KR20220111822A - 줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로의 분화 방법 및 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 분화 방법을 이용하는 경우, 신경전구체구를 효율적으로 망막외곽층세포로 분화 시킬 수 있는바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물{Methods for Generation of Retinal Outer Layer Cells from Stem Cells and Composition for Preventing or Treating Retinal Diseases Comprising Cells Thereby Generated}
본 발명은 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)의 분화 및 생성 방법에 관한 것이다.
실명은 의학적으로 광각이 없는 것을 말하며, 현재 세계적으로 전 인구의 0.2-0.5%인 수천만 명의 환자가 앓고 있는 질환으로, 개인적, 사회적 및 경제적으로 커다란 손실을 가져오고 있다. 전 세계적으로 실명의 가장 큰 원인 중 하나로서 망막의 시각세포(광수용체세포, photoreceptor cell) 및 망막색소상피세포의 변성을 들 수 있는데, 이는 선천적 요인 또는 다른 다양한 원인들에 의해 발생한다. 망막 미형성, 망막 변성(retinal degeneration), 노인성 황반변성(aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환(diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 선천성망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시(leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장(glaucoma), 시신경병증 및 외상 등 많은 질환들이 이 질환에 해당된다. 현재까지 이 질환들에 대한 근본적인 치료를 위한 약물요법은 없으며, 이들 질환의 원인이며 결과인 기능부전의 시각세포 및 망막색소상피세포를 새로운 기능성 세포로 재생하여 이식하는 것이 가장 가능성 있는 치료법으로 여겨지고 있다. 시각세포 및 망막색소상피세포 이식법은 망막 변성을 지연시키거나, 억제하고, 퇴화 또는 변성된 망막을 재생한 후 망막 기능을 향상시켜 실명을 방지하거나 또는 손상된 시력을 재생시킬 수 있을 것으로 평가되고 있다.
골수줄기세포(bone marrow stem cell: BMS), 망막줄기세포(retinal stem cell: RSC), 배아줄기세포(embryonic stem cell: ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC) 및 체세포핵치환줄기세포(somatic cell nuclear transfer cell: SCNT) 등을 이용한 안구 질환의 치료 가능성이 대두되고 있다. 그러나 줄기세포로부터 망막세포로의 분화 및 이를 이용한 세포치료에 대한 연구 성과는 미진한 상태에 있다. 이들 줄기세포로부터 망막세포로의 분화가 가능할 경우 1) 효과적인 세포 치료를 위한 무한한 세포공급이 가능하며, 2) 지금까지 알려지지 않은 배아세포(embryonic cell) 및 망막기원세포(retinal progenitor)로부터의 망막 세포로의 분화 기전이 규명되고, 3) 망막의 분화 관련 유전자 및 분자들의 발견 및 그에 대한 병변 규명과, 4) 망막변성질환의 발생기전 파악, 그리고 5) 망막 변성방지 및 망막 신경보호를 위한 약제 개발에도 이용 가능할 것이다.
최초의 인간 배아줄기세포주가 확립된 이후부터, 인간 배아줄기세포는 매우 다양한 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있으며, 상기 분화된 세포들이 각종 장기에서 발생하는 질환들을 치료할 수 있는 인간 세포치료법에 적용 될 수 있을 것으로 제안되어 왔다. 즉, 인간 배아줄기세포는 성상을 정확히 규명할 수 있고, 임상 치료 시 기능부전의 세포를 새로운 세포로 치환하기 위한 세포를 풍부히 공급할 수 있는 강력한 후보자로 여겨지고 있다. 인간 배아줄기세포에서 유도된 각종 장기를 구성하는 분화 세포들은 정상적인 분화 과정을 통해 형성되는 해당 세포들과 동일한 성상 및 기능을 가질 수 있을 것으로 가정 되어 왔다. 이 가능성에 기반하여, 발달 단계와 유사한 환경을 제공하는 분화 유도법이 췌장 호르몬-발현 내분비세포, 신경세포, 근육세포, 혈관내피세포분화 등에서 시도되고 있다. 망막 질환에서도 인간 배아줄기세포로부터 분화된, 망막 세포의 대표적인 세포인 시각세포 및 망막색소상피세포를 생산하고자 많은 시도들이 있었으나, 성적은 매우 저조하였다.
현재까지의 가장 큰 성공 중 하나로 보고된 연구결과는 망막 기원세포가 인간 배아줄기세포로부터 효과적으로 유도되었다는 것이나, 유도된 망막 기원세포로부터 시각세포의 분화는 실패하였다 (분화율 0.01% 미만)(Lamba, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 12769-74).
따라서, 임상적으로 적용이 가능한 시각세포 및 망막색소상피세포의 분화 방법의 개발의 필요성이 있다.
