KR102262206B1 - 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체 및 망막색소상피세포를 함유하는 하이드로겔 조성물과, 상기 하이드로겔 조성물을 이용한 망막색소상피세포 재생 또는 망막색소상피변성증의 치료 및 예방, 또는 황반변성증의 치료 및 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물 및 이의 용도{Hydrogel composition comprising retinal pigment epithelium cells and use of the same}
본 발명은 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체 및 망막색소상피세포를 함유하는 하이드로겔 조성물과, 상기 하이드로겔 조성물을 이용한 망막색소상피세포 재생 또는 망막색소상피변성증의 치료 및 예방, 또는 황반변성증의 치료 및 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.
망막색소상피(Retinal Pigment Epithelium)는 망막의 정상적인 시각 기능을 유지하는데 중요한 역할을 하며, 망막색소상피의 변성은 여러 망막 변성 질환을 일으킨다. 망막 중심 부위의 신경조직인 황반은 시세포가 밀집되어있으며, 물체의 상이 맺히는 곳으로 시력에 중요한 역할을 담당한다.
그러나, 노화, 유전 요인, 염증, 스트레스, 과한 자외선 노출 등의 다양한 원인으로 인해 망막에 변성이 일어나면 시력의 손상이 생긴다. 이러한 황반변성(Macula Degeneration, MD)은 특히, 노화에 의해 노인 환자에게 주로 발병하고 있으며, 이를 연령 관련 황반변성(Age-related Macular Degeneration, AMD)이라 한다.
전세계적으로 상기 연령 관련 황반변성을 치료하기 위한 기술들이 연구되고 있지만(비특허문헌 1 내지 3), 현재의 기술로는 치료 효과를 기대하기가 어려운 실정이다.
망막색소상피세포에 관한 특허문헌으로는 낭성구조물로부터 망막색소상피세포의 분화를 유도하는 방법(특허문헌 1), ＥＢＶ 감염 인간망막색소 상피세포를 이용한 혈관신생 질환용 세포 모델(특허문헌 2), 망막색소상피 분화 유도용 조성물(특허문헌 3) 등이 개시되어 있으나, 생체재료로 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 망막 재생을 시도한 사례는 전혀 알려지지 않은 실정이다.
따라서, 본 발명에서는 RPE 세포를 효과적으로 이식하기 위한 생체재료로 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 하이드로겔을 제작하고, 이를 이용하여 망막 재생을 확인하고자 하였다.
공개특허공보 제10-2013-0048468호 공개특허공보 제10-2014-0079067호 공개특허공보 제10-2017-0049775호
Ophthalmology 122(4) (2015) 809-816. Biomaterials 31(9) (2010) 2555-2564. Acta Biomaterialia 49 (2017) 329-343.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 망막색소상피세포를 효과적으로 이식하기 위하여, 생체재료로 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 사용한 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 망막색소상피세포를 효과적으로 이식하기 위하여, 생체재료로 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 사용한 하이드로겔 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로겔 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체 및 망막색소상피세포를 함유하는 것을 특징으로 하는, 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 인간으로부터 얻은 망막색소상피세포주를 배양하여 망막색소상피세포를 준비하는 단계, (b) 젤란검을 증류수에 용해시켜 젤란검 수용액을 얻는 단계, (c) 상기 (b) 단계와는 별도의 단계로서, 폴리에틸렌글리콜을 증류수에 용해시켜 폴리에틸렌글리콜 수용액을 얻는 단계, (d) 상기 젤란검 수용액 및 폴리에틸렌글리콜 수용액을 혼합한 후, 가교제를 첨가하여 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체를 얻는 단계, 및 (e) 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체에 상기 (a) 단계에서 준비한 망막색소상피세포를 혼합하는 단계를 포함하는, 막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 망막색소상피세포 재생을 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 망막색소상피변성증의 치료 및 예방을 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 황반변성증의 치료 및 예방을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명에 의한 망막색소상피세포 재생을 위한 조성물은 수초로부터 추출된 고분자 다당류로 우수한 물성과 생체 적합성을 가진 젤란검과 인체에 무해하며 물성 개선에 광범위하게 쓰이는 폴리에틸렌글리콜이 함유된 하이드로겔에서 RPE 세포의 부착 및 증식률을 높이고, 세포의 기능이 정상적으로 발현될 수 있는 효과가 발생한다.
