CN105994255B - Mdck细胞的冻存和复苏 - Google Patents

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Abstract

MDCK细胞的冻存和复苏，它涉及MDCK细胞的冻存和复苏。本发明的冻存方法为：通过限制冻存液在与细胞混合中的加入速率，防止细胞损坏，并通过调整降温速率，防止细胞内产生冰晶，导致细胞死亡。并在细胞复苏中，快速进行复苏，保证了细胞的完整性，存活率。本发明的方法能够很好的保持MDCK细胞活力。本发明的复苏后的细胞活力达95％以上，保证了细胞质量，使其长期存活。

Description

MDCK细胞的冻存和复苏
技术领域
本发明涉及一种细胞的冻存和复苏。
背景技术
细胞的深低温保存是困扰低温生物学研究领域的复杂难题。细胞连接在组织中的部位、结构和功能特殊，其对冷冻损伤的反应及冷冻损伤的保护机制也应具有其特殊性。因此，有必要对深低温保存中的细胞连接损伤特点和规律进行系统观察和研究，建立针对性的、有效的深低温保存技术方案，提高和保证组织和器官的深低温保存效果。研究表明，细胞连接可能是深低温保存过程中各种损伤因子作用靶点之一，并导致组织结构的损伤与破坏。首先，细胞连接通过跨细胞膜蛋白，外联相邻细胞或基质，内联细胞骨架蛋白，整个细胞连接处于细胞内、外的不同部位，在深低温保存过程中这些部位所受到的损伤压力是不同的，如水与离子运动导致的渗透压变化、降温和复温过程中细胞体积变化造成的机械张力等，增加了细胞连接组成蛋白结构的变化、破坏和变性等。
在低于-70℃的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。细胞冻存液是直接影响冻存后细胞活力、质量等的重要因素。冷冻速率直接决定这冷冻的效果，细胞在冷冻过程中存在如下变化：当细胞被冷冻至-5℃时，因冷冻液中添加冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍然没有结冰，当被冷冻至-5℃～-15℃时，细胞外出现结冰而细胞内并没有出现结冰状态，细胞内未结冰的水分子会比细胞外结冰的溶液中的水分子具有更高的化学能，其结果是，细胞内的水分子为了和细胞外的水分子化学能保持平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分子向外流动的情况也不同，如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间流出，结果随着温度的降低，细胞内结冰，如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶非常小或者不结冰。
现有常规的MDCK细胞冻存液有两种，一种是由DMSO(二甲基亚砜)、FBS(胎牛血清)和基础培养基配制而成，另一种是由DMSO与FBS按体积比1:9配制而成。这是目前较为普遍的细胞冻存方式，但是，采用上述冻存液进行冻存的操作，均是较为常规的方法进行的，使得冻存的MDCK细胞复苏后活率低，而且表面抗原丢失严重，影响实验效果。因此，迫切需要出现一种能够效果保证冻存效果的方法，即能够有效避免细胞连接受损的一种保护细胞连接的深低温保存方法。
发明内容
本发明为了解决上述问题，而提供了一种有效的MDCK细胞的冻存和复苏方法。
本发明的MDCK细胞的冻存，它是按照以下步骤进行的：
一、取传代培养至对数期的MDCK细胞，进行细胞消化培养后，离心，去上清，置于冰浴中，加入冻存液重悬细胞，至细胞密度达5×106/mL，得细胞冷冻液；其中，冻存液采用滴管沿冻存管壁滴加，滴加速度为：前3min按0.2mL/min的速度滴加，3～5min按0.5mL/min的速度滴加，剩余时间按0.75mL/min的速度滴加；
二、先将冷冻管降至4℃，然后以1.5℃/min的速度降至-8℃，再取出放入-10℃，然后以1.0℃/min的速度降至-20℃，然后静置30min，再以0.5℃/min的速度降至-80℃，最后放入液氮保存；
所述的冻存液由体积百分含量为10％的DMSO和体积百分含量为90％的胎牛血清组成。
本发明的MDCK细胞的复苏，它是按照以下步骤进行的：
一、将细胞生长液放入37℃水浴中预热，预热后用75％的酒精擦拭盛有细胞生长液的容器外壁，放入生物安全柜内；
二、从液氮中取出权利要求1冻存的MDCK细胞，立即放入37℃水浴解冻，轻摇使其在1min内全部融化，然后以75％的酒精擦拭保存管外部，置于生物安全柜内；
