WO2013065914A1 - 낭성구조물로부터 망막색소상피세포로의 분화 유도 방법 - Google Patents

낭성구조물로부터 망막색소상피세포로의 분화 유도 방법 Download PDF

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WO2013065914A1
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retinal
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cystic
retinal pigment
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조명수
유형곤
김상진
박정현
구승엽
유대훈
김명화
소동준
심규정
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제일약품 주식회사
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method of inducing differentiation from cystic structures obtained by culturing pluripotent stem cell-derived neural precursor spheres to Retinal Pigment Epithelial Cells (RPE).
  • RPE Retinal Pigment Epithelial Cells
  • Blindness refers to the absence of medically wide angle, a disease currently suffered by tens of millions of patients, 0.2-0.5% of the world's population, causing significant personal, social and economic losses.
  • One of the biggest causes of blindness worldwide is the degeneration of photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cells in the retina, which are caused by congenital factors or various other causes.
  • Many diseases include retinal detachment, glaucoma, optic neuropathy and trauma.
  • Photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cell transplantation have been evaluated to be able to delay or inhibit retinal degeneration, regenerate degenerated or degenerated retinas, and improve retinal function to prevent blindness or regenerate damaged vision. .
  • BMS Bone marrow stem cells
  • RSC retinal stem cells
  • ESC embryonic stem cells
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • SCNT somatic cell nuclear transfer cell
  • human embryonic stem cells Since the establishment of the first human embryonic stem cell line, human embryonic stem cells have the ability to differentiate into a wide variety of cell types, and human cell therapies that can treat diseases that occur in various organs. It has been proposed to be applicable to. In other words, human embryonic stem cells can be accurately identified, and is considered to be a strong candidate for abundantly supplying cells to replace dysfunctional cells with new cells during clinical treatment. Differentiated cells constituting various organs derived from human embryonic stem cells have been assumed to have the same properties and functions as those of cells formed through normal differentiation. Based on this possibility, differentiation induction methods that provide an environment similar to the developmental stage may be used for pancreatic hormone-expressing endocrine cells (D'Amour, et al., Nat.
  • retinal progenitor cells are effectively derived from human embryonic stem cells, but differentiation of photoreceptor cells from induced retinal progenitor cells failed (less than 0.01% differentiation) (Lamba Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 12769-74).
  • the present inventors carried out the invention with the support of the Mid-career Researcher Program through NRF grant, 2009-0084597, and the 21st Century Frontier Research Cell Application Research Project (SC3150).
  • retinal pigment epithelial cells can be obtained from cystic structures formed from neural precursor spheres obtained from pluripotent stem cells.
  • RPE Retinal Pigment Epithelial Cells
  • the present invention provides a method of inducing differentiation of retinal pigment epithelial cells (RPE) from a neural precursor sphere-derived cystic structure obtained by culturing an embryonic stem cell line.
  • RPE retinal pigment epithelial cells
  • the present invention also provides a retinal pigment epithelial cell differentiation induced through the above method and its progeny, and provides a composition for preventing or treating degenerative disease, including the same.
  • RPE Retinal Pigment Epithelial Cells
  • Retinal pigment epithelial cells can be obtained and differentiated into desired retinal pigment epithelial cells through a relatively short time, and thus can be usefully used for the prevention or treatment of various retinal degenerative diseases.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a process of differentiating a human embryonic stem cell (hESC) into a retinal epithelial cell (RPE). It takes about 14 days for RPE cells to form from the cystic vesicles of the spherical neural masses (SNM). Characteristic forms in the differentiation stage are shown from A to G. A and B represent neuronal rosettes and neural tube-like structures, respectively. C represents the initial SNM composed of neural tube-like structures. D is a purely isolated and expanded open neural tube-like structure by mechanical passage culture, E is a cystic vesicle form. F is a 3D cultured cystic vesicle with pigments on the surface of RPE cells, and G is a cystic vesicle-derived RPE cell after fragmentation and monolayer culture.
  • hESC human embryonic stem cell
  • RPE retinal epithelial cell
  • A is the embryonic body (EB)
  • B is the neurological rosette
  • C is the neural precursor mass (SNM)
  • D is the neural progenitor (NP) selection process
  • E is the NP proliferation process Shows.
  • F to H are expression of neuroepithelial markers in SNM
  • G is expression of Sox1 and Sox2 in EB (Embryo body)
  • J is expression of Pax6 and ⁇ III-tubulin in SNM including cystic vesicles after neuronal differentiation To show.
  • FIGS. 3A and 3B show the results of confirming ES and iPS-derived RPE cells.
  • A, B are RPE cells and pigments in cystic vesicles
  • C is RPE cells after monolayer culture of cystic vesicles
  • D is remodeling of vesicles after monolayer culture of ESC-derived RPE cells
  • E and F are derived from cystic EB Unknown cells are shown.
  • G depicts molecular marker expression of functional RPE cells.
  • H shows the results confirming that RPE is produced through the same process from induced pluripotent stem cells.
  • I shows that Ki67, a marker of dividing cells, also expresses during monolayer culture of ESC derived RPE cells.
  • J to M show the results of confirming the expression of RPE specific markers via immunochemistry.
  • Figure 4 shows the transmission electron micrographs (TEM) of cystic SNM-derived RPE cells (A, B), showing the results of phagocytosis (C to H).
  • TEM shows cubic epithelial cells with melanin granules (box of A), apical microvilli (B), and tight junctions between cells in the apical part of the cell.
  • Confocal microscopy shows the internalization of latex beads (C through E) and the outer segment (F through H) of FITC labeled photoreceptor cells.
  • z-scans were performed to obtain optical cross sections (E, H).
  • FIG. 5 is a diagram showing the functional activity and appearance of the graft ES-derived RPE cells.
  • a and B represent the secretion of neurotrophic factors PEDF and VEGF by ELISA test.
  • the Y axis shows the relative percentage concentration of neurotrophic factor compared to the differentiation medium (ES is the culture of ESC, RPE is the culture of ES-derived RPE cells. ARPE is the culture of adult RPE cells, and (2W) is 2 weeks). Culture, (4W) represents culture for 4 weeks, RA treatment lasted for 2 weeks).
  • C and D are compared by staining the retinal tissue, C is the result of H & E staining of normal retinal tissue, degenerated retinal tissue after D sodium-iodate inoculation.
  • E to G depict survival, in situ, and expression of RPE markers of ESC derived RPE cells confirmed by immunochemistry after transplantation.
  • FIG. 6 is a diagram showing RPE maturation and marker expression during sustained culture.
  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of retinal pigment epithelial cells (RPE) from the cystic structure of the neural precursor sphere obtained by culturing pluripotent stem cell lines.
  • RPE retinal pigment epithelial cells
  • RPE Retinal Pigment Epithelial Cells
  • pluripotent stem cells of the present invention includes “embryonic stem cells” and “induced pluripotent stem cells”, and “embryonic stem cells” are obtained from the inner cell mass of the blastocyst stage during the development of fertilized eggs and given a specific differentiation environment.
  • the method of inducing differentiation into retinal pigment epithelial cells comprises the steps of: (a) culturing a pluripotent stem cell line to form an embryoid body (EBryoid body, EB); (b) propagating the embryoid body; (c) dividing and cleaving the neural rosette and neural tube-like structures that appear during embryoid body culture; (d) selective separation and passage of neural precursor spheres (SNMs) formed from neural tube-like structures; (e) dividing the SNM derived cystic construct; And (f) culturing the divided cystic structures.
  • Retinal Pigment Epithelial Cells are characterized by inducing differentiation.
  • the pluripotent stem cell line preferably includes, but is not limited to, embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells.
  • the segmentation method separates only neurospecific constructs from neural precursor spheres, which can be done by various known methods.
  • the preferred method of ablation is a mechanical method, in particular a mechanical separation using a glass Pasteur pipette.
  • the mechanical method using the glass Pasteur pipette is a method of pulling a thin portion of pasteur pipet by applying heat to a thin portion of the pasteur pipet and cutting one end to a thickness of hair to cut a desired portion under a microscope.
  • pluripotent stem cell line may be cultured in an appropriate embryonic stem cell culture medium to induce differentiation into retinal pigment epithelial cells, but preferably mitomycin-C (mitomycin-C) is It is preferably cultured on the treated support cells and cultured using DMEM / F12 medium.
  • the composition of DMEM / F12 medium was 20% knockout serum replacement (SR), 2 mM L-glutamine, 0.4 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF), 1% non-essential amino acids , NEAA), 0.5% penicillin-reptomycin, 0.1 mM beta-mercaptoethanol.
  • the embryoid body formed by differentiation from embryonic stem cells sufficiently cultured for a certain period of time can be cultured by attaching to a culture plate coated with one of Matrigel, laminin, or L-polyornithine, and by this medium, neural progenitor cells can be selectively survived. can do.
