CN110487997A - 基于重组皮肤模型的光毒性检测方法 - Google Patents

基于重组皮肤模型的光毒性检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于重组皮肤模型的光毒性检测方法，其中，所述方法包括以下步骤：S1.接收和复苏重组皮肤模型；S2.选取光源；S3.确定重组皮肤模型的最大耐受剂量；S4.检测受试物光毒性。本发明基于重组皮肤模型的光毒性检测方法，不仅能够检测水溶性的化学品和化妆品原料，还能检测油状、膏状的化妆品成品和不同比例的配方物质，本发明基于重组皮肤模型的光毒性检测方法不仅模拟了人体皮肤对不同类外源性物质的生物反应变化，同时扩大了待测物质的检测范围，不再局限于水溶性的化学物质，还包括了各种性状的化妆品成品和配方。

Description

基于重组皮肤模型的光毒性检测方法
技术领域
本发明属于皮肤光毒性检测和研究技术领域，具体涉及一种基于重组皮肤模型的光毒性检测方法。
背景技术
光毒性（Phototoxicity）指的是皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应，或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照射下发生的类似反应，通常表现为红斑、水疱，色素沉着和皮肤增厚等。目前用于评价化妆品皮肤光毒性的试验方法主要有：动物试验、人体光斑贴试验和体外试验。
动物试验，目前国际上通用的动物试验方法是动物皮肤光照试验，即将动物背部皮肤去毛，然后将一定量的受试物涂抹至已去毛的皮肤上，经一定时间间隔后，用UVA光线照射，照射结束后在一定的观察时间观察皮肤反应，通过动物皮肤红斑、水肿反应积分判断该受试物是否具有光毒性。该方法多用豚鼠作为实验动物，也有人用家兔、裸鼠、大鼠和小鼠。我国GB 7919-1987《化妆品安全性评价程序和方法》及《化妆品卫生规范(2007年版)》中规定的化妆品光毒性试验方法即为该实验方法。
人体光斑贴试验，人体斑贴试验结果真实，是一种对化妆品光毒性安全评价理想的试验方法。人体光斑贴试验通过在人体皮肤表面直接敷贴受试物，同时接受一定剂量适当波长紫外线照射的方法，以检测诱发光毒性与光变应性皮炎的光毒性物质以及测试机体对某些光敏剂反应的一种皮肤试验。
体外试验，根据试验作用终点和作用机制不同，光毒性体外替代试验方法可以分为两大类：（a）用细胞、组织或者器官模型进行光毒性筛选试验，如3T3中性红摄取法、角质细胞试验法、肝细胞法；（b）注重对特定光毒性机制进行研究的试验，如红细胞溶血法、组氨酸光氧化法。
上述三类方法各有利弊，动物试验法是一种成熟的光毒性试验方法，其操作简单，但动物与人之间存在种属差异，从动物外推至人身上具有很大的局限性，且用大量动物对化妆品进行安全性评价与目前国际推行的“3R”原则有悖。人体斑贴试验方法有效、结果真实，是一种对化妆品人体光毒性安全评价理想的试验方法，但对受试志愿者有一定的要求，受试志愿者难找，从人道主义问题考虑，这种试验法不可取。体外替代试验已成为大势所趋。
专利CN107446993A公开了一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法，包括以下步骤：1.皮肤模型前期制备；2.树突状细胞的制备与培养；3.皮肤模型与树突状细胞共培养构建和受试物暴露；4.皮肤模型活性测试；5.皮肤模型基因组检测；6.共培养模型下层细胞分泌物检测；7.树突状细胞表面标志物表达检测；8.统计方法和结果预测。专利CN107446993A把具有屏障和代谢功能的体外重建的3D皮肤与具有免疫功能的树突状细胞组合在一起，建立了共培养的新型实验系统，与体内具有相似的功能和致敏感反应；专利CN107446993A可以从定性和定量两方面评价待测物质的皮肤致敏作用。目前关于重组皮肤模型评价待测物质的皮肤光毒性作用方面的报道较少。
