏蔽，只露出处理后的背部，每天暴露于UV-B辐射20分钟，持续1周。空白对照组不做任何处理，模型组仅进行UV-B辐射。实验组经UV-B照射后，背部每天涂抹5mg/cm2柿子低聚原花青素。实验结束后，切取背部UVB辐射的皮肤组织，甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、脱水，切片。
3.小鼠皮肤形态结构观察
将各组小鼠的皮肤样品置于甲醛溶液中固定，乙醇逐级脱水，石蜡包埋后进行超薄切片和苏木素-伊红(HE)染色。结果如图5A所示，经过UV-B辐射后，小鼠皮肤出现明显的红肿，粗糙，表皮增厚，而P-OPC组处理小鼠其皮肤较模型组有明显改善。皮肤形态学结果如图5B,C所示，空白对照组小鼠皮肤结构完整，而UV-B辐照组小鼠肉眼可见皮肤损伤，柿子原花青素低聚体处理则可以显著改善皮肤损伤。UV-B辐照后皮肤表皮明显增厚(图5D)，而原花青素低聚体则可以显著改善紫外辐照导致的皮肤损伤。
4.柿子原花青素低聚体抑制UV-B辐照引起的皮肤细胞凋亡
1周后，取小鼠皮肤样品进行组织学检查。将实验小鼠皮肤在4％多聚甲醛中固定24小时，随后包埋在石蜡中，并切成4mm切片。进行TUNEL染色。Western Blotting方法测定BCL-2,BAX和C-Caspase-3蛋白表达首先，用组织剪刀剪下裸鼠皮肤相同质量，相同部位的组织。然后，加入500mL RIPA裂解液，将组织匀浆。冰上裂解半小时，12000rpm离心5分钟(温度：4℃)，取上清，进行BCA测定，确定细胞凋亡相关蛋白BCL-2,BAX和C-Caspase-3的表达。具体操作步骤参照实验例3。
结果如图6A所示，UV-B可以显著诱导皮肤细胞的凋亡，与细胞水平的实验结果基本一致。实验结果表明，柿子低聚原花青素能抑制由紫外线照射引起的Bcl-2蛋白水平的减少及Bax及Caspase 3蛋白水平的增加(图6B和C)。进一步实验表明柿子低聚原花青素通过抑制MAPKs信号通路发挥相关作用。也进一步验证柿子低聚原花青素通过保护细胞中线粒体的完整性，进而起到抗凋亡的作用。这些结果也与细胞实验结果相一致。通过这些实验结果，我们可以认为P-OPC具有显著的抑制UV-B诱导的皮肤细胞凋亡，进而发挥其保护皮肤的作用。这也为后续采用P-OPC作为活性功能成分开发产品提供一定的实验基础。
5.柿子原花青素低聚体抑制UV-B辐照引起的皮肤组织炎症的发生
取小鼠皮肤样品进行组织学检查。将实验小鼠皮肤在4％多聚甲醛中固定24小时，随后包埋在石蜡中，并切成4mm切片。进行免疫荧光染色。并提取蛋白质，对炎症相关因子的蛋白表达量进行测定。
结果如图7所示，随着UV-B的辐照，UV-B辐照后，皮肤组织发生了严重的炎症反应，产生了大量的炎症标志物(图7C)，例如IL-6，TNF-α，经过P-OPC处理组小鼠的皮肤则炎症反应较轻。通过对其分子通路进行研究结果表明P-OCP可以显著抑制UV-B诱导的NF-κB的活化(图7A,B)。这些结果表明P-OPC可以抑制UV-B辐照诱导的皮肤组织损伤及炎症的发生，进而对皮肤组织起到保护作用。
细胞和动物实验证明，本发明制备得到的柿子低聚原花青素可以明显减少UV-B诱导HaCaT细胞和小鼠皮肤组织细胞的氧化损伤和凋亡，具有显著的紫外损伤修复功效，其作用机制与增强细胞抗氧化能力、加速清除氧自由基以及调控细胞凋亡相关蛋白通路来保护细胞中线粒体的完整性有关。柿子低聚原花青素毒副作用小、安全性高，有进一步在人体中应用的潜能，日后，可以逐步推广到化妆品、食品及药品领域，未来前景广阔。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种柿子低聚原花青素的制备方法，其特征在于，将柿子高聚原花青素在高温和Pb/C催化剂的催化作用下降解，所述降解在过量氢气存在的条件下进行，得到柿子低聚原花青素。
2.根据权利要求1所述的一种柿子低聚原花青素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取柿子高聚原花青素粉末，将其溶于体积分数为40％-70％的乙醇水溶液，配制成质量分数为2-10％的柿子高聚原花青素乙醇溶液；
(2)将柿子高聚原花青素乙醇溶液加入到反应釜中，加入Pb/C催化剂；
(3)通入氮气排尽高压反应釜内的空气，然后，再反复通入氢气2-3次排尽氮气；
(4)升温至60℃-140℃，升温速率20℃/min,通入氢气至0.5MPa-4MPa；
(5)搅拌，1h-4h后结束反应；
(6)冷却，过滤反应产物，回收催化剂；
(7)真空旋转蒸发，回收乙醇，冷冻干燥后经乙酸乙酯萃取即可得到柿子低聚原花青素粉末。
3.根据权利要求2所述的一种柿子低聚原花青素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中Pb/C催化剂的用量：为每150mL柿子高聚原花青素乙醇溶液加入0.1-0.6gPb/C催化剂。
4.根据权利要求1所述的一种柿子低聚原花青素的制备方法，其特征在于，步骤(5)搅拌速率为300-500rpm。
5.根据权利要求1所述的一种柿子低聚原花青素的制备方法，其特征在于，所述柿子为涩柿品种。
6.根据权利要求5所述的一种柿子低聚原花青素的制备方法，其特征在于，所述柿子包括磨盘柿、镜面柿、牛心柿、恭城水柿、文山火柿、安溪油柿和广东花县大红柿。
7.一种如权利要求1所述的柿子低聚原花青素的制备方法制备的柿子低聚原花青素在制备具有紫外损伤修复作用的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括乳剂、水凝胶剂和膏剂。
9.一种如权利要求1所述的柿子低聚原花青素的制备方法制备的柿子低聚原花青素在制备具有紫外损伤修复作用的化妆品中的应用。
10.一种如权利要求1所述的柿子低聚原花青素的制备方法制备的柿子低聚原花青素在制备具有紫外损伤修复作用的食品中的应用。
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