CN105838676A - 一种用于视网膜色素上皮细胞的培养液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于视网膜色素上皮细胞的培养液及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105838676A
CN105838676A CN201610298171.6A CN201610298171A CN105838676A CN 105838676 A CN105838676 A CN 105838676A CN 201610298171 A CN201610298171 A CN 201610298171A CN 105838676 A CN105838676 A CN 105838676A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nutrient solution
liquid storage
culture medium
acid
volume
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610298171.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105838676B (zh
Inventor
周琪
祝贺
谭元卿
郝捷
王磊
王柳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Zoology of CAS
Original Assignee
Institute of Zoology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Zoology of CAS filed Critical Institute of Zoology of CAS
Priority to CN201610298171.6A priority Critical patent/CN105838676B/zh
Publication of CN105838676A publication Critical patent/CN105838676A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105838676B publication Critical patent/CN105838676B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C12N2501/392—Sexual steroids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于培养视网膜色素上皮细胞(hESC‑RPE)的培养液，其特征在于，所述培养液包含：体积分数为96～97.5的基础培养基，体积分数为1的非必需氨基酸(NEAA)、体积分数为1的L‑谷氨酰胺、体积分数为0.5～2的N2添加剂、组分a和组分b。本发明还提供了上述培养液的制备方法，以及使用所述培养液培养视网膜色素上皮细胞(hESC‑RPE)的方法。与现有的培养基相比，本发明的培养基配方简单，成本较低，不涉及任何伦理问题，可以促进细胞增殖。

Description

一种用于视网膜色素上皮细胞的培养液及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于培养视网膜色素上皮细胞(RPE)的培养基，所述视网膜色素上皮细胞包括ARPE-19细胞系，原代分离的视网膜色素上皮细胞，人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞(hESC-RPE)，人诱导多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞(hiPSC-PRE)和多能干细胞来源的RPE。具体地，本发明涉及使用无动物源性、化学成分完全明确的培养基在维持RPE细胞的形态和功能，促进细胞增殖方面，以及进行规模化扩增和任何形式临床使用中的用途。
背景技术
视网膜色素变性(RP)，年龄相关性黄斑病变(AMD)，先天性黄斑变性(SMD)等视网膜相关疾病严重影响着人类的生活质量，但是目前临床上仍缺乏有效的治疗方法。发生该类疾病的主要原因是RPE对视细胞外节膜盘的吞噬、消化功能衰退，致使盘膜崩解物残留、形成一层障碍物，妨碍营养物质从脉络膜到视网膜转移，从而引起视细胞的进行性营养不良及逐渐变性和凋亡，最终导致整个脉络膜微循环异常，可能波及黄斑、视神经等损伤，影响患者视力，最终导致患者失明。