光毒性检测不仅是现代化学品安全评价技术的一项重要内容，更是不同化妆品原料及成品卫生规范需求。光毒性体外替代试验是大势所趋，目前3T3成纤维细胞中性红摄取试验（3T3 NRU PT）已获得欧盟的许可，作为皮肤光毒性试验的体外试验方法用于欧盟国家的化学品安全性评价，但由于其测试条件局限于水溶性化学物质或化妆品原料，该替代试验在很多化妆品成品的光毒性检测中受到限制。因此，开展基于体外重组人体组织工程皮肤模型的光毒性预测方法具有重要的现实意义。
Epikutis是以中国人皮肤组织分离出的角质形成细胞为种子细胞，经专利技术构建而成的3D重组表皮模型。Epikutis重组人表皮模型具有完整的表皮结构：基底层、棘层、颗粒层、角质层，与人表皮结构高度类似，而且是国内首款产业化的3D皮肤模型。
因此，开展基于重组皮肤模型Epikutis的光毒性评价方法对国人而言具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重组皮肤模型的光毒性评价方法，不仅能够检测水溶性的化学品和化妆品原料，还能检测油状、膏状的化妆品成品和不同比例的配方物质。
为此，本发明提供了以下技术方案。
第一方面，本发明提供了一种基于重组皮肤模型的光毒性检测方法，其中，所述方法包括以下步骤：
S1.接收和复苏重组皮肤模型；
S2.选取光源；
S3.确定重组皮肤模型的最大耐受剂量；
S4.检测受试物光毒性。
在优选的实施方式中，所述接收和复苏重组皮肤模型包括：
在6孔板中培养重组皮肤模型，每孔中1个重组皮肤模型，每孔添加900μL复苏液，在温度为36-38℃、相对湿度为92-95%和4-6%CO2的培养箱中孵育55-65min后，更换复苏液，过夜孵育18-22h，在复苏过程中，将损坏的以及表面上存在大量水分的重组皮肤模型丢弃，复苏结束后对重组皮肤模型表观进行评价，表面无气泡，无褶皱，不潮湿，表观正常后进行后续操作。
在优选的实施方式中，所述光源为波长为320-400nm的UVA。
在更优选的实施方式中，所述UVA的剂量为0.5-60J/cm2。
在最优选的实施方式中，所述UVA的最高剂量照射时间为120min以下。
在优选的实施方式中，所述确定重组皮肤模型的最大耐受剂量包括：使用UVA照射结束后，将重组皮肤模型在在温度为36-38℃、相对湿度为92-95%和4-6%CO2的培养箱中孵育22h，利用苏木精-伊红染色法检测重组皮肤模型形态学变化，利用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测重组皮肤模型组织活力变化，选取形态学无明显变化，组织活力在75%以上的最大辐照剂量作为重组皮肤模型的最大耐受剂量。
在优选的实施方式中，所述检测受试物光毒性包括：
1）将步骤S1复苏后的表观正常的重组皮肤模型分为UV+组和UV-组；
2）UV+组和UV-组分别设置空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和受试物组；
3）按照分组分别进行重组皮肤模型表面给药，给药体积为25-80μL，给药时间为2h，然后用磷酸盐缓冲液将重组皮肤模型表面残留的液体清洗干净，并用棉签将重组皮肤模型表面擦干，将重组皮肤模型转移至24孔板中，每孔培养液的体积为0.5-1mL；
4）将UV+组进行步骤S3测得的最大UVA耐受剂量照射，将UV-组置于相同环境的黑暗条件下，待UV+组照射完毕后，将UV+组和UV-组的所有重组皮肤模型转移至含有3.3-3.7mL培养液的6孔板中后孵育22h；
5）检测各组的组织活力，判断各组潜在的光毒性。
在优选的实施方式中，所述受试物包括水溶性的化学品、化妆品原料、油状或膏状的化妆品成品和不同比例的配方物质。
在优选的实施方式中，所述表观正常表现为重组皮肤模型表面无气泡、无褶皱、不潮湿。
在优选的实施方式中，所述重组皮肤模型为重组皮肤模型Epikutis，重组皮肤模型Epikutis是以中国人皮肤组织分离出的角质形成细胞为种子细胞，经专利技术构建而成的3D重组表皮模型。重组皮肤模型Epikutis具有完整的表皮结构：基底层、棘层、颗粒层、角质层，与人表皮结构高度类似。