三、将融化后的MDCK细胞悬液，加入到预热至37℃的细胞生长液中，在1000rpm转速下离心5min，弃上清，再用预热至37℃的含20％胎牛血清细胞生长液重悬，即完成MDCK细胞的复苏。细胞复苏后将在2-3小时贴壁，为保证细胞复苏后良好快速的生长状态，此时更换含15％胎牛血清细胞生长液，37℃培养2-3小时，然后更换含10％胎牛血清细胞生长液。
所述的EDTA-胰酶为质量百分含量为0.25％的EDTA-胰酶，其是由质量百分含量为0.25％的胰酶和0.53mMEDTA.4Na组成。
本发明包含以下有益效果：
本发明的冻存方法通过合理控制冷冻时的冻存速率，保持细胞内的水分不产生冰晶，并能够保证细胞处于冷冻状态，而且本申请通过在冻存前对细胞进行处理，对冻存液加入的速度进行限制，防止过度破坏细胞，如果加入快或者混合激烈，就会导致细胞损坏，导致冻存过程中，细胞死亡。
本发明的方法能够很好的保持MDCK细胞活力。本发明的复苏后的细胞活力达95％以上，保证了细胞质量，使其长期存活。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的MDCK细胞的冻存，它是按照以下步骤进行的：
一、取传代培养至对数期的MDCK细胞，进行细胞消化培养后，离心，去上清，置于冰浴中，加入冻存液重悬细胞，至细胞密度达5×106/mL，得细胞冷冻液；其中，冻存液采用滴管沿冻存管壁滴加，滴加速度为：前3min按0.2mL/min的速度滴加，3～5min按0.5mL/min的速度滴加，剩余时间按0.75mL/min的速度滴加；
二、先将冷冻管降至4℃，然后以1.5℃/min的速度降至-8℃，再取出放入-10℃，然后以1.0℃/min的速度降至-20℃，然后静置30min，再以0.5℃/min的速度降至-80℃，最后放入液氮保存；
所述的冻存液由体积百分含量为10％的DMSO和体积百分含量为90％的胎牛血清组成。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：1×107/mL的细胞密度滴加10mL冻存液。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：在MDCK细胞冻存前，更换细胞培养液，再进行细胞消化培养。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：细胞消化过程如下：
一、首先将EDTA-胰酶在37℃温度下预热，向传代培养至对数期的MDCK细胞中加入2ML的EDTA-胰酶，置于灭菌细胞瓶内，使EDTA-胰酶均匀分布在MDCK细胞薄层，37℃1min，然后去除EDTA-胰酶；
二、重新加入2mL预热至37℃的EDTA-胰酶，重复上述步骤；
三、加入1mLEDTA-胰酶，摇匀，置于37℃孵育3-5min，摇动细胞瓶至细胞成悬液，然后加入1mL胎牛血清中和；
四、加入8mL细胞生长液，用移液管从细胞瓶底部的一边向另一边进行吹打，且避免泡沫产生；
五、吹打后再加入细胞生长液至细胞悬液浓度为1×106/mL细胞，即完成。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：传代培养至对数期的MDCK细胞是采用含10％胎牛血清的DMEM/F12基础培养基进行培养的。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式的MDCK细胞的复苏，它是按照以下步骤进行的：
一、将细胞生长液放入37℃水浴中预热，预热后用75％的酒精擦拭盛有细胞生长液的容器外壁，放入生物安全柜内；
二、从液氮中取出权利要求1冻存的MDCK细胞，立即放入37℃水浴解冻，轻摇使其在1min内全部融化，然后以75％的酒精擦拭保存管外部，置于生物安全柜内；
三、将融化后的MDCK细胞悬液，加入到预热至37℃的细胞生长液中，在1000rpm转速下离心5min，弃上清，再用预热至37℃的含20％胎牛血清细胞生长液重悬，即完成MDCK细胞的复苏。细胞复苏后将在2-3小时贴壁，为保证细胞复苏后良好快速的生长状态，此时更换含15％胎牛血清细胞生长液，37℃培养2-3小时，然后更换含10％胎牛血清细胞生长液。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
以下实例所用的MDCK细胞均来源于国家CDC流感中心。
实施例1
在细胞冻存前，对MDCK细胞进行传代培养：
1、将状态良好，长成单层的MDCK细胞弃去细胞培养瓶中的培养液，用1mL的Hank’s平衡盐溶液(购买自gibco公司，编号为14170-112)清洗细胞1次，弃掉洗液；