Lamba et al., Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 12769-74.
본 발명자들은 임상적으로 적용이 가능한 망막외곽층세포 즉, 시각세포 및 망막색소상피세포의 분화 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 신경전구체구 단일세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일 배지 내에서 함께 배양하는 경우, 시각세포 및 망막색소상피세포로의 분화 효율이 높은 점을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 다음 단계를 포함하는 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로의 분화 방법을 제공하는 것이다.
신경전구체구 단일세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일 배지 내에서 함께 배양하는 단계; 및
신경전구체구로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로 분화시키는 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로의 분화 방법을 제공한다:
신경전구체구 단일세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일 배지 내에서 함께 배양하는 단계; 및
신경전구체구로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로 분화시키는 단계.
본 명세서 상의 용어 "망막외곽층세포"는 다층으로 구성된 망막을 구성하는 세포들 중 외곽 층에 존재하는 시각세포(photoreceptor cell)와 망막색소상피세포(retinal pigmented epithelium cell)를 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "시각세포"는 망막의 바깥 층에 존재하는 막대세포(rod cell) 및 원뿔세포(cone cell)를 의미한다. 시각세포는 광수용기 세포, 광수용체세포 등으로 지칭될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "망막색소상피세포"는 망막의 가장 바깥쪽 층에 위치하며 맥락막(choroid)과 접하고 있는 망막색소상피를 구성하고 있는 세포를 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "신경전구체구"는 인간 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포와 같은 전분화능줄기세포로부터 만들어진 신경 전구세포 또는 신경 조직으로부터 분리된 신경 전구세포가 구의 형태로 응집된 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 신경전구체구는 300 내지 700 μm의 크기를 가질 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 상기 신경전구체구는 450 내지 550 μm의 크기를 가질 수 있다.
신경전구체구 단일세포는 신경전구체구를 단일 세포화 하는 단계를 통해 분리될 수 있다. 상기 단일 세포화는 미세 절편 도구를 이용하여 신경전구체구를 절편화하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 세포 분리 효소를 사용하여 절편화하는 경우에는 세포의 손상이 많아 회수율이 적으므로 물리적인 방법이 사용될 수 있다. 절편화를 위한 도구로는 해부 현미경하에서 직경 500μm 이하의 응집물을 자를 수 있는 도구라면 모두 사용이 가능하며, 구체적으로, 유리 파스퇴르 파이펫을 가늘게 뽑은 것, 직경 100μm 이하의 금속선 및 마이크로미터(μm) 크기의 구멍을 갖는 금속 그물망 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 상기 절편화는 텅스텐 와이어를 이용하여 수행하였다.
또한, 상기 절편화된 신경전구체구는 세포 분리용 효소로서, 트립신-EDTA, 디스페이즈, 아큐테이즈 및 콜라게네이즈 등과 같이 통상의 기술분야에 잘 알려진 효소를 이용하여 단일화될 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 세포의 단일화는 아큐테이즈를 이용하여 수행하였다.
본 발명의 실시예에 의하면, 절편화된 신경전구체구는 셀스타트(CellStart)로 코팅된 직경 60mm 배양접시에서 bFGF와 N2 첨가제가 첨가된 배양배지로 12-24시간 부착배양한 후 배지를 제거하고 아큐테이즈 3-5ml을 넣고 37℃ 배양기에서 1-3시간 처리하여 단일세포화 될 수 있다.
신경전구체구의 낭성 구조물은 신경전구체구에 존재하는 물집형태의 투명낭을 의미하며, 이들은 신경전구체구에서 물집형태의 투명낭으로 돌출되거나 전체적으로 투명낭에 둘러싸인 형태로 존재할 수 있다. 상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 금속선 및 마이크로미터(μm) 크기의 구멍을 갖는 금속 그물망 등을 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 텅스텐 와이어를 사용하여 분리하였다.
상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 절편화할 수 있다.
신경전구체구 단일세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일배지 내에서 함께 배양하는 단계
본 단계는 신경전구체구 단일세포와 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일배지 내에서 함께 배양하는 단계이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 배양하는 단계는 공극성 구조물로 상하 이격된 공간 중 상단부 상에 신경전구체구 단일세포를 위치시키고, 하단부 상에 신경전구체구의 낭성 구조물을 위치시켜 배양하는 단계인 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 공극성 구조물은 다공성 메쉬(mesh)인 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 신경전구체구 단일세포는 신경전구체구의 비낭성 구조물로부터 분리되는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 신경전구체구 낭성 구조물은 신경전구체구 유래 투명낭으로부터 분리되는 것이다.
상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 절편화되어 배양할 수 있다. 상기 신경전구체구의 낭성 구조물의 절편 크기는 제한이 없다.