또한, 현재 시판되어 사용하고 있는 줄기세포를 포함하는 생체재료 시장은 부족한 실정으로서, 본 발명에 의하면 이러한 망막 치료제로 줄기세포제와 하이드로겔을 상품화하는 제형으로 활용할 수 있는 장점이 있다.
도 1a는 제조된 PEG/GG 하이드로겔의 육안 이미지를 나타낸 사진이고, 도 1b는 다공의 형태를 확인한 SEM 사진이며, 도 1c는 다공의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 2는 PEG, PEG/GG 하이드로겔을 FT-IR을 통해 나타낸 그래프이다.
도 3은 PEG/GG 하이드로겔들의 공극률을 나타낸 결과이다.
도 4는 PEG/GG 하이드로겔들의 팽윤도를 나타낸 결과이다.
도 5는 PEG/GG 하이드로겔들의 분해도를 나타낸 결과이다.
도 6은 PEG/GG 하이드로겔들의 세포증식률을 나타낸 결과이다.
도 7a 내지 도 7c는 PEG/GG 하이드로겔들의 유전자 발현을 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 8은 PEG/GG 하이드로겔들에서의 세포 생존력 평가를 나타낸 결과이다.
도 9는 PEG/GG 하이드로겔들 내에 세포들의 부착과 증식을 나타낸 SEM 사진이다.
도 10은 PEG/GG 하이드로겔들 내에서의 세포의 분포 및 형태를 나타낸 H&E 염색사진이다.
이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 구체적으로 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체 및 망막색소상피세포를 함유하는 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물에 관한 것이다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물에 포함되는 상기 젤란검(gellan gum; GG)은 생체 적합성이 뛰어난 생체재료중 하나로서, 내열성, 내산성, 내효소성의 우수한 물성을 가진다. 또한, 제조과정이 복잡하지 않고, 체온에 가까운 온도에서 겔화가 되기 때문에 주입 가능한 형태로 사용되기에 적합하다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물에 포함되는 상기 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)은 생물학적 화학 물질과 특별한 상호 작용을 일으키지 않기 때문에 인체에 무해한 물질이며, 점성을 주는 기능을 가진다.
특히, 친수성 고분자이기 때문에 의료용 소재에 많이 사용되고, 이외에도 다른 재료와의 복합화나 재료의 표면 개질을 통한 물성 개선을 위해 광범위하게 이용된다.
따라서, 본 발명에서는 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 혼합한 하이드로겔을 제작하여, 망막색소상피세포 증식 및 재생 효율을 높이고자 하였다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물에서, 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체는 상기 조성물의 전체 중량 대비 1~10 중량%, 바람직하게는 1~5 중량%를 함유할 수 있다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물에서, 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체가 상기 조성물의 전체 중량 대비 10 중량%를 초과하는 경우에는 점성이 높아져, 세포증식과 성장을 억제하는 문제가 있고, 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체가 상기 조성물의 전체 중량 대비 1 중량% 미만인 경우에는 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜의 가교 결합물이 지지체로서의 역할을 할 수 없는 문제가 있다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물에서, 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체의 가교제는 염화칼슘(CaCl2), 염화 리튬(LiCl), 염화나트륨(NaCl), 염화칼륨(KCl), 염화세슘(CsCl), 엔도젠 폴리아민 스페르미딘(Endogen polyamine spermidine) 등 중에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물에서, 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜은 90~99 : 1~10의 중량비, 바람직하게는 95~99 : 1~5의 중량비로 함유될 수 있다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물에서, 상기 망막색소상피세포는 인간 유래일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물에서, 상기 조성물은 망막색소상피세포 재생용일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (a) 인간으로부터 얻은 망막색소상피세포주를 배양하여 망막색소상피세포를 준비하는 단계, (b) 젤란검을 증류수에 용해시켜 젤란검 수용액을 얻는 단계, (c) 상기 (b) 단계와는 별도의 단계로서, 