RPE细胞是位于视网膜最外部靠近脉络膜层的连续单层细胞，它们在维护视网膜细胞生存环境和功能代谢上发挥着不可或缺的功能。2012年，美国OCAT公司(前用名：Advanced Cell Technology)首次在临床试验中利用hESC-RPE治疗AMD和SMD患者，并在后续报道中证明了hESC-RPE在移植中期是安全和有效的。
APRE-19细胞是一种因为基因突变导致端粒酶激活，进而永生化的RPE细胞系。在很多研究中，实验者通常会选择APRE-19作为RPE类细胞的阳性对照组，或者先利用APRE-19细胞进行实验条件的摸索。
近年来，随着越来越多的干细胞类临床试验的开展，为了推进干细胞类产品的临床应用，人们一直在不断尝试改进细胞的培养体系。期望获得无动物源性、化学成分明确的培养体系。起初，RPE类细胞(如ARPE-19，人胎儿RPE细胞)是以含有胎牛血清(FBS)的培养基进行培养。随着替代胎牛血清的血清替代物(KOSR)的问世，原有的FBS成分逐渐被KOSR所替代。但是，KOSR依然是取源于动物，且化学成分至今尚未公开，为hESC-RPE的临床应用带来了安全隐患。
综上所述，RPE类细胞具有较大的临床应用潜能，如治疗RP和AMD，而这些都需要大量的人视网膜色素上皮细胞。因此，当前亟需可用于培养RPE类细胞的无动物源成分、化学成分明确的培养基。
发明内容
针对上述需求，本发明首次提出一种无动物源性、化学成分明确的RPE类细胞培养基。
本发明的目的就是提供一种用于培养RPE类细胞的培养基，并且该培养基无动物源性，化学成分明确，从而为RPE类细胞的临床应用奠定良好的基础。
本发明提供了一种用于培养视网膜色素上皮细胞(hESC-RPE)的培养液，其特征在于，所述培养液包含：体积分数为96～97.5的基础培养基，体积分数为1的非必需氨基酸(NEAA)、体积分数为1的L-谷氨酰胺、体积分数为0.5～2的N2添加剂、组分a和组分b；
其中，所述基础培养基选自MEM、α-MEM、1640、DMEM、F10、F12、D/F12、Neurobasl和knokcout DMEM中的一种；优选地，所述基础培养基的渗透压为280～300Pa；
所述组分a由在培养液中的浓度为1-100mg/L的L-肉毒碱、1-100mg/L的乙醇胺、10-200mg/L的腐胺、0.01-0.1mg/L的亚硒酸钠、1-5mg/L亚麻酸、1-5mg/L的亚油酸、5-10mg/L的转铁蛋白组成；
所述组分b由在培养液中的终浓度为10-500mg/L的维生素C酸或10-500mg/L的维生素C酸磷酸镁盐、0.5-50mg/L的还原型谷胱甘肽组成。
在根据本发明的一个实施方案中，所述培养液还包含组分c，所述组分c选自表皮生长因子EGF、胰岛素、Rock通路选择性抑制剂中的一种或多种；其中，所述表皮生长因子EGF在培养液中的终浓度为10～20μg/L、胰岛素在培养液中的终浓度为1～100mg/L、Rock通路选择性抑制剂在培养液中的终浓度为1～100μM，优选为5～10μM；所述Rock通路选择性抑制剂为HA100或Y27632。
其中，各生长因子添加体积为微量体积，不影响总培养液体积。
在根据本发明的一个实施方案中，所述培养液中N2添加剂由溶于去离子水或Mili Q水的1～10mg/ml的动物源胰岛素或人重组胰岛素、1～200mg/ml的人转铁蛋白、0.1～1mg/ml的亚硒酸钠、1～20mg/ml的腐胺和0.1～10mg/ml的孕酮组成。
在根据本发明的一个实施方案中，所述培养基还包含1000U/mL的青霉素和100-500mg/L链霉素。
本发明进一步提供了上述培养液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1)将组分a的成份溶于灭菌去离子水中配制成储液a，优选地，所述储液a为50×储液；更优选地，所述储液a使用0.22μm的滤器过滤；
2)将在培养液中的终浓度为10-500mg/L的维生素C酸或维生素C酸/维生素C酸磷酸镁盐与在培养液中的终浓度为0.5-50mg/L的还原型谷胱甘肽混合后溶于灭菌去离子水中配制成储液b，优选地，所述储液b为1000×储液；更优选地，所述储液b使用0.22μm的滤器过滤；
3)提供适当的容器，根据培养基的终体积，按照体积比向所述容器中加入所述终体积的1％的非必需氨基酸、1％的L-谷氨酸、0.5～2％的N2添加剂，最后加入基础培养基至体积达到所述终体积；更优选地，所述储液a使用0.22μm的滤器过滤；
4)根据步骤3)所述的终体积，向所述容器中加入适量的储液a和储液b，即得所述培养液。
在根据本发明的一个实施方案中，所述方法还包括加入1000U/mL的青霉素和100-500mg/L的链霉素。
在根据本发明的一个实施方案中，所述方法为：
(1)按照在培养液中的终浓度为2mg/L的L-肉毒碱、1mg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、0.016mg/L的亚硒酸钠、1mg/L的亚油酸、1mg/L的亚麻酸、5mg/L的转铁蛋白的比例制备50×的储液a；优选地，使用0.22μm的滤器过滤；