2、向培养瓶内加入1mL预热的胰酶，盖好培养瓶，将其放入37℃温箱1min，弃掉胰酶；
3、重复步骤2；
4、培养瓶内加入1mL预热的胰酶，盖好培养瓶，将其放入37℃温箱1～4min，期间显微镜下观察细胞状态，当细胞出现明显细胞间隙时终止消化过程，弃掉胰酶；
5、加入0.2mL胎牛血清中和残余胰酶的活性，再补加8mL的细胞培养液(当用于后续传代时，培养瓶内剩余细胞，需要补加8mL量的细胞培养液；当用于后续冻存时，培养瓶内剩余细胞，需要补加8mL量的细胞培养液)，将细胞瓶轻轻拍打制成细胞悬液分装至T-25细胞瓶中，在37℃温箱培养，隔天更换细胞培养液，待MDCK细胞长成单层后停止培养，为分离流感病毒备用；其中，步骤五中所述的细胞培养液的pH为7.5，细胞培养液为：每1mL细胞培养液含有0.84mL的MEM、0.11mL的胎牛血清、0.012mL的L-谷氨酰胺、0.01mL的青链霉素和0.015mL的羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
上述细胞培养液中的成分均购买自Gibco公司，其中，MEM的商品编号：933346，胎牛血清(FBS)的商品编号：348555，L-谷氨酰胺(L-Gln)的商品编号：872417，青链霉素(P.S)的商品编号：918576,羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)的商品编号：908816。
将上述培养后的MDCK细胞进行冻存，过程如下：
1、细胞冻存材料
1)成片的MDCK细胞：80％～90％成片，细胞生长良好存活率高；
2)体积百分含量为10％的DMSO；体积百分含量为90％的胎牛血清
3)0.25％的EDTA-胰酶(质量百分含量为0.25％的胰酶；0.53mM EDTA.4Na)。
4)无菌移液管：1mL和10mL；
5)15mL无菌离心管。
2、冻存过程如下：
一、取传代培养至对数期的MDCK细胞，进行细胞消化培养后，移入15mL无菌离心管，1000rpm，离心5min，去上清，置于冰浴中，加入冻存液重悬细胞(添加过程中缓慢加入，避免剧烈操作)，至细胞密度达5×106/mL，得细胞冷冻液；其中，冻存液采用滴管沿冻存管壁滴加，滴加速度为：前3min按0.2mL/min的速度滴加，3～5min按0.5mL/min的速度滴加，剩余时间按0.75mL/min的速度滴加；
二、先将冷冻管降至4℃，然后以1.5℃/min的速度降至-8℃，再取出放入-10℃，然后以1.0℃/min的速度降至-20℃，然后静置30min，再以0.5℃/min的速度降至-80℃，最后放入液氮保存；
所述的冻存液由体积百分含量为10％的DMSO和体积百分含量为90％的胎牛血清组成。
所述的细胞消化过程如下：
一、首先将EDTA-胰酶在37℃温度下预热，向传代培养至对数期的MDCK细胞中加入2ML的EDTA-胰酶，置于灭菌细胞瓶内，使EDTA-胰酶均匀分布在MDCK细胞薄层，37℃1min，然后去除EDTA-胰酶；
二、重新加入2ML预热至37℃的EDTA-胰酶，重复上述步骤；
三、加入1mLEDTA-胰酶，摇匀，置于37℃孵育3-5min，摇动细胞瓶至细胞成悬液，然后加入1mL胎牛血清中和；
四、加入8mL细胞生长液，用移液管从细胞瓶底部的一边向另一边进行吹打，且避免泡沫产生；
五、吹打后再加入细胞生长液至细胞悬液浓度为1×106/mL细胞，即完成。
传代培养至对数期的MDCK细胞是采用含10％胎牛血清的DMEM/F12基础培养基进行培养的。
对上述冻存后的MDCK细胞进行复苏，过程如下：
一、将细胞生长液放入37℃水浴中预热，预热后用75％的酒精擦拭盛有细胞生长液的容器外壁，放入生物安全柜内；
二、从液氮中取出冻存的MDCK细胞，检查放置MDCK细胞的冻存管盖子是否拧紧，避免热胀冷缩过程盖子松掉，立即放入37℃水浴解冻，轻摇使其在1min内全部融化，然后以75％的酒精擦拭保存管外部，置于生物安全柜内；
三、将融化后的MDCK细胞悬液，加入到预热至37℃的细胞生长液中，在1000rpm转速下离心5min，弃上清，再用预热至37℃的含20％胎牛血清细胞生长液重悬，即完成MDCK细胞的复苏。细胞复苏后将在2-3小时贴壁，为保证细胞复苏后良好快速的生长状态，此时更换含15％胎牛血清细胞生长液，37℃培养2-3小时，然后更换含10％胎牛血清细胞生长液。
实施例2
本实施例采用常规冻存及复苏方法，作为对照试验。
1、细胞冻存步骤
冻存液的配置
