CN103215219A - 一种mdck细胞改良传代方法 - Google Patents

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任莉娜
张崇华
杜溪乔
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Abstract

一种MDCK细胞改良传代方法。它是在MDCK细胞（培养瓶规格：T-75）传代消化过程中，通过3次更换消化液(EDTA-胰酶)，前2次消化液作用时间为1min，第3次消化液作用时间因细胞消化状态而定，每次加入1mL消化液，使消化液作用温度始终保持在37℃最佳消化温度；加入消化液前要用Hank’s平衡盐溶液清洗细胞、终止消化时弃掉消化液后要加入0.2mL的胎牛血清，其目的是为了进行消化液和胎牛血清的中和作用，保护细胞；本发明累计消化时间为3～6min。与流感监测方案相比，每消化一瓶（培养瓶规格：T-75）MDCK细胞节省有效工作时间9～11min,节约消化液8mL。

Description

一种MDCK细胞改良传代方法
技术领域
本发明涉及动物组织培养技术领域，MDCK细胞（狗肾细胞）主要用于流感病毒的分离。
背景技术
流感病毒所导致的流行性感冒（简称流感）是WHO第1个实行全球监测的传染病，是预防控制流感的策略和措施之一，其中流感毒株的分离对于流感监测具有非常重要的意义，作为国家流感监测的网络实验室，通过对所在监测地区的流感病毒的分离掌握最新的流感流行趋势，为疫苗株的选择制备做好流感疫情预报。
目前在基层的流感监测网络实验室中用于流感病毒分离的MDCK细胞在20～35代之间，对于状态良好长成单层的MDCK细胞，其传代消化是关键技术，每一次传代消化决定着细胞下一代的生长状态及对流感病毒的分离效果。
目前,国内分离流感病毒主要采用MDCK细胞培养法，作为流感监测的网络实验室，每年都承担着大量的流感病毒分离鉴定工作，实验室需要培养大量的MDCK细胞，根据国家流感监测方案《流行性感冒诊断标准WS285-2008（附录A）》进行一瓶MDCK细胞(培养瓶规格：T-75)传代需要消化液（EDTA-胰酶）11mL、消化时间为12～17min,在工作中如果传代细胞为5瓶，累计EDTA-胰酶用量在55mL、累计工作时间60～85mim，在实际工作中上述工作模式影响了工作质量、工作效率，增大了工作成本，因此建立更为有效的MDCK细胞传代模式至关重要。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有MDCK细胞培养法存在工作效率低、工作质量差以及工作成本高的问题，而提供了一种MDCK细胞改良传代方法。
本发明的一种MDCK细胞改良传代方法，是按照以下步骤进行的：
一、取培养瓶中培养的单层MDCK细胞，弃去培养瓶中培养液，用Hank’s平衡盐溶液清洗MDCK细胞，弃掉洗液；
二、向步骤一培养瓶中清洗后的MDCK细胞加入1mL预热的胰酶，放入37℃温箱培养1min，弃掉胰酶；
三、重复步骤二操作1次；
四、向步骤三处理的MDCK细胞中加入1mL预热的胰酶，放入37℃温箱培养1～4min，期间显微镜下观察细胞状态，若细胞出现明显细胞间隙时终止消化过程，弃掉胰酶；
五、向步骤四处理后的MDCK细胞中加入0.2mL胎牛血清中和残余胰酶的活性，再补入8mL的细胞培养液，混匀制成细胞悬液分装至T-25细胞瓶中，在37℃温箱培养，隔天更换细胞培养液，待MDCK细胞长成单层后停止培养，即完成MDCK细胞改良传代；其中，步骤五中所述的细胞培养液为：每1mL细胞培养液含有0.84mL的MEM、0.11mL的胎牛血清、0.012mL的L-谷氨酰胺、0.01mL的青链霉素和0.015mL的羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
本发明包含以下有益效果：
MDCK细胞传代消化过程中需要消化液（即EDTA-胰酶），EDTA-胰酶在37℃时消化效果是最佳的，消化前胰酶应37℃预热，细胞消化温度同时控制在37℃，消化过程中应更换胰酶，始终使胰酶保持对细胞最有效的消化作用；同时细胞培养液中的胎牛血清可以中和胰酶的消化作用，因此在对细胞进行消化前应用洗液清洗培养瓶中残留的培养液，减少残留培养液的胎牛血清对胰酶的中和作用。根据实际工作的需要，改良的MDCK细胞传代技术，在传代一瓶MDCK细胞的过程中只需要3mL的EDTA-胰酶及3～6min的消化时间；在流感流行季节，实际工作中平均每一次需要5瓶细胞传代，改良的传代技术可以累计节约40mLEDTA-胰酶、节省45～55min的工作时间。
本发明提高了工作质量和工作效率、节约有效工作时间、降低了实验成本，同时提高了流感病毒分离效率。本发明每传代消化一瓶（T-75）MDCK细胞与国家流感监测方案《流行性感冒诊断标准WS285-2008（附录A）》相比节省9～11min,节约8mL胰酶。
每传代消化一瓶（T-75）MDCK细胞与国家流感监测方案《流行性感冒诊断标准WS285-2008（附录A）》相比节省9～11min,实际工作中平均每次传代消化5瓶MDCK细胞以备流感病毒分离用，可累计节省45～55min有效工作时间。
每传代消化一瓶（T-75）MDCK细胞与国家流感监测方案《流行性感冒诊断标准WS285-2008（附录A）》相比节约8mL胰酶，在流感流行季节，实际工作中平均每次消化累计节约40mL胰酶。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种MDCK细胞改良传代方法，是按照以下步骤进行的：
一、取培养瓶中培养的单层MDCK细胞，弃去培养瓶中培养液，用Hank’s平衡盐溶液清洗MDCK细胞，弃掉洗液；
二、向步骤一培养瓶中清洗后的MDCK细胞加入1mL预热的胰酶，放入37℃温箱培养1min，弃掉胰酶；
三、重复步骤二操作1次；
四、向步骤三处理的MDCK细胞中加入1mL预热的胰酶，放入37℃温箱培养1～4min，期间显微镜下观察细胞状态，若细胞出现明显细胞间隙时终止消化过程，弃掉胰酶；