  • the embryoid body of the present invention can be incubated for 3 to 7 days in NP selective medium, and the desired neuroprecursor sphere can be obtained by proliferating in proliferation medium for 4 to 7 days again.
  • the goblet-derived neuronal progenitor cells produced in the present invention may form a neurospecific composition, and these structures may exhibit morphological characteristics of neural rosettes or neural tubes.
  • the generated neural precursor spheres may be characterized by having an open neural tube structure.
  • the cystic structure of the present invention is formed from an open neural tube structure, and may preferably be characterized by showing pigments on the outside after separation by mechanical cleavage. More preferably, the pigment may be formed within 5 to 9 days after separation.
  • the isolated cystic constructs may be attached to a culture dish coated with Matrigel (Matrigel, BD, Franklin lakes, NJ, USA).
  • Matrigel Matrigel, BD, Franklin lakes, NJ, USA.
  • the present invention provides a method for examining the expression of mRNA or protein of a retinal epithelial cell-specific gene, and more specifically, at least one gene selected from Mitf, Pax6, RPE65, and bestrophin. Expression can be confirmed.
  • the present invention provides a method for evaluating phagocytosis of differentiated retinal pigment epithelial cells. The expression or phagocytosis of such genes can be assessed using assay methods for identifying general gene expression, such as PT-PCR, which measures mRNA levels, and confirms general phagocytosis. This can be done through biotechnological methods.
  • a differentiation promoter known in the art for promoting the differentiation of cells may be used without limitation, and preferably, differentiation may be performed by treating retinoic acid (RA). Can be promoted, and more preferably retinoic acid can be treated for 1 to 3 weeks.
  • RA retinoic acid
  • the present invention may also provide a retinal pigment epithelial cell or progeny thereof differentiated by the above invention, and a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal degeneration disease.
  • retina degeneration disease refers collectively to abnormalities caused by structural, biochemical and physiological causes in the retina.
  • abnormalities in the retina usually include retinal detachment, macular degeneration, monoretinopathy, and central chorioretinopathy.
  • Representative examples include retinal detachment and macular degeneration.
  • the therapeutic composition of the present invention may be prepared in a suitable formulation including an acceptable carrier depending on the mode of administration.
  • Formulations suitable for the mode of administration are known and may comprise agents that facilitate movement, typically through the membrane.
  • the therapeutic composition of the present invention can be used in the form of a general pharmaceutical formulation.
  • parenteral preparation it can be prepared in the form of sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions or lyophilized preparations, oral administration in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups or wafers. It can be prepared in unit dosage ampoules or in multiple dosage forms.
  • the therapeutic composition of the present invention may be administered with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a binder for example, in the case of oral administration, a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a coloring agent, or a fragrance may be used.
  • a buffer a preservative, a painless agent, a soluble agent may be used.
  • Topical agents, enteric agents, stabilizers and the like can be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • Preferred modes of administration and preparations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular or injectable. Injections include non-aqueous solvents such as aqueous solvents such as physiological saline solution or ring gel solution, vegetable oils, higher fatty acid esters (e.g., oleic acid, etc.), and alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol or glycerin).
  • the method for treating brain or nervous system diseases using the therapeutic composition of the present invention comprises administering a therapeutically effective amount of the therapeutic composition of the present invention.
  • the pharmaceutically effective amount is well known in the medical field such as the type of disease, the age, weight, health, sex of the patient, sensitivity to the drug of the patient, the route of administration, the method of administration, the frequency of administration, the duration of treatment, the combination or drug used Depending on the factor, it can be readily determined by one skilled in the art.
  • Mitomycin-C is used for the passage and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cell line (SNUhES3) and pluripotent stem cell line (human iPS cell line set, System Bio).
  • treated cells mouse embryonic fibroblast cell line, STO or human foreskin fibroblast, HFF
  • SR knockout serum replacement
  • L- L-glutamine
  • DMEM with glutamin glutamin
  • 0.4 ng / ml bFGF basic fibroblast growth factor
  • NEAA non essential amino acids
  • penicillinstreptomycin and 0.1 mM beta-mercaptoethanol / F12 medium was used.
  • the propagated embryonic stem cells were mechanically divided into agglomerates having 200 to 300 cells, and then cultured again on support cells.
  • RPE Retinal Pigment Epithelial Cells
  • EB embryoid body
  • SNMs Spherical neural masses
  • EB is DMEM / F12 medium (0.5% N2 substrate, 2 mM L-glutamin), 1% non essential amino acids (NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin (NP) selection medium, Incubated for 5 days in 0.1 mM beta-mercaptoethanol and additionally in DMEM / F12 medium ( 0.5% N2 substrate, 2 mM L-glutamine, 20ng / ml bFGF) for 4-7 days. (basic fibroblast growth factor), 1% non essential amino acids (NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin (including 0.1 mM beta-mercaptoethanol).
  • Neural rosettes and neural tube like structures observed during neuronal growth were mechanically cut using a glass pasteur pipette and then cultured in bacterial culture dishes containing NP growth media. It became.
  • SNMs passage 1-4
  • SNMs contained open neural tube structures (FIG. 1D) and these SNMs were selected, isolated and passaged (FIG. 1E).
  • the cystic structure appeared from the neural tube structure opened through passage culture, which was mechanically separated and suspended in the growth medium.
  • cystic constructs were mechanically partitioned and attached to a culture dish coated with Matrigel (Matrigel, BD, Franklin lakes, NJ, USA) and then 1 x 10 -6 M all-trans-retinoic acid for 1 to 4 weeks.
  • Matrigel Matrigel, BD, Franklin lakes, NJ, USA
  • RA SIGMA, St. Louis, MO, USA
  • B27 B27 (2%, Invitrogen) derived from NP growth medium for differentiation and proliferation of RPE.
  • a fixation step of the cells was performed in 0.04 M phosphate buffer with 1% osmium tetroxide. After successively performing dehydrogenation with ethanol and infiltration with epoxy resin, the cells were transferred to the beam capsule for polymerization. Ultra-thin slices were obtained using an ultramicrotome, and the slices were observed at 80 kV using a transmission electron microscope (JEM-1400; JEOL Ltd., Japan).
  • mouse- and rabbit anti-human nestin (1: 100, Chemicon, Temecula, CA, USA), mouse anti-musashi (1: 200, Chemicon), mouse anti-paired box gene 6 (Pax6, 1: 200, Chemicon) , rabbit anti-tight junction protein ZO-1 (1: 200, Zymed, South San Francisco CA, USA), mouse anti-microphthalmia-associated transcription factor (Mitf, 1: 200) (Abcam, Cambridge, CB, UK), mouse anti-retinal pigment epithelium-specific 65 kDa protein (RPE65, 1: 200), mouse anti-bestrophin (1: 200) (Novus biological, Littleton, CO, USA), mouse anti- ⁇ v ⁇ 5 integrin (1: 200, Milipore , Billerica, MA, USA).
  • Primary antibodies to detect primary antigens include Alexa Fluor® 488 donkey anti-mouse and anti-rabbit IgG, Alexa Fluor® 594 donkey anti-mouse, anti-rabbit IgG (1: 200, Molecular Probes, Eugene, OR , USA), and the cell nuclei were counterstained with DAPI.
  • RNA was obtained from RPE cells, ARPE-19 cells (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) differentiated from hESCs, EBs, SNMs, cystic SNM using TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), CDNA synthesis was performed using oligo-dT as a primer according to the manufacturer's instructions using AMV reverse transcriptase (AccuPower RT PreMix; Bioneer, Taejeon, Korea).
  • PCR amplification was performed using Taq Polymerase (HiPi Plus 5x PCR Premix; Elpis biotech, Taejeon, Korea), and the standard method was used. PCR conditions were denatured for 5 minutes at 94 °C 30 seconds at 94 °C, 30 seconds at 55 °C, 10 minutes at 72 °C was repeated 30 times. In order to analyze the relative expression with other mRNAs, the amount of cDNA was normalized based on the signal of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • the length of the primer sequence and the amplification product is as follows.
  • RPE reactive oxygen species
  • POS photoreceptor outer segments
  • nonspecific phagocytosis by RPE cells derived from cystic SNMs was assessed by latex bead ingestion.
  • Carboxylate-modified polysterene FITC-labeled latex beads (1 ⁇ m diameter, Sigma) were washed several times to remove reagents for stabilization and cells were washed in 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 beads. The exposure was at 37 ° C. for one day.
  • the retina was obtained from the eye of a slaughtered cow and in red light, the retina contained 20% (wt / vol) sucrose, 20 mM Tris HCl, pH 7.4, 10 mM glucose, 5 mM taurine, 2 mM MgCl 2 . Transfer to 10 ml homogeneous solution.