胎牛血清：9ml
二甲基亚砜：1ml
(2)细胞消化。
(3)细胞消化后，加入配置好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。
细胞冻存浓度为1×106
(4)细胞冻存过程：4℃2小时，-20℃2小时，放入液氮长期保存。
2、细胞复苏过程：
(1)将细胞生长液放入37℃回温，回温后以70％～75％的酒精擦拭，放入生物安全柜(或无菌的操作台)内。
(2)自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程盖子容易松掉。
(3)立即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1分钟内全部融化，以70％～75％的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜(或无菌操作台)。
(4)取出1.0ml解冻的细胞悬液，缓慢加入有生长液的细胞培养瓶内，混合均匀，放入培养箱培养。
(5)次日，更换细胞生长液。
对复苏后的MDCK细胞进行以下检测：
1、MDCK细胞敏感性检测
选择已知的TCID50的流感病毒，在同一条件下分别感染早代(小于30代)的细胞株和现有的细胞株，对其进行TCID50测定。如果测试的TCID50比早代的低2个或以上Lg，表明其对病毒的敏感性已经下降，不应继续使用。如果两者相差不超出一个Lg，表明可继续使用。
2、流感病毒分离
采用MDCK细胞进行甲型H1N1流感病毒分离，通过MDCK细胞分离的流感病毒与原始标本相似。另外，由于“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性高，因此，采用MDCK细胞分离病毒，对复苏后的MDCK细胞效果进行验证。
1)实验材料
75～90％成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶；TPCK处理胰酶(牛胰腺来源Ⅷ)(SIGMAT8802)；HEPES缓冲液，1M母液；D-MEM培养基(高糖，含有L-谷氨酰胺)，HanK’s液；青、链霉素母液(10000U/mL青霉素G，10000μg/mL硫酸链霉素)；牛血清白蛋白组分V，7.5％溶液(GIBCOCat No 15260)；处理好的临床标本0.5mL；无菌移液管。
2)培养基和试剂的准备
a)青、链霉素母液(终浓度：100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)
b)牛血清白蛋白组分V 12.5mL(终浓度：25mM)
c)HEPES缓冲液12.5mL(终浓度：25mM)
d)加入7.5％NaHCO310～15mL(终浓度：2～3％)。
3、流感病毒MDCK细胞分离过程
(1)75～90％成片细胞的准备
a)用40倍光学显微镜观察细胞生长状态，选择处于对数生长期的MDCK细胞用于病毒分离。
b)轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸6mLpH 7.4～7.6的HanK’s液(或PBS缓冲液)清洗细胞3遍。
(2)接种与细胞培养瓶
a)用无菌的移液管将清洗细胞的HanK’s液从细胞培养瓶中移出。
b)用无菌的移液管吸取500μl临床样品置于细胞瓶中，温和摇动数次，使之均与铺于细胞培养瓶底。
c)将步骤2)中培养瓶放入35℃,5％CO2培养箱中吸附1～2h。
d)从培养箱中取出培养瓶，用10mL的无菌移液管吸取6mL pH 7.4-7.6的HanK’s液(或PBS缓冲液)清洗细胞，加入5mL含终浓度2μg/mLTPCK处理胰酶病毒生长液于细胞培养瓶中。
e)放置于35℃,5％CO2培养箱培养。
f)每日观察细胞病变情况(细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大成网状，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落)。
(3)细胞培养物的收获
a)当75％～100％细胞出现病变时进行收获，即使无细胞病变也应于第7天收获。
b)进行红细胞凝集实验(HA)，用HI方法进行流感病毒的鉴定。对于HA≤8的细胞分离物，进行10-1～10-3稀释后，再感染细胞继续进行细胞传代，直至HA≥8时才能利用HI方法进行病毒的鉴定。经连续传代2此以上，HA<8者，可以用核酸检测方法鉴定分型。
流感病毒分离结果如表2所示，