五、向步骤四处理后的MDCK细胞中加入0.2mL胎牛血清中和残余胰酶的活性，再补入8mL的细胞培养液，混匀制成细胞悬液分装至T-25细胞瓶中，在37℃温箱培养，隔天更换细胞培养液，待MDCK细胞长成单层后停止培养，即完成MDCK细胞改良传代；其中，步骤五中所述的细胞培养液为：每1mL细胞培养液含有0.84mL的MEM、0.11mL的胎牛血清、0.012mL的L-谷氨酰胺、0.01mL的青链霉素和0.015mL的羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
本实施方式细胞培养液中的成分均购买自Gibco公司，其中，MEM的商品编号：933346，胎牛血清（FBS）的商品编号：348555，L-谷氨酰胺（L-Gln）的商品编号：872417，青链霉素（P.S）的商品编号：918576,羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）的商品编号：908816。
本实施方式的MDCK细胞购买自国家CDC流感中心。
本实施方式包含以下有益效果：
MDCK细胞传代消化过程中需要消化液（即EDTA-胰酶），EDTA-胰酶在37℃时消化效果是最佳的，消化前胰酶应37℃预热，细胞消化温度同时控制在37℃，消化过程中应更换胰酶，始终使胰酶保持对细胞最有效的消化作用；同时细胞培养液中的胎牛血清可以中和胰酶的消化作用，因此在对细胞进行消化前应用洗液清洗培养瓶中残留的培养液，减少残留培养液的胎牛血清对胰酶的中和作用。根据实际工作的需要，改良的MDCK细胞传代技术，在传代一瓶MDCK细胞的过程中只需要3mL的EDTA-胰酶及3～6min的消化时间；在流感流行季节，实际工作中平均每一次需要5瓶细胞传代，改良的传代技术可以累计节约40mLEDTA-胰酶、节省45～55min的工作时间。
本实施方式提高了工作质量和工作效率、节约有效工作时间、降低了实验成本，同时提高了流感病毒分离效率。本发明每传代消化一瓶（T-75）MDCK细胞与国家流感监测方案《流行性感冒诊断标准WS285-2008（附录A）》相比节省9～11min,节约8mL胰酶。
每传代消化一瓶（T-75）MDCK细胞与国家流感监测方案《流行性感冒诊断标准WS285-2008（附录A）》相比节省9～11min,实际工作中平均每次传代消化5瓶MDCK细胞以备流感病毒分离用，可累计节省45～55min有效工作时间。
每传代消化一瓶（T-75）MDCK细胞与国家流感监测方案《流行性感冒诊断标准WS285-2008（附录A）》相比节约8mL胰酶，在流感流行季节，实际工作中平均每次消化累计节约40mL胰酶。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的胰酶为质量百分含量为0.25%的EDTA-胰酶。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述的预热的胰酶是指将胰酶预热至37℃。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一和二中所述的培养瓶为T-75。其它与具体实施方式一至三之一相同。
通过以下试验验证本发明的有益效果：
本试验操作过程应严格遵守生物安全操作手册，在无菌条件下进行，用于细胞消化的0.25%EDTA-胰酶（购买自gibco公司，编号为25200-056）置37℃预热，本试验的一种MDCK细胞改良传代方法，具体如下：
1、将状态良好，长成单层的MDCK细胞弃去细胞培养瓶中的培养液，用1mL的Hank’s平衡盐溶液(购买自gibco公司，编号为14170-112)清洗细胞1次，弃掉洗液；
2、向培养瓶内加入1mL预热的胰酶，盖好培养瓶，将其放入37℃温箱1min，弃掉胰酶；
3、重复步骤2；
4、培养瓶内加入1mL预热的胰酶，盖好培养瓶，将其放入37℃温箱1～4min，期间显微镜下观察细胞状态，当细胞出现明显细胞间隙时终止消化过程，弃掉胰酶；
5、加入0.2mL胎牛血清中和残余胰酶的活性，再补加8mL的细胞培养液（当用于后续传代时，培养瓶内剩余细胞，需要补加8mL量的细胞培养液；当用于后续冻存时，培养瓶内剩余细胞，需要补加8mL量的细胞培养液），将细胞瓶轻轻拍打制成细胞悬液分装至T-25细胞瓶中，在37℃温箱培养，隔天更换细胞培养液，待MDCK细胞长成单层后停止培养，为分离流感病毒备用；其中，步骤五中所述的细胞培养液的pH为7.5，细胞培养液为：每1mL细胞培养液含有0.84mL的MEM、0.11mL的胎牛血清、0.012mL的L-谷氨酰胺、0.01mL的青链霉素和0.015mL的羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
本试验细胞培养液中的成分均购买自Gibco公司，其中，MEM的商品编号：933346，胎牛血清（FBS）的商品编号：348555，L-谷氨酰胺（L-Gln）的商品编号：872417，青链霉素（P.S）的商品编号：918576,羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）的商品编号：908816。
本试验的MDCK细胞购买自国家CDC流感中心。
本试验的主要用途是对T-75细胞瓶单层MDCK细胞传代消化后，分装至7～9瓶T-25细胞瓶内预分离流感病毒用。
本试验每传代消化一瓶（T-75）MDCK细胞与国家流感监测方案《流行性感冒诊断标准WS285-2008（附录A）》相比节省9～11min,节约8mL胰酶。
每传代消化一瓶（T-75）MDCK细胞与国家流感监测方案《流行性感冒诊断标准WS285-2008（附录A）》相比节省9～11min,实际工作中平均每次传代消化5瓶MDCK细胞以备流感病毒分离用，可累计节省45～55min有效工作时间。
每传代消化一瓶（T-75）MDCK细胞与国家流感监测方案《流行性感冒诊断标准WS285-2008（附录A）》相比节约8mL胰酶，在流感流行季节，实际工作中平均每次消化累计节约40mL胰酶。