폴리에틸렌글리콜을 증류수에 용해시켜 폴리에틸렌글리콜 수용액을 얻는 단계, (d) 상기 젤란검 수용액 및 폴리에틸렌글리콜 수용액을 혼합한 후, 가교제를 첨가하여 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체를 얻는 단계, 및 (e) 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체에 상기 (a) 단계에서 준비한 망막색소상피세포를 혼합하는 단계를 포함하는, 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법에서, 상기 (a) 단계는 망막색소상피세포주인 ARPE-19 세포를 DMEM/F-12 배양액에서 배양하여 망막색소상피세포를 준비하는 단계일 수 있다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법에서, 상기 (b) 단계는 젤란검 파우더를 90~110℃의 온도로 가열한 증류수에 넣고 교반 하에 10~40분 동안 가열하여 젤란검 수용액을 제조하는 단계일 수 있다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법에서, 상기 (c) 단계는 폴리에틸렌글리콜 파우더를 90~110℃의 온도로 가열한 증류수에 넣고 교반 하에 10~40분 동안 가열하여 젤란검 수용액을 제조하는 단계일 수 있다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법에서, 상기 (d) 단계는 상기 젤란검 수용액 및 폴리에틸렌글리콜 수용액을 90~99 : 1~9의 중량비, 바람직하게는 95~99 : 1~5의 중량비로 혼합한 후, 가교제를 첨가하고 1~30분 동안 가교 결합시켜 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체를 얻는 단계일 수 있다.
상기 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법에서, 상기 (e) 단계는 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체에 상기 (a) 단계에서 준비한 망막색소상피세포를 혼합하되, 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체 및 상기 망막색소상피세포의 중량비가 1~10: 90~99가 되도록 첨가하여 혼합하는 단계일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물의 용도로서, 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 망막색소상피세포 재생을 위한 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물의 용도로서, 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 망막색소상피변성증의 치료 및 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물의 용도로서, 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 황반변성증의 치료 및 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양
인간(American Type Culture Collection®)으로부터 얻은 RPE 세포주인 ARPE-19 세포를 DMEM/F-12 배양액에서 배양하였다.
이때, 상기 배양액은 DMEM/F-12(Dulbeco’s Modified Eagle’s Media, Gibco, USA)를 사용하였으며, 10 %의 우태아혈청 (FBS, Gibco) 및 1 %의 페니실린 (PS, 100 U/mL)과 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Gibco)을 첨가하여 사용하였다.
상기 ARPE-19 세포를 37℃, 5% CO2 조건 하의 인큐베이터에서 배양하였다. ARPE-19 세포는 적절한 세포 수를 얻을 때까지 배양하였으며, 배지는 2 일마다 교체하였다.
< 실시예 2> PEG / GG 가교 결합물의 제조
PEG (0, 1, 3 및 5 중량%의 농도)를 100℃의 온도에서 증류수(dH2O)에 용해시키고, 20분 동안 계속 교반하여 완전히 용해시킨 후, GG (1 %(w/v))를 각각 용액에 첨가하여 모두 용해시킨 다음, 0.03 % CaCl2를 첨가하고 혼합물을 10분 동안 가교 결합시켰다.
< 실시예 3> ARPE -19의 캡슐화
상기 실시예 2에서 제조된 PEG/GG 가교 결합물을 120℃에서 30분 동안 멸균한 후에, 5×105 cells/ml의 ARPE-19 세포를 혼합하였다. 페트리 접시에 부어준 후 15분 동안 실온에서 온도 감소에 의한 겔화가 일어났다.
제작된 하이드로겔을 펀치를 이용하여 직경 8 mm, 높이 5 mm의 하이드로겔을 제조하였고, DMEM/F-12 배양액에 넣어 5% CO2, 37℃의 인큐베이터에서 배양하였다.
< 실험예 1> 하이드로겔 지지체의 특성 분석
1. PEG/ GG 하이드로겔의 육안 관찰 및 내부 형태 관찰
제조된 PEF/GG 하이드로겔의 육안 관찰은 도 1a에 나타내었으며, PEG 함량에 따른 외적인 변화는 나타나지 않았다. 이때, 하이드로겔의 표면 특성과 형태학은 전자주사현미경 (Bio-LV-SEM, SN-3000 Hitachi, Japan)으로 확인하였다.