  • the retinal suspension is placed in sucrose consisting of 5 levels of concentration (27% -60% wt / vol) comprising 20 mM Tris HCl, 10 mM glucose and 10 mM taurine, followed by ultracentrifugation at 25,000 rpm at 4 ° C. for 1 hour. Isolated (XL-90, Beckman).
  • FITC-labeled POS was washed and mixed back free in cell culture medium. It was then incubated with RPE cells at 5% carbon dioxide, 37 °C. After 4 hours of incubation, surface-attached beads were washed by PBS and 0.4% Trypan Blue was added to remove extracellular fluorescence.
  • Enzyme Immunoassay secretion of PEDF and VEGF
  • RPE cells and adult RPE cells isolated from cystic structure-derived SNM were incubated for 2 to 4 weeks with 1 x 10 -6 M of retinoic acid (RA) and without control, and the culture supernatant was secreted.
  • Isolated pigmented epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were isolated for detection.
  • ChemiKine TM PEDF sandwich ELISA kit (Chemicon) and humanVEGF ELISA kit (Thermo scientific, Rockford, IL, USA) were used to detect PEDF and VEGF, respectively, according to the manufacturer's protocol.
  • cystic SNM derived RPE Prior to transplantation, cystic SNM derived RPE was incubated with DAPI (10 ⁇ g / ml) for 30 minutes. Several washing procedures were performed to remove DAPI from the medium. Isolation by incubation at 37 ° C., 0.05% trypsin / 0.1% EDTA for 5 minutes.
  • RPE cells 10 5 cells / 5 ⁇ l were injected into the subretinal space through the sclera using a 33-gauge needle attached to a Hamilton syringe.
  • Cyclosporine A (210 mg / l, Cipol-N®, Chong Kun Dang, Seoul, Korea) was administered to drinking water the day before transplantation before denuclearization.
  • hESC-derived SNM was used to produce functional RPE cells.
  • hESC is known to be able to differentiate into neuroepithelial cells through the differentiation process of SNM is formed in EB through extracellular reaction (A-C of Figure 2a).
  • Initial SNM (passage culture 1-4) can be confirmed that the neuronal rosette (FH of Figure 2b) and the neural tube ( Figure 1C), it was confirmed that the various markers for neuroepithelial cells are expressed (FH of Figure 2b) ).
  • Cystic vesicles showed typical RPE morphology, such as polygonal epithelial monolayer.
  • the pigment begins to form (A, B of Fig. 3a), through which the SNM-derived cystic vesicles cultured and isolated from the embryonic stem cell line was confirmed that the differentiation was induced by RPE.
  • the sectioned cystic vesicles were cultured in a monolayer in a culture dish and the cells showed RPE morphology.
  • the cystic structure of EB showed various forms (E, F of FIG. 3A). This confirms that the morphological characteristics of RPE cells only appear from SNM including cystic vesicles.
  • the attached cystic vesicles were capable of differentiation until fusion and showed pigmentation (C in FIG. 3A).
  • the vesicular layer of cells (FIG. 3D) was again shown in the fusion environment. Expression of Pax6 was maintained until monolayer culture (J in FIG. 3B). However, it was confirmed that the expression level gradually decreases as maturation occurs.
  • Pax6 and Mitf are helix-loop-helix leucine zipper transcription factors involved in melanogenesis and RPE65 is a required factor for retinol conversion during retinoid regeneration for phototransduction and visual regeneration.
  • Vheropin is also known to act as an ion channel as an RPE-specific protein located on the basolateral plasma membrane.
  • RPC cell markers Pax6 and Mitf as well as the mature RPE cell markers bestropin (L in FIG. 3b) and RPE65 (M in FIG. 3b) were confirmed by immunostaining (J, K in FIG. 3b). After monolayer culture of cystic vesicles, most of the cells (90% or more) expressed such RPE markers. In addition, the presence of Ki67-positive cells, which can confirm the presence of rapidly proliferating cells, was also confirmed (I of FIG. 3B).
  • TEM was used to identify pigmented square epithelial cells with features such as tight junctions of microvilli apical, melanin granules and apical cells of the apical part (Fig. 4A, B).
  • y-axis projection was performed. Immunostaining confocal microscopy of cells to identify surface marker ZO-1 of RPE cells confirmed the incorporation of FITC-labeled latex beads in these cells (FIG. 4E). After 4 hours of incubation, confocal microscopy confirmed the internalization of the FITC-labeled POS (Fig. 4F, G). FITC-labeled POS was observed inside the cells near the DAPI-stained nucleus (FIG. 4H). Therefore, it was confirmed that differentiation-induced RPE from cystic structures exhibited the function of mature RPE cells that actively exhibit phagocytosis.
  • CM conditioned medium
  • the secretion of PEDF and VEGF was compared between the group treated with retinoic acid and the group not treated.
  • Retinoic acid is known to affect the visual cycle, which is known to be involved in the maturation and differentiation of various cells.
  • the secretion of PEDF was markedly increased by treatment of retinoic acid (RA) for 2 weeks.
  • RA retinoic acid
  • VEGF shows no change (Fig. 5A, B).
  • cystic structure-derived RPE can secrete the same growth factor secreted by RPE, and that retinoic acid can promote the differentiation and maturation of RPE.
  • Cystic vesicles can be expanded by passage culture, and cystic vesicle-derived RPE also has the advantage that it can be effectively expanded for transplantation.
  • RPE since most cystic vesicle-containing cells (90% or more) are differentiated into RPE, RPE can be efficiently obtained.
  • the pigment formation period can also be effectively shortened, so that the efficiency for obtaining RPE cells is effectively improved.
  • the RPE is effectively implanted, thereby confirming the possibility that the RPE derived from the cystic structure of the present invention can be used for the treatment of retinal degeneration diseases.

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Abstract

본 발명은 배아줄기세포주 및 유도전분화능 줄기세포를 포함하는 전분화능줄기세포주를 배양하여 얻어지는 신경전구체구의 낭성구조물로부터 망막색소상피세포로의 분화 유도 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 배아줄기세포주를 배양하여 얻어지는 신경전구체구 유래 낭성구조물(cystic structure)로부터 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells, RPE)로의 분화 유도 방법은, 종래 사용되지 않고 제거되었던 낭성 구조물을 분화시켜 망막색소상피세포를 얻을 수 있고 비교적 짧은 시간을 통해 목적하는 망막색소상피세포로 분화시킬 수 있으므로 다양한 망막변성질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

낭성구조물로부터 망막색소상피세포로의 분화 유도 방법
전분화능줄기세포 유래 신경전구체구를 배양하여 얻어지는 낭성구조물(cystic structure)로부터 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells; RPE)로의 분화 유도 방법에 관한 것이다.
실명은 의학적으로 광각이 없는 것을 말하며, 현재 세계적으로 전 인구의 0.2-0.5%인 수천만 명의 환자가 앓고 있는 질환으로, 개인적, 사회적 및 경제적으로 커다란 손실을 가져오고 있다. 전 세계적으로 실명의 가장 큰 원인 중 하나로서 망막의 광수용체세포(photoreceptor cell) 및 망막색소상피세포의 변성을 들 수 있는데, 이는 선천적 요인 또는 다른 다양한 원인들에 의해 발생한다. 망막미형성, 망막 변성(retinal degeneration), 노인성 황반변성(aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환(diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 선천성망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장(glaucoma), 시신경병증 및 외상 등 많은 질환들이 이 질환에 해당된다. 현재까지 이 질환들에 대한 근본적인 치료를 위한 약물요법은 없으며, 이들 질환의 원인이며 결과인 기능부전의 광수용체세포 및 망막색소상피세포를 새로운 기능성 세포로 재생하여 이식하는 것이 가장 가능성 있는 치료법으로 여겨지고 있다. 광수용체세포 및 망막색소상피세포 이식법은 망막 변성을 지연시키거나, 억제하고, 퇴화 또는 변성된 망막을 재생한 후 망막 기능을 향상시켜 실명을 방지하거나 또는 손상된 시력을 재생시킬 수 있을 것으로 평가되고 있다.
골수 줄기세포(bone marrow stem cell; BMS), 망막줄기세포 (retinal stem cell; RSC), 배아줄기세포 (embryonic stem cell; ESC), 유도 전분화능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC) 및 체세포핵치환 줄기세포(somatic cell nuclear transfer cell; SCNT) 등을 이용한 치료 가능성이 대두되고 있다. 그러나 줄기세포로부터 망막세포로의 분화 및 이를 이용한 세포치료에 대한 연구 성과는 미진한 상태에 있다. 이들 줄기세포로부터 망막세포로의 분화가 가능할 경우 1) 효과적인 세포 치료를 위한 무한한 세포공급이 가능하며, 2) 지금까지 알려지지 않은 배아세포 (embryonic cell) 및 망막기원세포 (retinal progenitor)로부터 망막 세포로의 분화 기전이 규명되고, 3) 망막의 분화 관련 유전자 및 분자들의 발견 및 그에 의한 병변 규명과, 4) 망막 변성질환의 발생기전 파악, 그리고 5) 망막 변성방지 및 망막 신경보호를 위한 약제 개발에도 이용 가능할 것이다.
