WO2022169209A1 - 줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2022169209A1
WO2022169209A1 PCT/KR2022/001533 KR2022001533W WO2022169209A1 WO 2022169209 A1 WO2022169209 A1 WO 2022169209A1 KR 2022001533 W KR2022001533 W KR 2022001533W WO 2022169209 A1 WO2022169209 A1 WO 2022169209A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
retinal
neural
stem cells
differentiation
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/001533
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조명수
남승택
엄장현
Original Assignee
(주)에스바이오메딕스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)에스바이오메딕스 filed Critical (주)에스바이오메딕스
Priority to EP22749959.7A priority Critical patent/EP4289942A1/en
Priority to CA3207040A priority patent/CA3207040A1/en
Priority to JP2023547114A priority patent/JP2024506286A/ja
Priority to CN202280012758.XA priority patent/CN116783287A/zh
Priority to US18/275,289 priority patent/US20240124837A1/en
Priority to AU2022216137A priority patent/AU2022216137A1/en
Publication of WO2022169209A1 publication Critical patent/WO2022169209A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C12N2502/081—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for differentiation and generation of retinal outer layer cells from spherical neural mass (SNM).
  • SNM spherical neural mass
  • Blindness refers to the absence of wide angle medically, and it is a disease that currently affects tens of millions of patients, 0.2-0.5% of the total population worldwide, causing great personal, social and economic loss.
  • One of the biggest causes of blindness worldwide is degeneration of retinal photoreceptor cells (photoreceptor cells) and retinal pigment epithelial cells, which are caused by congenital factors or various other causes.
  • the visual cell and retinal pigment epithelial cell transplantation method is evaluated to be able to prevent blindness or regenerate damaged vision by delaying or inhibiting retinal degeneration, and improving retinal function after regenerating the degenerated or degenerated retina.
  • BMS Bone marrow stem cell
  • RSC retinal stem cell
  • ESC embryonic stem cell
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • SCNT stem cell nuclear transfer cell
  • human embryonic stem cells Since the first human embryonic stem cell line was established, human embryonic stem cells have the ability to differentiate into a wide variety of cells, and the differentiated cells are a human cell therapy that can treat diseases occurring in various organs. has been proposed to be applicable to In other words, human embryonic stem cells are considered to be strong candidates that can accurately identify their properties and provide abundant supply of cells to replace dysfunctional cells with new cells during clinical treatment. It has been hypothesized that differentiated cells constituting various organs derived from human embryonic stem cells can have the same properties and functions as those cells formed through a normal differentiation process. Based on this possibility, a differentiation induction method that provides an environment similar to the developmental stage has been tried in the differentiation of pancreatic hormone-expressing endocrine cells, neurons, muscle cells, and vascular endothelial cells. In retinal diseases, many attempts have been made to produce visual cells and retinal pigment epithelial cells, which are representative cells of retinal cells, differentiated from human embryonic stem cells, but the results were very poor.
  • the present inventors made intensive research efforts to develop a clinically applicable method of differentiation of outer retinal layer cells, that is, optical cells and retinal pigment epithelial cells.
  • the present invention was completed by identifying the high efficiency of differentiation into optic cells and retinal pigment epithelial cells when single cells of neural progenitor cells and cystic structures of neural progenitors were cultured together in a single medium.
  • an object of the present invention is to provide a method for differentiation from spherical neural mass (SNM) into retinal outer layer cells, comprising the following steps.
  • SNM spherical neural mass
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal diseases comprising the outer retinal layer cells produced by the differentiation method.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating retinal diseases comprising administering to an individual the outer retinal layer cells produced by the differentiation method.
  • Another object of the present invention is to provide a use for the treatment of retinal diseases of the outer retinal layer cells produced by the differentiation method.
  • a method for differentiation from spherical neural mass (SNM) into retinal outer layer cells comprising the steps of:
  • outer retinal layer cells refers to photoreceptor cells and retinal pigmented epithelium cells present in the outer layer among the cells constituting the multi-layered retina.
  • vision cell refers to rod cells and cone cells present in the outer layer of the retina.
  • Photoreceptor cells may be referred to as photoreceptor cells, photoreceptor cells, and the like.
  • retinal pigment epithelial cell refers to a cell constituting the retinal pigment epithelium located in the outermost layer of the retina and in contact with the choroid.
  • neural progenitor cells refers to neural progenitor cells made from pluripotent stem cells such as human embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells or neural progenitor cells isolated from neural tissue aggregated in the form of spheres.
  • the neural precursors used in the present invention may have a size of 300 to 700 ⁇ m. According to an embodiment of the present invention, the neural precursor sphere may have a size of 450 to 550 ⁇ m.
  • Neuronal progenitor single cells can be isolated through the step of single-celling neuronal progenitor cells.
  • the single cellization may include sectioning the neural progenitors using a microsectioning tool.
  • a physical method may be used because the recovery rate is low due to a large amount of damage to the cells.
  • a tool for sectioning any tool that can cut aggregates with a diameter of 500 ⁇ m or less under a dissecting microscope can be used.
  • a metal mesh or the like having a hole in the size can be used.
  • the sectioning was performed using a tungsten wire.
  • fragmented neuroprogenitor cells may be unified using enzymes well-known in the art, such as trypsin-EDTA, dispase, accutase, and collagenase, as an enzyme for cell isolation.
  • enzymes well-known in the art such as trypsin-EDTA, dispase, accutase, and collagenase, as an enzyme for cell isolation.
  • cell unification was performed using Accutase.
  • the sectioned neural progenitor spheres are adherent and cultured for 12-24 hours in a culture medium containing bFGF and N2 additives in a culture dish with a diameter of 60 mm coated with CellStart, then the medium is removed and the accumulator is removed. Add 3-5 ml of Tase and treat for 1-3 hours in an incubator at 37° C. to become single cells.
  • the cystic structure of the neural precursor refers to a transparent sac in the form of a blister present in the neural precursor, and these may protrude from the neural precursor as a transparent sac in the form of a blister or may exist in the form of being entirely surrounded by the transparent sac.
  • the cystic structure of the neural progenitor can be separated using a metal wire and a metal mesh having micrometer ( ⁇ m) sized holes. According to an embodiment of the present invention, the cystic structure of the neural precursors was separated using a tungsten wire.
  • the cystic structure of the neural precursors can be sectioned.
  • This step is a step of culturing the neural precursor single cells and the cystic structure of the neural precursor cells together in a single medium.
  • the culturing step is a step of culturing by placing a single neuronal precursor cell on the upper end of a space spaced up and down with a porous structure, and placing a cystic structure of the neural precursor on the lower end.
  • the porous structure is a porous mesh (mesh).
  • the neural progenitor single cell is isolated from the non-cystic structure of the neural progenitor.
  • the neural precursor cystic construct is separated from the neural precursor-derived transparent sac.
  • the cystic structure of the neural precursors may be sectioned and cultured.
  • the fragment size of the cystic structure of the neural progenitor is not limited.
  • the cystic structure of the neural progenitor cells can be adhered and cultured in DMEM/F12 culture medium with N2 and B27 additives added by putting 15 to 20 cystic structure sections per culture dish in a culture dish coated with CellStart. It is not limited.
  • the cystic structure of the neural precursor sphere is a porous structure and is located on the lower end of the space spaced up and down.
  • Neuronal progenitor single cells can be placed in a cell-start-coated culture dish and 0.5 ⁇ 10 5 to 1.5 ⁇ 10 5 cells are put thereinto, and then cultured together with the cystic structure of the neural precursors for 1-3 weeks, but is not limited thereto.
  • the neural precursor single cell is a porous structure and is located on the upper end of the space spaced up and down.
  • the coating material used in each step may be cell start, but is not limited thereto, and may additionally include an extracellular matrix (ECM) for cell adhesion.
  • ECM extracellular matrix
  • the extracellular matrix can be used alone or in combination with other substances in addition to Cell Start.
  • the neural precursors are differentiated from stem cells.
  • the stem cells are pluripotent stem cells.
  • the stem cells are embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSCs), adult stem cells (adult stem cells), nuclear replacement embryonic stem cells ( somatic cell nuclear transfer embryonic stem cells) and stem cells generated by direct reprogramming.
  • the stem cells are embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells.
  • the neural progenitor cells are differentiated from stem cells through the following steps:
  • the step of forming an embryoid body from a stem cell may be performed for 4-6 days, but is not limited thereto.
  • the step of forming an embryoid body from a stem cell may be performed using an Essential 6 cell culture medium, but is not limited thereto.
  • embryonic body refers to a three-dimensional aggregate of pluripotent stem cells represented by embryonic stem cells, and the pluripotent stem cells can reproduce the differentiation process of the early embryonic development stage through the embryoid body, and endoderm, Differentiation is possible into all tridermal somatic cells of mesoderm and ectoderm.
  • the step of forming a neural rosette and a neural tube-like structure from the embryonic body may be performed for 4-6 days, but is not limited thereto.
  • the step of forming a neural rosette and a neural tube-like structure from the embryonic body may be performed using a cell-start-coated culture dish, but is not limited thereto.
  • DMEM/ It is made by culturing with F12 minimal culture medium for 4-6 days, and then replacing the DMEM/F12 minimal culture medium with 1/2 N2 with DMEM/F12 culture medium with bFGF and N2 added, culturing for 5-10 days.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the culture medium used in this step may be a DMEM/F12 cell culture medium to which bFGF and N2 additives are added, but a culture medium capable of forming/maintaining neural rosettes may be selectively used without limitation.
  • single cells of neural progenitor cells and cystic structures of neural progenitors are cultured together in a single medium, and then, single cells and cystic structures of neural progenitors are differentiated into extraretinal layer cells.
  • the neural precursor is a single cell of a neural precursor, a cystic construct of a neural precursor, or a cystic construct of a single cell and a neural precursor.
  • the outer retinal layer cells are photoreceptors, retinal pigment epithelium, or photoreceptor and retinal pigment epithelium.
  • rhodopsin and ⁇ III-tubulin expression is increased, or RPE65 and Bestrophin expression are increased.
  • the outer retinal layer cells are to improve or prevent blindness.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal diseases comprising the outer retinal layer cells generated by the differentiation method.
  • the retinal disease is retinal dysplasia, retinal degeneration, aged macular degeneration, diabetic retinopathy, retinitis pigmentosa, It is selected from the group consisting of glaucoma, optic neuropathy, trauma, retinal detachment, Leber's congenital amaurosis and congenital retinal atrophy.
  • outer retinal layer cells are the same cells as the outer retinal layer cells described in the differentiation method, the description of the outer retinal layer cells is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
  • the present invention relates to a method for treating a retinal disease comprising administering to an individual the outer retinal layer cells generated by the differentiation method.
  • the "individual” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, refers to mammals such as humans or non-human primates, mice, dogs, cats, horses and cattle.
  • the present invention relates to the use of the outer retinal layer cells produced by the differentiation method for treating retinal diseases.
  • outer retinal layer cells are the same cells as the outer retinal layer cells described in the above-described differentiation method, the description of the outer retinal layer cells is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