상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 셀스타트(CellStart)가 코팅 된 배양접시에 배양접시 당 15 내지 20개의 낭성 구조물 절편을 넣고 N2, B27 첨가제가 첨가된 DMEM/F12 배양배지에서 부착 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 공극성 구조물로 상하 이격된 공간 중 하단부 상에 위치하는 것이다.
신경전구체구 단일세포는 셀스타트가 코팅된 배양접시에 올리고 세포를 0.5Х105 내지 1.5Х105개 넣어준 후 신경전구체구의 낭성 구조물과 함께 1-3주간 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 신경전구체구 단일세포는 공극성 구조물로 상하 이격된 공간 중 상단부상에 위치하는 것이다.
상기 각 단계에서 사용되는 코팅물질은 셀스타트일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 세포부착을 위한 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 추가적으로 포함할 수 있다. 이는 미분화 줄기세포 및 신경세포들은 자력으로 배양 접시에 부착하여 성장할 수 없기 때문에, 세포외기질 또는 다른 지지세포의 도움을 받아야 유지 배양이 가능하기 때문이다.
세포외기질은 셀스타트 외에도 다른 물질 단독 또는 혼합하여 사용 가능하다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 신경전구체구는 줄기세포로부터 분화되는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 줄기세포는 전분화능줄기세포인 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs), 성체줄기세포(adult stem cells), 핵 치환 배아 줄기세포(somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell) 및 직접 분화법(direct reprogramming)에 의해 생성되는 줄기세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포인 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 신경전구체구는 다음의 단계를 통해 줄기세포로부터 분화되는 것이다:
줄기세포(stem cell)로부터 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계;
상기 배아체로부터 신경로제트(neural rosette) 및 신경관 유사 구조(neural tube-like structure)를 형성하는 단계; 및
상기 신경로제트 및 신경관 유사 구조로부터 신경전구체구를 형성하는 단계.
줄기세포(stem cell)로부터 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계는 4-6일간 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
줄기세포(stem cell)로부터 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계는 Essential 6 세포배양 배지를 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "배아체"는 배아줄기세포로 대표되는 전분화능줄기세포의 3차원 집합체를 의미하며, 전분화능줄기세포는 배아체를 통해 초기 배아 발생단계의 분화과정을 재현할 수 있고 내배엽, 중배엽, 외배엽의 모든 삼배엽성 체세포로 분화가 가능하다.
상기 배아체로부터 신경로제트(neural rosette) 및 신경관 유사 구조를 형성하는 단계는 4-6일간 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배아체로부터 신경로제트(neural rosette) 및 신경관 유사 구조를 형성하는 단계는 셀스타트가 코팅 되어있는 배양 접시를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배아체로부터 신경로제트(neural rosette) 및 신경관 유사 구조를 형성하는 단계는 상기 배아체 형성과정으로 형성된 배아체를 셀스타트가 코팅 되어있는 배양 접시에서 1/2 함량의 N2 첨가제만 첨가된 DMEM/F12 최소배양 배지로 4-6일간 배양하여 이루어지며 이후 1/2 N2 첨가 DMEM/F12 최소배양 배지를 bFGF와 N2가 첨가된 DMEM/F12 배양배지로 교체하여 5-10일간 배양하여 증식 시킴으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 단계에서 사용되는 배양배지는 bFGF 와 N2 첨가제가 첨가된 DMEM/F12 세포배양 배지일 수 있으나, 신경로제트가 형성/유지 가능한 배양액은 선택적으로 제한 없이 사용될 수 있다.
신경전구체구로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로 분화 시키는 단계
본 단계는 신경전구체구 단일세포와 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일 배지 내에서 함께 배양된 후 신경전구체구 단일세포와 낭성 구조물이 망막외곽층세포로 분화되는 단계이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 신경전구체구는 신경전구체구 단일 세포, 신경전구체구의 낭성 구조물, 또는 신경전구체구 단일 세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 시각세포(photoreceptor cell), 망막색소상피세포(retinal pigment epithelium cell), 또는 시각세포(photoreceptor cell) 및 망막색소상피세포(retinal pigment epithelium cell)이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 로돕신(rhodopsin) 및 βⅢ-튜불린(tubulin) 발현이 증가되는 것이거나, RPE65 및 Bestrophin의 발현이 증가되는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 실명을 개선 또는 예방하는 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 망막 질환은 실명, 망막미형성, 망막 변성(retinal degeneration), 노인성 황반변성(aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환(diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 녹내장(glaucoma), 시신경병증, 외상, 망막박리, 레버씨 선천성 흑암시 및 선천성 망막위축증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 망막외곽층 세포는 상기 분화 방법에 기재된 망막외곽층 세포와 동일한 세포이기 때문에, 망막외곽층 세포에 관한 기재는 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
본 발명은 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로의 분화 방법 및 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 분화 방법을 이용하는 경우, 배양배지 및 기본 배양 첨가제 외에 다른 화학적 구성물 이나 타 지지세포 없이 신경전구체구만으로 효율적으로 신경전구세포를 망막외곽층세포로 분화 시킬 수 있는 바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 망막외곽층세포 분화유도 단계별 세포 형태 및 분리 배양에 사용되는 배양 접시에 대해 나타낸다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 망막외곽층세포 분화유도 단계별 세포형태 및 분리 배양에 사용되는 배양 접시에 대해 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, SNM의 특성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3a는 망막외곽층세포 분화에 최적 분리배양 방법을 확인한 결과를 나타낸다(신경전구체구 단일세포만 배양).