최초의 인간 배아줄기세포주가 확립된 이후부터, 인간 배아줄기세포는 매우 다양한 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있으며, 상기 분화된 세포들이 각종 장기에서 발생하는 질환들을 치료할 수 있는 인간 세포치료법에 적용될 수 있을 것으로 제안되어 왔다. 즉, 인간 배아줄기세포는 성상을 정확히 규명할 수 있고, 임상 치료 시, 기능부전의 세포를 새로운 세포로 치환하기 위한 세포를 풍부히 공급할 수 있는 강력한 후보자로 여겨지고 있다. 인간 배아줄기세포에서 유도된 각종 장기를 구성하는 분화 세포들은 정상적인 분화 과정을 통해 형성되는 해당 세포들과 동일한 성상 및 기능을 가질 수 있을 것으로 가정 되어 왔다. 이 가능성에 기반하여, 발달 단계와 유사한 환경을 제공하는 분화 유도법이 췌장 호르몬-발현 내분비세포 (D'Amour, et al., Nat. Biotechnol., 2006; 24: 1392-401), 신경세포 (Pankratz, et al., Stem Cells 2007; 25: 1511-20), 근육세포 (Barberi et al., Nat. Med., 2007; 13: 642-8), 혈관내피세포 (Wang, et al., Nat. Biotechnol., 2007; 25: 317-8) 분화 등에서 시도되고 있다. 망막 질환에서도 인간 배아줄기세포로부터 분화된, 망막 세포의 대표적인 세포인 광수용체세포 및 망막색소상피세포를 생산하고자 많은 시도들이 있었으나, 성적은 매우 저조하였다.
현재까지의 가장 큰 성공 중 하나로 보고된 연구결과는 망막 기원세포가 인간 배아줄기세포로부터 효과적으로 유도되었다는 것이나, 유도된 망막 기원세포로부터 광수용체세포의 분화는 실패하였다(분화율 0.01% 미만)(Lamba, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 12769-74). 또 다른 하나는 인간 배아줄기세포로부터 광수용체세포를 성공적으로 분화시켰다고 보고하였으나, 이는 총 분화 유도기간이 200일 이상 걸리며, 그 분화율도 8%로서 매우 미미하기 때문에, 이를 임상에 적용하여 실명을 치료하기에는 현실적으로 불가능한 성적이다(Osakada et al., Nat. Biotechnol., 2008; 26: 215-24).
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자는 중견연구자지원사업(Mid-career Researcher Program through NRF grant, 2009-0084597) 및 21세기 프런티어 연구 세포응용연구 사업(SC3150)의 지원을 받아 발명을 수행하였다.
본 발명자들은 효과적으로 망막색소상피세포를 얻기 위한 방법에 대하여 연구하던 중, 전분화능줄기세포로부터 얻어지는 신경전구체구로부터 형성되는 낭성구조물로부터 망막색소상피세포를 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 전분화능줄기세포유래 신경전구체구를 배양하여 얻어지는 낭성구조물(cystic structure)로부터 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells, RPE)로의 분화 유도 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 배아줄기세포주를 배양하여 얻어지는 신경전구체구 유래 낭성구조물(cystic structure)로부터 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells, RPE)로 분화 유도 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 방법을 통해 분화가 유도된 망막색소상피세포 및 이의 자손을 제공하며, 이를 포함하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 배아줄기세포주를 배양하여 얻어지는 신경전구체구 유래 낭성구조물(cystic structure)로부터 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells, RPE)로의 분화 유도 방법은, 종래 사용되지 않고 제거되었던 낭성 구조물을 분화시켜 망막색소상피세포를 얻을 수 있고 비교적 짧은 시간을 통해 목적하는 망막색소상피세포로 분화시킬 수 있으므로 다양한 망막변성질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 hESC(human embryonic stem cell)가 RPE(Retinal Epithelial Cell)로 분화되는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다. 신경전구체구(spherical neural masses; SNM)의 낭성 소포(cystic vesicle)로부터 RPE 세포가 형성되는데 약 14일이 소요된다. 분화단계에서 나타나는 특징적인 형태에 대하여 A 부터 G까지 나타내었다. A와 B는 신경성 로제트와 신경관 유사 구조를 각각 나타낸다. C는 신경관 유사 구조로 구성된 초기 SNM을 나타낸다. D는 열린 신경관 유사 구조(open neural tube-like structure)를 기계적 계대 배양에 의하여 순수하게 분리하고 확장한 모습이며, E는 낭성 소포 형태이다. F는 RPE 세포와 표면에 색소를 가진 3D 배양된 낭성 소포이며, G는 단편화와 단층 배양을 수행한 뒤의 낭성 소포 유래 RPE 세포이다.
도 2a 및 2b는 분화단계에 대한 증거를 나타낸 도이다. A는 배상체(Embryoid body; EB), B는 신경성 로제트, C는 신경전구체구(spherical neural mass; SNM), D는 신경전구세포 (neural progenitor; NP) 선별과정 이후, E는 NP 증식과정 이후를 도시한다. F 내지 H는 SNM에서 신경상피세포의 마커의 발현, G는 EB(Embryo body)에서의 Sox1 및 Sox2의 발현, J는 신경성 분화 이후의 낭성 소포를 포함하는 SNM에서의 Pax6 및 βⅢ-tubulin의 발현을 도시한다.
도 3a 및 도 3b는 ES 및 iPS 유래 RPE 세포를 확인한 결과를 나타낸 도이다. A, B는 낭성 소포에서의 RPE 세포와 색소, C는 낭성 소포의 단층 배양 이후의 RPE 세포, D는 ESC 유래 RPE 세포의 단층 배양 이후에 소포의 재 형성, E 및 F는 낭성 EB로부터 유래된 알려지지 않은 세포를 도시한다. G는 기능성 RPE 세포의 분자 마커 발현을 도시한다. H는 유도전분화능줄기세포로부터 같은 과정을 통해 RPE가 생성되는 것을 확인한 결과를 도시한다. I는 분열하는 세포의 마커인 Ki67이 ESC 유래 RPE 세포의 단층 배양 동안에도 발현함을 도시한다. J 부터 M 은 RPE 특이적 마커의 발현을 면역 화학법을 통해 확인한 결과를 도시한다.
도 4는 낭성 SNM 유래 RPE 세포의 투과전자현미경(Transmission electron micrographs; TEM) 모습(A, B)이며, 식세포 작용을 확인(C 내지 H)한 결과를 나타낸 도이다. TEM은 멜라닌 과립을 갖는 입방 상피 세포를 보여주며(A의 박스), 미세융모의 정단(apical microvilli, B), 그리고 세포 정단 부분의 세포 사이에서 밀착연접(tight junctions)을 도시한다. 공초점 현미경은 라텍스 비드의 내재화(C 내지 E)와 FITC 표지된 광수용체세포의 외절(outer segment)(F 내지 H)를 보여준다. z-스캔은 광학 크로스 단면을 얻기 위하여 수행되었다(E, H).
도 5는 ES 유래 RPE 세포의 기능적인 활성과 이식편의 모습을 나타낸 도이다. A, B는 ELISA 테스트에 의한 신경 영양성 인자인 PEDF 와 VEGF의 분비를 나타낸다. Y 축은, 분화 배지와 비교하여 신경영양인자의 상대적 %농도를 나타낸다(ES는 ESC의 배양액, RPE는 ES 유래 RPE 세포의 배양액이다. ARPE는 성인 RPE 세포의 배양액을 의미하며, (2W)는 2주간 배양, (4W)는 4주간 배양을 나타낸다. RA 처리는 2주동안 지속하였다). C 및 D는 망막조직을 염색하여 비교한 것으로, C는 정상 망막조직을, D 나트륨-이오데이트 접종 후 변성된 망막조직을 H&E 염색한 결과이다. E 내지 G는 이식 이후에 면역화학법으로 확인된 ESC 유래 RPE 세포의 생존, 자리잡음, RPE마커의 발현을 도시한다.
도 6은 지속적인 배양 동안에 RPE 성숙 및 마커 발현을 나타낸 도이다. 낭성 소포의 색소(A)는 활발한 분화 동안 단층 배양(B)의 초기에 사라졌으며, Mitf(C) 와 Pax6 (D)의 발현은 성숙한 RPE 그룹에서는 발현이 감소되었으나, ZO-1의 발현은 증가하였다.