  • the present invention provides a method for differentiation from spherical neural mass (SNM) into retinal outer layer cells, and a composition comprising the outer retinal layer cells produced by the differentiation method.
  • SNM spherical neural mass
  • the differentiation method of the present invention it is possible to efficiently differentiate neural progenitor cells into outer retinal layer cells only with neural progenitor cells without other chemical components or other supporting cells in addition to the culture medium and basic culture additives. It can be useful for commercialization.
  • Figure 1a shows a culture dish used for cell morphology and separation culture in each stage of inducing differentiation of outer retinal layer cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1b shows a culture dish used for cell morphology and separation culture in each step of inducing differentiation of outer retinal layer cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3a shows the result of confirming the optimal separation and culture method for the differentiation of the outer retinal layer cells (culture of neural progenitor single cells only).
  • Figure 3b shows the result of confirming the optimal separation and culture method for the differentiation of the outer retinal layer cells (mixed culture of neural progenitor cells and cystic sections).
  • Figure 3c shows the results of confirming the optimal separation and culture method for the differentiation of the outer retinal layer cells (cystic sections in a cell culture insert, single neural progenitor cells in a 6-well cell culture dish for 1 day, and then separate culture).
  • Figure 3d shows the result of confirming the optimal separation culture method for the differentiation of the outer retinal layer cells (neural progenitor single cells in a cell culture insert, cystic sections in a 6-well cell culture dish for 1 day, and then cultured separately).
  • Figure 3e shows the results of confirming the optimal separation culture method for the differentiation of the outer retinal layer cells (neural progenitor single cells on the underside of the cell culture insert, cystic sections cultured in a 6-well cell culture dish for 1 day and then cultured separately).
  • Figure 4a shows the results of confirming whether or not the differentiation of the visual cells differentiated from embryonic stem cells by the expression of markers, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4b shows the results of confirming whether or not the differentiation of photoreceptors differentiated from induced pluripotent stem cells by the expression of markers, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4c shows the result of confirming whether the photon cells are differentiated by measuring the concentration of cyclic GMP, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4d shows the results of confirming the differentiation of photon cells differentiated from embryonic stem cells by rhodopsin, ⁇ III-tubulin, and Nestin gene expression according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4e shows the results of confirming whether retinal epithelial cells differentiated from embryonic stem cells are differentiated with RPE65, Bestrophin, and ZO-1 markers according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4f shows the results of confirming the differentiation of retinal epithelial cells differentiated from induced pluripotent stem cells with RPE65, Bestrophin, and ZO-1 markers according to an embodiment of the present invention.
  • 5A shows the results of confirming the in vivo engraftment of differentiated visual cells and retinal epithelial cells through an animal experiment, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5b is a view showing the conduct of the electroretinal diagram to measure the efficacy of differentiated visual cells and retinal epithelial cells, according to an embodiment of the present invention
  • Figure 5c shows the results of confirming the efficacy of the differentiated visual cells and retinal epithelial cells through electroretinogram measurement, according to an embodiment of the present invention.
  • % used to indicate the concentration of a specific substance is (weight/weight) % for solid/solid, (weight/volume) % for solid/liquid, and Liquid/liquid is (volume/volume) %.
  • hESC human embryonic stem cells
  • Undifferentiated hESCs (SNUhES32) for extraretinal cell differentiation were cultured in Vitronectin (GIBCO, A27940)-coated culture dishes using Essential 8 (GIBCO, A15169-01) culture medium.
  • the undifferentiated stem cells were cultured in the form of colonies.
  • culture for 7 days but if the middle part of the colony is to be induced by differentiation, use a tool made in the shape of a hook to cut the tip of a glass pipette into 20-30 grids, and then cut 100 pieces into Vitronectin-coated It was transferred to a new culture dish and subcultured, and the culture medium was replaced and maintained before 24 hours passed every day from the 3rd to the 7th day.
  • iPSCs Induced pluripotent stem cells
  • hFSiPS1 undifferentiated iPSCs
  • the cells were bound with the primary antibody at 4°C.
  • a secondary antibody suitable for each primary antibody-derived species was used (see Table 1 below).
  • hESCs Undifferentiated human embryonic stem cells
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • hESC human embryonic stem cells
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • DMEM/F12 medium (0.5% N2 substrate, 2 mM L-glutamin, 1% non-essential amino acids (NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin and 0.1 mM beta-mercaptoethanol) for 5 days.
  • DMEM/F12 medium (0.5% N2 substrate, 2 mM L-glutamin, 20ng/ml basic fibroblast growth factor ( bFGF), 1% non-essential amino acids (NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin, and 0.1 mM beta-mercaptoethanol) for 4-7 days.
  • N2bF medium 1% N2 substrate in DMEM/F12 medium, 2 mM L-glutamin, 20ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF) ), 1% non-essential amino acids (NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin, and 0.1 mM beta-mercaptoethanol
  • spherical neural mass SNM
  • SNM subculture was carried out by mechanical cutting using 0.1 mm tungsten wire when the diameter reached about 500 ⁇ m, and subculture was possible without changing the characteristics up to 10 times.
  • Neuroprogenitor-derived cystic constructs were adhered to and cultured on a CellStart-coated 6-well culture dish one day before the separation culture for differentiation into extraretinal cells, and cells unified from the non-cystic structure of the neuroprogenitor cells on a CellStart-coated cell culture insert ( Neuronal progenitor cells (single cells) were adherently cultured.
  • SNM single cellization the fragmented SNM was adhered to a cell start-coated culture dish, and 1 day later, accutase was treated to form single cells.
  • N2B27 cell culture medium was used for cell culture for isolation culture.
  • FIGS. 1A and 1B are diagrams showing the above process in a simple schematic form for each primary and cell form for each stage.
  • Cells that have been differentiated up to SNM were cultured under the following conditions to find optimal culture conditions for the differentiation of extraretinal cells.
  • the above conditions were carried out in a cell-start-coated culture dish, and the cell culture medium was cultured using N2B27 medium.
  • RT-PCR Reverse Transcriptase Amplification Reaction
  • Rhodopsin a marker expressed in visual cells among the outer retinal layer cells, was performed as follows to determine whether the cells were differentiated into extraretinal cells according to the separation and culture time.
  • RNA of differentiated visual cells from SNM was obtained using TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and according to the manufacturer's instruction method (AccuPower RT PreMix; Bioneer, Taejeon, Korea) using AMV reverse transcriptase (RT). Accordingly, cDNA synthesis was performed using oligo-dT as a primer.
  • PCR amplification was performed using Taq Polymerase (HiPi Plus 5x PCR Premix; Elpis biotech, Taejeon, Korea), and a standard method was used. PCR conditions were repeated 30 times after denaturation at 94°C for 5 minutes, 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 10 seconds. To analyze the relative expression with other mRNAs, the amount of cDNA was normalized based on the signal of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • cGMP Enzyme immunoassay kit (GE Healthcare) was used according to the manufacturer's protocol to measure the concentration of light transduction pathway metabolites in extraretinal cells on the 7th day of isolation and culture.
  • Phosphodiesterase inhibitor (IBMX, 50 mM) was treated 48 hours before cGMP measurement.
  • a sterile 1% NaIO 3 saline solution was intravenously injected once (70 mg/kg) into 6-week-old SD rats.
  • the animals were anesthetized by intramuscular injection of tiletamine/zolazepam (Zoletil®) and xylazine.
  • the pupils were dilated with tropicamide 0.5% and phenylephrine HCl 2.5% eye drops (Mydrin-P®) and treated with proparacineHCl 0.5% (Alcaine®) local ophthalmic anesthetic.
  • SNM-derived outer retinal layer cells Prior to transplantation, SNM-derived outer retinal layer cells were incubated with DAPI (10 ⁇ g/ml) for 30 minutes. Washing process was performed several times to remove DAPI from the medium. Isolation was performed by incubation at 37°C under 0.05% trypsin/0.1% EDTA for 5 minutes.
  • each isolated outer retinal layer cells (1x10 5 cells/2 ⁇ l) were injected into the subretinal space or the vitreous cavity using a 26-gauge needle attached to a Hamilton syringe.
  • Cyclosporine A (210 mg/l, Cipol-N®, Chong Kun Dang, Seoul, Korea) was administered to drinking water the day before transplantation before the enucleation procedure.
  • One week after transplantation the eyes were denucleated and flash frozen using an embedding compound (FSC 22®, Leica microsystems, IL).
  • the cooled pieces were washed with PBS and blocked in 3% bovine serum albumin solution in PBS solution containing 0.1% Triton X100. After blocking, the reaction was performed with the primary antibody for 1 day, and for immunohistochemical testing, an Anti-b ⁇ -tub antibody and mixed human antibody, RPE65 and ZO-1 antibodies were used.
  • the electroretinogram was measured by b-wave at 4, 12, and 24 weeks after cell transplantation.
  • FIG. 1a and 1b schematically show a series of processes of the present invention and show the cell morphology step by step.
  • pluripotent stem cells including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells
  • differentiation into cells of the nervous system must be induced. From the beginning, using the culture structure and cell culture medium, efficient differentiation into neural progenitor cells was induced through selective culture of neural progenitor cells, proliferation culture, induction of neural-specific structures, and formation of neural progenitors. If no signal was given, it was found that the properties of neural progenitor cells were maintained even after initial or repeated passage ( FIG. 2 ).
  • neural precursor cells were isolated and cultured to confirm that the objective of the present invention was the efficient differentiation of visual cells and retinal epithelial cells.
  • the present invention confirmed that differentiation efficiency can be remarkably increased even by a culture method without medium supplements such as external cell transduction signal activators and inhibitors for the differentiation of visual cells and retinal epithelial cells using pluripotent stem cells.
  • Rhodopsin in single neuronal progenitor cells showed a similar trend to that of d) culture conditions (Fig. 3e), but the cystic structure was derived because neuroprogenitor single cells were attached to the underside of the cell culture insert.
  • d) It was found that the culture conditions are optimal for the differentiation of the outer retinal layer cells (optical cells) because the mixing of cells cannot be completely excluded and it is not easy to recover each.
  • the method to evaluate the function of visual cells in vitro is to measure the concentration of metabolites in the light transduction pathway by measuring the difference between light and dark.
  • concentration of cyclic GMP When differentiated visual cells were cultured in the light spot and in the dark for the same period, the concentration of cyclic GMP in the cells cultured at the light site than in the dark place was decreased, and phosphodiester The same pattern was confirmed even when treated with a raise inhibitor (IBMX).
  • IBMX raise inhibitor
  • retinal pigment epithelial cells which have been differentiated from embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, express ZO-1, RPE65, and Bestrophin.
  • retinal pigment epithelial cells differentiated based on the present invention were transplanted into retinal degenerated rats, and the engraftment ability was confirmed after 12 weeks. As a result, it was confirmed that human antibody and ⁇ III-tubulin, a neuronal marker, were expressed together with DAPI. In addition, it was confirmed that RPE65 and Bestrophin, which are retinal epithelial cell markers, are expressed together with ZO-1, which is an epithelial cell marker (FIG. 5a). Furthermore, since all the transplanted cells were observed in the outer retinal layer, it was confirmed that the transplanted cells had high engraftment ability.
  • the present invention relates to a method for differentiation and generation of retinal outer layer cells from spherical neural mass (SNM).
  • SNM spherical neural mass