동결 건조된 PEG/GG 하이드로겔의 카본테이프로 고정하고, 백금으로 코팅한 후 다공성이 관찰되었다. PEG가 함유된 겔에서는 젤란검보다 작은 다공을 갖고, PEG의 함량이 증가할수록 다공성의 크기가 감소하였다. 이때, 다공의 크기는 대략 200~350 ㎛ 사이를 나타내었다.
2. PEG/ GG 하이드로겔의 FT-IR 분석
제조된 PEG, GG 및 PEG/GG 하이드로겔의 구조학적 변화를 확인해 보고자 FT-IR을 이용하여 4,000~500 cm-1의 범위에서 정성적 분석을 하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
PEG의 피크는 841 cm-1, 2882 cm-1에서 -CH기 피크가 생성되었으며, 1093 cm-1에서 -COC-기 피크가 생성되었다.
GG의 주요 피크는 글루코피라노스 고리의 -OH 그룹의 존재로 인해 3369 cm-1에서 넓은 피크가 나타났으며, 1425 cm-1, 1630 cm-1에서 카르복실레이트기가 나타나고, 2924 cm-1의 피크는 -CH2가 타나났다.
PEG의 함량이 증가할수록 1150 cm-1 부근의 피크가 깊어지는 것을 확인할 수 있는데, 이는 PEG와 GG의 피크가 겹쳐져 중첩 효과로 강한 밴드가 나타난 것을 통하여, 하이드로겔의 특성이 개질되었음을 확인하였다.
3. 공극률 측정
지지체 내의 공극을 측정하기 위해 하이드로겔을 동결 건조시켰으며, 증류수에 일정 시간 담가 증류수의 부피 변화를 통해 측정하였다. 측정한 공식은 다음과 같다.
공극률(%) =
Figure 112019005334290-pat00001
상기 식에서, V1은 처음 증류수의 부피, V2는 지지체를 넣은 후 증가한 증류수의 부피, V3는 지지체를 제거한 후 줄어든 증류수의 부피를 의미한다.
다공성은 세포 부착과 침투 및 영양소 교환을 유도 할 수 있기 때문에 하이드로겔의 중요한 특성인데, 도 3은 제작된 하이드로겔의 다공성을 보여 주는 것으로, GG 하이드로겔과 PEG/GG 하이드로겔의 다공성은 60% 이상을 나타내었다.
이러한 결과에 따르면, 하이드로겔의 PEG 농도가 증가할수록 점도가 증가하여, 다공성이 감소하고 구멍 크기가 줄어드는 결과를 확인하였다.
4. 팽윤도 측정
지지체의 팽윤도 측정을 위해 하이드로겔을 동결 건조시켰으며, PBS에 담가 시간에 따른 지지체의 무게 변화를 측정하였고, 측정 공식은 다음과 같다.
팽윤도 (%)
Figure 112019005334290-pat00002
상기 식에서, Ws는 PBS에 적신 무게, Wd는 동결건조 무게를 의미한다.
도 4에 나타낸 측정 결과에서, 모든 지지체의 수분 흡수율이 매우 높음을 확인하였다.
5. 분해율 측정
지지체의 분해율을 측정하기 위해 하이드로겔을 동결 건조시켰으며, 증류수에 담가 시간에 따른 지지체의 무게 변화를 특정하였고 측정 공식은 다음과 같다.
분해율 (%)
Figure 112019005334290-pat00003
상기 식에서, Wf는 기본 무게, Wd는 동결건조 무게를 의미한다.
하이드로겔은 세포 운반체이며, ECM을 대체하기 때문에, 적절한 생분해성을 제공해야 한다. 특히 망막 이식을 위한 하이드로겔은 RPE 세포층의 결합과 세포층에 고르게 분포되어야 한다.