본 발명은 전분화능줄기세포주를 배양하여 얻어지는 신경전구체구의 낭성구조물(cystic structure)로부터 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells, RPE)로의 분화 유도 방법에 관한 것이다.
본 명세서상의 “망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells; RPE)”란, 외부 혈관 망막 베리어의 일부분을 형성하는 단층의 색소세포들은 의미한다. 이들 세포들은 망막의 기능을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것을 특징으로 하며, 광에너지를 흡수, 시각 사이클의 유지를 위한 광수용체와 상호작용, 광수용체와 맥락모세혈관층의 결합구조를 유지하는 다양한 성장인자들을 분비하고, 이온, 물, 대사 산물을 서브레티날 공간으로부터 혈액으로 이송하는 역할, 광수용체의 외절(outer segment)의 식세포 작용을 수행하는 세포를 말한다.
본 발명의 “전분화능줄기세포”란 “배아줄기세포”와 “유도전분화능줄기세포”를 포함하며 “배아줄기세포”란 수정란의 발달과정 중 배반포 단계의 내세포괴로부터 얻어지며 특정 분화환경이 주어지지 않는 한 미분화 상태로 계속해서 분열할 수 있고, 조건에 따라 거의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 특성을 가진 세포를 말하고 “유도전분화능줄기세포”는 체세포에 전분화능 관련인자를 인위적으로 주입하여 배아줄기세포와 같은 증식 및 분화능력을 갖도록 만든 세포를 말한다.
본 발명에 있어서, 망막색소상피세포로의 분화 유도 방법은 (a) 전분화능줄기세포주를 배양하여 배상체(Embryoid body, EB)를 형성하는 단계; (b) 상기 배상체를 증식 배양하는 단계; (c) 배상체 배양동안에 나타나는 신경성 로제트와 신경관 유사 구조를 분할, 절단하는 단계; (d) 신경관 유사구조로부터 형성된 신경전구체구(Spherical neural masses, SNMs) 를 선택 분리하여 계대 배양하는 단계; (e) SNM 유래 낭성 구조물을 분할하는 단계; 및 (f) 분할된 낭성구조물을 배양하는 단계;를 포함하여 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells; RPE)로 분화를 유도하는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 전분화능줄기세포주는 바람직하게는 배아줄기세포 또는 유도전분화능 줄기세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 분할 방법은 신경전구체구에서 신경특이적 구조물만을 분리하는 것으로서, 이는 공지된 다양한 방법에 의하여 행해질 수 있다. 본 발명의 구체적 실시에서, 바람직한 상기 절제 방법은 기계적인 방법, 특히 유리파스퇴르 피펫을 이용하여 기계적으로 분리하는 방법이다. 상기 유리파스퇴르 피펫을 이용한 기계적인 방법은 파스퇴르피펫(pasteur pipet)의 가는 부위에 열을 가하여 잡아당긴 후 한쪽 끝을 머리카락 정도의 굵기로 만들어 이를 이용하여 현미경 하에서 원하는 부위를 잘라내는 방법이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여 전분화능줄기세포주는 망막색소상피세포로의 분화를 유도하기 위하여 적절한 배아줄기세포 배양용 배지에서 배양될 수 있으나, 바람직하게는 미토마이신-C(mitomycin-C)가 처리된 지지세포 위에서 배양되며 DMEM/F12 배지를 사용하여 배양하는 것이 바람직하다. DMEM/F12 배지의 조성은 20% 녹아웃 혈청대체물(knockout serum replacement, SR), 2 mM L-글루타민(glutamine), 0.4 ng/ml basic fibroblast growth factor(bFGF), 1% 아미노산 보충제(non essential amino acids, NEAA), 0.5% 페니실린-스트랩토마이신(penicillinstreptomycin), 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol)을 포함할 수 있다.
일정 동안 충분히 배양된 배아줄기세포로부터 분화되어 생성되는 배상체는 마트리젤, 라미닌 또는 L-폴리오르니틴 중의 하나로 코팅한 배양접시에 붙여서 배양할 수 있으며, 이러한 배지에 의하여 신경계 전구세포들이 선택적으로 생존할 수 있다.
본 발명의 배상체는 NP 선택배지에서 3일 내지 7일 동안 배양될 수 있으며, 다시 4일 내지 7일 동안 증식배지에서 증식함으로써 원하는 신경전구체구를 얻을 수 있다.
본 발명에서 생성되는 배상체 유래 신경계 전구세포들은 신경특이적 조성물을 형성할 수 있으며, 이러한 구조물은 신경성 로제트(neural rosette) 또는 신경관(neural tube)의 형태학적인 특징을 나타낼 수 있다. 망막색소상피세포로의 바람직한 분화 유도를 위해서는 생성되는 신경전구체구가 열린 신경관 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 낭성구조물(cystic structure)은 열린 신경관(open neural tube)구조로부터 형성되는 것으로써, 바람직하게는 기계적인 절단에 의한 분리 이후 외부에 색소를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 바람직하게는 분리 후 5일 내지 9일 이내 색소를 형성할 수 있다.
분리된 낭성 구조물들은 마트리젤(Matrigel, BD, Franklin lakes, NJ, USA )로 코팅된 배양접시에 부착되어 이루어질 수 있다.
본 발명에 따르면, 분화된 세포가 망막색소상피세포로 적절히 분화가 되었는지를 추가적으로 확인할 수 있으며, 이를 위해서는 망막색소상피세포의 형태학적, 기능적인 특징 등을 제한없이 확인할 수 있다. 바람직한 실시예로써 본 발명에서는 망막상피세포 특이적 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현을 살피는 방법을 제시하고 있으며, 보다 구체적으로는 Mitf, Pax6, RPE65, 베스트로핀(Bestrophin) 중에서 선택되는 1이상의 유전자의 발현을 확인할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시예로써 본 발명에서는 분화된 망막색소상피세포의 식세포 작용을 평가하는 방법을 제시한다. 이러한 유전자의 발현 또는 식세포 작용의 평가는 일반적인 유전자 발현 확인을 위한 검정 방법, 예를 들면, mRNA 수준을 측정하는 PT-PCR등의 당업계에서 널리 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 일반적인 식세포 작용을 확인하기 위한 생명공학적인 방법을 통해 수행할 수 있다.
본 발명의 망막색소상피세포의 분화를 촉진하기 위해서는 세포의 분화를 촉진하는 당업계에 공지된 분화 촉진제제를 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 레티노산(retinoic acid; RA)을 처리하여 분화를 촉진할 수 있고, 보다 바람직하게는 레티노산을 1주 내지 3주 동안 처리할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기와 같은 발명에 의하여 분화된 망막색소상피세포 또는 이의 자손, 및 이를 포함하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 “망막변성질환”이란 망막에 구조적, 생화학적, 생리적 원인에 의한 이상이 나타나는 것을 총체적으로 일컫는다. 즉 망막에 이상이 생기는 것으로 보통 망막박리, 황반변성, 단요망막병증, 중심성맥락망막변증이 있으며 대표적인 것으로는 망막박리와 황반변성을 예로 할 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조될 수 있다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있으며 전형적으로 막을 통과하는, 이동을 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료용 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용 제조에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 또는 동결건조제제, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 또는 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 결합체, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 또는 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예로, 올레인산에칠 등), 알코올류(예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 뇌 또는 신경계 질환을 치료하는 방법은, 본 발명의 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 약학적 유효량은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 사람 전분화능줄기세포 유래 SNM으로부터 RPE의 분화
전분화능 줄기세포주인 미분화된 인간배아줄기세포주(SNUhES3)와 유도전분화능줄기세포주(human iPS cell line set, System Bio)의 계대 및 유지를 위해서 미분화된 배아줄기세포를 미토마이신-C(mitomycin-C)가 처리된 지지세포(생쥐 배아 섬유아세포주, mouse embryonic fibroblast cell line, STO 혹은 human foreskin fibroblast, HFF) 위에서 배양하였으며, 배양액으로 20% knockout serum replacement(SR), 2 mM L-글루타민(L-glutamin), 0.4 ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor), 1% NEAA(non essential amino acids), 0.5% 페니실린스트렙토마이신(penicillinstreptomycin), 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol)이 포함된 DMEM/F12배지를 사용하였다. 7일간 배양 후 증식된 배아줄기세포를 200 내지 300개의 세포를 갖는 덩어리가 되도록 기계적으로 분할한 후, 이를 다시 지지 세포 위에서 배양하였다.
망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells; 이하 RPE) 분화의 개략적인 과정을 도 1에서 나타내었다.