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로의 분화 방법 및 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 분화 방법을 이용하는 경우, 신경전구체구를 효율적으로 망막외곽층세포로 분화시킬 수 있는바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)의 분화 및 생성 방법에 관한 것이다.
본 특허출원은 2021년 02월 02일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2021-0015038호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
실명은 의학적으로 광각이 없는 것을 말하며, 현재 세계적으로 전 인구의 0.2-0.5%인 수천만 명의 환자가 앓고 있는 질환으로, 개인적, 사회적 및 경제적으로 커다란 손실을 가져오고 있다. 전 세계적으로 실명의 가장 큰 원인 중 하나로서 망막의 시각세포(광수용체세포, photoreceptor cell) 및 망막색소상피세포의 변성을 들 수 있는데, 이는 선천적 요인 또는 다른 다양한 원인들에 의해 발생한다. 망막 미형성, 망막 변성(retinal degeneration), 노인성 황반변성(aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환(diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 선천성망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시(leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장(glaucoma), 시신경병증 및 외상 등 많은 질환들이 이 질환에 해당된다. 현재까지 이 질환들에 대한 근본적인 치료를 위한 약물요법은 없으며, 이들 질환의 원인이며 결과인 기능부전의 시각세포 및 망막색소상피세포를 새로운 기능성 세포로 재생하여 이식하는 것이 가장 가능성 있는 치료법으로 여겨지고 있다. 시각세포 및 망막색소상피세포 이식법은 망막 변성을 지연시키거나, 억제하고, 퇴화 또는 변성된 망막을 재생한 후 망막 기능을 향상시켜 실명을 방지하거나 또는 손상된 시력을 재생시킬 수 있을 것으로 평가되고 있다.
골수줄기세포(bone marrow stem cell: BMS), 망막줄기세포(retinal stem cell: RSC), 배아줄기세포(embryonic stem cell: ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC) 및 체세포핵치환줄기세포(somatic cell nuclear transfer cell: SCNT) 등을 이용한 안구 질환의 치료 가능성이 대두되고 있다. 그러나 줄기세포로부터 망막세포로의 분화 및 이를 이용한 세포치료에 대한 연구 성과는 미진한 상태에 있다. 이들 줄기세포로부터 망막세포로의 분화가 가능할 경우 1) 효과적인 세포 치료를 위한 무한한 세포공급이 가능하며, 2) 지금까지 알려지지 않은 배아세포(embryonic cell) 및 망막기원세포(retinal progenitor)로부터의 망막 세포로의 분화 기전이 규명되고, 3) 망막의 분화 관련 유전자 및 분자들의 발견 및 그에 대한 병변 규명과, 4) 망막변성질환의 발생기전 파악, 그리고 5) 망막 변성방지 및 망막 신경보호를 위한 약제 개발에도 이용 가능할 것이다.
최초의 인간 배아줄기세포주가 확립된 이후부터, 인간 배아줄기세포는 매우 다양한 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있으며, 상기 분화된 세포들이 각종 장기에서 발생하는 질환들을 치료할 수 있는 인간 세포치료법에 적용될 수 있을 것으로 제안되어 왔다. 즉, 인간 배아줄기세포는 성상을 정확히 규명할 수 있고, 임상 치료 시 기능부전의 세포를 새로운 세포로 치환하기 위한 세포를 풍부히 공급할 수 있는 강력한 후보자로 여겨지고 있다. 인간 배아줄기세포에서 유도된 각종 장기를 구성하는 분화 세포들은 정상적인 분화 과정을 통해 형성되는 해당 세포들과 동일한 성상 및 기능을 가질 수 있을 것으로 가정되어 왔다. 이 가능성에 기반하여, 발달 단계와 유사한 환경을 제공하는 분화 유도법이 췌장 호르몬-발현 내분비세포, 신경세포, 근육세포, 혈관내피세포분화 등에서 시도되고 있다. 망막 질환에서도 인간 배아줄기세포로부터 분화된, 망막 세포의 대표적인 세포인 시각세포 및 망막색소상피세포를 생산하고자 많은 시도들이 있었으나, 성적은 매우 저조하였다.
현재까지의 가장 큰 성공 중 하나로 보고된 연구결과는 망막 기원세포가 인간 배아줄기세포로부터 효과적으로 유도되었다는 것이나, 유도된 망막 기원세포로부터 시각세포의 분화는 실패하였다 (분화율 0.01% 미만)(Lamba, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 12769-74).
따라서, 임상적으로 적용이 가능한 시각세포 및 망막색소상피세포의 분화 방법의 개발의 필요성이 있다.
본 발명자들은 임상적으로 적용이 가능한 망막외곽층세포 즉, 시각세포 및 망막색소상피세포의 분화 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 신경전구체구 단일세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일 배지 내에서 함께 배양하는 경우, 시각세포 및 망막색소상피세포로의 분화 효율이 높은 점을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 다음 단계를 포함하는 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로의 분화 방법을 제공하는 것이다.
신경전구체구 단일세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일 배지 내에서 함께 배양하는 단계; 및
신경전구체구로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로 분화시키는 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 망막 질환 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포의 망막 질환 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로의 분화 방법을 제공한다:
신경전구체구 단일세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일 배지 내에서 함께 배양하는 단계; 및
신경전구체구로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로 분화시키는 단계.
본 명세서 상의 용어 "망막외곽층세포"는 다층으로 구성된 망막을 구성하는 세포들 중 외곽 층에 존재하는 시각세포(photoreceptor cell)와 망막색소상피세포(retinal pigmented epithelium cell)를 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "시각세포"는 망막의 바깥 층에 존재하는 막대세포(rod cell) 및 원뿔세포(cone cell)를 의미한다. 시각세포는 광수용기 세포, 광수용체세포 등으로 지칭될 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "망막색소상피세포"는 망막의 가장 바깥쪽 층에 위치하며 맥락막(choroid)과 접하고 있는 망막색소상피를 구성하고 있는 세포를 의미한다.
본 명세서 상의 용어 "신경전구체구"는 인간 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포와 같은 전분화능줄기세포로부터 만들어진 신경 전구세포 또는 신경 조직으로부터 분리된 신경 전구세포가 구의 형태로 응집된 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 신경전구체구는 300 내지 700 μm의 크기를 가질 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 상기 신경전구체구는 450 내지 550 μm의 크기를 가질 수 있다.
신경전구체구 단일세포는 신경전구체구를 단일 세포화 하는 단계를 통해 분리될 수 있다. 상기 단일 세포화는 미세 절편 도구를 이용하여 신경전구체구를 절편화하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 세포 분리 효소를 사용하여 절편화하는 경우에는 세포의 손상이 많아 회수율이 적으므로 물리적인 방법이 사용될 수 있다. 절편화를 위한 도구로는 해부 현미경하에서 직경 500μm 이하의 응집물을 자를 수 있는 도구라면 모두 사용이 가능하며, 구체적으로, 유리 파스퇴르 파이펫을 가늘게 뽑은 것, 직경 100μm 이하의 금속선 및 마이크로미터(μm) 크기의 구멍을 갖는 금속 그물망 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 상기 절편화는 텅스텐 와이어를 이용하여 수행하였다.
또한, 상기 절편화된 신경전구체구는 세포 분리용 효소로서, 트립신-EDTA, 디스페이즈, 아큐테이즈 및 콜라게네이즈 등과 같이 통상의 기술분야에 잘 알려진 효소를 이용하여 단일화될 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 세포의 단일화는 아큐테이즈를 이용하여 수행하였다.
본 발명의 실시예에 의하면, 절편화된 신경전구체구는 셀스타트(CellStart)로 코팅된 직경 60mm 배양접시에서 bFGF와 N2 첨가제가 첨가된 배양배지로 12-24시간 부착배양한 후 배지를 제거하고 아큐테이즈 3-5ml을 넣고 37℃ 배양기에서 1-3시간 처리하여 단일세포화 될 수 있다.
신경전구체구의 낭성 구조물은 신경전구체구에 존재하는 물집형태의 투명낭을 의미하며, 이들은 신경전구체구에서 물집형태의 투명낭으로 돌출되거나 전체적으로 투명낭에 둘러싸인 형태로 존재할 수 있다. 상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 금속선 및 마이크로미터(μm) 크기의 구멍을 갖는 금속 그물망 등을 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 텅스텐 와이어를 사용하여 분리하였다.
상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 절편화할 수 있다.