在本发明中，所述重组皮肤模型采用广东博溪生物科技有限公司生产的重组皮肤模型Epikutis，货号为PM1011；所述培养液采用广东博溪生物科技有限公司生产的培养液，货号为PY3021；所述复苏液采用广东博溪生物科技有限公司生产的复苏液，货号为PY3031。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明基于重组皮肤模型的光毒性检测方法，不仅能够检测水溶性的化学品和化妆品原料，还能检测油状、膏状的化妆品成品和不同比例的配方物质，本发明基于重组皮肤模型的光毒性检测方法不仅模拟了人体皮肤对不同类外源性物质的生物反应变化，同时扩大了待测物质的检测范围，不再局限于水溶性的化学物质，还包括了各种性状的化妆品成品和配方。
另一方面，本发明通过选用特定波长的UVA，选用特定剂量的UVA以及选用特定的UVA照射时间，进一步保证了本发明基于重组皮肤模型的光毒性检测方法的准确性，若受试物中添加了一定浓度的光毒性物质后，可以用本发明的重组皮肤模型Epikutis，配合本发明的光毒性检测方法准确的检测出来。
附图说明
图1为UVA辐射重组皮肤模型Epikutis结果示意图；
图2为UVA辐射重组皮肤模型Epikutis的角质层示意图；
图3为化学品氯丙嗪的光毒性评价结果示意图；
图4为化妆品成品的光毒性评价示意图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚的呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。由此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例提供一种基于重组皮肤模型Epikutis的光毒性评价方法，包括以下步骤：
S1.接收和复苏重组皮肤模型Epikutis；
S2.选取光源；
S3.确定重组皮肤模型Epikutis的最大耐受剂量；
S4.检测受试物光毒性。
所述步骤S1包括：
在6孔板中培养重组皮肤模型Epikutis，每孔中1个重组皮肤模型Epikutis，每孔添加900μL复苏液，36-38℃、4-6%CO2、95%相对湿度的孵箱中孵育55-65min，后更换复苏液，过夜孵育18-22h，在复苏过程中，将损坏了以及表面上存在大量水分的重组皮肤模型Epikutis丢弃，复苏结束后对重组皮肤模型Epikutis表观进行评价，表面无气泡，无褶皱，不潮湿，表观正常后进行后续操作。
所述步骤S2中选取的光源为波长在320-400nm的UVA，所述UVA的剂量为0.5-60J/cm2，所述UVA的最高剂量照射时间为120min以下。
所述步骤S3包括：
使用UVA照射结束后，将重组皮肤模型Epikutis在36-38℃、4-6%CO2、95%相对湿度的孵箱中孵育22h，然后利用苏木精-伊红染色法检测组织形态学变化、利用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测组织活力变化，选取形态学无明显变化，组织活力在75%以上的最大辐照剂量作为重组皮肤模型Epikutis的最大耐受剂量。
所述步骤S4包括：
1）将步骤S1复苏后的表观正常的重组皮肤模型Epikutis分为UV+组和UV-组；
2）UV+组和UV-组分别设置空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和受试物组；
3）按照分组分别进行重组皮肤模型Epikutis表面给药，给药体积25-80μL，给药时间为2h，然后用磷酸盐缓冲液将重组皮肤模型Epikutis表面残留的液体清洗干净，清洗15次，并用棉签将重组皮肤模型Epikutis表面擦干，将重组皮肤模型Epikutis转移至24孔板中，每孔培养液的体积为0.5mL；
4）UV+组进行步骤S3测得的最大UVA耐受剂量照射，UV-组则放在相同环境的黑暗条件下；待UV+组照射完毕后，将UV+组和UV-组的所有重组皮肤模型转移至含有3.3mL培养液的6孔板中后孵育22h；
5）检测各组的组织活力，判断各组潜在的光毒性。
所述的形态学无明显变化指的是UV辐照组的皮肤组织与空白对照组的组织相比较，基底层细胞未发生凋亡或出现空泡，角质层未变厚；组织活力的计算也是根据空白对照组而得。
所述的重组皮肤模型Epikutis是以中国人皮肤组织分离出的角质形成细胞为种子细胞，具有完整的表皮结构：基底层、棘层、颗粒层、角质层，与人表皮结构高度类似。