배상체(embryoid body; EB) 형성을 위하여, 미분화된 전분화능줄기세포 콜로니를 기계적으로 분리하고 세균 배양 접시에서 7일 동안 배양하였다. 신경전구체구(Spherical neural masses, 이하 SNMs)는 EB로부터 형성되었다. EB는 NP(neural progenitor) 선택 배지인 DMEM/F12배지(0.5% N2 substrate, 2 mM L-글루타민(L-glutamin), 1% NEAA(non essential amino acids), 0.5% 페니실린스트렙토마이신(penicillinstreptomycin), 0.1mM 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol) 포함)에서 5일 동안 배양되었고, 추가적으로 4 내지 7일 동안 증식 배지인 DMEM/F12배지(0.5% N2 substrate, 2 mM L-글루타민, 20ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor), 1% NEAA(non essential amino acids), 0.5% 페니실린스트렙토마이신(penicillinstreptomycin), 0.1 mM 베타-머캅토에탄올 포함)에서 증식되었다.
신경 증식 배양 동안에 관찰되는 신경성 로제트(Neural rosettes)와 신경관 유사 구조(neural tube like structure)는 유리파스퇴르 피펫을 가늘게 뽑은 도구를 이용하여 기계적으로 절단하였으며, 이후 NP 증식배지를 포함하는 세균 배양 접시에서 배양되었다. SNMs의 초기 계대배양(passage 1-4) 동안에, 몇몇 SNM들은 열린 신경관 구조들을 포함하고 있으며(도1D) 이러한 SNM들을 선택, 분리하여 계대 배양하였다(도1E). 낭성 구조물(Cystic structure)은 계대 배양을 통해 열린 신경관 구조물로부터 나타났으며, 이를 기계적으로 분리하여 증식배지에서 부유 배양하였다.
이러한 낭성 구조물들은 기계적으로 분할되고 마트리젤(Matrigel, BD, Franklin lakes, NJ, USA )로 코팅된 배양 접시에 부착한 후 1주 내지 4주 동안 1 x 10-6 M 의 all-trans-retinoic acid(RA, SIGMA, St. Louis, MO, USA)을 포함하거나 포함하지 않은 조건에서 배양되었다. RPE의 분화와 증식을 위해서 bFGF (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)는 NP 증식배지 유래 B27(2%, Invitrogen)로 교체되었다.
2. RPE 특징 분석
2.1 전자 현미경 분석
2.5% 글루타르알데히드로 고정화한 후, 1%의 4산화 오스뮴(osmium tetroxide)으로 0.04M 인산염 완충액에서 세포의 고정 단계를 수행하였다. 에탄올을 이용한 탈수소화 과정 및 에폭시레진을 이용한 침윤 과정을 연속적으로 수행한 후 세포들은 중합을 위하여 빔 캡슐로 이동되었다. 초박편제작기(ultramicrotome)를 이용하여 초박편을 얻었으며 투과 전자 현미경(JEM-1400; JEOL Ltd., Japan) 을 이용하여 80 kV에서 박편을 관찰하였다.
2.2 면역화학분석법(Immunocytochemistry)
세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 4%의 파라포름알데히드로 고정하였다. 0.1% Triton X100을 포함하는 PBS 에서 3% 소 혈청 알부민 용액으로 하루 동안 차단 물질(blocking solution)로 처리하였고 이후, 샘플은 1차 항체와 함께 하룻동안 배양되었다. 면역세포화학적인 분석을 위하여 사용된 1차 항체들은 다음과 같다:
mouse-및 rabbit anti-human nestin (1:100, Chemicon, Temecula, CA, USA), mouse anti-musashi (1:200, Chemicon), mouse anti-paired box gene 6 (Pax6, 1:200, Chemicon), rabbit anti-tight junction protein ZO-1 (1:200, Zymed, South San Francisco CA, USA), mouse anti-microphthalmia-associated transcription factor (Mitf, 1:200) (Abcam, Cambridge, CB, UK), mouse anti-retinal pigment epithelium-specific 65 kDa protein (RPE65, 1:200), mouse anti-bestrophin (1:200) (Novus biological, Littleton, CO, USA), mouse anti-αvβ5 integrin (1:200, Milipore, Billerica, MA, USA ).
1차 항원을 검출하기 위한 1차 항체로는 Alexa Fluor® 488 donkey anti-mouse와 anti-rabbit IgG, Alexa Fluor® 594 donkey anti-mouse, anti-rabbit IgG (1:200, Molecular Probes, Eugene, OR, USA)가 사용되었으며, 세포 핵은 DAPI로 대비 염색되었다.
3. 역전사 중합효소 증폭반응(RT-PCR)
RPE로의 분화를 확인하기 위해, RPE에서 발현되는 마커인 Mitf, Pax6, RPE65, 베스트로핀의 전사 수준에서의 발현에 대한 RT-PCR 분석을 다음과 같이 수행하였다.
TRIzol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 hESCs, EBs, SNMs, cystic SNM 으로부터 분화된 RPE 세포, ARPE-19세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)로부터 RNA를 획득하였으며, AMV 역전사효소를 이용하는 제조자의 지시방법((AccuPower RT PreMix; Bioneer, Taejeon, Korea)에 따라 올리고-dT를 프라이머로 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다.
PCR 증폭은 Taq Polymerase(HiPi Plus 5x PCR Premix; Elpis biotech, Taejeon, Korea)를 이용하여 수행하였으며, 표준 방식을 사용하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 10분을 30회 반복하였다. 다른 mRNA 들과의 상대적인 발현을 분석하기 위해서 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) mRNA의 신호에 기초하여 cDNA의 양을 표준화하였다.
다양한 조건의 어닐링 온도와 싸이클 횟수를 반복 실험한 결과 비례적으로 증폭되는 구간이 각각의 프라이머 쌍들에 대해서 결정되고 PCR 조건은 최적화되었다.
프라이머 서열과 증폭 산물의 길이는 다음과 같다.
표 1
유전자명 유전자방향 염기서열 결과물의 크기
GAPDH Forward 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'　 450bp
Reverse 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
Mitf Forward 5'-TTCACGAGCGTCCTGTATGCAGAT-3'　 106bp
Reverse 5'-TTGCAAAGCAGGATCCATCAAGCC-3'　
Pax6 Forward 5'-GGCAACCTACGCAAGATGGC-3' 459bp
Reverse 5'-TGAGGGCTGTGTCTGTTCGG-3'
RPE65 Forward 5'-GCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTT-3' 259bp
Reverse 5'-TGAGGGCTGTGTCTGTTCGG-3'
Bestrophin Forward 5'- GCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTT-3' 359bp
Reverse 5'- TGTTCTGCCGGAGTCATAAAGCCT-3
4. In vitro phagocytosis assays
RPE의 특이적/비특이적 식세포 작용을 조사하기 위하여, 소의 망막으로부터 분리된 세포를 FITC-labeled POS와 FITC-표지 라텍스 비드와 함께 배양하였다. RPE의 주요 기능 중 하나는 POS(photoreceptor outer segments)의 식세포작용이다. POS는 RPE에 의하여 소화되며, 재사용되고 광수용체 기반으로부터 광감작성 외절을 재구성하기 위하여 광수용체로 되돌아 간다. 이를 위하여, 낭성 SNMs 로부터 유래된 RPE 세포에 의한 비특이적 식세포 작용을 라텍스 비드 흡수(latex bead ingestion)에 의해서 평가하였다.
카르복실레이트-변형 폴리스티렌(Carboxylate-modified polysterene) FITC-labeled latex beads(1 ㎛ diameter, Sigma)는 안정화를 위한 시약의 제거를 위하여 수차례 세척되었고 세포들은 1 x 105 ~ 1 x 106 비드에 37℃에서 하루 동안 노출되었다.
배양 후에는, 표면에 결합된 비드들은 PBS에 의해서 세척하여 제거되었으며, 0.4% Trypan Blue가 세포 외 형광을 제거하기 위해 첨가되었다. 고정화 및 블로킹 이후, 세포들은 anti-ZO-1 antibody (1:200, Zymed, South San Francisco, CA)에 의하여 염색되었다. Alexa Fluor® 594 donkey anti-rabbit IgG가 1차 항체를 검출하기 위하여 사용되었고 세포 핵은 DAPI로 대비 염색되었다. 비드의 세포 내 흡수의 평가는 공초점 현미경(LSM 510, Carl Zeiss)을 이용하여 평가되었다.
식세포 작용의 평가는 bovine POS(photoreceptor outer segments)((Molday RS, Hicks D, Molday L. Peripherin. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1987 Jan;28(1):50-61.), Lin H, Clegg DO. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998;39:1703-1712.)에 의하여 수행되었다.