신경전구체구 단일세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일배지 내에서 함께 배양하는 단계
본 단계는 신경전구체구 단일세포와 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일배지 내에서 함께 배양하는 단계이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 배양하는 단계는 공극성 구조물로 상하 이격된 공간 중 상단부 상에 신경전구체구 단일세포를 위치시키고, 하단부 상에 신경전구체구의 낭성 구조물을 위치시켜 배양하는 단계인 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 공극성 구조물은 다공성 메쉬(mesh)인 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 신경전구체구 단일세포는 신경전구체구의 비낭성 구조물로부터 분리되는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 신경전구체구 낭성 구조물은 신경전구체구 유래 투명낭으로부터 분리되는 것이다.
상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 절편화되어 배양할 수 있다. 상기 신경전구체구의 낭성 구조물의 절편 크기는 제한이 없다.
상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 셀스타트(CellStart)가 코팅 된 배양접시에 배양접시 당 15 내지 20개의 낭성 구조물 절편을 넣고 N2, B27 첨가제가 첨가된 DMEM/F12 배양배지에서 부착 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 신경전구체구의 낭성 구조물은 공극성 구조물로 상하 이격된 공간 중 하단부 상에 위치하는 것이다.
신경전구체구 단일세포는 셀스타트가 코팅된 배양접시에 올리고 세포를 0.5Х105 내지 1.5Х105개 넣어준 후 신경전구체구의 낭성 구조물과 함께 1-3주간 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 신경전구체구 단일세포는 공극성 구조물로 상하 이격된 공간 중 상단부상에 위치하는 것이다.
상기 각 단계에서 사용되는 코팅물질은 셀스타트일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 세포부착을 위한 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 추가적으로 포함할 수 있다. 이는 미분화 줄기세포 및 신경세포들은 자력으로 배양 접시에 부착하여 성장할 수 없기 때문에, 세포외기질 또는 다른 지지세포의 도움을 받아야 유지 배양이 가능하기 때문이다.
세포외기질은 셀스타트 외에도 다른 물질 단독 또는 혼합하여 사용 가능하다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 신경전구체구는 줄기세포로부터 분화되는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 줄기세포는 전분화능줄기세포인 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs), 성체줄기세포(adult stem cells), 핵 치환 배아 줄기세포(somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell) 및 직접 분화법(direct reprogramming)에 의해 생성되는 줄기세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포인 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 신경전구체구는 다음의 단계를 통해 줄기세포로부터 분화되는 것이다:
줄기세포(stem cell)로부터 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계;
상기 배아체로부터 신경로제트(neural rosette) 및 신경관 유사 구조(neural tube-like structure)를 형성하는 단계; 및
상기 신경로제트 및 신경관 유사 구조로부터 신경전구체구를 형성하는 단계.
줄기세포(stem cell)로부터 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계는 4-6일간 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
줄기세포(stem cell)로부터 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계는 Essential 6 세포배양 배지를 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "배아체"는 배아줄기세포로 대표되는 전분화능줄기세포의 3차원 집합체를 의미하며, 전분화능줄기세포는 배아체를 통해 초기 배아 발생단계의 분화과정을 재현할 수 있고 내배엽, 중배엽, 외배엽의 모든 삼배엽성 체세포로 분화가 가능하다.
상기 배아체로부터 신경로제트(neural rosette) 및 신경관 유사 구조를 형성하는 단계는 4-6일간 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배아체로부터 신경로제트(neural rosette) 및 신경관 유사 구조를 형성하는 단계는 셀스타트가 코팅 되어있는 배양 접시를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배아체로부터 신경로제트(neural rosette) 및 신경관 유사 구조를 형성하는 단계는 상기 배아체 형성과정으로 형성된 배아체를 셀스타트가 코팅 되어있는 배양 접시에서 1/2 함량의 N2 첨가제만 첨가된 DMEM/F12 최소배양 배지로 4-6일간 배양하여 이루어지며 이후 1/2 N2 첨가 DMEM/F12 최소배양 배지를 bFGF와 N2가 첨가된 DMEM/F12 배양배지로 교체하여 5-10일간 배양하여 증식시킴으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 단계에서 사용되는 배양배지는 bFGF 와 N2 첨가제가 첨가된 DMEM/F12 세포배양 배지일 수 있으나, 신경로제트가 형성/유지 가능한 배양액은 선택적으로 제한 없이 사용될 수 있다.
신경전구체구로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로 분화시키는 단계
본 단계는 신경전구체구 단일세포와 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일 배지 내에서 함께 배양된 후 신경전구체구 단일세포와 낭성 구조물이 망막외곽층세포로 분화되는 단계이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 신경전구체구는 신경전구체구 단일 세포, 신경전구체구의 낭성 구조물, 또는 신경전구체구 단일 세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 시각세포(photoreceptor), 망막색소상피세포(retinal pigment epithelium), 또는 시각세포(photoreceptor) 및 망막색소상피세포(retinal pigment epithelium)이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 로돕신(rhodopsin) 및 βⅢ-튜불린(tubulin) 발현이 증가되는 것이거나, RPE65 및 Bestrophin의 발현이 증가되는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 실명을 개선 또는 예방하는 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 망막 질환은 망막미형성, 망막 변성(retinal degeneration), 노인성 황반변성(aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환(diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 녹내장(glaucoma), 시신경병증, 외상, 망막박리, 레버씨 선천성 흑암시 및 선천성 망막위축증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 망막외곽층세포는 상기 분화 방법에 기재된 망막외곽층세포와 동일한 세포이기 때문에, 망막외곽층세포에 관한 기재는 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 망막 질환 치료방법에 관한 것이다.
상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 마우스(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포의 망막 질환 치료 용도에 관한 것이다.
상기 망막외곽층세포는 상술한 분화 방법에 기재된 망막외곽층세포와 동일한 세포이기 때문에, 망막외곽층세포에 관한 기재는 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
본 발명은 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로의 분화 방법 및 상기 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 분화 방법을 이용하는 경우, 배양배지 및 기본 배양 첨가제 외에 다른 화학적 구성물이나 타 지지세포 없이 신경전구체구만으로 효율적으로 신경전구세포를 망막외곽층세포로 분화시킬 수 있는 바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 망막외곽층세포 분화유도 단계별 세포 형태 및 분리 배양에 사용되는 배양 접시에 대해 나타낸다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 망막외곽층세포 분화유도 단계별 세포형태 및 분리 배양에 사용되는 배양 접시에 대해 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, SNM의 특성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3a는 망막외곽층세포 분화에 최적 분리배양 방법을 확인한 결과를 나타낸다(신경전구체구 단일세포만 배양).
도 3b는 망막외곽층세포 분화에 최적 분리배양 방법을 확인한 결과를 나타낸다(신경전구체구 단일세포와 낭성 절편 혼합 배양).