도 3b는 망막외곽층세포 분화에 최적 분리배양 방법을 확인한 결과를 나타낸다(신경전구체구 단일세포와 낭성 절편 혼합 배양).
도 3c는 망막외곽층세포 분화에 최적 분리배양 방법을 확인한 결과를 나타낸다(세포배양 인서트에 낭성 절편, 6-well 세포배양 접시에 신경전구체구 단일세포 1일 배양 후 분리배양).
도 3d는 망막외곽층세포 분화에 최적 분리배양 방법을 확인한 결과를 나타낸다(세포배양 인서트에 신경전구체구 단일세포, 6-well 세포배양 접시에 낭성 절편 1일 배양 후 분리배양).
도 3e는 망막외곽층세포 분화에 최적 분리배양 방법을 확인한 결과를 나타낸다(세포배양 인서트 아래면에 신경전구체구 단일세포, 6-well 세포배양 접시에 낭성 절편 1일 배양 후 분리배양).
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라, 배아줄기세포로부터 분화된 시각세포의 분화 여부를 마커의 발현 여부로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 유도만능줄기세포로부터 분화된 시각세포의 분화 여부를 마커의 발현 여부로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따라, 시각세포의 분화 여부를 cyclic GMP의 농도를 측정하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따라, 배아줄기세포로부터 분화된 시각세포의 분화 여부를 rhodopsin, βⅢ-tubulin, Nestin 유전자 발현으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따라, 배아줄기세포로부터 분화된 망막상피세포의 분화 여부를 RPE65, Bestrophin, ZO-1 마커로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4f는 본 발명의 일 실시예에 따라, 유도만능줄기세포로부터 분화된 망막상피세포의 분화 여부를 RPE65, Bestrophin, ZO-1 마커로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라, 분화된 시각세포 및 망막상피세포의 생체 내 생착을 동물실험을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 분화된 시각세포 및 망막상피세포의 효능을 측정하기 위해 망막전위도를 실시를 나타내는 도면이다
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라, 분화된 시각세포 및 망막상피세포의 효능을 망막전위도 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
인간 배아줄기세포(human Embryonic stem cells, hESC) 배양
망막외곽세포 분화를 위한 미분화된 hESCs(SNUhES32)는 Vitronectin(GIBCO, A27940)코팅 배양 접시에서 Essential 8(GIBCO, A15169-01) 배양액을 사용하여 배양하였다.
이때, 미분화 줄기세포는 콜로니(Colony) 형태로 배양하였다. 7일간 배양을 원칙으로 하되, 콜로니 가운데 부분이 분화로 유도되려 하면 유리 파이펫 끝부분을 갈고리 형태로 만든 도구를 이용하여 20-30개 정도의 격자무늬로 조각내어 100개의 조각을 Vitronectin이 코팅된 새로운 배양 접시에 옮겨 계대배양하고, 3일 째부터 7일 째까지 매일 24시간이 지나기 전에 배양액을 교체하여 유지하였다.
유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem cells, iPSCs) 배양
상기 hESC 배양 방법과 동일한 방법으로, 시각세포 분화를 위한 미분화된 iPSCs(hFSiPS1)를 배양하였다.
면역세포화학(Immunocytochemistry)분석
세포를 4% 파라포름알데하이드 용액에 10분간 고정시켰다.
각각의 항체가 세포질 내로 투과가 잘되게 하기 위하여, 0.1% Trition X-100 (in PBS) 용액으로 15분간 반응시키고, 2% 소혈청알부민 (BSA, in PBS) 용액으로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
그 다음, 일차 항체와 4℃에서 세포를 결합시켰다. 상기 일차 항체가 결합된 세포를 확인하기 위하여 각각의 일차항체 유래 종에 맞는 이차 항체를 사용하였다(하기 표 1 참조).