所述的阳性对照指的是[1] [2] 的某种已知具有光毒性的化学物质，例如，0.125-0.5mM）、8-甲氧基补骨脂素（0.1-0.2mM）、异丙嗪（1.25-5mM）、酪洛芬（3-6mM）、异补骨脂素（0.5-2mM）、6-甲基香豆素（3-5mg/mL）[3] 。
所述的阴性对照指的是单浓度的某种已知无光毒性的化学物质，例如，十六烷基磺酸钠（0.5-2mM）、青霉素钠（75-300mM）、L-组氨酸（40-160mM）。
所述的判断各组潜在的光毒性的评价标准为：在化学品、化妆品原料或成品本身没有毒性的作用下（组织活力>75%），UVA辐射后组织活力下降程度大于25%时判定为具有光毒性，即组织活力（UV-）-组织活力（UV+）>25%；若受试物不能确定安全浓度，则在进行光毒性判定前需进行安全浓度的筛选。
实施例2
本实施例提供一种化学品氯丙嗪基于重组皮肤模型Epikutis的光毒性评价方法，包括以下步骤：
S1.接收和复苏重组皮肤模型Epikutis；
S2.选取光源；
S3.确定重组皮肤模型Epikutis的最大耐受剂量；
S4.检测受试物光毒性。
所述步骤S1包括：
在6孔板中培养重组皮肤模型Epikutis，每孔中1个重组皮肤模型Epikutis，每孔添加900μL复苏液，36-38℃、4-6%CO2、95%相对湿度的孵箱中孵育55-65min，后更换复苏液，过夜孵育18-22h，在复苏过程中，将损坏了以及表面上存在大量水分的重组皮肤模型Epikutis丢弃，复苏结束后对重组皮肤模型Epikutis表观进行评价，表面无气泡，无褶皱，不潮湿，表观正常后进行后续操作。
所述步骤S2中选取的光源为波长在320-400nm的UVA，所述UVA的剂量为0.5-60J/cm2，所述UVA的最高剂量照射时间为120min以下。
所述步骤S3包括：
复苏完成后，将重组皮肤模型Epikutis转移到无菌六孔板中（提前添加0.9 mL培养液，每块板五个模型），每个孔板为一组，共6组，包括对照组和5个辐照组，辐照剂量分别为5 J/cm2、10J/cm2、20 J/cm2、40J/cm2和60 J/cm2。每组照射结束后，关闭照射仪，15min后进行下一组照射。
每组辐照完毕后，将重组皮肤模型Epikutis移入另一个加有新鲜培养液（每孔3.3mL）的6孔板内，将6孔板置于37℃、5% CO2、95%相对湿度的条件下孵育22h，然后利用苏木精-伊红染色法检测组织形态学变化、利用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测组织活力变化，选择重组皮肤模型Epikutis在UVA辐射后组织活力依旧在75%以上的剂量为安全剂量，同时，在该剂量下组织的形态学无明显变化的为重组皮肤模型Epikutis的UVA最大耐受剂量。最终确定重组皮肤模型Epikutis的UVA最大耐受剂量为40J/cm2。
所述步骤S4包括：
1）将步骤S1复苏后的表观正常的重组皮肤模型Epikutis分为UV+组和UV-组；
2）UV+组和UV-组分别设置溶剂对照组和氯丙嗪组（3个浓度）；
3）按照分组分别进行重组皮肤模型Epikutis表面给药，氯丙嗪（简写为CPZ）的给药浓度分别为0.125mM、0.25mM和0.5mM，溶剂为丙二醇和乙醇的混合溶液（丙二醇（v）:乙醇（v）=3:7），每个浓度组3个平行模型，给药体积25μL，记录给药时间，后置于37℃、5% CO2、95%相对湿度条件下孵育2h，然后用磷酸盐缓冲液将重组皮肤模型Epikutis表面残留的液体清洗干净，清洗15次，并用棉签将重组皮肤模型Epikutis表面擦干，将重组皮肤模型Epikutis转移至24孔板中，每孔培养液的体积为0.5mL；
4）UV+组进行步骤S3测得的最大UVA耐受剂量照射，辐照剂量为40J/cm2，照射时揭开孔板盖，UV-组则放在相同环境的黑暗条件下；待UV+组照射完毕后，将UV+组和UV-组的所有重组皮肤模型转移至含有3.3mL培养液的6孔板中后孵育22h；
5）判断化学品氯丙嗪的光毒性