21일 동안 PEG/GG 하이드로겔의 분해성을 측정하였고, GG 하이드로겔의 분해속도는 PEG가 들어간 하이드로겔보다는 빨랐다. 초반의 분해율은 PEG의 함유량이 증가할수록 적었지만, 10일이 지난 이후에는 분해율의 큰 변화가 없었고, 21일이 모두 지난 후에는 GG와 3 중량%의 PEG 하이드로겔은 65% 이상의 분해율을 보였다.
< 실험예 2> 하이드로겔에 캡슐화된 세포 특성 평가
1. 세포 증식률 평가
하이드로겔의 생체 적합성 및 증식을 확인하기 위해 세포 증식률은 MTT 분석법 (3-[4,-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide; thiazolyl blue, Amresco, USA)을 이용해 평가하였다.
ARPE 세포를 하이드로겔에 캡슐화한 후, 1, 3, 5, 7, 14일 째에 배양액 1 ml과 MTT 시약 100 ㎕를 첨가하여 4시간 동안 5% CO2, 37℃의 인큐베이터에서 배양하였다.
그 후 보라색 결정이 생성되면 디메틸설폭사이드(DMSO, Sigma, USA)를 1 mL식 넣어 보라색 결정을 완전히 용해시킨 후, 96 웰 플레이트로 0.1 mL씩 분주하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
측정 결과는 도 5에 나타내었으며, 배양기간이 증가할수록 세포가 증식하였고, 3 중량% PEG/GG 하이드로겔에서 가장 높은 세포 증식률을 확인하였다.
2. mRNA 발현 분석
하이드로겔에서 배양된 ARPE 세포에서 추출된 mRNA의 발현을 RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용해 분석하여 도 6에 나타내었다.
3일, 7일, 14일 째의 샘플을 cDNA를 합성하여 증폭시키고, 1% 아가로스 겔에 넣어 100V 조건으로 전기 영동하였으며, 360 ㎚ 파장의 자외선으로 조사하여, RPE65, CRALBP, NPR-A 밴드를 관찰하였다.
항존 유전자인 베타-락틴(β-actin)을 사용하여, Cellular Retinaldehyde-Binding Protein(CRALBP), Retinal Pigment Epithelium-specific 65-kDa(RPE65), Natriuretic Peptide-A Receptor(NPR-A)의 발현 정도를 표준화하여 수치화한 결과, 3 중량% PEF/GG 하이드로겔에서 배양된 세포의 mRNA 발현이 가장 높게 나타남을 확인하였다(도 6 참조).
3. 세포 생존력 평가
세포의 생존력을 평가하기 위해 Live/Dead cell imaging kit (Invitrogen, USA)을 이용하였으며, 각각의 PEG/GG 하이드로겔을 얇게 잘랐고, 컨포컬용 접시에 시약을 미리 적신 후, 하이드로겔 위를 다시 덮어 시약이 내부까지 들어갈 수 있도록 3시간 동안 5% CO2, 37℃의 조건으로 인큐베이션 하였다.
빛을 차단한 뒤 고분해능 공초점 레이저 주사현미경(LSM 880 with Airycsan, Carl Zeiss, Germany)으로 하이드로겔 내부에 살아 있는 세포와 죽은 세포를 관찰하였다.
1일 및 14일 째의 샘플을 확인한 결과, 살아있는 세포를 나타내는 녹색은 시간이 지남에 따라 증가하였으며, 3 중량% PEG/GG 하이드로겔에서 가장 많이 나타남을 확인하였다.
4. PEG/ GG 하이드로겔 내부의 세포의 부착과 증식 분석 ( 전자주사현미경 관찰)
PEG/GG 하이드로겔에서 ARPE 세포의 부착과 이동양상을 확인하기 위해 전자주사현미경 (Bio-LV-SEM, SN-3000 Hitachi, Japan)을 이용하여 관찰하여 도 8에 나타내었다.
5×105 cells/ml 세포를 파종한 하이드로겔을 1일 및 14일 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후, 2.5% 글루타 알데히드 (Sigma-aldrich)로 24시간 동안 고정하고, 냉장 4시간, 냉동 4시간 후 딥프리져(deep freezer)에 얼려서 24시간 동결 건조하였다.