Claims (4)

1.一种MDCK细胞改良传代方法，其特征在于MDCK细胞改良传代方法是按照以下步骤进行的：
一、取培养瓶中培养的单层MDCK细胞，弃去培养瓶中培养液，用Hank’s平衡盐溶液清洗MDCK细胞，弃掉洗液；
二、向步骤一培养瓶中清洗后的MDCK细胞加入1mL预热的胰酶，放入37℃温箱培养1min，弃掉胰酶；
三、重复步骤二操作1次；
四、向步骤三处理的MDCK细胞中加入1mL预热的胰酶，放入37℃温箱培养1～4min，期间显微镜下观察细胞状态，若细胞出现明显细胞间隙时终止消化过程，弃掉胰酶；
五、向步骤四处理后的MDCK细胞中加入0.2mL胎牛血清中和残余胰酶的活性，再补入8mL的细胞培养液，混匀制成细胞悬液分装至T-25细胞瓶中，在37℃温箱培养，隔天更换细胞培养液，待MDCK细胞长成单层后停止培养，即完成MDCK细胞改良传代；其中，步骤五中所述的细胞培养液为：每1mL细胞培养液含有0.84mL的MEM、0.11mL的胎牛血清、0.012mL的L-谷氨酰胺、0.01mL的青链霉素和0.015mL的羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
2.根据权利要求1所述的一种MDCK细胞改良传代方法，其特征在于所述的胰酶为质量百分含量为0.25%的EDTA-胰酶。
3.根据权利要求1或2所述的一种MDCK细胞改良传代方法，其特征在于所述的预热的胰酶是指将胰酶预热至37℃。
4.根据权利要求1所述的一种MDCK细胞改良传代方法，其特征在于步骤一和二中所述的培养瓶为T-75。
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