(2)按照10-500mg/L的维生素C酸或10-500mg/L的维生素C酸/维生素C酸磷酸镁盐、1mg/L还原型谷胱甘肽的比例制备1000×的储液b；
(3)根据配制的培养基的终体积，按体积分数加入所述终体积1％的非必需氨基酸、1％的L-谷氨酸、0.5％-2％的N2添加剂、加入knockoutDMEM至所述终体积；
(4)加入相应量的储液a；
(5)加入相应量的储液b，既得培养基；
优选地，以5M氯化钠将所述培养基的渗透压调制至280～300Pa；优选地，所述表皮生长因子EGF在使用前配制成适宜的浓度直接加入到所述培养液中。
在根据本发明的一个实施方案中，当所述培养液还进一步添加胰岛素时是通过包括下述步骤的方法实现的：
在所述培养基中加入适量的胰岛素，充分溶解至溶液清澈，所述胰岛素在培养液中的浓度为1～100mg/L。
在根据本发明的一个实施方案中，当所述培养液还包含ROCK通路的选择性抑制剂HA100或Y27632时是通过包括下述步骤的方法实现的：
将所述HA100或Y27632溶于微量的DMSO中，然后溶于灭菌去离子水中，搅拌，并以0.22μm滤器过滤，配制为储液c，优选地，所述储液c为1000×储液；更优选地，所述储液a、储液b和储液c置于-20℃～-80℃的环境中存储；更优选地，存储时分装至小容量容器中。
使用时，直接将适宜浓度的生长因子添加在培养液中使用，现配现用，不易以培养液的形式储存。
本发明进一步提供了一种视网膜色素上皮细胞(hESC-RPE)的培养方法，其特征在于，所述培养方法使用如权利要求1～5中任一项所述的培养液培养细胞；
优选地，所述培养方法包括步骤：
a)将hESC-RPE细胞以单细胞悬液的形式接种到所述培养液中得到细胞悬液；优选地，所述细胞悬液的密度为0.5～1×105个细胞/cm2；
b)每隔一天换一次培养基，使细胞长到100％的饱和度后使用trypleTMselect酶消化10min后传代；优选地，传代时培养液中添加ROCK抑制剂Y27632；
优选地，所述培养液的使用量为每4.5cm2加入1mL培养基；
优选地，所述培养液中ROCK抑制剂Y27632的浓度为10μM。
本发明具有以下有益效果：
与现有的培养基相比，本发明的培养基配方简单，成本较低，不涉及任何伦理问题，可以促进细胞增殖，而且培养的细胞具有正常的形态与功能，而且该培养基临床应用的前景也非常好，所以不论是从基础研究还是市场推广，本发明都具有更广泛的前景。
本发明的主要前景和意义包括：
1)使用本发明的培养基培养的视网膜色素上皮细胞，与传统的培养基相比，不论从生长效率、细胞的形态与功能、还是批次与批次之间的稳定性，都有显著的提高。
2)化学成分明确培养基培养的视网膜色素上皮细胞可以为药物筛选以及视网膜色素上皮细胞临床试验药物都提供了很好的条件。
3)人视网膜色素上皮细胞的临床应用首先必须确保是临床级别的种子干细胞。这样才能将多能性干细胞相关产品应用于临床，以往的培养基中的动物源性成分都会限制其应用。本发明在化学成分完全明确的条件下可以很好的促进视网膜色素上皮细胞生长并且所培养的细胞具有正常的功能与形态，所以可以更快的促进将来的临床转化。
本发明涉及一种适于培养多类型视网膜色素上皮细胞的化学成分明确的培养基。本发明培养基适合将来的临床应用。本发明中培养基配方的各组分明确，成本低廉，非常有利于视网膜色素上皮细胞大规模的制备并应用于临床。
附图说明
图1为以北京干细胞库建立的临床级人胚胎干细胞系(Q-CTS-hESC-2)在无滋养层，无动物源，化学成分明确的E8-vitronectin人胚胎干细胞培养系统培养后，使用自发分化的方法获得的hESC-RPE。
图2为经过本发明的培养基培养过4代后的hESC-RPE的情况。
图3为免疫荧光检测用本发明的培养基培养过后的hESC-RPE的标志性蛋白表达情况。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
主要材料和试剂
低温保存箱购自中国，海尔；制冰机购自中国，唯利安；液氮罐购自中国，东亚；四度离心机购自美国，Beckman；生物安全柜、二氧化碳培养箱和Nanodrop购自美国，Thermo；细胞计数仪、纯水仪购自美国，Millipore；电子天平购自德国，赛多利斯；移液枪、多聚酶链式反应(PCR)仪购自德国，Eppendorf；激光共聚焦显微镜购自德国，Carl Zeiss；实时荧光定量PCR仪购自美国，Talent；灭菌锅购自日本，Sanyo；正置显微镜购自日本，Olympus；