도 3c는 망막외곽층세포 분화에 최적 분리배양 방법을 확인한 결과를 나타낸다(세포배양 인서트에 낭성 절편, 6-well 세포배양 접시에 신경전구체구 단일세포 1일 배양 후 분리배양).
도 3d는 망막외곽층세포 분화에 최적 분리배양 방법을 확인한 결과를 나타낸다(세포배양 인서트에 신경전구체구 단일세포, 6-well 세포배양 접시에 낭성 절편 1일 배양 후 분리배양).
도 3e는 망막외곽층세포 분화에 최적 분리배양 방법을 확인한 결과를 나타낸다(세포배양 인서트 아래면에 신경전구체구 단일세포, 6-well 세포배양 접시에 낭성 절편 1일 배양 후 분리배양).
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라, 배아줄기세포로부터 분화된 시각세포의 분화 여부를 마커의 발현 여부로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 유도만능줄기세포로부터 분화된 시각세포의 분화 여부를 마커의 발현 여부로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따라, 시각세포의 분화 여부를 cyclic GMP의 농도를 측정하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따라, 배아줄기세포로부터 분화된 시각세포의 분화 여부를 rhodopsin, βⅢ-tubulin, Nestin 유전자 발현으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따라, 배아줄기세포로부터 분화된 망막상피세포의 분화 여부를 RPE65, Bestrophin, ZO-1 마커로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4f는 본 발명의 일 실시예에 따라, 유도만능줄기세포로부터 분화된 망막상피세포의 분화 여부를 RPE65, Bestrophin, ZO-1 마커로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라, 분화된 시각세포 및 망막상피세포의 생체 내 생착을 동물실험을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 분화된 시각세포 및 망막상피세포의 효능을 측정하기 위해 망막전위도를 실시를 나타내는 도면이다
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라, 분화된 시각세포 및 망막상피세포의 효능을 망막전위도 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
인간 배아줄기세포(human Embryonic stem cells, hESC) 배양
망막외곽세포 분화를 위한 미분화된 hESCs(SNUhES32)는 Vitronectin(GIBCO, A27940)코팅 배양 접시에서 Essential 8(GIBCO, A15169-01) 배양액을 사용하여 배양하였다.
이때, 미분화 줄기세포는 콜로니(Colony) 형태로 배양하였다. 7일간 배양을 원칙으로 하되, 콜로니 가운데 부분이 분화로 유도되려 하면 유리 파이펫 끝부분을 갈고리 형태로 만든 도구를 이용하여 20-30개 정도의 격자무늬로 조각내어 100개의 조각을 Vitronectin이 코팅된 새로운 배양 접시에 옮겨 계대배양하고, 3일 째부터 7일 째까지 매일 24시간이 지나기 전에 배양액을 교체하여 유지하였다.
유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem cells, iPSCs) 배양
상기 hESC 배양 방법과 동일한 방법으로, 시각세포 분화를 위한 미분화된 iPSCs(hFSiPS1)를 배양하였다.
면역세포화학(Immunocytochemistry)분석
세포를 4% 파라포름알데하이드 용액에 10분간 고정시켰다.
각각의 항체가 세포질 내로 투과가 잘되게 하기 위하여, 0.1% Trition X-100 (in PBS) 용액으로 15분간 반응시키고, 2% 소혈청알부민 (BSA, in PBS) 용액으로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
그 다음, 일차 항체와 4℃에서 세포를 결합시켰다. 상기 일차 항체가 결합된 세포를 확인하기 위하여 각각의 일차항체 유래 종에 맞는 이차 항체를 사용하였다(하기 표 1 참조).
끝으로, 세포핵을 확인하기 위하여, 4', 6-다이아미노-2-페닐인돌(DAPI)이 포함된 PBS에 10분간 반응시켜 핵 염색을 완료한 후 형광현미경을 사용하여 이미지를 획득하고, 중요 마커들을 확인 및 분석하였다.
단백질
(Protein)		 종
(Species)		 제조사
(Company)		 희석
(Dilution)
Nestin Rabbit Millipore 1:100
Musashi Mouse Chemicon 1:200
Pax6 Rabbit Novus viologicals 1:100
Mouse Chemicon 1:200
βШ-tub Rabbit BioLegend 1:1000
Mouse BioLegend 1:500
SOX1 Rabbit Chemicon 1:200
SOX2 Rabbit Chemicon 1:100
LMX1A Goat Santa Cruz 1:100
Nurr1 Rabbit Chemicon 1:200
Rhodopsin Rabbit Millipore 1:100
Blueopsin Rabbit Chemicon 1:200
Redopsin Rabbit Chemicon 1:100
PDE6b Rabbit abcam 1:50
Recoverin Rabbit Chemicon 1:100
ZO-1 Rabbit Zymed 1:200
RPE65 Mouse Novus biological 1:200
Bestrophin Mouse Novus biological 1:200
인간 전분화능줄기세포에서 망막외곽세포로의 분화
전분화능줄기세포주인 미분화된 인간배아줄기세포(hESC) 또는 유도만능줄기세포(iPSC)를 해동 시점부터 2회 계대배양을 진행하여 안정화시키고 3회째 계대배양 후 7일간 배양을 유지하였다.
7일 배양된 인간배아줄기세포(hESC) 또는 유도만능줄기세포(iPSC)(전분화능줄기세포)의 배양액을 제거하고 DPBS(-)로 한 번 수세 한 뒤 디스페이즈 1ml을 넣고 37℃ 배양기에서 3분간 반응시켜 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 배아체(Embryoid body, EB) 형성을 위하여 페트리 배양접시에 EB배지(Essential 6, 0.5% penicillin, streptomycin)에서 5일간 배양하였다.
EB 5일차에 신경성 세포들만 자랄 수 있도록 EB를 셀스타트 코팅 dish 옮겨 신경 선택 배지인 DMEM/F12배지(0.5% N2 substrate, 2 mM L-glutamin, 1% non-essential amino acids(NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin, 0.1 mM beta-mercaptoethanol 포함)에서 5일간 배양하였다. 추가적으로, 신경로제트(Neural rosette)와 신경관 유사 구조(Neural tube like structure)형성 및 증식을 위해 증식 배지인 DMEM/F12배지(0.5% N2 substrate, 2 mM L-glutamin, 20ng/ml basic fibroblast growth factor(bFGF), 1% non-essential amino acids(NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin, 0.1 mM beta-mercaptoethanol 포함)에서 4-7일간 배양하여 증식하였다.
이후 신경로제트(Neural rosette)와 신경관 유사 구조(Neural tube like structure)형성 및 증식을 위해 N2bF배지(DMEM/F12 배지에 1% N2 substrate, 2 mM L-glutamin, 20ng/ml basic fibroblast growth factor(bFGF), 1% non-essential amino acids(NEAA), 0.5% penicillinstreptomycin, 0.1 mM beta-mercaptoethanol 포함)에서 10~14일간 배양하였다.
배양 기간 동안 신경로제트 및 신경관 유사 구조가 관찰되면 유리 파스퇴르피펫을 가늘게 뽑은 도구를 이용하여 바닥에서 떼어 절단하였고, 이 후 petri-dish에 옮겨 N2bF 배지에서 배양하여 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로 형성되게 하였다.
SNM 계대배양은 직경이 500 μm정도가 되면 0.1 mm텅스텐 wire를 이용하여 기계적으로 절단하는 방법으로 진행하였으며, 최대 10번까지 특성이 변하지 않고 계대가 가능하였다.
망막외곽세포로의 분화를 위한 분리배양 1일전 셀스타트 코팅 6-well 배양접시에 신경전구체구 유래 낭성 구조물을 부착 배양하였고, 셀스타트 코팅 세포 배양 인서트에 신경전구체구 비낭성 구조물로부터 단일화한 세포 (신경전구체구 단일세포)를 부착 배양하였다. SNM 단일세포화는 절편화한 SNM을 셀스타트 코팅 배양 접시에 부착배양하고 1일 뒤 accutase를 처리하여 단일세포화 하였다. 분리배양을 위한 세포 배양에는 N2B27 세포배양 배지를 사용하였다.
분리배양은 낭성 구조물 절편이 배양되어 있는 6-well 배양접시에 단일세포화한 신경전구체구 단일세포가 배양되어 있는 세포 배양 인서트를 넣어 진행하였고, 세포 배양에는 N2B27 세포배양 배지를 사용하였으며, 분리배양 3주 동안 분화가 종료될 때까지 2일에 한 번씩 배지를 교체해 주었다.
도 1a 및 도 1b는 상기의 과정을 일차 별 간단한 모식화 및 단계 별 세포 형태로 나타낸 도이다.
망막외곽세포 분화 최적화
SNM까지 분화가 완료된 세포로 망막외곽세포 분화에 최적화된 배양조건을 찾기 위해 다음과 같은 조건의 배양을 진행하였다.
a) SNM 세포만 배양,
b) SNM 세포와 낭성 절편 혼합 배양,
c) 세포배양 인서트에 낭성 절편, 6-well 세포배양 접시에 SNM 단일세포 1일 배양 후 분리배양,
d) 세포배양 인서트에 SNM 단일세포, 6-well 세포배양 접시에 낭성 절편 1일 배양 후 분리배양,
e) 세포배양 인서트 아래 면에 SNM 단일세포, 6-well 세포배양 접시에 낭성 절편 1일 배양 후 분리배양.
상기의 조건은 셀스타트 코팅이 된 배양접시에서 진행되었으며, 세포 배양 배지는 N2B27 배지를 이용하여 배양하였다.
역전사중합효소 증폭반응(RT-PCR)
분리배양 시간에 따라 망막외곽세포로의 분화 여부를 확인하기 위해 망막외곽층세포중 시각세포에서 발현되는 마커인 Rhodopsin의 전사 수준에서의 발현에 대한 RT-PCR 분석을 다음과 같이 수행하였다.