건조된 지지체를 자른 후 단면을 관찰하기 위해, 금속판에 카본테이프를 부착해 지지체를 고정시키고 백금 코팅하였다. 이를 전자주사현미경을 이용해 지지체에서의 세포 부착과 이동양상을 관찰하였다.
대조군인 GG 하이드로겔보다 3 w% PEG가 포함된 PEG/GG 하이드로겔에서 ARPE 세포의 부착과 이동이 잘 일어났음을 확인하였다(도 9 참조). 도 10은 PEG/GG 하이드로겔들 내에서의 세포의 분포 및 형태를 나타낸 H&E 염색사진이다.
상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 의한 망막색소상피세포 재생을 위한 조성물은 수초로부터 추출된 고분자 다당류로 우수한 물성과 생체 적합성을 가진 젤란검과 인체에 무해하며 물성 개선에 광범위하게 쓰이는 폴리에틸렌글리콜이 함유된 하이드로겔에서 RPE 세포의 부착 및 증식률을 높이고, 세포의 기능이 정상적으로 발현될 수 있는 효과가 발생하기 때문에, 망막의 조직 재생에 적용 가능하며, 그 외 다른 장기의 조직재생 의학 분야에 적용이 가능하다.

Claims (16)

  1. 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체 및 망막색소상피세포를 함유하며,
    상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜은 96~98 : 2~4의 중량비로 혼합한 후, 염화칼슘(CaCl2)으로 가교하며, 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜의 지지체는 조성물의 전체 중량 대비 1~5 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 망막색소상피세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는, 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 망막색소상피세포 재생용인 것을 특징으로 하는, 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물.
  8. (a) 인간으로부터 얻은 망막색소상피세포주를 배양하여 망막색소상피세포를 준비하는 단계;
    (b) 젤란검을 증류수에 용해시켜 젤란검 수용액을 얻는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계와는 별도의 단계로서, 폴리에틸렌글리콜을 증류수에 용해시켜 폴리에틸렌글리콜 수용액을 얻는 단계;
    (d) 상기 젤란검 수용액 및 폴리에틸렌글리콜 수용액을 혼합한 후, 염화칼슘(CaCl2)을 첨가하여 가교된 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체를 얻는 단계; 및
    (e) 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체에 상기 (a) 단계에서 준비한 망막색소상피세포를 혼합하는 단계를 포함하며,
    상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜은 96~98 : 2~4의 중량비로 혼합하고, 상기 젤란검과 폴리에틸렌글리콜의 지지체는 조성물의 전체 중량 대비 1~5 중량%를 함유하는 것을 특징으로하는 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계는 망막색소상피세포주인 ARPE-19 세포를 DMEM/F-12 배양액에서 배양하여 망막색소상피세포를 준비하는 것을 특징으로 하는 망막색소상피세포를 포함하는 하이드로겔 조성물의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계는 젤란검 파우더를 90~110℃의 온도로 가열한 증류수에 넣고 교반 하에 10~40분 동안 가열하여 젤란검 수용액을 제조하는 것을 특징으로 하는, 망막색소상피세포를 포함하는 젤란검 하이드로겔 조성물의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 (c) 단계는 폴리에틸렌글리콜 파우더를 90~110℃의 온도로 가열한 증류수에 넣고 교반 하에 10~40분 동안 가열하여 젤란검 수용액을 제조하는 것을 특징으로 하는, 망막색소상피세포를 포함하는 젤란검 하이드로겔 조성물의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 젤란검 수용액 및 폴리에틸렌글리콜 수용액을 혼합한 후, 상기 염화칼슘(CaCl2)을 첨가하고 1~30분 동안 가교 결합시켜 젤란검과 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 지지체를 얻는 것을 특징으로 하는, 망막색소상피세포를 포함하는 젤란검 하이드로겔 조성물의 제조방법.
  13. 삭제
  14. 제1항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔 조성물을 포함하는 망막색소상피세포 재생을 위한 조성물.
  15. 제1항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔 조성물을 포함하는 망막색소상피변성증의 치료 및 예방을 위한 조성물.
  16. 제1항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 따른 하이드로겔 조성물을 포함하는 황반변성증의 치료 및 예방을 위한 조성물.
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