电泳仪套装，GelDoc XR凝胶成像系统购自美国，BIO-RAD；圆形玻片(Coverslip)购自美国Bellco Glass。除非特别指明，本文中的试剂来源如下：商品化N2添加剂,Life technology公司；KnockOutTM DMEM培养基，Invitrogen公司；KnockOutTM血清(KOSR)，Invitrogen公司；0.05％及0.25％胰蛋白酶，Invitrogen公司；100×链霉素-青霉素(SP)，Invitrogen公司；二甲基亚砜(DMSO)，Invitrogen公司；100×非必需氨基酸(Nonessential amino acids，NEAA)，Invitrogen公司；100×谷氨酰胺，Invitrogen公司；N-2supplement，Invitrogen公司；B-27Supplements，Invitrogen公司；β-mercaptoethanol(β-巯基乙醇，100M)，Invitrogen公司；100×链霉素/青霉素(Streptomycin/Penicillin，SP)，Invitrogen公司；TrypLETM，Invitrogen公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-，Real-Time试剂盒，日本TOYOBO公司；TRIzol，Invitrogen公司；RNAReverse试剂盒，Invitrogen公司；Triton X-100，北京索莱宝科技有限公司；多聚甲醛(PFA)，Sigma；Hoechst 33342，Invitrogen。
除非特别指明，本文中所用到的细胞，购自中国科学院动物研究所。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1 培养基的制备
1)按照2mg/L的L-肉毒碱、1mg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、0.016mg/L的亚硒酸钠、1mg/L的亚油酸、1mg/L的亚麻酸、5mg/L的转铁蛋白的比例溶于灭菌的去离子水中，制备50×的储液(表1)，使用0.22μm的滤器过滤分装，-20℃保存。
2)计算最终的培养基配制体积，按该体积加入1％的非必需氨基酸，1％的L-谷氨酸，0.5％-2％的N2添加剂，加入KODMEM至所需配制总体积；
3)按所需配制体积加入相应量的1)中所述50×的储液；
4)按照50-200mg/L的维生素C酸或50-200mg/L的维生素C酸/维生素C酸磷酸镁盐、1mg/L的还原型谷胱甘肽、4ng/mL的胰岛素浓度分别制备1000×的储液(表2)；
5)将步骤3)制备的储液和步骤4)制备的储液按照所需的量加入到步骤2)制备的基础培养基中，然后与1％的商品化的青链霉素混合均匀，加热到37℃使用。
表1 50×储液的组成和比例
组分 工作浓度 50×储液浓度
亚油酸 1 50
亚麻酸 1 50
腐胺 16 800
L-肉毒碱 2 100
人转铁蛋白 5 250
亚硒酸盐钠 0.016 0.8
乙醇胺 1 50
除非特别说明，表1中各组分的浓度单位为mg/L
表2 1000×储液的组成和比例
组分 工作浓度 1000×储液浓度
胰岛素 4 4000
还原型谷胱甘肽 1 1000
维生素C酸 50-200 50000-200000
除非特别说明，表2中各组分的浓度单位为mg/L
实施例2 使用本发明的培养基培养人胚胎干细胞来源视网膜色素上皮细胞
具体实施步骤：
1)利用传统的自分化方法获得hESC-RPE细胞，在纯化至第二代的hESC-RPE细胞用TrypleTM酶消化10分钟左右，使细胞脱离或即将脱离皿底，收集酶液，并用磷酸缓冲液(PBS)清洗一次，1200rpm，离心3分钟。弃上清液，用本发明所述培养基重悬，统计细胞数量。以0.5-1×105cells/cm2的密度接种。以12孔板为例，一个12孔板中1个孔常规培养基添加量为1mL，也就是说12孔板中一个孔可以接种0.5-1×105cells/cm2的hESC-RPE细胞。
2)将步骤1)中接种好的细胞使用本发明所述培养基培养，每隔一天更换一次培养基，当细胞长满时，将细胞进行传代。
实施例3 使用本发明的培养基培养ARPE-19细胞
具体实施步骤：
1)利用本发明的培养基培养APRE-19细胞，约15天后细胞长满培养皿，用TrypleTM酶消化5分钟左右，使细胞脱离或即将脱离皿底，收集酶液，并用PBS清洗一次，1200rpm，离心3分钟。弃上清液，用本发明所述培养基重悬，统计细胞数量。以6孔板为例，一个6孔板中1个孔常规培养基添加量为2mL。
2)将步骤1)中接种好的细胞使用本发明所述培养基培养，每隔一天更换一次培养基，当细胞长满时，将细胞进行传代。
图1为以北京干细胞库建立的临床级人胚胎干细胞系(Q-CTS-hESC-2)在无滋养层，无动物源，化学成分明确的E8-vitronectin人胚胎干细胞培养系统培养后，使用自发分化的方法获得的hESC-RPE：其中，
A为利用Q-CTS-hESC-2自分化获得hESC-RPE的流程图。约3-4个月可获得较纯的RPE细胞；
B为利用免疫荧光染色技术对分化获得的hESC-PRE进行标志性蛋白鉴定，包括：SOX2,OTX2,BEST1,MITF,ZO-1,鉴定结果为全部阳性，Bars＝200μm；