TRIzol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 SNM으로부터 분화된 시각세포의 RNA를 획득하였으며, AMV reverse transcriptase(RT)를 이용하는 제조자의 지시방법(AccuPower RT PreMix; Bioneer, Taejeon, Korea)에 따라 oligo-dT를 프라이머로 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다.
PCR 증폭은 Taq Polymerase(HiPi Plus 5x PCR Premix; Elpis biotech, Taejeon, Korea)를 이용하여 수행하였으며, 표준 방식을 사용하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 변성 후 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 10초를 30회 반복하였다. 다른 mRNA 들과의 상대적인 발현을 분석하기 위해서 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA의 신호에 기초하여 cDNA의 양을 표준화하였다.
다양한 조건의 어닐링 온도와 싸이클 횟수를 반복 실험한 결과 비례적으로 증폭되는 구간이 각각의 프라이머 쌍들에 대해서 결정되고 PCR 조건은 최적화되었다.
유전자 발현 분석에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
유전자명 유전자방향 염기서열 서열번호
Rhodopsin Forward 5'-CACAGGATGCAATTTGGAGG-3' 서열번호 1
Reverse 5'-CCTTCTGTGTGGTGGCTGAC-3' 서열번호 2
βⅢ tubulin Forward 5'-CAACAGCACGGCCATCCAGG-3' 서열번호 3
Reverse 5'-CTTGGGGCCCTGGGCCTCCGA-3' 서열번호 4
Nestin Forward 5'-CAGCTGGCGCACCTCAAGATG-3' 서열번호 5
Reverse 5'-AGGGAAGTTGGGCTCAGGACTGG-3' 서열번호 6
GAPDH Forward 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 서열번호 7
Reverse 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' 서열번호 8
광전달 경로대사물질 농도 측정법
cGMP Enzyme immunoassay kit(GE Healthcare)으로 분리배양 7일차의 망막외곽세포에서 광전달경로 대사물질 농도를 측정하기 위해 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하였다. 포스포디에스터레이즈 억제제(IBMX, 50 mM)는 cGMP 측정 48시간 전에 처리하였다.
망막 퇴화 설치류 모델에서의 SNM 유래 망막외곽층세포 이식
6주령의 SD 랫트에 멸균된 1% NaIO3 살린용액을 1회 정맥 주사하였다(70 mg/kg). 정맥 주사 4일 후 동물들은 tiletamine/zolazepam(Zoletil®)과 xylazine의 근육 주사를 통해 마취 처리하였다.
동공은 tropicamide 0.5%와 phenylephrine HCl 2.5% eye drops(Mydrin-P®)에 의해 확장되었고 proparacineHCl 0.5%(Alcaine®) 국부 안약 마취제를 처리하였다.
이식 전에, SNM 유래 망막외곽층세포는 DAPI(10μg/ml)와 함께 30분간 배양되었다. 배지에서 DAPI를 제거하기 위하여 여러 번 세척과정을 수행하였고. 37℃, 0.05% trypsin/0.1% EDTA 하에서 5분 동안 배양함으로써 분리하였다.
수술 현미경을 통해 시각화하고 분리된 각각의 망막외곽층세포(1x105 cells/2μl)를 Hamilton syringe에 부착된 26-gauge 바늘을 이용하여 망막하 공간 또는 유리체강에 주입하였다.
사이클로스포린 A(Cyclosporine A)(210 mg/l, Cipol-N®, Chong Kun Dang, Seoul, Korea)은 이식 하루 전날 탈핵 과정 전까지 식수에 투여하였다. 이식 1주일 후, 안구를 탈핵화하고 embedding compound(FSC 22®, Leica microsystems, IL)를 이용하여 급속 동결 처리하였다.
냉각 편을 PBS로 세척하고 0.1% Triton X100를 포함하는 PBS 용액의 3% bovine serum albumin solution에서 블로킹 하였다. 블로킹 후에는 1차 항체와 함께 1일 동안 반응하였으며 면역 조직 화학적 검사를 위하여 항체는 Anti-bШ-tub항체 및 혼합 인간항체, RPE65 및 ZO-1 항체를 사용하였다.
망막전위도는 세포 이식 후 4, 12, 24주차에 b-wave를 측정하였다.
결과
인간 전분화능줄기세포로부터 망막외곽층세포 분화
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일련의 과정을 모식화 하고 단계별 세포 형태를 나타내었다.
전분화능줄기세포(배아줄기세포 및 유도만능줄기세포 포함)를 망막외곽층세포로 분화시키기 위해서는 신경계 세포로 분화를 유도해야 한다. 초기부터 배양 구조 및 세포배양 배지를 이용하여 신경전구세포 선별배양, 증식배양, 신경특이적 구조물 유도, 신경전구체구 형성 단계를 거쳐 신경전구세포로의 효율적인 분화를 유도하였으며, 신경전구체구는 별도의 분화 신호를 주지 않으면 초기나 반복적인 계대 후에도 신경전구세포의 성질을 유지하는 것을 알 수 있었다(도 2).
최종적으로는 신경전구체구의 두 가지 타입의 구조물만을 분리배양 하여 본 발명의 목적인 시각세포와 망막상피세포가 효율적으로 분화되는 것을 확인하였다.
본 발명은 전분화능줄기세포를 이용한 시각세포 및 망막상피세포 분화에 외부의 세포 전달 신호 활성제 및 억제제와 같은 배지 보충물 없이 배양 방법으로도 분화 효율을 획기적으로 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
망막외곽층세포 분화 최적화
상기 목차 "망막외곽층세포 분화 최적화"의 분화 조건 a)의 경우에는 시각세포의 마커인 Rhodopsin의 발현이 거의 나타나지 않았고(도 3a), b) 배양 조건의 경우에는 낭성 구조물 유래세포만 살아남고 신경전구체구 단일세포는 거의 살아남지 못하는 현상을 확인하였다(도 3b). c) 배양 조건은 신경전구체구 단일세포에서 Rhodopsin의 발현이 나타났으나(도 3c), d) 배양 조건에 비해서는 낮은 경향이 나타났으며 d) 배양 조건에서 Rhodopsin의 발현이 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 3d). e) 배양 조건은 신경전구체구 단일세포에서 Rhodopsin의 발현이 d) 배양 조건과 비슷한 경향이 나타났으나(도 3e), 세포 배양 인서트의 아래 면에 신경전구체구 단일세포를 부착시켰기 때문에 낭성 구조물 유래의 혼합을 완전 배제할 수 없고 각각의 회수에 용이하지 못하기 때문에 d) 배양 조건이 망막외곽층세포(시각세포) 분화에 최적임을 알 수 있었다.
전분화능줄기세포 유래 망막외곽층세포의 기능적인 특성 분석
성숙된 시각세포의 세포성 기능과 관련된 특정 분자 마커의 면역세포화학법을 이용하여 확인하였다. 도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이, 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포로부터 분화가 완료된 세포는 blueopsin, redopsin, PDE6b, recoverin, rhodopsin을 발현하고 신경세포의 마커인 βⅢ-tubulin도 함께 발현되는 것을 확인하였다.
시각세포의 기능 평가를 in vitro에서 할 수 있는 방법은 광전달경로 대사물질 농도를 명소 및 암소에서의 차이 측정을 통해 알 수 있다. 기능을 하는 광전달경로가 있을 경우 cyclic GMP의 농도에 차이가 생기는데 분화된 시각세포를 동일기간 명소와 암소에서 배양하였을 때 암소보다 명소에서 배양한 세포의 cyclic GMP의 농도가 감소하였고, 포스포디에스터레이즈 억제제(IBMX)를 처리하였을 때에도 같은 양상을 확인하였다. 이는 본 발명에 의해 분화된 시각세포가 광전달경로를 내재한다는 것이므로 시각세포로 분화가 되었음을 의미한다(도 4c).
분리배양 기간 동안 시각세포의 특이 단백질인 rhodopsin의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과 분리배양 7일차에 rhodopsin의 mRNA 발현이 가장 높게 확인되었다. 이러한 결과는, 분리배양 7일째 시각세포의 분화가 이미 높은 수준으로 일어남을 나타내며 21일째는 신경전구세포 마커인 Nestin이 거의 발현되지 않음을 볼 때 대부분의 세포가 분화가 완료되는 것으로 확인된다(도 4d).
망막색소상피세포의 분화 여부를 특정 분자 마커의 면역세포화학법을 이용하여 확인하였다. 도 4e 및 도 4f에서 확인할 수 있듯이, 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포로부터 분화가 완료된 망막색소상피세포가 ZO-1, RPE65, Bestrophin를 발현하는 것을 확인하였다.
망막 퇴화 설치류 모델에서의 SNM 유래 망막외곽층세포 이식에 따른 효능
본 발명을 토대로 분화된 시각세포 및 망막색소상피세포를 망막 퇴화 랫트에 이식하고 12주 후에 생착능을 확인한 결과 DAPI와 함께 인간항체 및 신경세포 마커인 βⅢ-tubulin이 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 망막상피세포 마커인 RPE65와 Bestrophin이 상피세포 마커인 ZO-1과 함께 발현되는 것을 확인하였다(도 5a). 더 나아가, 이식한 세포는 모두 망막외곽층에서 관찰되었기 때문에 이식세포가 높은 생착능을 가지는 것을 알 수 있었다.
망막전위도 측정 결과는 이식군 모두에서 b-wave amplitude가 유지되는 것을 확인하였고(도 5b), 이식 후 시간이 지남에 따라 시기능이 약간의 감소를 보이나 대조군에 비해 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다. 더불어 시각세포의 이식은 RPE 이식보다 높은 시기능 개선을 보여주었다(도 5c).
본 발명은 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)의 분화 및 생성 방법에 관한 것이다.