보다 구체적으로, 망막은 도축된 소의 안구로부터 획득하였으며 적색광원에서, 망막을 20% (wt/vol) 수크로오스, 20 mM Tris HCl, pH 7.4, 10 mM 글루코오스, 5 mM 타우린, 2 mM MgCl2을 포함하는 10ml의 균질 용액에 옮겼다. 망막현탁액은 20 mM Tris HCl, 10 mM 글루코오스 및 10 mM 타우린을 포함하는 5 단계의 농도(27%-60% wt/vol)로 구성된 수크로오스에 배치된 후 1시간 동안 4℃에서 25,000 rpm으로 초원심 분리되었다(XL-90, Beckman).
정제된 소의 POS는 FluoReporter FITC 단백질 라벨링 키트(protein labeling kit) (Invitrogen)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 라벨링되었다. FITC-labeled POS는 세척되고 세포 배양 배지에서 자유 상태로 다시 혼합하였다. 그 후 5%의 이산화탄소, 37℃에서 RPE 세포와 함께 배양하였다. 4시간 동안의 배양이 끝난 후, 표면 부착 비드는 PBS에 의해서 세척되었고, 0.4% Trypan Blue가 세포 외 형광 반응을 제거하기 위하여 첨가되었다.
고정화 및 블로킹 이후, 세포들은 anti-ZO-1 antibody(1:200, Zymed, South San Francisco, CA)에 의하여 염색되었다. Alexa Fluor® 594 donkey anti-rabbit IgG가 1차 항체를 검출하기 위하여 사용되었고 세포 핵은 DAPI로 대비 염색되었다. 비드의 세포 내 흡수의 평가는 공초점 현미경(LSM 510, Carl Zeiss)을 이용하여 평가되었다. POS의 내재화 평가를 위하여, 세포를 통한 y-축 프로젝션을 검사하였다.
5. 효소 면역 측정법(PEDF 및 VEGF의 분비측정)
낭성 구조 유래 SNM으로부터 분리된 RPE 세포와 성인 RPE 세포들을 2 내지 4주 동안 1 x 10-6 M 의 레티노산(retinoic acid; RA)을 첨가하고 이를 첨가하지 않은 대조군을 두어 배양하였고 배양 상등액은 분비된 색소 상피성 인자(secreting pigment epithelium-derived factor; PEDF)와 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)의 검출을 위해 분리하였다.
ChemiKineTM PEDF sandwich ELISA kit(Chemicon)와 humanVEGF ELISA kit (Thermo scientific, Rockford, IL, USA)가 PEDF와 VEGF를 검출하기 위해 제조업자의 프로토콜에 따라 각각 사용되었다.
6. 망막 퇴화 마우스 모델에서의 cystic SNM-유래 RPEs 의 망막하 이식
이하의 실시예는 Ophthalmic and Vision Research를 위한 동물의 사용법에 대하여 규제하고 있는 ARVO 선언의 규제에 따라 실시하였다.
6주령의 SD 랫트에 멸균된 1% NaIO 3 살린용액을 1회 정맥 주사하였다(70 mg/kg). 정맥 주사 후 4일 후 동물들은 tiletamine/zolazepam(Zoletil®)과 자일라진(xylazine)의 근육 주사를 통해 마취 처리하였다. 동공은 tropicamide 0.5%와 phenylephrine HCl 2.5% eye drops(Mydrin-P®)에 의해 확장되었고 proparacine HCl 0.5% (Alcaine®) 국부 안약 마취제를 처리하였다.
이식 전에, 낭성 SNM 유래 RPE는 DAPI(10μg/ml)와 함께 30분간 배양되었다. 배지에서 DAPI를 제거하기 위하여 여러 번 세척과정을 수행하였고. 37℃, 0.05% trypsin/0.1% EDTA 하에서 5분 동안 배양함으로써 분리하였다.
수술 현미경을 통해 시각화하고 분리된 RPE 세포(105 cells/5μl)를 Hamilton syringe 에 부착된 33-gauge 바늘을 이용하여 공막을 통해 망막하 공간에 주입하였다.
사이클로스포린 A(Cyclosporine A)(210 mg/l, Cipol-N®, Chong Kun Dang, Seoul, Korea)은 이식 하루 전날 탈핵 과정 전까지 식수에 투여되었다. 이식 일주일 후, 안구를 탈핵화하고 embedding compound(FSC 22®, Leica microsystems, IL)를 이용하여 급속 동결 처리하였다.
냉각편을 PBS로 세척하고 0.1% Triton X100를 포함하는 PBS 용액의 3% 소 혈청 알부민 용액에서 배양하였다. 배양 후에는 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 배양하였으며 면역 조직 화학적 검사를 위한 항체는 Anti-ZO-1, anti-RPE65 및 anti-Bestrophin antibodies가 사용되었다. 1차 항체를 검출하기 위한 항체로는 Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG, Alexa Fluor® 594 donkey anti-rabbit IgG 가 사용되었다.
7. 결과
7.1 hESC 유래 신경 상피세포의 RPE 세포로의 분화
기능을 가진 RPE 세포를 생산하기 위해서, hESC-유래 SNM이 사용되었다. hESC는 세포외 반응을 통하여 EB에서 SNM이 형성되는 분화 과정을 통해서 신경 상피 세포로 분화할 수 있음이 알려져 있다(도2a의 A-C). 초기 SNM(계대 배양 1-4)은 신경성 로제트(도 2b의 F-H)와 신경관(도 1C)으로 구성되어 있음을 확인할 수 있으며, 신경 상피 세포에 대한 다양한 마커가 발현됨을 확인하였다(도 2b의 F-H).
신경 전구체 선택 및 증식 동안에 세포들은 눈의 발달에 매우 중요한 Pax6 를 발현하였다. 포유류의 발달 동안에, 초기 신경관은 부풀어 망막이 될 수 있는 기관을 포함하는 기관이 된다. 초기 SNM은, 몇 개의 신경관 구조가 부풀어 기관으로 변화되고(도 1D) SNM의 낭성(cystic) 부분을 형성하였다(도 1E). 이러한 낭성 부분은 입체현미경 하에서 기계적인 분리방법으로 쉽게 분리되고 낭성 소포를 형성하였다(도 1F). 흥미롭게도 SNM의 낭성 부위는 신경성 분화를 위한 부착이 있는 때에도 Pax6를 발현하는 것을 확인할 수 있었다(도2b의 J).
낭성 소포의 막세포는 다각형 형태의 상피성 단층과 같은 전형적인 RPE의 형태를 보였다. 또한 분리 후 1주가 지나자 색소가 형성되기 시작하는 것을 확인할 수 있었으며(도3a의 A, B), 이를 통해 배아줄기세포주로부터 배양되고 분리된 SNM유래 낭성 소포가 RPE로 분화가 유도되었음을 확인할 수 있었다.
이전의 연구는 배아줄기세포로부터 RPE를 형성시키는 방법이 자발적인 분화과정에 의하거나 이를 증진시키기 위하여 Wnt, Nodal 안타고니스트, 니코틴아미드(nicotinamide), 액티빈 A(activin A), TGF-β(transforming growth factor beta) 등의 배지 보충물을 사용하였으나, 이러한 분화 등은 세포군집의 70% 정도만이 분화후 8주 이후에 색소를 나타내는 것으로 알려져있었다. 따라서, 본 발명의 경우 SNM으로부터 분리된지 1주만에 SNM의 낭성소포가 색소를 나타내는 것으로 보아 기존의 연구에 비하여 RPE의 분화 유도의 효율이 매우 향상된 것임을 확인할 수 있었다.
절편화된 낭성 소포는 배양 접시에서 단층으로 배양되었고 세포는 RPE 형태를 보였다. 반면에 EB의 낭성 구조는 다양한 형태를 보였다(도 3a의 E, F). 이를 통해 RPE 세포의 형태학적인 특징은 오직 낭성소포를 포함하는 SNM으로부터만 나타나는 것을 확인할 수 있다. 부착된 낭성 소포는 융합될 때까지 분화가 가능하였으며, 색소를 나타냄을 확인할 수 있었다(도3a의 C). 또한 세포의 소포성 층(도3D)은 융합 환경에서 다시 나타내었다. Pax6의 발현은 단층 배양 시까지 유지되었다(도 3b의 J). 그러나, 발현 정도는 성숙이 이루어지면서 점차 감소하는 것을 확인하였다.
7.2 낭성 소포 유래 RPE의 특징 분석
SNM-유래 낭성 소포로부터 배양된 단층 세포의 특징을 분석하여 해당 세포가 RPE로 분화된 것인지에 대한 확인을 수행하였다.