C为利用qPCR技术对分化获得的hESC-RPE标志性基因表达检测，包括RPE65，MITF，PAX6，TRYOSINASE，CREEBP，OCT4，β-ACTIN，GAPDH，其中APRE-19为人RPE细胞系，在此做阳性对照，而hESCs做隐形对照。结果显示分化获得的hESC-RPE具有特异性基因的高表达；
D为利用透射电子显微镜鉴定分化获得的hESC-RPE细胞结构，结果显示分化获得的细胞具有hESC-RPE典型特征：黑色素颗粒和顶端微绒毛结构，Bars＝200μm。
图2为经过本发明的培养基培养过7代后的hESC-RPE的情况：其中，
A为光学显微镜观察，在本发明所述培养基中添加Y27632后细胞具有更好的标志性“鹅卵石”形态，而未添加Y27632的细胞出现“纤维状”形态；
B为用MTT进行细胞活性分析，发现体检Y27632后，细胞增殖效果更佳；
C为qRT-RCR鉴定经过不同培养基培养后的hESC-RPE的标志性基因表达情况。其中，用本发明的培养基培养的相比与常规含有20％KOSR培养基培养的hESC-RPE具有更高的标志性基因表达量。除此之外，在专利所述培养基中添加Y27632后，基因表达上调效果更为显著。
图3为免疫荧光检测用本发明的培养基培养过后的hESC-RPE的标志性蛋白表达情况：其中，
A为神经外胚层标志性蛋白OTX2；
B为眼区标志性蛋白MITF；
C,D为RPE标志性蛋白BEST1和RPE65；
E为紧密连接蛋白ZO-1；Bars＝200μm。
以上标志性蛋白表达情况证明了经过专利所述培养液培养过的细胞依然具有正常RPE所具体的形态蛋白表达特征。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种用于培养视网膜色素上皮细胞(hESC-RPE)的培养液，其特征在于，所述培养液包含：体积分数为96～97.5的基础培养基，体积分数为1的非必需氨基酸(NEAA)、体积分数为1的L-谷氨酰胺、体积分数为0.5～2的N2添加剂、组分a和组分b；
其中，所述基础培养基选自MEM、α-MEM、1640、DMEM、F10、F12、D/F12、Neurobasl和knokcout DMEM中的一种；优选地，所述基础培养基的渗透压为280～300Pa；
所述组分a由在培养液中的浓度为1-100mg/L的L-肉毒碱、1-100mg/L的乙醇胺、10-200mg/L的腐胺、0.01-0.1mg/L的亚硒酸钠、1-5mg/L亚麻酸、1-5mg/L的亚油酸、5-10mg/L的转铁蛋白组成；
所述组分b由在培养液中的终浓度为10-500mg/L的维生素C酸或10-500mg/L的维生素C酸磷酸镁盐、0.5-50mg/L的还原型谷胱甘肽组成。
2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液还包含组分c，所述组分c选自表皮生长因子EGF、胰岛素、Rock通路选择性抑制剂中的一种或多种；其中，所述表皮生长因子EGF在培养液中的终浓度为10～20μg/L、胰岛素在培养液中的终浓度为1～100mg/L、Rock通路选择性抑制剂在培养液中的终浓度为1～100μM，优选为5～10μM；所述Rock通路选择性抑制剂为HA100或Y27632。
3.如权利要求1或2所述的培养液，其特征在于，所述培养液中N2添加剂由溶于去离子水或Mili Q水的1～10mg/ml的动物源胰岛素或人重组胰岛素、1～200mg/ml的人转铁蛋白、0.1～1mg/ml的亚硒酸钠、1～20mg/ml的腐胺和0.1～10mg/ml的孕酮组成。
4.如权利要求1～3中任一项所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包含1000U/mL的青霉素和100-500mg/L的链霉素。
5.如权利要求1～4中任一项所述的培养基的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1)将组分a的成份溶于灭菌去离子水中配制成储液a，优选地，所述储液a为50×储液；更优选地，所述储液a使用0.22μm的滤器过滤；
2)将在培养液中的终浓度为10-500mg/L的维生素C酸或维生素C酸/维生素C酸磷酸镁盐与在培养液中的终浓度为0.5-50mg/L的还原型谷胱甘肽混合后溶于灭菌去离子水中配制成储液b，优选地，所述储液b为1000×储液；更优选地，所述储液b使用0.22μm的滤器过滤；
3)提供适当的容器，根据培养基的终体积，按照体积比向所述容器中加入所述终体积的1％的非必需氨基酸、1％的L-谷氨酸、0.5～2％的N2添加剂，最后加入基础培养基至体积达到所述终体积；更优选地，所述储液a使用0.22μm的滤器过滤；