4、复苏后的MDCK细胞存活率测定
取细胞复苏后的细胞悬液，按每mL细胞悬液加10μL的0.1％台盼蓝溶液，混合均匀，静置10min。吸取混合液，滴入细胞计数板内，在显微镜下观察计数。凡折光性强而不着色者为活细胞，染蓝色者为死细胞，计数1000个细胞，计算细胞存活力，具体公式为：
活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100；
结果显示：采用实施例1(即本发明的方法)的存活率能够达到95％以上，而采用实施例2的方法存活率最高能达到90％。
5、复苏后的MDCK细胞形态学观察
采用实施例1的冻存液冻存的细胞，在细胞复苏过程，培养MDCK细胞开始贴壁，在倒置显微镜下观察复苏后的细胞状态，生长过程中仍旧保持几个至十几个细胞聚集生长的特性，细胞形态良好；培养24h后，可见95％以上的MDCK细胞大面积贴壁生长，无悬浮细胞，细胞呈铺路石样生长，大小均匀，折光性好，显示活力旺盛；结果见表1所示；实施例2对比试验的冻存液，复苏培养24h后，悬浮细胞较多，贴壁生长的细胞形状不规则，折光性较差，活力较低。
表1复苏后MDCK细胞状态
表2甲型H1N1流感病毒分离对比
血凝素滴度(HA) 实验组 对照组
2<HA<8 12份 26份
8≤HA<16 16份 9份
HA≥16 7份 0份
合计 35份 35份
综合以上分析，可知，采用本发明的技术方案MDCK细胞冻存复苏效果，均优于现有方案。

Claims (6)

1.MDCK细胞的冻存方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、取传代培养至对数期的MDCK细胞，进行细胞消化培养后，离心，去上清，置于冰浴中，加入冻存液重悬细胞，至细胞密度达5×106/mL，得细胞冷冻液；其中，冻存液采用滴管沿冻存管壁滴加，滴加速度为：前3min按0.2mL/min的速度滴加，3～5min按0.5mL/min的速度滴加，剩余时间按0.75mL/min的速度滴加；
二、在步骤一处理后，先将冷冻管降至4℃，然后以1.5℃/min的速度降至-8℃，再取出放入-10℃，然后以1.0℃/min的速度降至-20℃，然后静置30min，再以0.5℃/min的速度降至-80℃，最后放入液氮保存；
所述的冻存液由体积百分含量为10％的DMSO和体积百分含量为90％的胎牛血清组成。
2.根据权利要求1所述的MDCK细胞的冻存方法，其特征在于1×107/mL的细胞密度滴加10mL冻存液。
3.根据权利要求1所述的MDCK细胞的冻存方法，其特征在于在MDCK细胞冻存前，更换细胞培养液，再进行细胞消化培养。
4.根据权利要求1所述的MDCK细胞的冻存方法，其特征在于细胞消化过程如下：
一、首先将EDTA-胰酶在37℃温度下预热，向传代培养至对数期的MDCK细胞中加入2ML的EDTA-胰酶，置于灭菌细胞瓶内，使EDTA-胰酶均匀分布在MDCK细胞薄层，37℃1min，然后去除EDTA-胰酶；
二、重新加入2mL预热至37℃的EDTA-胰酶，重复上述步骤；
三、加入1mL EDTA-胰酶，摇匀，置于37℃孵育3-5min，摇动细胞瓶至细胞成悬液，然后加入1mL胎牛血清中和；
四、加入8mL细胞生长液，用移液管从细胞瓶底部的一边向另一边进行吹打，且避免泡沫产生；
五、吹打后再加入细胞生长液至细胞悬液浓度为1×106/mL细胞，即完成。
5.根据权利要求1所述的MDCK细胞的冻存方法，其特征在于传代培养至对数期的MDCK细胞是采用含10％胎牛血清的DMEM/F12基础培养基进行培养的。
6.MDCK细胞的复苏方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、将细胞生长液放入37℃水浴中预热，预热后用75％的酒精擦拭盛有细胞生长液的容器外壁，放入生物安全柜内；
二、从液氮中取出按照权利要求1冻存方法冻存的MDCK细胞，立即放入37℃水浴解冻，轻摇使其在1min内全部融化，然后以75％的酒精擦拭保存管外部，置于生物安全柜内；
三、将融化后的MDCK细胞悬液，加入到预热至37℃的细胞生长液中，在1000rpm转速下离心5min，弃上清，再用预热至37℃的含20％胎牛血清细胞生长液重悬，即完成MDCK细胞的复苏， 细胞复苏后将在2-3小时贴壁，为保证细胞复苏后良好快速的生长状态，此时更换含15％胎牛血清细胞生长液，37℃培养2-3小时，然后更换含10％胎牛血清细胞生长液。
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