성숙한 RPE의 세포성 기능과 관련된 특정한 분자 마커의 발현을 RT-PCR과 면역세포화학법을 통해 확인하였다. Pax6, Mitf, RPE65, 베스트로핀의 mRNA 발현을 hESC-유래 RPE 세포에서 확인하였다(도 3a의 G). Pax6와 Mitf는 멜라닌 형성에 참여하는 헬릭스-루프-헬릭스 류신 지퍼전사 인자이며, RPE65는 광신호전달(phototransduction)과 시각 재생을 위한 레티노이드 재생 동안에 레티놀의 전환을 위해 요구되는 인자이다. 또한, 베스트로핀은 basolateral 플라즈마 멤브레인에 위치한 RPE 특이적 단백질로써 이온 채널의 역할을 한다고 알려져있다.
성숙한 RPE세포 마커인 베스트로핀(도 3b의 L) 및 RPE65(도 3b의 M)뿐만 아니라 초기 RPC 세포 마커 Pax6 와 Mitf 의 발현을 면역염색을 통해 확인하였다(도3b의 J, K). 낭성 소포의 단층 배양 후, 대부분의 세포(90% 이상)들은 상기와 같은 RPE 마커들을 발현하였다. 또한 빠르게 증식하는 세포의 존재를 확인할 수 있는 Ki67-양성 세포의 존재도 확인되었다(도 3b의 I)
7.3 세포 외 hESCs 유래 RPE 세포의 기능적인 특징 분석
전자현미경으로 세포를 관찰한 결과 성숙한 RPE의 특징들을 확인할 수 있었다. TEM을 통해 미세 융모의 정단, 멜라닌 과립과 세포의 정단 부분의 세포의 tight junction (도4A, B)과 같은 특징으로 가진 색소 정방형 상피 세포를 확인하였다.
세포 외 형광 물질을 트리판 블루로 억제한 후, 공초점 현미경을 통해 라텍스 비드의 내재화를 확인한 결과 도4C 및 도4D에 도시된 바와 같이 내재된 형광물질을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 분화된 세포가 성숙한 RPE의 특징인 식세포 작용을 나타냄을 확인할 수 있었다.
표지된 비드가 내재화된 것을 확인하기 위하여, y-축 프로젝션을 수행하였다. RPE 세포의 표면 마커 ZO-1을 확인하기 위한 세포의 면역염색 공초점 현미경을 통하여 이러한 세포들에 FITC-표지 라텍스 비드가 내재화된 것을 확인하였다(도4E). 배양 후 4시간이 경과한 후 공초점 현미경을 이용해 FITC-표지 POS의 내재화를 확인하였다(도4F, G). FITC-표지 POS는 DAPI-염색된 핵 근처의 세포 내부에서 관찰됨을 확인하였다(도 4H). 따라서, 낭성 구조물로부터 분화 유도된 RPE는 식세포 작용을 활발히 나타내는 성숙한 RPE 세포의 기능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
7.4 효소 면역 측정법: PEDF 및 VEGF의 분비확인
RPE는 PEDF 및 VEGF과 같은 성장 인자들이 다양하게 분비되는 것이 알려져 있다. 분화된 RPE가 이러한 RPE의 성장인자들을 분비하는지 확인하기 위하여, hESC-유래 RPE와 성인 RPE 세포의 배양 상등약으로부터 CM(conditioned medium)을 얻었다.
상대적 정량화의 결과 hESC-유래 RPE에서 분비되는 영양 인자들은 성인 RPE에서 분비되는 인자들과 유사한 것을 확인하였다. 분비되는 영양 인자들의 농도는 배양시간이 지속될수록 더 높게 나타났다.
또한, 레티노산을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹의 PEDF, VEGF의 분비를 비교하였다. 레티노산은 시각 사이클에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이를 통해 다양한 세포의 성숙과 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다. 흥미롭게도, PEDF의 분비는 2주 동안의 레티노산(retinoic acid, RA)의 처리에 의하여 뚜렷하게 증가하였다. 반면, VEGF의 분비는 아무런 변화를 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 5 A, B).
이를 통해 낭성 구조 유래 RPE는 RPE가 분비하는 성장인자를 동일하게 분비할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 레티노산이 RPE의 분화 및 성숙을 촉진할 수 있음을 알 수 있었다.
7.5 망막 퇴화 랫트 모델에서의 cystic SNM-유래 RPE세포의 망막하 이식에 따른 결과확인
sodium-iodate를 주입한 렛트로부터 분리된 망막 부위의 H&E 염색은 대조군과 비교하여 RPE층의 손실을 보여주고 외피 핵층의 붕괴를 나타냄을 확인하였다(도 5C, D). 망막이 퇴화된 상기의 렛트에 분화된 RPE 세포를 망막하층에 주입한 후 분화된 RPE세포가 적절히 기능을 발휘하는지 확인하였다.
이식 일주일 후, 이식된 세포의 생존과 자리잡음을 면역조직화학분석법을 통하여 확인하였다. 공초점 현미경을 통하여 DAPI-전 염색된 세포의 망학하 공간으로의 통합을 확인할 수 있었다. 세포는 RPE 층과 베스트로핀, ZO-1, RPE65 등의 성숙된 RPE 마커의 발현을 형성하였으며(도 5F, G), 반면에 대조군은 이러한 변화를 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 5E).
낭성 소포는 계대 배양에 의하여 확장될 수 있고, 낭성 소포유래 RPE 역시 이식을 위해 효과적으로 확장될 수 있는 장점이 있다. 또한 대부분의 낭성 소포 포함 세포(90%이상)는 RPE로 분화되므로 RPE를 효율적으로 수득할 수 있으며, 본 발명에 따르면 색소 형성 기간 또한 효과적으로 단축할 수 있어 RPE 세포를 얻기 위한 효율이 효과적으로 개선됨을 확인할 수 있었다. 또한 망막이식을 통해 기능을 확인한 결과 RPE 가 효과적으로 이식되는 것을 확인하였으므로 이를 통해 본 발명의 낭성 구조 유래의 RPE는 망막변성질환의 치료에 사용될 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.

Claims (18)

  1. 전분화능줄기세포유래 신경전구체구를 배양하여 얻어지는 낭성구조물(cystic structure)로부터 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells; RPE)로의 분화 유도 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분화 유도 방법은
    (a) 전분화능줄기세포를 배양하여 배상체(Embryoid body, EB)를 형성하는 단계;
    (b)상기 배상체를 증식 배양하는 단계;
    (c) 배상체 배양동안에 나타나는 신경성 로제트와 신경관 유사 구조를 분할, 절단하는 단계;
    (d) 신경관 유사구조로부터 형성된 신경전구체구(Spherical neural masses; SNMs)를 선택 분리하여 계대 배양하는 단계;
    (e) SNM 유래 낭성 구조물을 분할하는 단계; 및
    (f) 분할된 낭성구조물을 배양하는 단계;를 특징으로 하는 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelial Cells; RPE)로의 분화 유도 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 전분화능줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도전분화능 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 전분화능줄기세포는 미토마이신-C(mitomycin-C)가 처리된 지지세포위에서 배양되며 DMEM/F12 배지를 사용하여 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 DMEM/F12 배지는 20% 녹아웃 혈청대체물(knockout serum replacement, SR), 2mM L-글루타민(glutamine), 0.4 ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor), 1% 아미노산 보충제(non essential amino acids, NEAA), 0.5% 페니실린-스트랩토마이신(penicillinstreptomycin), 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol)이 포함된 배지임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 (c) 또는 (e) 단계의 분할은 유리파스퇴르피펫을 이용한 기계적 분할 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 신경전구체구는 열린 신경관(open neural tube)구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 배상체는 NP(neural progenitor) 선택배지에서 3 내지 7일 동안 배양된 후, 4 내지 7일 동안 증식배지에서 증식되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 낭성 구조물은 분리 후 5일 내지 9일 이내 색소가 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (f)단계에서 레티노산(retinoic acid; RA)을 1주 내지 3주 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제2항에 있어서, 상기 (f)단계의 배양은 마트리젤로 코팅된 배양접시에 부착되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 분화된 세포가 목적하는 세포로 분화되었는지 여부를 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 판정은 분화된 세포가 망막색소상피세포 특이적 유전자의 mRNA 또는 단백질을 발현하는지 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 특이적 유전자는 Mitf, Pax6, RPE65, 베스트로핀으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 판정은 분화된 세포의 식세포 작용 평가를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 분화된 망막색소상피세포 또는 이의 자손.
  17. 제16항의 망막상피세포 또는 이의 자손을 포함하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 망막변성 질환은 망막미형성, 망막 변성 (retinal degeneration), 노인성 황반변성 (aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환 (diabetic retinopathy), 망막색소변성 (retinitis pigmentosa), 녹내장 (glaucoma), 시신경병증, 외상, 망막박리, 레버씨 선천성 흑암시 및 선천성 망막위축증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 망막색소변성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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