4)根据步骤3)所述的终体积，向所述容器中加入适量的储液a和储液b，即得所述培养液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括加入终浓度为1000U/mL的青霉素和100-500mg/L的链霉素。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法为：
(1)按照在培养液中的终浓度为2mg/L的L-肉毒碱、1mg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、0.016mg/L的亚硒酸钠、1mg/L的亚油酸、1mg/L的亚麻酸、5mg/L的转铁蛋白的比例制备50×的储液a；优选地，使用0.22μm的滤器过滤；
(2)按照10-500mg/L的维生素C酸或10-500mg/L的维生素C酸/维生素C酸磷酸镁盐、1mg/L还原型谷胱甘肽的比例制备1000×的储液b；
(3)根据配制的培养基的终体积，按体积分数加入所述终体积1％的非必需氨基酸、1％的L-谷氨酸、0.5％-2％的N2添加剂、加入KODMEM至所述终体积；
(4)加入相应量的储液a；
(5)加入相应量的储液b，既得培养基；
优选地，以5M氯化钠将所述培养基的渗透压调制至280～300Pa；优选地，所述表皮生长因子EGF在使用前配制成适宜的浓度直接加入到所述培养液中。
8.如权利要求5～7中任一项所述的方法，其特征在于，当所述培养液还进一步添加胰岛素时是通过包括下述步骤的方法实现的：
在所述培养基中加入胰岛素，充分溶解至溶液清澈，所述胰岛素在培养液中的浓度为1～100mg/L。
9.如权利要求5～8中任一项所述的方法，其特征在于，当所述培养液还包含ROCK通路的选择性抑制剂HA100或Y27632时是通过包括下述步骤的方法实现的：
将所述HA100或Y27632溶于微量的DMSO中，然后溶于灭菌去离子水中，搅拌，并以0.22μm滤器过滤，配制为储液c，优选地，所述储液c为1000×储液；更优选地，所述储液a、储液b和储液c置于-20℃～-80℃的环境中存储；更优选地，存储时分装至小容量容器中。
10.一种视网膜色素上皮细胞(hESC-RPE)的培养方法，其特征在于，所述培养方法使用如权利要求1～5中任一项所述的培养液培养细胞；
优选地，所述培养方法包括步骤：
a)将视网膜色素上皮细胞以单细胞悬液的形式(hESC-RPE)接种到所述培养液中得到细胞悬液；优选地，所述细胞悬液的密度为0.5～1×105个细胞/cm2；
b)每隔一天换一次培养基，使细胞长到100％的饱和度后使用trypleTMselect酶消化10min后传代；优选地，传代时培养液中添加ROCK抑制剂Y27632；
优选地，所述培养液的使用量为每4.5cm2加入1mL培养基；
优选地，所述培养液中ROCK抑制剂Y27632的浓度为10μM。
CN201610298171.6A 2016-05-06 2016-05-06 一种用于视网膜色素上皮细胞的培养液及其制备方法和应用 Active CN105838676B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610298171.6A CN105838676B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种用于视网膜色素上皮细胞的培养液及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610298171.6A CN105838676B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种用于视网膜色素上皮细胞的培养液及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105838676A true CN105838676A (zh) 2016-08-10
CN105838676B CN105838676B (zh) 2020-06-05

Family

ID=56592079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610298171.6A Active CN105838676B (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种用于视网膜色素上皮细胞的培养液及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105838676B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282096A (zh) * 2016-10-19 2017-01-04 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 一种人类视网膜色素上皮细胞层的分离培养方法