끝으로, 세포핵을 확인하기 위하여, 4', 6-다이아미노-2-페닐인돌(DAPI)이 포함된 PBS에 10분간 반응시켜 핵 염색을 완료한 후 형광현미경을 사용하여 이미지를 획득하고, 중요 마커들을 확인 및 분석하였다.
단백질
(Protein)		 종
(Species)		 제조사
(Company)		 희석
(Dilution)
Nestin Rabbit Millipore 1:100
Musashi Mouse Chemicon 1:200
Pax6 Rabbit Novus viologicals 1:100
Mouse Chemicon 1:200
βШ-tub Rabbit BioLegend 1:1000
Mouse BioLegend 1:500
SOX1 Rabbit Chemicon 1:200
SOX2 Rabbit Chemicon 1:100
LMX1A Goat Santa Cruz 1:100
Nurr1 Rabbit Chemicon 1:200
Rhodopsin Rabbit Millipore 1:100
Blueopsin Rabbit Chemicon 1:200
Redopsin Rabbit Chemicon 1:100
PDE6b Rabbit abcam 1:50
Recoverin Rabbit Chemicon 1:100
ZO-1 Rabbit Zymed 1:200
RPE65 Mouse Novus biological 1:200
Bestrophin Mouse Novus biological 1:200
인간 전분화능줄기세포에서 망막외곽세포로의 분화
전분화능줄기세포주인 미분화된 인간배아줄기세포(hESC) 또는 유도만능줄기세포(iPSC)를 해동 시점부터 2회 계대배양을 진행하여 안정화시키고 3회째 계대배양 후 7일간 배양을 유지하였다.
7일 배양된 인간배아줄기세포(hESC) 또는 유도만능줄기세포(iPSC)(전분화능줄기세포)의 배양액을 제거하고 DPBS(-)로 한 번 수세 한 뒤 디스페이즈 1ml을 넣고 37℃ 배양기에서 3분간 반응시켜 세포를 분리하였다. 분리 된 세포는 배아체(Embryoid body, EB) 형성을 위하여 페트리 배양접시에 EB배지(Essential 6, 0.5% penicillin, streptomycin)에서 5일간 배양하였다.
EB 5일차에 신경성 세포들만 자랄 수 있도록 EB를 셀스타트 코팅 dish 옮겨 신경 선택 배지인 DMEM/F12배지(0.5% N2 substrate, 2 mM L-glutamin, 1% non essential amino acids(NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin, 0.1 mM beta-mercaptoethanol 포함)에서 5일간 배양하였다. 추가적으로, 신경로제트(Neural rosette)와 신경관 유사 구조(Neural tube like structure)형성 및 증식을 위해 증식 배지인 DMEM/F12배지(0.5% N2 substrate, 2 mM L-glutamin, 20ng/ml basic fibroblast growth factor(bFGF), 1% non essential amino acids(NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin, 0.1 mM beta-mercaptoethanol 포함)에서 4-7일간 배양하여 증식하였다.
이후 신경로제트(Neural rosette)와 신경관 유사 구조(Neural tube like structure)형성 및 증식을 위해 N2bF배지(DMEM/F12 배지에 1% N2 substrate, 2 mM L-glutamin, 20ng/ml basic fibroblast growth factor(bFGF), 1% non essential amino acids(NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin, 0.1 mM beta-mercaptoethanol 포함)에서 10~14일간 배양하였다.
배양 기간 동안 신경로제트 및 신경관 유사 구조가 관찰되면 유리 파스퇴르피펫을 가늘게 뽑은 도구를 이용하여 바닥에서 떼어 절단하였고, 이 후 petri-dish에 옮겨 N2bF 배지에서 배양하여 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로 형성되게 하였다.
SNM 계대배양은 직경이 500 μm정도가 되면 0.1 mm텅스텐 wire를 이용하여 기계적으로 절단하는 방법으로 진행하였으며, 최대 10번까지 특성이 변하지 않고 계대가 가능하였다.
망막외곽세포로의 분화를 위한 분리배양 1일전 셀스타트 코팅 6-well 배양접시에 신경전구체구 유래 낭성 구조물을 부착 배양 하였고, 셀스타트 코팅 세포 배양 인서트에 신경전구체구 비낭성 구조물로부터 단일화한 세포 (신경전구체구 단일세포)를 부착 배양 하였다. SNM 단일세포화는 절편화한 SNM을 셀스타트 코팅 배양 접시에 부착배양하고 1일 뒤 accutase를 처리하여 단일세포화 하였다. 분리배양을 위한 세포 배양에는 N2B27 세포배양 배지를 사용 하였다.
분리배양은 낭성 구조물 절편이 배양되어 있는 6-well 배양접시에 단일세포화한 신경전구체구 단일세포가 배양되어 있는 세포 배양 인서트를 넣어 진행하였고, 세포 배양에는 N2B27 세포배양 배지를 사용 하였으며, 분리배양 3주 동안 분화가 종료 될 때까지 2일에 한번씩 배지를 교체해 주었다.
도 1a 및 도 1b는 상기의 과정을 일차 별 간단한 모식화 및 단계 별 세포 형태로 나타낸 도이다.
망막외곽세포 분화 최적화
SNM까지 분화가 완료된 세포로 망막외곽세포 분화에 최적화된 배양조건을 찾기 위해 다음과 같은 조건의 배양을 진행하였다.
a) SNM 세포만 배양,
b) SNM 세포와 낭성 절편 혼합 배양,
c) 세포배양 인서트에 낭성 절편, 6-well 세포배양 접시에 SNM 단일세포 1일 배양 후 분리배양,
d) 세포배양 인서트에 SNM 단일세포, 6-well 세포배양 접시에 낭성 절편 1일 배양 후 분리배양,
e) 세포배양 인서트 아래 면에 SNM 단일세포, 6-well 세포배양 접시에 낭성 절편 1일 배양 후 분리배양.
상기의 조건은 셀스타트 코팅이 된 배양접시에서 진행 되었으며, 세포 배양 배지는 N2B27 배지를 이용하여 배양 하였다.
역전사중합효소 증폭반응(RT-PCR)
분리배양 시간에 따라 망막외곽세포로의 분화 여부를 확인 하기 위해 망막외곽층세포중 시각세포에서 발현되는 마커인 Rhodopsin의 전사 수준에서의 발현에 대한 RT-PCR 분석을 다음과 같이 수행하였다.
TRIzol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 SNM으로부터 분화된 시각세포의 RNA를 획득하였으며, AMV reverse transcriptase(RT)를 이용하는 제조자의 지시방법(AccuPower RT PreMix; Bioneer, Taejeon, Korea)에 따라 oligo-dT를 프라이머로 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다.
PCR 증폭은 Taq Polymerase(HiPi Plus 5x PCR Premix; Elpis biotech, Taejeon, Korea)를 이용하여 수행하였으며, 표준 방식을 사용하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 후 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 10초를 30회 반복하였다. 다른 mRNA 들과의 상대적인 발현을 분석하기 위해서 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA의 신호에 기초하여 cDNA의 양을 표준화하였다.
다양한 조건의 어닐링 온도와 싸이클 횟수를 반복 실험한 결과 비례적으로 증폭되는 구간이 각각의 프라이머 쌍들에 대해서 결정되고 PCR 조건은 최적화되었다.
유전자 발현 분석에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
유전자명 유전자방향 염기서열 서열번호
Rhodopsin Forward 5'-CACAGGATGCAATTTGGAGG-3' 서열번호 1
Reverse 5'-CCTTCTGTGTGGTGGCTGAC-3' 서열번호 2
βⅢ tubulin Forward 5'-CAACAGCACGGCCATCCAGG-3' 서열번호 3
Reverse 5'-CTTGGGGCCCTGGGCCTCCGA-3' 서열번호 4
Nestin Forward 5'-CAGCTGGCGCACCTCAAGATG-3' 서열번호 5
Reverse 5'-AGGGAAGTTGGGCTCAGGACTGG-3' 서열번호 6
GAPDH Forward 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 서열번호 7
Reverse 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' 서열번호 8
광전달 경로대사물질 농도 측정법
cGMP Enzyme immunoassay kit(GE Healthcare)으로 분리배양 7일차의 망막외곽세포에서 광전달경로 대사물질 농도를 측정하기 위해 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 포스포디에스터레이즈 억제제(IBMX, 50 mM)는 cGMP 측정 48시간 전에 처리하였다.
망막 퇴화 설치류 모델에서의 SNM 유래 망막외곽층세포 이식
6주령의 SD 랫트에 멸균된 1% NaIO3 살린용액을 1회 정맥 주사하였다(70 mg/kg). 정맥 주사 4일 후 동물들은 tiletamine/zolazepam(Zoletil®)과 xylazine의 근육 주사를 통해 마취 처리하였다.
동공은 tropicamide 0.5%와 phenylephrine HCl 2.5% eye drops(Mydrin-P®)에 의해 확장되었고 proparacineHCl 0.5%(Alcaine®) 국부 안약 마취제를 처리하였다.
이식 전에, SNM 유래 망막외곽층세포는 DAPI(10μg/ml)와 함께 30분간 배양되었다. 배지에서 DAPI를 제거하기 위하여 여러 번 세척과정을 수행하였고. 37 ℃ 0.05% trypsin/0.1% EDTA 하에서 5분 동안 배양함으로써 분리하였다.
수술 현미경을 통해 시각화하고 분리된 각각의 망막외곽층세포(1x105 cells/2μl)를 Hamilton syringe 에 부착된 26-gauge 바늘을 이용하여 망막하 공간 또는 유리체강에 주입하였다.
사이클로스포린 A(Cyclosporine A)(210 mg/l, Cipol-N®, Chong Kun Dang, Seoul, Korea)은 이식 하루 전날 탈핵 과정 전까지 식수에 투여하였다. 이식 1주일 후, 안구를 탈핵화하고 embedding compound(FSC 22®, Leica microsystems, IL)를 이용하여 급속 동결 처리하였다.
냉각 편을 PBS로 세척하고 0.1% Triton X100를 포함하는 PBS 용액의 3% bovine serum albumin solution에서 블로킹 하였다. 블로킹 후에는 1차 항체와 함께 1일 동안 반응하였으며 면역 조직 화학적 검사를 위하여 항체는 Anti-bШ-tub항체 및 혼합 인간항체, RPE65 및 ZO-1 항체를 사용하였다.
망막전위도는 세포 이식 후 4, 12, 24주차에 b-wave를 측정하였다.
결과
인간 전분화능줄기세포로부터 망막외곽층세포 분화
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일련의 과정을 모식화 하고 단계별 세포 형태를 나타내었다.
전분화능줄기세포(배아줄기세포 및 유도만능줄기세포 포함)를 망막외곽층세포로 분화시키기 위해서는 신경계 세포로 분화를 유도해야 한다. 초기부터 배양 구조 및 세포배양 배지를 이용하여 신경전구세포 선별배양, 증식배양, 신경특이적 구조물 유도, 신경전구체구 형성 단계를 거쳐 신경전구세포로의 효율적인 분화를 유도하였으며, 신경전구체구는 별도의 분화 신호를 주지 않으면 초기나 반복적인 계대 후에도 신경전구세포의 성질을 유지하는 것을 알 수 있었다(도 2).
최종적으로는 신경전구체구의 두 가지 타입의 구조물만을 분리배양 하여 본 발명의 목적인 시각세포와 망막상피세포가 효율적으로 분화되는 것을 확인하였다.
본 발명은 전분화능줄기세포를 이용한 시각세포 및 망막상피세포 분화에 외부의 세포 전달 신호 활성제 및 억제제와 같은 배지 보충물 없이 배양 방법으로도 분화 효율을 획기적으로 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
망막외곽층세포 분화 최적화
상기 목차 "망막외곽층세포 분화 최적화"의 분화 조건 a)의 경우에는 시각세포의 마커인 Rhodopsin의 발현이 거의 나타나지 않았고(도 3a), b) 배양 조건의 경우에는 낭성 구조물 유래세포만 살아남고 신경전구체구 단일세포는 거의 살아남지 못하는 현상을 확인하였다(도 3b). c) 배양 조건은 신경전구체구 단일세포에서 Rhodopsin의 발현이 나타났으나(도 3c), d) 배양 조건에 비해서는 낮은 경향이 나타났으며 d) 배양 조건에서 Rhodopsin의 발현이 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 3d). e) 배양 조건은 신경전구체구 단일세포에서 Rhodopsin의 발현이 d) 배양 조건과 비슷한 경향이 나타났으나(도 3e), 세포 배양 인서트의 아래 면에 신경전구체구 단일세포를 부착 시켰기 때문에 낭성 구조물 유래의 혼합을 완전 배제 할 수 없고 각각의 회수에 용이하지 못하기 때문에 d) 배양 조건이 망막외곽층세포(시각세포) 분화에 최적임을 알 수 있었다.
전분화능줄기세포 유래 망막외곽층세포의 기능적인 특성 분석
성숙된 시각세포의 세포성 기능과 관련된 특정 분자 마커의 면역세포화학법을 이용하여 확인하였다. 도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이, 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포로부터 분화가 완료된 세포는 blueopsin, redopsin, PDE6b, recoverin, rhodopsin을 발현하고 신경세포의 마커인 βⅢ-tubulin도 함께 발현 되는 것을 확인하였다.
시각세포의 기능 평가를 in vitro에서 할 수 있는 방법은 광전달경로 대사물질 농도를 명소 및 암소에서의 차이 측정을 통해 알 수 있다. 기능을 하는 광전달경로가 있을 경우 cyclic GMP의 농도에 차이가 생기는데 분화된 시각세포를 동일기간 명소와 암소에서 배양 하였을 때 암소보다 명소에서 배양한 세포의 cyclic GMP의 농도가 감소하였고, 포스포디에스터레이즈 억제제(IBMX)를 처리 하였을 때에도 같은 양상을 확인하였다. 이는 본 발명에 의해 분화된 시각세포가 광전달경로를 내재한다는 것이므로 시각세포로 분화가 되었음을 의미 한다(도 4c).
분리배양 기간 동안 시각세포의 특이 단백질인 rhodopsin의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과 분리배양 7일차에 rhodopsin의 mRNA 발현이 가장 높게 확인 되었다. 이러한 결과는, 분리배양 7일째 시각세포의 분화가 이미 높은 수준으로 일어남을 나타내며 21일째는 신경전구세포 마커인 Nestin이 거의 발현되지 않음을 볼 때 대부분의 세포가 분화가 완료되는 것으로 확인된다(도 4d).
망막색소상피세포의 분화 여부를 특정 분자 마커의 면역세포화학법을 이용하여 확인하였다. 도 4e 및 도 4f에서 확인할 수 있듯이, 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포로부터 분화가 완료된 망막색소상피세포가 ZO-1, RPE65, Bestrophin를 발현하는 것을 확인하였다.
망막 퇴화 설치류 모델에서의 SNM 유래 망막외곽층세포 이식에 따른 효능
본 발명을 토대로 분화된 시각세포 및 망막색소상피세포를 망막 퇴화 랫트에 이식하고 12주 후에 생착능을 확인한 결과 DAPI와 함께 인간항체 및 신경세포 마커인 βⅢ-tubulin이 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 망막상피세포 마커인 RPE65와 Bestrophin이 상피세포 마커인 ZO-1과 함께 발현되는 것을 확인하였다(도 5a). 더 나아가, 이식한 세포는 모두 망막외곽층에서 관찰되었기 때문에 이식세포가 높은 생착능을 가지는 것을 알 수 있었다.
망막전위도 측정 결과는 이식군 모두에서 b-wave amplitude가 유지 되는 것을 확인하였고(도 5b), 이식 후 시간이 지남에 따라 시기능이 약간의 감소를 보이나 대조군에 비해 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다. 더불어 시각세포의 이식은 RPE 이식보다 높은 시기능 개선을 보여 주었다(도 5c).
<110> S-Biomedics <120> Methods for Generation of Retinal Outer Layer Cells from Stem Cells and Composition for Preventing or Treating Retinal Diseases Comprising Cells Thereby Generated <130> PN210088 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhodopsin F primer <400> 1 cacaggatgc aatttggagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhodopsin R primer <400> 2 ccttctgtgt ggtggctgac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta III tubulin F primer <400> 3 caacagcacg gccatccagg 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta III tubulin R primer <400> 4 cttggggccc tgggcctccg a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nestin F primer <400> 5 cagctggcgc acctcaagat g 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nestin R primer <400> 6 agggaagttg ggctcaggac tgg 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F primer <400> 7 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R primer <400> 8 tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (12)

  1. 다음 단계를 포함하는 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로의 분화 방법:
    신경전구체구 단일세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일 배지 내에서 함께 배양하는 단계; 및
    신경전구체구로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로 분화시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 공극성 구조물로 상하 이격된 공간 중 상단부 상에 신경전구체구 단일세포를 위치시키고, 하단부 상에 신경전구체구의 낭성 구조물을 위치시켜 배양하는 단계인 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 공극성 구조물은 다공성 메쉬(mesh)인 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 신경전구체구 단일세포는 신경전구체구 유래 비낭성 구조물로부터 분리되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 신경전구체구 낭성 구조물은 신경전구체구 유래 투명낭으로부터 분리되는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 신경전구체구는 줄기세포로부터 분화되는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cells, ESCs), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs), 성체줄기세포(adult stem cells), 핵 치환 배아 줄기세포(somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell) 및 직접 분화법(direct reprogramming)에 의해 생성되는 줄기세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 신경전구체구는 다음의 단계를 통해 줄기세포로부터 분화되는 것인, 방법:
    줄기세포(stem cell)로부터 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계;
    상기 배아체로부터 신경로제트(neural rosette) 및 신경관 유사 구조(neural tube-like structure)를 형성하는 단계; 및
    상기 신경로제트 및 신경관 유사 구조로부터 신경전구체구를 형성하는 단계.
  9. 제1항에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 로돕신(rhodopsin) 및 βⅢ-튜불린의 발현이 증가되거나, 또는 RPE65 및 Bestrophin의 발현이 증가되는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 시각세포(photoreceptor cell), 망막색소상피세포(retinal pigment epithelium cell), 또는 시각세포 및 망막색소상피세포인 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 실명을 개선 또는 예방하는 것인, 방법.
  12. 제1항에 따른 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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