Claims (12)

  1. 다음 단계를 포함하는 신경전구체구(spherical neural mass, SNM)로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로의 분화 방법:
    신경전구체구 단일세포 및 신경전구체구의 낭성 구조물을 단일 배지 내에서 함께 배양하는 단계; 및
    신경전구체구로부터 망막외곽층세포(retinal outer layer cells)로 분화시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 공극성 구조물로 상하 이격된 공간 중 상단부 상에 신경전구체구 단일세포를 위치시키고, 하단부 상에 신경전구체구의 낭성 구조물을 위치시켜 배양하는 단계인 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 공극성 구조물은 다공성 메쉬(mesh)인 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 신경전구체구 단일세포는 신경전구체구 유래 비낭성 구조물로부터 분리되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 신경전구체구 낭성 구조물은 신경전구체구 유래 투명낭으로부터 분리되는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 신경전구체구는 줄기세포로부터 분화되는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cells, ESCs), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs), 성체줄기세포(adult stem cells), 핵 치환 배아 줄기세포(somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell) 및 직접 분화법(direct reprogramming)에 의해 생성되는 줄기세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 신경전구체구는 다음의 단계를 통해 줄기세포로부터 분화되는 것인, 방법:
    줄기세포(stem cell)로부터 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계;
    상기 배아체로부터 신경로제트(neural rosette) 및 신경관 유사 구조(neural tube-like structure)를 형성하는 단계; 및
    상기 신경로제트 및 신경관 유사 구조로부터 신경전구체구를 형성하는 단계.
  9. 제1항에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 로돕신(rhodopsin) 및 βⅢ-튜불린의 발현이 증가되거나, 또는 RPE65 및 Bestrophin의 발현이 증가되는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 시각세포(photoreceptor cell), 망막색소상피세포(retinal pigment epithelium cell), 또는 시각세포 및 망막색소상피세포인 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 망막외곽층세포는 실명을 개선 또는 예방하는 것인, 방법.
  12. 제1항에 따른 분화 방법으로 생성된 망막외곽층세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
PCT/KR2022/001533 2021-02-02 2022-01-27 줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물 WO2022169209A1 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22749959.7A EP4289942A1 (en) 2021-02-02 2022-01-27 Method for inducing and preparing retinal outer layer cells from stem cells, and composition for preventing or treating retinal diseases, containing cells prepared thereby
CA3207040A CA3207040A1 (en) 2021-02-02 2022-01-27 Method for inducing and preparing retinal outer layer cells from stem cells, and composition for preventing or treating retinal diseases, containing cells prepared thereby
JP2023547114A JP2024506286A (ja) 2021-02-02 2022-01-27 幹細胞から網膜外層細胞の誘導生成方法及びそれによって生成された細胞を含む網膜疾患予防又は治療用組成物
CN202280012758.XA CN116783287A (zh) 2021-02-02 2022-01-27 从干细胞诱导生成视网膜外层细胞的方法及包含通过该方法生成的细胞的用于预防或治疗视网膜疾病的组合物
US18/275,289 US20240124837A1 (en) 2021-02-02 2022-01-27 Method for inducing and preparing retinal outer layer cells from stem cells, and composition for preventing or treating retinal diseases, containing cells prepared thereby
AU2022216137A AU2022216137A1 (en) 2021-02-02 2022-01-27 Method for inducing and preparing retinal outer layer cells from stem cells, and composition for preventing or treating retinal diseases, containing cells prepared thereby

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0015038 2021-02-02
KR1020210015038A KR20220111822A (ko) 2021-02-02 2021-02-02 줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022169209A1 true WO2022169209A1 (ko) 2022-08-11

Family

ID=82742323

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/001533 WO2022169209A1 (ko) 2021-02-02 2022-01-27 줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240124837A1 (ko)
EP (1) EP4289942A1 (ko)
JP (1) JP2024506286A (ko)
KR (1) KR20220111822A (ko)
CN (1) CN116783287A (ko)
AU (1) AU2022216137A1 (ko)
CA (1) CA3207040A1 (ko)
WO (1) WO2022169209A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110037907A (ko) * 2009-10-06 2011-04-13 서울대학교산학협력단 줄기세포를 망막세포로 분화시키는 방법
KR20130048468A (ko) * 2011-11-02 2013-05-10 제일약품주식회사 낭성구조물로부터 망막색소상피세포의 분화를 유도하는 방법
CN111094554A (zh) * 2017-09-14 2020-05-01 国立研究开发法人理化学研究所 视网膜组织的制备方法
KR20210015038A (ko) 2019-07-31 2021-02-10 (주)케이아이오티 빅데이터 분석을 이용한 차량 노면소음 감소장치

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110037907A (ko) * 2009-10-06 2011-04-13 서울대학교산학협력단 줄기세포를 망막세포로 분화시키는 방법
KR20130048468A (ko) * 2011-11-02 2013-05-10 제일약품주식회사 낭성구조물로부터 망막색소상피세포의 분화를 유도하는 방법
CN111094554A (zh) * 2017-09-14 2020-05-01 国立研究开发法人理化学研究所 视网膜组织的制备方法
KR20210015038A (ko) 2019-07-31 2021-02-10 (주)케이아이오티 빅데이터 분석을 이용한 차량 노면소음 감소장치

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Ph.D. Thesis", 1 August 2015, SEOUL NATIONAL UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL: MEDICINE AND OPHTHALMOLOGY, Korea, article PARK JUNG HYUN: "Subretinal transplantation of photoreceptor precursors and retinal pigment epithelium derived from human embryonic stem cells in retinal degeneration rats", pages: 1 - 62, XP055956954 *
LAMBA, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 103, 2006, pages 12769 - 74
SHIN JOO YOUNG, DAEJOONG MA, MI-SUN LIM, MYUNG SOO CHO, YOUNG JOO KIM, HYEONG GON YU: "Embryonic stem cell-derived photoreceptor precursor cells differentiated by coculture with RPE cells", MOLECULAR VISION, MOLECULAR VISION, US, vol. 27, 9 May 2021 (2021-05-09), US , pages 288 - 299, XP055956958, ISSN: 1090-0535 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20240124837A1 (en) 2024-04-18
KR20220111822A (ko) 2022-08-10
EP4289942A1 (en) 2023-12-13
JP2024506286A (ja) 2024-02-13
CA3207040A1 (en) 2022-08-11
CN116783287A (zh) 2023-09-19
AU2022216137A1 (en) 2023-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11421203B2 (en) Method of producing human retinal pigment epithelial cells
US9157062B2 (en) Compositions and methods for promoting the generation of PDX1+ pancreatic cells
US11746324B2 (en) Large scale production of retinal pigment epithelial cells
JP6864670B2 (ja) 網膜色素上皮細胞の調製法
AU2003246176B2 (en) Process for producing nerve cells
US20110086379A1 (en) Method of Differentiating Stem Cells
US20150147301A1 (en) Methods and compositions of producing patient-specific multipotent neuronal stem cells
US9708582B2 (en) Method of differentiating stem cells
CN108699525A (zh) 视网膜色素上皮细胞的制备
WO2017179767A1 (ko) 지방줄기세포에서 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포로의 분화 유도 방법, 및 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포로부터 성장인자를 다량 분비하는 인간 줄기세포의 분화 유도 방법
WO2015016420A1 (ko) 직접 리프로그래밍을 통한 유도 도파민성 전구세포 제조방법
US9487751B2 (en) Method to isolate, identify, and use embryonic stem cells directed to forebrain interneuron fate
WO2013065914A1 (ko) 낭성구조물로부터 망막색소상피세포로의 분화 유도 방법
WO2022169209A1 (ko) 줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물
JP2023500830A (ja) 網膜色素上皮細胞を生成するための方法
WO2019147025A1 (ko) Rad51 활성화제를 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달률을 향상시키는 방법
WO2021125844A1 (ko) 인간 만능 줄기세포로부터 제작된 3d 오가노이드를 해체하여 희소돌기아교세포를 다량 확보하는 분화방법
CN110004112A (zh) 一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂ii期的卵母细胞的方法
WO2021125839A1 (ko) 인간 만능 줄기세포로부터 3d 오가노이드를 이용하여 미세교세포를 다량 확보하는 미세교세포의 분화방법
WO2024043521A1 (ko) 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 이용한 폐포 오가노이드 제작 방법
WO2021060637A1 (ko) 줄기세포로부터 도파민 신경전구세포 분화 유도 방법
WO2023177181A1 (ko) 돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물
WO2020085527A1 (ko) 소포체 스트레스 완화제를 이용한 생체 외 배양 간세포 제조방법 및 이를 통해 마련된 생체 외 배양 간세포
US20130280218A1 (en) Methods of obtaining cell populations enriched with desired cells
Klimanskaya Retinal pigment epithelium derived from embryonic stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22749959

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3207040

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18275289

Country of ref document: US

Ref document number: 202280012758.X

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023547114

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022216137

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022749959

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022749959

Country of ref document: EP

Effective date: 20230904

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022216137

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20220127

Kind code of ref document: A