CN106434531A (zh) * 2016-11-30 2017-02-22 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法
CN107760649A (zh) * 2017-11-02 2018-03-06 北京全式金生物技术有限公司 一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂
CN108251371A (zh) * 2018-01-11 2018-07-06 苏州市立医院（苏州市妇幼保健院、苏州市中心体检站、苏州市公惠医院、苏州市立医院司法鉴定所、苏州市肿瘤诊疗中心） 视网膜色素上皮细胞体外培养方法及其专用培养基
CN108570415A (zh) * 2017-03-10 2018-09-25 上海睿泰生物科技股份有限公司 一种用于制备上皮细胞片的培养装置及其应用
CN111979195A (zh) * 2020-09-04 2020-11-24 四川大学华西医院 糖尿病视网膜病变全视网膜体外培养模型的构建方法
CN114438030A (zh) * 2020-11-05 2022-05-06 中国科学院动物研究所 将胚胎干细胞诱导为视网膜色素上皮细胞的培养基及应用
CN115873797A (zh) * 2021-09-29 2023-03-31 北京干细胞与再生医学研究院 一种视网膜色素上皮细胞的扩增培养基及培养方法
WO2024011449A1 (zh) * 2022-07-13 2024-01-18 山东第一医科大学附属眼科研究所(山东省眼科研究所、山东第一医科大学附属青岛眼科医院) 视网膜色素上皮细胞在替代角膜内皮方面的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013065914A1 (ko) * 2011-11-02 2013-05-10 제일약품 주식회사 낭성구조물로부터 망막색소상피세포로의 분화 유도 방법
CN104611291A (zh) * 2015-01-29 2015-05-13 中国科学院动物研究所 一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013065914A1 (ko) * 2011-11-02 2013-05-10 제일약품 주식회사 낭성구조물로부터 망막색소상피세포로의 분화 유도 방법
CN104611291A (zh) * 2015-01-29 2015-05-13 中国科学院动物研究所 一种用于将胚胎干细胞诱导为心肌细胞的培养基及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHOZO SONODA等: "A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells", 《NATURE PROTOCOLS》 *
沈仁权: "《生物化学教程》", 31 December 1993, 高等教育出版社 *
苏宜香: "《营养学》", 31 October 2006, 北京大学医学出版社 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282096A (zh) * 2016-10-19 2017-01-04 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 一种人类视网膜色素上皮细胞层的分离培养方法
CN106434531A (zh) * 2016-11-30 2017-02-22 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法
CN108570415A (zh) * 2017-03-10 2018-09-25 上海睿泰生物科技股份有限公司 一种用于制备上皮细胞片的培养装置及其应用
CN107760649A (zh) * 2017-11-02 2018-03-06 北京全式金生物技术有限公司 一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂
WO2019085994A1 (zh) * 2017-11-02 2019-05-09 北京全式金生物技术有限公司 一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂
CN107760649B (zh) * 2017-11-02 2021-03-30 北京全式金生物技术有限公司 一种用于人神经系统细胞培养和人多能性干细胞向神经系统细胞分化的营养添加剂
CN108251371A (zh) * 2018-01-11 2018-07-06 苏州市立医院（苏州市妇幼保健院、苏州市中心体检站、苏州市公惠医院、苏州市立医院司法鉴定所、苏州市肿瘤诊疗中心） 视网膜色素上皮细胞体外培养方法及其专用培养基