氯丙嗪的光毒性的结果见图3，由图3可以看出，混合溶液对重组皮肤模型Epikutis的组织活力几乎没有影响，0.125mM和0.25mM的氯丙嗪自身对皮肤组织活力的影响也较小（组织活力在90%以上），但在UVA辐照下，组织活力明显下降。当氯丙嗪浓度为0.125mM时，UVA导致活力下降了66.52%，而浓度为0.25mM时，UVA导致活力下降了80.69%，高浓度的氯丙嗪（0.5mM）导致重组皮肤模型Epikutis组织活力下降至71.15 %，因此，该浓度不能作为光毒性判断的参考浓度。最后，化学品氯丙嗪具有较强的光毒性，产生光毒性的浓度最低为0.125mM。
实施例3
本实施例提供一种化妆品成品F）[4] 基于重组皮肤模型Epikutis的光毒性评价方法，包括以下步骤：
S1.接收和复苏重组皮肤模型Epikutis；
S2.选取光源；
S3.确定重组皮肤模型Epikutis的最大耐受剂量；
S4.检测受试物光毒性。
所述步骤S1包括：
在6孔板中培养重组皮肤模型Epikutis，每孔中1个重组皮肤模型Epikutis，每孔添加900μL复苏液，36-38℃、4-6%CO2、95%相对湿度的孵箱中孵育55-65min，后更换复苏液，过夜孵育18-22h，在复苏过程中，将损坏了以及表面上存在大量水分的重组皮肤模型Epikutis丢弃，复苏结束后对重组皮肤模型Epikutis表观进行评价，表面无气泡，无褶皱，不潮湿，表观正常后进行后续操作。
所述步骤S2中选取的光源为波长在320-400nm的UVA，所述UVA的剂量为0.5-60J/cm2，所述UVA的最高剂量照射时间为120min以下。
所述步骤S3包括：
复苏完成后，将重组皮肤模型Epikutis转移到无菌六孔板中（提前添加0.9 mL培养液，每块板五个模型），每个孔板为一组，共6组，包括对照组和5个辐照组，辐照剂量分别为5 J/cm2、10J/cm2、20 J/cm2、40J/cm2和60 J/cm2。每组照射结束后，关闭照射仪，15min后进行下一组照射。
每组辐照完毕后，将重组皮肤模型Epikutis移入另一个加有新鲜培养液（每孔3.3mL）的6孔板内，将6孔板置于37℃、5% CO2、95%相对湿度的条件下孵育22h，然后利用苏木精-伊红染色法检测组织形态学变化、利用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测组织活力变化，选择重组皮肤模型Epikutis在UVA辐射后组织活力依旧在75%以上的剂量为安全剂量，同时，在该剂量下组织的形态学无明显变化的为重组皮肤模型Epikutis的UVA最大耐受剂量。0-60J/cm2的UVA均未使重组皮肤模型Epikutis的组织活力下降至75%以下，而60J/cm2时，重组皮肤模型Epikutis的角质层变厚，结果见图1和图2。，最终确定重组皮肤模型Epikutis的UVA最大耐受剂量为40J/cm2。最终确定重组皮肤模型Epikutis的UVA最大耐受剂量为40J/cm2。
所述步骤S4包括：
1）将步骤S1复苏后的表观正常的重组皮肤模型Epikutis分为UV+组和UV-组；
2）UV+组和UV-组分别设置对照组和化妆品成品组（共3组）；
3）对照组的重组皮肤模型Epikutis不做任何处理，化妆品成品组分为3组，添加不同浓度氯丙嗪的化妆品成品组，分别为F组、F+[5] [6] （0.25mM）组和F+CPZ（0.5mM）组。每个浓度组3个平行模型，给药体积为25μL，记录给药时间，后置于37℃、5% CO2、95%相对湿度条件下孵育2h，然后用磷酸盐缓冲液将重组皮肤模型Epikutis表面残留的化妆品成品清洗干净，清洗15次，并用棉签将重组皮肤模型Epikutis表面擦干，将重组皮肤模型Epikutis转移至24孔板中，每孔培养液的体积为0.5mL；
4）UV+组进行UVA辐照，辐照剂量为40J/cm2，照射时揭开孔板盖，UV-组则放在相同环境的黑暗条件下；待UV+组照射完毕后，将UV+组和UV-组的所有重组皮肤模型Epikutis转移至含有3.3mL培养液的6孔板中，孔板置于37℃、5% CO2、95%相对湿度条件下孵育22h后，利用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法对各组重组皮肤模型Epikutis的组织活力进行检测；
5）判断化妆品成品的光毒性
化妆品成品的光毒性结果见图4，由图4可以看出，化妆品成品自身不具有光毒性，而在化妆品中添加不同浓度的强光毒物质-氯丙嗪后，结果产生一定的变化。当氯丙嗪浓度为0.25mM时不产生光毒性，当浓度升高至0.5mM时，化妆品成品表现出光毒性，UVA导致重组皮肤模型Epikutis的组织活力下降了40%左右。由此可以说明，若化妆品中添加了一定浓度的光毒性物质后，可以用重组皮肤模型Epikutis检测出来。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (10)

1.一种基于重组皮肤模型的光毒性检测方法，其中，所述方法包括以下步骤：
S1.接收和复苏重组皮肤模型；
S2.选取光源；
S3.确定重组皮肤模型的最大耐受剂量；
S4.检测受试物光毒性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述接收和复苏重组皮肤模型包括：
在6孔板中培养重组皮肤模型，每孔中1个重组皮肤模型，每孔添加900μL复苏液，在温度为36-38℃、相对湿度为92-95%和4-6%CO2的培养箱中孵育55-65min后，更换复苏液，过夜孵育18-22h，在复苏过程中，将损坏的以及表面上存在大量水分的重组皮肤模型丢弃，复苏结束后对重组皮肤模型表观进行评价，表观正常后进行后续操作。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光源为波长为320-400nm的UVA。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述UVA的剂量为0.5-60J/cm2。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述UVA的最高剂量照射时间为120min以下。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述确定重组皮肤模型的最大耐受剂量包括：使用UVA照射结束后，将重组皮肤模型在在温度为36-38℃、相对湿度为92-95%和4-6%CO2的培养箱中孵育22h，利用苏木精-伊红染色法检测重组皮肤模型形态学变化，利用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测重组皮肤模型组织活力变化，选取形态学无明显变化，组织活力在75%以上的最大辐照剂量作为重组皮肤模型的最大耐受剂量。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测受试物光毒性包括：
1）将步骤S1复苏后的表观正常的重组皮肤模型分为UV+组和UV-组；
2）UV+组和UV-组分别设置空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和受试物组；
3）按照分组分别进行重组皮肤模型表面给药，给药体积为25-80μL，给药时间为2h，然后用磷酸盐缓冲液将重组皮肤模型表面残留的液体清洗干净，并用棉签将重组皮肤模型表面擦干，将重组皮肤模型转移至24孔板中，每孔培养液的体积为0.5-1mL；
4）将UV+组进行步骤S3测得的最大UVA耐受剂量照射，将UV-组置于相同环境的黑暗条件下，待UV+组照射完毕后，将UV+组和UV-组的所有重组皮肤模型转移至含有3.3-3.7mL培养液的6孔板中后孵育22h；
5）检测各组的组织活力，判断各组潜在的光毒性。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试物包括水溶性的化学品、化妆品原料、油状或膏状的化妆品成品和不同比例的配方物质。
9.根据权利要求2所述的方法，其中，所述表观正常表现为重组皮肤模型表面无气泡、无褶皱、不潮湿。
10.重组皮肤模型在制备光毒性检测试剂盒中的用途。
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