CN111979195A (zh) * 2020-09-04 2020-11-24 四川大学华西医院 糖尿病视网膜病变全视网膜体外培养模型的构建方法
CN114438030A (zh) * 2020-11-05 2022-05-06 中国科学院动物研究所 将胚胎干细胞诱导为视网膜色素上皮细胞的培养基及应用
CN115873797A (zh) * 2021-09-29 2023-03-31 北京干细胞与再生医学研究院 一种视网膜色素上皮细胞的扩增培养基及培养方法
WO2024011449A1 (zh) * 2022-07-13 2024-01-18 山东第一医科大学附属眼科研究所(山东省眼科研究所、山东第一医科大学附属青岛眼科医院) 视网膜色素上皮细胞在替代角膜内皮方面的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105838676B (zh) 2020-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105838676A (zh) 一种用于视网膜色素上皮细胞的培养液及其制备方法和应用
Fronk et al. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations
ES2764473T3 (es) Métodos mejorados para producir células RPE y composiciones de células RPE
CN103857789B (zh) 制备间充质干细胞基础培养基和利用间充质干细胞基础培养基制备细胞治疗产品的方法及用该培养基得到的分化产品
CN108699528A (zh) 在先天性巨结肠症中通过衍生自多能干细胞的人肠神经嵴谱系可行的基于细胞的治疗和药物开发
CN107427534A (zh) 治疗视网膜疾病的方法
Blenkinsop et al. Ophthalmologic stem cell transplantation therapies
Main et al. Managing the potential and pitfalls during clinical translation of emerging stem cell therapies
CN108138144A (zh) 视网膜色素上皮细胞的制备
CN102511471A (zh) 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法
CN109749997A (zh) 一种角膜缘干细胞无血清培养基及其培养方法
CN109136184A (zh) 诱导人多能性干细胞分化为rpe细胞的方法
Yu et al. An important role for adenine, cholera toxin, hydrocortisone and triiodothyronine in the proliferation, self-renewal and differentiation of limbal stem cells in vitro
CN104755609A (zh) 用于防止干细胞破碎和聚集的方法和组合物
CN106987555A (zh) 高效诱导人多能干细胞向心肌细胞分化的小分子化合物组合物
CN102344906A (zh) 一种毛囊干细胞的分离培养方法
CN106916787A (zh) 一种角膜缘干细胞培养基及其培养方法
CN107002035A (zh) 干细胞组合物和生产用于治疗应用的干细胞的方法
Turani et al. Antibiotics delay in vitro human stem cell regrowth
JP2022502047A (ja) ヒト網膜前駆細胞の単離および培養の方法
CA3017103A1 (en) Method of isolating mesenchymal stromal cells and applications for tissue engineering
CN106011054A (zh) 小鼠海马神经干细胞向软骨细胞分化的方法
Johnen et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts
JP6616559B2 (ja) シート状細胞培養物の製造方法
Eriksen et al. Protocols for SARS-CoV-2 infection in primary ocular cells and eye organoids

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant