WO2024043521A1 - 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 이용한 폐포 오가노이드 제작 방법 - Google Patents

폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 이용한 폐포 오가노이드 제작 방법 Download PDF

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김성원
조아영
임민재
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가톨릭대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing alveolar organoids using induced pluripotent stem cells derived from human alveolar cells.
  • Organoids are mini-organs created by culturing or recombining cells isolated from stem cells or organ cells. They are characterized by being able to differentiate as close to actual tissues as possible based on having a structure and function very similar to each organ.
  • type 2 alveolar cells constitute ⁇ 7% of alveolar epithelial cells (The Formation of Pulmonary Alveoli; Stephen E. McGowan; in The Lung (Second Edition) , 2014), plays a role in preventing collapse by producing surfactant protein and maintaining lung function and surface tension.
  • type 2 alveolar cells have the same phenotype as type 1 alveolar cells, making them difficult to culture, and maintaining type 2 alveolar cells in human lung tissue is difficult.
  • the present inventors produced alveolar organoids using induced pluripotent stem cells derived from human alveolar cells and developed a medium suitable for producing alveolar organoids.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for producing alveolar organoids from alveolar cell-derived induced pluripotent stem cells.
  • Another object of the present invention is to provide an alveolar organoid produced by the method for producing an alveolar organoid according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for producing alveolar organoids.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for producing alveolar organoids.
  • Another object of the present invention is to provide a tissue therapeutic agent comprising the alveolar organoid according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method of screening for a therapeutic agent for lung-related diseases using the alveolar organoid according to the present invention.
  • the present invention provides a method for producing alveolar organoids from alveolar cell-derived induced pluripotent stem cells comprising the following steps:
  • step b) inducing differentiation of the endoderm cells of step a) into anterior foregut endoderm cells in AFM (Anterior Foregut endoderm Media) medium;
  • step b) inducing differentiation of the anterior foregut endoderm cells of step b) into alveolar progenitors in a progenitor differentiation medium;
  • step d) Culturing the alveolar precursor of step c) in AM (Alveolar Media) medium.
  • the alveolar cells may be type 2 alveolar cells, but are not limited thereto.
  • the AFM medium includes Ham's F12, dexamethasone, IBMX (3-Isobutyl-methylxanthine), B27 supplement, N2 supplement, BSA (Bovine serum albumin), HEPES (Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), and calcium chloride (CaCl 2 ), may include one or more selected from the group consisting of 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, Anti Antibiotic-Antimycotic, Ascobic acid, Glutamax, Recombinant Human BMP4, and CHIR99021, but is limited thereto. It doesn't work.
  • the AM medium contains Ham's F12, dexamethasone, IBMX (3-Isobutyl-methylxanthine), B27 supplement, N2 supplement, BSA (Bovine serum albumin), HEPES (Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), and calcium chloride ( It may include, but is not limited to, one or more selected from the group consisting of CaCl 2 ), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, and Antibiotic-Antimycotic.
  • steps b) to d) may be performed by a three-dimensional culture method, but are not limited thereto.
  • kits for producing alveolar organoids including a medium for inducing endoderm cell differentiation, Anterior Foregut endoderm Media (AFM) medium, precursor differentiation medium, and Alveolar Media (AM) medium.
  • AFM Anterior Foregut endoderm Media
  • AM Alveolar Media
  • the kit may further include instructions describing a method of producing alveolar organoids from alveolar cell-derived induced pluripotent stem cells according to the present invention, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for producing alveolar organoids.
  • the present invention provides an alveolar organoid produced by the method for producing an alveolar organoid according to the present invention.
  • tissue therapeutic agents comprising alveolar organoids according to the present invention
  • the present invention provides a method for preventing or treating lung-related diseases, comprising administering and/or transplanting the alveolar organoid according to the present invention to an individual in need thereof.
  • the present invention provides a use of the alveolar organoid according to the present invention for preventing or treating lung-related diseases.
  • the present invention provides the use of the alveolar organoid according to the present invention for producing a therapeutic agent for lung-related diseases.
  • the present invention provides a method of screening for a therapeutic agent for lung-related diseases using the alveolar organoid according to the present invention.
  • the method includes treating the organoid with a test substance; And if the expression of a biomarker protein for a lung-related disease or mRNA encoding the same increases or decreases after treatment of the test material compared to before treatment, it may include the step of selecting the test material as a treatment for a lung-related disease. , but is not limited to this.
  • the lung-related diseases include cystic fibrosis, respiratory distress syndrome, acute respiratory distress syndrome, pulmonary tuberculosis, cough, bronchial asthma, cough based on increased airway hyperresponsiveness, influenza syndrome, cough suppression, and airway hyperresponsiveness.
  • tuberculosis disease asthma, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, reversible airway obstruction, adult respiratory disease syndrome, pigeon breeder's disease, farmer's lung, bronchopulmonary dysplasia, airway disease, emphysema, allergic organ.
  • Banknotes may be selected from the group consisting of aspergillosis, allergic bronchitis bronchiectasis, occupational asthma, reactive airway disease syndrome, interstitial lung disease, and parasitic lung disease.
  • the alveolar organoid prepared according to the present invention is differentiated from induced pluripotent stem cells derived from human alveolar cells, and can be repeatedly and efficiently differentiated into alveolar organoids due to the epigenetic memory of alveolar cells, and can be differentiated into actual alveolar organoids. Since it can be reproduced similarly, it is expected to be useful for research into the pathogenesis of respiratory diseases and screening to discover therapeutic drugs.
  • Figure 1 is a diagram showing the process of producing induced pluripotent stem cells (iPSCs) by reprogramming human alveolar cells (AT2 cells).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • Figure 2 shows the results of analyzing the protein characteristics of induced pluripotent stem cells (iPSCs) produced by reprogramming human alveolar cells (AT2 cells) using immunofluorescence staining.
  • the iPSCs undifferentiation markers Oct3/4, NANOG, and a diagram showing the relative expression level of LIN28 with respect to AT2 cells (left), and a diagram showing the results of observing the expression of Oct3/4, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81 using a confocal microscope (right) )am.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of observing the differentiation process of alveolar organoids from induced pluripotent stem cells (iPSCs) produced by reprogramming human alveolar cells (AT2 cells) using an optical microscope.
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • Figure 4 is a schematic diagram showing a protocol for differentiating alveolar organoids from induced pluripotent stem cells (iPSCs) prepared by reprogramming human alveolar cells (AT2 cells).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • Figure 5 shows using immunofluorescence staining to confirm whether induced pluripotent stem cells (iPSCs) produced by reprogramming human alveolar cells (AT2 cells) were differentiated into endoderm, using SOX17 and FOXA2, which are characteristic factors of endoderm.
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • Figure 6 is a diagram showing the results of observing the differentiation process of alveolar organoids from induced pluripotent stem cells (iPSCs) produced by reprogramming human alveolar cells (AT2 cells) using immunofluorescence staining.
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • the present invention provides a method for producing alveolar organoids from alveolar cell-derived induced pluripotent stem cells comprising the following steps:
  • step b) inducing differentiation of the endoderm cells of step a) into anterior foregut endoderm cells in AFM (Anterior Foregut endoderm Media) medium;
  • step b) inducing differentiation of the anterior foregut endoderm cells of step b) into alveolar progenitors in a progenitor differentiation medium;
  • step d) Culturing the alveolar precursor of step c) in AM (Alveolar Media) medium.
  • organoid refers to a three-dimensional assembly of one or more cell types that mimics the superficial appearance or actual structure or function of a tissue or organ.
  • the alveolar cells may be type 2 alveolar cells (AT2 cells), but are not limited thereto.
  • the type 2 alveolar cells may be isolated from lung tissue, subcultured after isolation, or commercially purchased, but are not limited thereto.
  • lung tissue includes all lung tissue structures and associated tissues, including but not limited to veins, arteries, blood vessels, capillaries, and types of cells that are part of or associated with such structures; lung and pleural tissue; and vascular smooth muscle, pericyte, and vascular endothelial lineages and/or phenotypes.
  • the lung tissue may be isolated from a mammal, such as a human, mouse, rat, guinea pig, rabbit, monkey, pig, horse, cow, sheep, antelope, dog, or cat, but is not limited thereto. Preferably, it may be a human. Obtaining such lung tissue can be obtained by methods known in the art.
  • differentiation means a phenomenon in which cells become specialized in structure or function while they proliferate and grow, that is, cells, tissues, etc. change in form or function in order to perform a given task.
  • induced pluripotent stem cells refers to cells induced by artificially performing a dedifferentiation process (reprogramming) on adult cells that have already completed differentiation. It has pluripotency.
  • the induced pluripotent stem cells can be differentiated into cells of various organs such as the brain and heart.
  • the induced pluripotent stem cells may be cells obtained by dedifferentiating human type 2 alveolar cells, but the type of tissue is not particularly limited as long as they are of human origin.
  • the induced pluripotent stem cells derived from alveolar cells are produced by introducing a virus containing a pluripotency inducing factor into alveolar cells. More specifically, the alveolar cell-derived induced pluripotent stem cells are manufactured by an induced pluripotent stem cell production method comprising the following steps, and may be derived from alveolar cells, particularly type 2 alveolar cells, but are not limited thereto. :
  • dedifferentiation refers to the epigenetic process of returning partially or terminally differentiated cells to an undifferentiated state such as pluripotent or multipotent, thereby enabling the formation of new differentiated tissues.
  • dedifferentiation refers to a retrograde process. This phenomenon of dedifferentiation is possible because the epigenetic modifications of the cell genome are not fixed but are a reversible process that can be erased and re-formed.
  • Dedifferentiation also called “reprogramming,” refers to the process of changing the genetic and expression profile of partially or terminally differentiated cells to resemble that of embryonic stem cells. For example, the changes include changes in methylation patterns, changes in the expression rate of stem cell genes, etc.
  • the artificial dedifferentiation process is virus-mediated using lentivirus belonging to the retroviridae family, Sendai virus belonging to the paramyxoviridae family, etc., using virus-mediated or non-viral vectors, and non-virus-mediated reverse using proteins and cell extracts. It may be performed by introducing differentiation factors, or includes a dedifferentiation process using stem cell extracts, compounds, etc., but in the present invention, it is preferable to use Sendairus.
  • reprogramming-inducing genes refer to genes that can reprogram differentiated cells.
  • Oct-4, Sox2, Klf4, and c-Myc are called Yamanaka factors.
  • the virus in step (S2) may be Sendai virus
  • the dedifferentiation inducer in step (S2) is Klf4, c-Myc, and polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2.
  • the Sendai virus dedifferentiation inducer is Klf4, c-Myc
  • polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2 (CytotuneTM 2.0 Sendai mix) can be used, but is not limited thereto, and can be used without limitation as long as induced pluripotent stem cells can be derived from alveolar cells.
  • c-Myc is an oncogene that performs various intracellular functions including cell growth, differentiation, proliferation, programmed cell death, and transformation into cancer cells. In addition, it was found to be a downstream gene of LIF (Leukemia Inhibitory Factor)/STAT3 and Wnt signaling mechanism, which are major mechanisms for maintaining pluripotency (Sears et al., Genes Dev, 14:2501-2514, 2000).
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • Wnt signaling mechanism which are major mechanisms for maintaining pluripotency (Sears et al., Genes Dev, 14:2501-2514, 2000).
  • the c-Myc transcription factor is expected to play a role in preventing cell proliferation within dedifferentiated pluripotent stem cells.
  • c-Myc not only binds to the Myc recognition site on the genome, but also changes the chromatin structure to help Oct-4 and Sox2 bind to target genes (Lewitzky and Yamanaka, Current Opinion in Biotechnology, 18:467-473, 2007).
  • Klf4 is involved in growth inhibition and plays a role in regulating the cell cycle. Recent studies have shown that, similar to c-Myc, it acts as a downstream gene of STAT3 in embryonic stem cells and, when overexpressed, maintains Oct-4 expression and inhibits differentiation of mouse embryonic stem cells (Li et al., Blood, 105:635-637, 2005).
  • the step of delivering the pluripotent differentiation inducer into alveolar cells is essential.
  • polycistronic Klf4-Oct3 is produced using Sendai viruses as transporters.
  • Genes encoding counterdifferentiation inducers of /4-Sox2, c-Myc, and Klf4 can be delivered to the alveolar cells, but the combination of counterdifferentiation factors delivered according to the transporter is not limited thereto.
  • the alveolar cell-derived induced pluripotent stem cells of step a) may be cultured in a cell culture dish coated with vitronectin before performing step a).
  • the alveolar cell-derived induced pluripotent stem cells fill 60 to 90%, 60 to 80%, or 70 to 80% of the culture dish, the alveolar cell-derived induced pluripotent stem cells are cultured in a medium for inducing endoderm cell differentiation to form endoderm cells. It can induce differentiation into endoderm cells.
  • media refers to a medium that can induce differentiation and support survival of desired cells (including tissues or organoids) in vitro, and is a medium used in the art suitable for culturing cells. Includes all badges. Medium and culture conditions can be selected depending on the type of cell.
  • “medium for inducing endoderm cell differentiation” refers to a culture medium that promotes differentiation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) into endoderm cells, and according to one embodiment of the present invention, the STEMdiffTM Definitive Endoderm Kit ( STEMCELL #05110) was used, but any iPSC can be used without limitation as long as it can induce differentiation into lung endoderm cells.
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • the STEMdiffTM Definitive Endoderm Kit may include Endoderm Basal Medium, Definitive Endoderm Supplement MR (100), and Definitive Endoderm Supplement CJ (100), specifically, Endoderm Basal Medium 100 mL, Definitive Endoderm Supplement MR (100) It may contain 0.35 mL, and 1.1 mL of Definitive Endoderm Supplement CJ (100).
  • pneumocyte-derived induced pluripotent stem cells are cultured in a medium for inducing endoderm cell differentiation by adding MR supplement + CJ supplement to the medium for inducing endoderm cell differentiation and culturing for 2 days. Afterwards, only CJ supplement may be added and cultured for 1 to 5 days, 1 to 3 days, 1 to 2 days, 2 to 4 days, or 2 to 3 days.
  • endoderm used in the present invention refers to the innermost germ layer of the three germ layers (ectoderm, mesoderm, and endoderm) that are formed by cells moving into the inside of the gastrulation as a result of gastrulation. It differentiates into respiratory and digestive organs such as the liver and pancreas. Therefore, in order to promote the differentiation of induced pluripotent stem cells into alveolar organoids in the present invention, efficient differentiation into endoderm cells is essential as a prerequisite (Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2007, vol.4, no.2 , pp. 142-149).
  • the endoderm cells may express SOX17 and FOXA2, which are endoderm characteristic factors, but are not limited thereto.
  • the AFM (Anterior Foregut endoderm Media) medium refers to a culture medium that promotes differentiation of endoderm cells into anterior foregut endoderm cells, and includes Ham's F12, Dexamethasone, IBMX (3-Isobutyl-methylxanthine), B27 supplement, N2 supplement, BSA (Bovine serum albumin), HEPES (Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), Calcium Chloride (CaCl 2 ), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, Anti Antibiotic-Antimycotic, Ascobic acid , Glutamax, Recombinant Human BMP-4, and CHIR99021, but is not limited thereto.
  • the AFM medium contains 50 to 150 ⁇ M of IBMX, 0.5 to 3% of B27 supplement, 0.1 to 2% of N2 supplement, 20 to 70 nM of dexamethasone, 0.1 to 2% of BSA, and calcium chloride (CaCl 2 ) based on 500 mL of Ham's F12.
  • Recombinant Human KGF 1 to 20 ng/ml Recombinant Human FGF-10 1 to 20 ng/ml
  • Anti Antibiotic-Antimycotic 0.1 to 2% It may include, but is not limited to, ascobic acid 20 to 100 ⁇ g/ml, Glutamax 0.5 to 5 mM, Recombinant Human BMP-4 1 to 20 ng/ml, and/or CHIR99021 1 to 10 ⁇ M.
  • the culture period of step b) is not particularly limited, for example, 1 to 8 days, 1 to 5 days, 1 to 3 days, 1 to 2 days, 2 to 5 days, 2 to 4 days, 2 to 3.
  • it may be performed for 7 days, but is not limited thereto.
  • progenitor differentiation medium used in the present invention refers to a culture medium that promotes differentiation of anterior foregut endoderm cells into precursor cells, and according to one embodiment of the present invention, SAGM medium may be used.
  • SAGM medium or "small airway growth medium” is a growth medium containing one or more of hydrocortisone, epidermal growth factor, epinephrine, transferrin, insulin, retinoic acid, triiodothyronine, and bovine serum albumin-fatty acids. means.
  • progenitor refers to a cell that is differentiated into a specific type of cell or to form a specific type of tissue. It is a state in which differentiation has partially progressed from stem cells, and stem cells go through the precursor stage and finally Can differentiate into adult cells.
  • the culture period of step c) is not particularly limited, for example, 1 to 8 days, 1 to 5 days, 1 to 3 days, 1 to 2 days, 2 to 5 days, 2 to 4. performed for 1, 2 to 3 days, 3 to 7 days, 3 to 4 days, 4 to 7 days, 4 to 5 days, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, or 7 days It may be performed for 7 days, according to an embodiment of the present invention, but is not limited thereto.
  • the alveolar precursor may express EPCAM, an epithelial cell factor.
  • the culture period of step d) is not particularly limited, but is preferably cultured for up to 90 days. If the cell density becomes too high during the culture period, cells are separated using Accutase. A step of repeating the re-embedding process may be further included, but is not limited thereto.
  • AM Alveolar Media
  • the AM medium refers to a culture medium that promotes the differentiation of precursor cells into final adult cells.
  • the AM medium includes Ham's F12, dexamethasone, and IBMX ( 3-Isobutyl-methylxanthine), B27 supplement, N2 supplement, BSA (Bovine serum albumin), HEPES (Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), Calcium Chloride (CaCl 2 ), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, and Antibiotic-Antimycotic, but is not limited thereto.
  • the AM medium contains 50 to 150 ⁇ M of IBMX, 0.5 to 3% of B27 supplement, 0.1 to 2% of N2 supplement, 20 to 70 nM of dexamethasone, 0.1 to 2% of BSA, and calcium chloride (CaCl 2 ) based on 500 mL of Ham's F12. 0.5 to 1.5 mM, HEPES 10 to 20 mM, 8-BrcAMP 10 to 200 ⁇ M, Recombinant Human KGF 1 to 20 ng/ml, Recombinant Human FGF-10 1 to 20 ng/ml, and/or Anti Antibiotic-Antimycotic 0.1 to 20 ng/ml. It may include 2%, but is not limited thereto.
  • step a) may be performed in a two-dimensional culture vessel, and steps b) to d) may be performed in a three-dimensional culture vessel, but are not limited thereto, and the cells of each stage may be It can be performed in a culture vessel suitable for differentiation.
  • steps b) to d) can be performed by a 3D culture method in which the culture is performed in a 3D culture vessel.
  • the specific conditions for the three-dimensional culture are not particularly limited and may be performed by methods commonly performed in the art, for example, polyester, polyalkylene, polyfluorochloroethylene, polyvinyl chloride, Polystyrene, polysulfone, cellulose acetate, glass fiber, ceramic particles, matrigel, extracellular matrix components (e.g. fibronectin, chondronectin, laminin), collagen, poly-L lactic acid. and an adhesive material selected from the group consisting of inert metal fibers, preferably Matrigel.
  • the endoderm cells of step a) express the endoderm characteristic factors SOX17 and FOXA2
  • the alveolar precursors of step c) express the epithelial cell factor EPCAM
  • the alveolar precursors that are cultured in AM medium and differentiated into alveolar organoids express the expression of type 1 alveolar cells and type 2 alveolar cells. Therefore, the present invention relates to each process by which induced pluripotent stem cells are differentiated into alveolar organoids. By checking step by step, alveolar organoids can be efficiently produced.
  • the present invention provides a kit for producing alveolar organoids comprising a medium for inducing endoderm cell differentiation, Anterior Foregut endoderm Media (AFM) medium, precursor differentiation medium, and Alveolar Media (AM) medium.
  • AFM Anterior Foregut endoderm Media
  • AM Alveolar Media
  • the kit may further include instructions describing a method of producing alveolar organoids from alveolar cell-derived induced pluripotent stem cells according to the present invention, but is not limited thereto.
  • the instructions may be attached to the container or may be packaged independently of the container.
  • the kit may include without limitation any composition known in the art to be necessary for differentiating alveolar cell-derived induced pluripotent stem cells into alveolar organoids.
  • the kit may additionally include a culture dish, and the culture dish may be a culture dish for suspension culture or a culture dish for adherent culture.
  • the culture dish for attachment culture may be coated with a polypeptide, and the polypeptide may be, for example, vitronectin (VTN), laminine, fibronectin, poly ornithine, or matrigel ( Matrigel).
  • VTN vitronectin
  • laminine laminine
  • fibronectin poly ornithine
  • Matrigel matrigel
  • the present invention provides a composition for producing alveolar organoids in another aspect of the present invention.
  • the composition for producing alveolar organoids may have the same composition as the AFM medium or AM medium, and may include Ham's F12, Dexamethasone, IBMX (3-Isobutyl-methylxanthine), B27 supplement, N2 supplement, and BSA (Bovine serum albumin). , HEPES (Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), calcium chloride (CaCl 2 ), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, Anti Antibiotic-Antimycotic, Ascobic acid, Glutamax, Recombinant Human BMP4, and CHIR99021. It may include one or more selected from, but is not limited to this.
  • the composition may further include small airway growth medium (SAGM), but is not limited thereto.
  • SAGM small airway growth medium
  • organoid production used in the present invention includes all activities that can generate or maintain organoids. For example, it may be to differentiate cells or cells isolated from a specific tissue into tissue or organ cells with a specific function, and/or to survive, grow, or proliferate an organoid.
  • the present invention provides alveolar organoids produced by the method according to the present invention in another aspect of the present invention.
  • the alveolar organoids are produced using induced pluripotent stem cells derived from alveolar cells, so they can be efficiently differentiated into alveolar organoids due to the epigenetic memory of alveolar cells.
  • the alveolar organoid may contain both type 2 alveolar cells and type 1 alveolar cells, but is not limited thereto.
  • the present invention can provide a tissue therapeutic agent containing the alveolar organoid in another aspect of the present invention, and the tissue may be pulmonary tissue, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for preventing or treating lung-related diseases, comprising administering and/or transplanting the alveolar organoid to an individual in need thereof.
  • the present invention provides a use of the alveolar organoid according to the present invention for preventing or treating lung-related diseases.
  • the present invention provides the use of the alveolar organoid according to the present invention for producing a therapeutic agent for lung-related diseases.
  • an “individual” may be a human or non-human mammal that has developed or is capable of developing a lung-related disease.
  • Non-human mammals include, for example, mammals such as livestock and pets, such as sheep, cattle, pigs, dogs, cats, and murines.
  • the individual is a human.
  • the "lung-related disease” includes, but is not limited to, cystic fibrosis, respiratory distress syndrome, acute respiratory distress syndrome, pulmonary tuberculosis, cough, bronchial asthma, cough based on increased airway hyperresponsiveness, influenza syndrome, cough suppression, airway hyperresponsiveness. , tuberculosis disease, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, reversible airway obstruction, adult respiratory disease syndrome, pigeon breeder's disease, farmer's lung, bronchopulmonary dysplasia, airway disease, emphysema, allergic organ. These may include aspergillosis, allergic bronchitis bronchiectasis, occupational asthma, reactive airway disease syndrome, interstitial lung disease, and parasitic lung disease.
  • “administration” means introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a patient by any appropriate method, and the route of administration of the composition of the present invention is various oral or parenteral routes as long as it can reach the target tissue. It can be administered through
  • prevention means any act of delaying a lung-related disease by administration/transplantation of a tissue therapeutic agent or alveolar organoid according to the present invention
  • treatment refers to any action of delaying a lung-related disease by administering/transplanting a tissue therapeutic agent or alveolar organoid according to the present invention. It refers to any action in which lung-related disease symptoms are improved or beneficially changed by administration/transplantation, and “improvement” refers to parameters related to lung-related disease, e.g. For example, it means any action that reduces the severity of symptoms.
  • the tissue therapeutic agent of the present invention may be a pharmaceutical composition containing the alveolar organoid as an active ingredient, and the pharmaceutical composition may contain appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions. More may be included.
  • carrier is also called a vehicle and refers to a compound that facilitates the addition of a protein or peptide into a cell or tissue.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • carrier it is a commonly used carrier that facilitates the introduction of many organic substances into tissues.
  • “diluent” is defined as a compound diluted in water that not only stabilizes the biologically active form of the protein or peptide of interest, but also dissolves the protein or peptide.
  • Salts dissolved in buffer solutions are used as diluents in the art.
  • a commonly used buffer solution is phosphate buffered saline because it mimics the salt state of human body fluids. Because buffer salts can control the pH of a solution at low concentrations, it is rare for buffer diluents to modify the biological activity of the compound.
  • composition according to the present invention can be formulated and used in the form of external preparations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., and sterile injection solutions, respectively, according to conventional methods.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations contain the above compounds with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, or sucrose. ) or prepared by mixing lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, etc.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectable ester such as ethyl oleate.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurin, glycerogeratin, etc. can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in case of parenteral administration, it can be administered by intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, etc. You can.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. It can be.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art. Alternatively, it can be manufactured by placing it in a large capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
  • the present invention provides, in another aspect of the present invention, a method of screening for a therapeutic agent for lung-related diseases using the alveolar organoid according to the present invention.
  • the method for screening a therapeutic agent for lung-related diseases includes treating the organoid with a test substance;
  • a step of selecting the test material as a therapeutic agent for the lung-related disease may be included.
  • the test substance is a substance predicted to prevent, improve, or treat lung-related diseases.
  • the test substance is a small molecule compound, an antibody, an antisense nucleotide, a small interfering RNA, or a short hairpin. It may include, but is not limited to, RNA (short hairpin RNA), nucleic acids, proteins, peptides, and other extracts or natural products.
  • first, second, etc. may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The above terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.
  • a first component may be named a second component, and similarly, the second component may also be named a first component without departing from the scope of the present invention.
  • the term “and/or” includes any of a plurality of related stated items or a combination of a plurality of related stated items.
  • the term "combination thereof" included in the Markushi format expression means a mixture or combination of one or more selected from the group consisting of the components described in the Markushi format expression, It means containing one or more selected from the group consisting of constituent elements.
  • the human lung tissue used in this experiment was obtained during lung surgery and was used with the patient's consent before surgery. After collecting normal lung tissue, cells were separated by transporting it on ice in HBSS solution (Gibco, Gaithersberg, MD) containing antibiotic-antifungal solution (Giboco, amphotericin B, penicillin, streptomycin). Specifically, to isolate human type 2 alveolar cells, normal lung tissue excised during surgery was washed with HBSS solution containing an antibiotic-antifungal solution until no blood was visible.
  • the reacted solution was passed through a 40 mm strainer, collected in a 50 ml falcon tube, and centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes at room temperature. The supernatant was discarded, 3 ml Red Blood Cell Lysis Buffer (11814389001 Roche) was added, and reaction was performed at room temperature for 3 minutes. Then, centrifugation was performed at 1500 rpm for 3 minutes at room temperature, and the cells were suspended in 10 ml of SAGM media (Lonza) (containing 10 ⁇ M ROCK inhibitor) on a dish and incubated in a 5% CO 2 incubator at 37°C. did.
  • SAGM media Lithoxyribonine
  • SAGM media was changed once every 2-3 days, and when AT2 cells grew more than 60%, cells were removed and subcultured using the Animal Component-Free Cell Dissociation Kit (Catalog # 05426).
  • the lamellar body a characteristic marker of AT2 cells, was reacted with Lysotracker fluorescence (green) for 30 minutes and observed under a fluorescence microscope.
  • Example 2 iPSC (induced pluripotent stem cell) reprogramming using Sendai virus
  • Example 2 In order to culture alveolar cells in a state suitable for transduction, the same amount of human alveolar cells obtained in Example 1 was seeded in a 6-well plate, and the alveolar cells comprised about 70 to 80% of the 2-well or more dishes. When grown, the number of cells in one well was confirmed.
  • Subculture was performed on the 7th day after transduction using the CytotuneTM2.0 Sendai mix.
  • the timing of the subculture may vary depending on the proliferation rate of the cells, and subculture can be performed when the cell density in the plate reaches approximately 70% to 80% after treatment with Sendai mix.
  • SAGM media was removed from the wells in which the cells were grown, washed with PBS, and cells were removed using TrypLE. The fallen cells were collected in SAGM media and then centrifuged at 1500 rpm for 3 minutes. The supernatant was removed, and cells were seeded on a previously prepared cell culture plate.
  • the cell culture plate was coated with vitronectin (manufactured by Gibco) diluted 1/100 in PBS for 1 hour at room temperature, the remaining vitronectin was removed, and then washed with PBS. Within 7 days of seeding the cells, the medium was replaced with E8, and the medium was changed every day thereafter, and whether colonies were formed was observed through a microscope for 3 to 4 weeks.
  • vitronectin manufactured by Gibco
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • Treated with primary antibodies against Oct3/4, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, LIN28, and NANOG were reacted at 4°C for 18 hours, then washed with PBS and treated with fluorescent secondary antibodies (Alexa Fluor 594-conjugates, manufactured by Santa Cruz Biotechnology) against the primary antibodies, Oct3/4, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, LIN28, and NANOG. It was reacted at room temperature for 1 hour. After washing with PBS and mounting with mounting solution, expression was analyzed using confocal microscopy. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) was used for visualization of intracellular nuclei through DNA staining.
  • fluorescent secondary antibodies Alexa Fluor 594-conjugates, manufactured by Santa Cruz Biotechnology
  • the iPSC undifferentiation markers Oct3/4, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, LIN28, and NANOG are expressed in induced pluripotent stem cells prepared from human alveolar cells. confirmed.
  • Example 3 Subculture (passaging) and mass culture of induced pluripotent stem cells (iPSC) prepared from human alveolar cells
  • the medium is removed from the cells, washed with PBS, and added with 10 ⁇ M ROCK inhibitor ( After adding E8 medium supplemented with (manufactured by Sigma), cells were cut into pieces from the edge of the induced pluripotent stem cells using a 100 ⁇ l pipette tip while observing under a microscope. After adding E8 (w/ 10 ⁇ M ROCK inhibitor) medium to a new cell culture dish, the fragmented induced pluripotent stem cells were harvested with E8 medium, placed in the new culture dish, and cultured in an incubator.
  • induced pluripotent stem cells were subcultured in E8 medium to obtain colonies composed only of induced pluripotent stem cells, which were treated with ReLeSRTM (manufactured by STEMCELL Technologies), a cell separation solution exclusively for iPSC, at room temperature for 1 minute. After removing the ReLeSRTM solution, cells were harvested with E8 medium and centrifuged at 1500 rmp for 5 minutes. The supernatant was removed and the pellet was suspended in E8 (w/ 10 ⁇ M ROCK inhibitor) medium. The suspended cells were placed in a cell culture dish containing previously prepared E8 (w/ 10 ⁇ M ROCK inhibitor) medium and cultured in an incubator.
  • ReLeSRTM manufactured by STEMCELL Technologies
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • alveolar organoids were prepared by inducing differentiation of AT2 cell-derived iPSCs (AT2 iPSCs) obtained in Example 3 into alveolar organoids, and the specific method is as follows.
  • AT2 iPSCs obtained in Example 3 were cultured on vitronectin-coated dishes, and the medium was changed once a day. TeSRTM-E8TM (STEMCELL #05990) medium was used. When the AT2 iPSCs in the dish reached a cell density of 70-80%, they were cultured using the differentiation medium of the STEMdiffTM Definitive Endoderm Kit (STEMCELL #05110). According to the manufacturer's instructions, MR and CJ supplements were added to the medium during culture. After culturing for one day, only CJ supplement was added and cultured for 2 to 4 days.
  • Example 4 differentiation of AT2 iPSCs into endoderm cells was performed using a two-dimensional culture method in a culture dish, and the subsequent process was performed using Matrigel. (Corning #356231) was used to conduct a three-dimensional culture in the form of a dome, and Matrigel was used at 60%.
  • Example 4 In order to convert the endoderm cells of 4-1 of Example 4 into anterior foregut endoderm cells, which are precursors of lung and airway cells, they were cultured for 7 days using AFM (Anterior Foregut endoderm Media) medium. . Then, to induce differentiation into alveolar progenitors, they were cultured for 7 days using SAGMTM (Lonza #CC-3118) medium. Once the culture in SAGM medium was completed, they were continued in AM (Alveolar Media) medium for maturation of alveolar organoids. Cultured. If cells continue to divide during culture in AM medium and the cell density of the spheroid becomes too high, Accutase (Corning #25-058-CI) to separate the spheroid, and then Matrigel again.
  • AFM anterior Foregut endoderm Media
  • SAGMTM Superior #CC-3118
  • the re-dome embedding process was repeated and cultured for up to 90 days.
  • the spheroid maintains a spherical shape, maintains an appropriate cell density, and a lumen is confirmed
  • culture is continued in AM medium without a re-dome process, and fluorescent staining is performed to determine whether the cells constituting the spheroid include alveolar epithelial cells. It was confirmed through .
  • the specific compositions of the AFM medium and AM medium used are shown in Table 1 and Table 2, respectively.
  • Immunofluorescence staining was performed to confirm the characteristics of alveolar organoids during the differentiation process.
  • the alveolar organoid prepared according to the present invention is differentiated from induced pluripotent stem cells derived from human alveolar cells, and can be repeatedly and efficiently differentiated into alveolar organoids due to the epigenetic memory of alveolar cells, and can be differentiated into actual alveoli and Since it can be reproduced similarly, it can be useful for research into the pathogenesis of respiratory diseases and screening to discover therapeutic drugs, so it has industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 이용한 폐포 오가노이드 제작 방법 등에 관한 것으로, 본 발명에 따라 제조된 폐포 오가노이드는 사람 폐포세포 유래 유도만능줄기세포로부터 분화된 것으로 폐포세포의 후생학적 기억 (epigenetic memory)으로 인해 폐포 오가노이드로 효율적으로 분화될 수 있는바, 호흡기 질환의 발병 과정에 대한 연구 및 치료 약물 발굴을 위한 스크리닝 등에 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 이용한 폐포 오가노이드 제작 방법
본 발명은 사람 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 이용한 폐포 오가노이드 제작 방법 등에 관한 것이다.
본 발명은 2022년 8월 26일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2022-0107869호에 기초한 우선권을 주장하며, 상기 출원들의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
오가노이드는 줄기세포나 장기세포에서 분리한 세포를 배양하거나 재조합하여 만든 미니장기로서, 각 해당 기관과 매우 유사한 구조와 기능을 가지는 것을 기반으로 하여 실제 조직과 최대한 가깝게 분화가 가능하다는 특징이 있다.
최근 재생의학이나 세포 치료제로 오가노이드의 연구가 활발하게 진행되고 있다. 실질적인 약물 대사반응 등의 시도는 동물실험에서 주로 이루어 지고 있으나, 인간과 동물의 유전자 구조가 100% 같지 않기 때문에 동물에게 아무런 반응이 없는 물질도 인간에게 치명적일 수 있으며, 동물의 권리 침해에 대한 문제가 있다. 또한, 2차원으로 배양된 세포는 불멸화(immortalized)된 세포로서 약물 대사 정도에 있어 실제 장기와 차이가 있는바 정확한 실험이 어렵다는 문제가 있다. 또한, 약물대사를 평가하는데 있어 가장 우수한 방법은 사람의 장기세포를 직접 이용하는 것이나 조직을 구하는데 한계가 있으며 체외 증식이 어려워 많은 양을 얻는데 어려움이 있다.
한편, 최근 대기오염원인 미세먼지의 농도 증가가 암을 포함한 폐질환과 관련된 위험성 및 사망률 증가와 관련성이 있다는 연구 결과가 발표되고 있다. 또한, 폐질환은 세계의 주요 사망원인 중 세 번째 요인으로 알려져 있으나, 손상된 폐를 회복시키는 원리는 알려져 있지 않다.
폐는 다른 장기에 비해 구조적으로 복잡하고 세포의 종류가 다양함에도 불구하고, 아직까지 많은 연구가 진행되지 않고 있다. 특히, 폐 조직에서 2형 폐포세포(Alveolar type 2 cells; AT2 cells)는 폐포 상피세포 중 ~7% 정도를 구성하고 있으며 (The Formation of Pulmonary Alveoli; Stephen E. McGowan; in The Lung (Second Edition), 2014), surfactant protein을 생산하여 폐의 기능과 표면장력을 유지시킴으로써 붕괴(collapse)를 막아주는 주는 역할을 한다.
그러나, 2형 폐포세포는 2D에서 배양하였을 경우 1형 폐포세포와 같은 모양의 표현형(phenotype)을 갖게 되어 배양에 어려움이 있고, 사람 폐 조직에서 2형 폐포세포를 유지시키는 것은 어려운 실정이다.
이에, 본 발명자들은 사람 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 이용한 폐포 오가노이드를 제작하였으며, 폐포 오가노이드 제조에 적합한 배지를 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 폐포세포 유래 유도만능줄기세포로부터 폐포 오가노이드를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드를 제작하는 방법으로 제작된 폐포 오가노이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 폐포 오가노이드 제작용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 폐포 오가노이드 제작용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드를 포함하는 조직 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드를 이용하여 폐 관련 질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 폐포세포 유래 유도만능줄기세포로부터 폐포 오가노이드를 제작하는 방법을 제공한다:
a) 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 내배엽 세포 분화 유도용 배지에서 배양하여 내배엽성 세포(Endoderm cell)로 분화를 유도하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 내배엽성 세포를 AFM(Anterior Foregut endoderm Media) 배지에서 전방 전장 내배엽 세포(Anterior Foregut Endoderm cell)로 분화를 유도하는 단계;
c) 상기 단계 b)의 전방 전장 내배엽 세포를 전구체 분화 배지에서 폐포 전구체(alveolar progenitor)로 분화를 유도하는 단계; 및
d) 상기 단계 c)의 폐포 전구체를 AM(Alveolar Media) 배지에서 배양하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 폐포세포는 2형 폐포세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 AFM 배지는 Ham's F12, 덱사메타손, IBMX(3-Isobutyl-methylxanthine), B27 보충제, N2 보충제, BSA(Bovine serum albumin), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 염화칼슘(CaCl2), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, Anti Antibiotic-Antimycotic, Ascobic acid, Glutamax, Recombinant Human BMP4, 및 CHIR99021로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 AM 배지는 Ham's F12, 덱사메타손, IBMX(3-Isobutyl-methylxanthine), B27 보충제, N2 보충제, BSA(Bovine serum albumin), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 염화칼슘(CaCl2), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, 및 Anti Antibiotic-Antimycotic로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 b) 내지 d)는 3차원 배양 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 내배엽 세포 분화 유도용 배지, AFM(Anterior Foregut endoderm Media) 배지, 전구체 분화 배지, 및 AM(Alveolar Media) 배지를 포함하는 폐포 오가노이드 제작용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 키트는 본 발명에 따른 폐포세포 유래 유도만능줄기세포로부터 폐포 오가노이드를 제작하는 방법이 기재된 지시서(instruction)를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 폐포 오가노이드 제작용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드를 제작하는 방법으로 제작된 폐포 오가노이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드를 포함하는 조직 치료제를 제공한다,
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드를 이를 필요로 하는 개체에 투여 및/또는 이식하는 단계를 포함하는 폐 관련 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드의 폐 관련 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드의 폐 관련 질환 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드를 이용하여 폐 관련 질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 방법은 상기 오가노이드에 피검 물질을 처리하는 단계; 및 상기 피검 물질의 처리 후 폐 관련 질환의 바이오마커 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현이 처리 전과 비교하여 증가 또는 감소되는 경우, 상기 피검 물질을 폐 관련 질환의 치료제로 선별하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 폐 관련 질환은 낭성 섬유증, 호흡곤란 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 폐결핵, 기침, 기관지 천식, 증가된 기도 과민반응에 기반한 기침, 독감 증후군, 기침억제, 기도 과민반응, 결핵 질병, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐기종, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 가역적인 기도 폐쇄, 성인 호흡기 질병 증후군, 비둘기 사육자병, 농부의 폐, 기관지폐 이형성증, 기도 질환, 폐기종, 알러지성 기관지폐 아스퍼질러스증, 알러지성 기관지염 기관지확장증, 직업성 천식, 반응성 기도 질병 증후군, 간질성 폐 질병, 및 기생충성 폐 질병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따라 제조된 폐포 오가노이드는 사람 폐포세포 유래 유도만능줄기세포로부터 분화된 것으로 폐포세포의 후생학적 기억(epigenetic memory)으로 인해 반복적으로 폐포 오가노이드로 효율적으로 분화될 수 있고, 실제 폐포와 유사하게 재현될 수 있어 생체 호흡기 질환의 발병 과정에 대한 연구 및 치료 약물 발굴을 위한 스크리닝 등에 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 사람 폐포세포(AT2 cell)를 재프로그램화 하여 유도만능줄기세포(iPSCs)를 제조하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 사람 폐포세포(AT2 cell)를 재프로그램화 하여 제조된 유도만능줄기세포(iPSCs)의 단백질 특성을 면역형광염색법을 통해 분석한 결과를 나타낸 것으로, iPSCs 미분화 마커인 Oct3/4, NANOG, 및 LIN28의 AT2 cell에 대한 상대적 발현량을 나타낸 도면(좌측), Oct3/4, SSEA4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81의 발현을 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면(우측)이다.
도 3은 사람 폐포세포(AT2 cell)를 재프로그램화 하여 제조된 유도만능줄기세포(iPSC)로부터 폐포 오가노이드(alveolar organoid)가 분화되는 과정을 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 사람 폐포세포(AT2 cell)를 재프로그램화 하여 제조된 유도만능줄기세포(iPSCs)로부터 폐포 오가노이드를 분화하기 위한 개략적인 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 5는 사람 폐포세포(AT2 cell)를 재프로그램화 하여 제조된 유도만능줄기세포(iPSCs)가 내배엽(Endoderm)으로 분화되었는지 면역형광염색법을 통해 확인한 것으로, 내배엽 특징 인자인 SOX17 및 FOXA2를 이용하여 정상적으로 내배엽으로 분화되었는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 사람 폐포세포(AT2 cell)를 재프로그램화 하여 제조된 유도만능줄기세포(iPSCs)로부터 폐포 오가노이드(alveolar organoid)가 분화되는 과정을 면역형광염색법을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 폐포세포 유래 유도만능줄기세포로부터 폐포 오가노이드를 제작하는 방법을 제공한다:
a) 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 내배엽 세포 분화 유도용 배지에서 배양하여 내배엽성 세포(Endoderm cell)로 분화를 유도하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 내배엽성 세포를 AFM(Anterior Foregut endoderm Media) 배지에서 전방 전장 내배엽 세포(Anterior Foregut Endoderm cell)로 분화를 유도하는 단계;
c) 상기 단계 b)의 전방 전장 내배엽 세포를 전구체 분화 배지에서 폐포 전구체(alveolar progenitor)로 분화를 유도하는 단계; 및
d) 상기 단계 c)의 폐포 전구체를 AM(Alveolar Media) 배지에서 배양하는 단계.
본 발명에서, "오가노이드"란 용어는 조직 또는 기관의 표면적 외관 또는 실제 구조 또는 기능을 모방하는 하나 이상의 세포 유형의 3차원 집합체를 지칭한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폐포세포는 2형 폐포세포(AT2 cell)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2형 폐포세포(AT2 cell)는 폐 조직으로부터 분리된 것, 분리 후 계대배양된 것, 또는 상업적으로 구입된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "폐 조직"은 모든 폐 조직 구조, 및 정맥, 동맥, 혈관, 모세관, 및 상기 구조의 일부이거나, 또는 그와 관련된 유형의 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 관련된 조직; 폐 및 흉막 조직; 및 혈관 평활근, 혈관주위세포, 및 혈관 내피 계통 및/또는 표현형을 포함할 수 있지만, 그에 한정되지 않는다. 상기 폐 조직은 포유동물, 예컨대 인간, 마우스, 랫트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 또는 고양이 등에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 인간일 수 있다. 이러한 폐 조직의 수득은 당업계에 알려진 방법으로 수득될 수 있다.
본 발명에서 "분화"란 세포가 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉, 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)"란 이미 분화가 완성된 성체세포들에 대하여 인위적으로 역분화과정(재프로그램화)을 수행하여 유도된 세포들로 만능분화능(pluripotency)을 가진다. 상기 유도만능줄기세포는 뇌, 심장 등의 다양한 장기 세포로 분화될 수 있다. 본 발명에 있어서, 유도만능줄기세포는 사람 2형 폐포세포를 역분화시켜 얻은 세포일 수 있으나, 사람 유래의 것이라면 조직의 종류는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폐포세포 유래 유도만능줄기세포는 역분화 유도인자를 포함하는 바이러스를 폐포세포에 도입하여 제조된 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 상기 폐포세포 유래 유도만능줄기세포는 하기의 단계를 포함하는 유도만능줄기세포 제조방법으로 제조된 것으로, 폐포세포, 특히, 2형 폐포세포로부터 유도된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(S1) 폐포세포를 분리하는 단계;
(S2) 역분화 유도인자를 포함하는 바이러스를 상기 폐포세포에 도입하는 단계; 및
(S3) 상기 바이러스가 도입된 폐포세포로부터 유도만능줄기세포를 유도하는 단계.
본 발명에서 사용되는 용어 "역분화"는 부분 또는 최종 분화된 세포를 만능성(pluripotent) 또는 다능성 (multipotent)과 같은 미분화 상태로 되돌려서, 새로운 분화 조직의 형성이 가능하도록 하는 후성학적(epigenetic)인 역행 과정을 의미한다. 이러한 역분화 현상은 세포 유전체의 후성학적인 변형들이 고정되어 있는 것이 아니라 지워지고 다시 형성될 수 있는 가역적인 과정이기 때문에 가능하다. 역분화는 "재프로그램화(reprogramming)"라고도 불리우며, 부분 또는 최종 분화된 세포의 유전적 및 표현적 프로필을 배아줄기세포의 그것과 비슷하도록 변화시키는 과정에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 변화는 메틸화 패턴의 변화, 줄기세포성 유전자의 발현율 변화 등을 포함한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스과(retroviridae)에 속하는 렌티바이러스, 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae)에 속하는 센다이바이러스 등을 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함하나, 본 발명에서는 센다이이러스를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 "역분화 유도인자 (reprogramming-inducing gene)“는 분화가 끝난 세포를 재프로그램화 시킬 수 있는 유전자들을 의미하며, 특히, Oct-4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 Yamanaka 인자라고 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (S2)의 바이러스는 센다이 바이러스(sendai virus)일 수 있으며, 상기 단계 (S2)의 역분화 유도인자는 Klf4, c-Myc, 및 polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 본 발명에의 일 실시예에 따르면, 상기 센다이 바이러스 역분화 유도인자는 Klf4, c-Myc, 및 polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2(Cytotune™2.0 Sendai mix)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 폐포세포로부터 유도만능줄기세포를 유도할 수 있다면 제한없이 사용될 수 있다.
c-Myc는 세포 성장, 분화, 증식, 세포 예정사 및 암세포로의 형질 전환 등의 다양한 세포 내 기능을 수행하는 발암 유전자이다. 또한 만능성을 유지하는 주요 기작인 LIF(Leukemia Inhibitory Factor)/STAT3와 Wnt 신호전달 메커니즘의 하위 유전자로 밝혀졌다(Sears et al., Genes Dev, 14:2501-2514, 2000). c-Myc 전사인자는 역분화된 만능줄기세포 내에서 세포의 증식을 저해하는 것을 막아주는 역할을 하는 것으로 예상되고 있다. 또한, c-Myc은 게놈(genome) 상에 존재하는 Myc 인식부위에 결합하는 것뿐만 아니라 염색질 구조를 변화시켜 Oct-4와 Sox2 가 표적 유전자에 잘 결합할 수 있도록 도와주는 기능을 수행한다(Lewitzky and Yamanaka, Current Opinion in Biotechnology, 18:467-473, 2007).
Klf4는 성장 억제에 관여하여 세포주기를 조절하는 역할을 한다. 최근 연구에 따르면 c-Myc과 유사하게 배아줄기세포에서 STAT3의 하위 유전자로 작용하며, 과발현시 Oct-4 발현을 유지시켜 생쥐 배아줄기세포의 분화를 억제한다고 밝혀졌다(Li et al., Blood, 105:635-637, 2005).
본 발명에서 재프로그램화를 통해 유도만능줄기세포를 형성하기 위해서는, 상기 역분화 유도인자를 폐포세포 내에 전달하는 단계를 필수적으로 거치게 되며, 구체적으로는, 센다이 바이러스들을 수송체로 사용하여 polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2, c-Myc 및 Klf4의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 상기 폐포세포에 전달할 수 있으나, 수송체에 따라서 전달되는 역분화 인자의 조합은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 a)의 폐포세포 유래 유도만능줄기세포는 단계 a)를 실시하기 전 비트로넥틴(vitronectin)이 코팅된 세포배양접시(cell culture dish)에서 배양될 수 있으며, 폐포세포 유래 유도만능줄기세포가 배양접시의 60 내지 90%, 60 내지 80%, 또는 70 내지 80% 찼을 때, 상기 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 내배엽 세포 분화 유도용 배지에서 배양하여 내배엽성 세포(Endoderm cell)로 분화를 유도할 수 있다.
본 발명에서 "배지(media)"는 생체 외에서 목적하는 세포(조직 또는 오가노이드도 포함)로의 분화 유도 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당업계에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다.
본 발명에서 "내배엽 세포 분화 유도용 배지"란 유도만능줄기세포(iPSC)의 내배엽성 세포로의 분화를 촉진하는 배양 배지를 의미하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, STEMdiff™ Definitive Endoderm Kit(STEMCELL #05110)를 사용하였으나, iPSC를 폐 내배엽 세포로 분화를 유도할 수 있다면 제한 없이 모두 사용할 수 있다.
상기 STEMdiff™ Definitive Endoderm Kit는 Endoderm Basal Medium, Definitive Endoderm Supplement MR(100), 및 Definitive Endoderm Supplement CJ(100)를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로는 Endoderm Basal Medium 100 mL, Definitive Endoderm Supplement MR(100) 0.35 mL, 및 Definitive Endoderm Supplement CJ(100) 1.1 mL를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 a)에서 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 내배엽 세포 분화 유도용 배지에서 배양하는 것은 내배엽 세포 분화 유도용 배지에 MR supplement + CJ supplement를 첨가하여 2일간 배양한 뒤, CJ supplement만 첨가하여 1 내지 5일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 2 내지 4일, 또는 2 내지 3일간 배양하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "내배엽(Endoderm)"은 낭배형성(gastrulation)의 결과로 세포들이 낭배의 안쪽으로 이동해 들어와서 형성되는 삼배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 중 가장 안쪽에 위치한 배엽으로 폐, 간, 췌장 등 호흡 및 소화기관으로 분화한다. 따라서, 본 발명에서 유도만능줄기세포의 폐포 오가노이드로의 분화를 촉진시키기 위해서는 선행요건으로 효율적인 내배엽성 세포로의 분화가 필수적으로 요구된다(Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2007, vol.4, no.2, pp. 142-149).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 내배엽성 세포는 내배엽 특징 인자인 SOX17 및 FOXA2를 발현할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 AFM(Anterior Foregut endoderm Media) 배지는 내배엽성 세포의 전방 전장 내배엽 세포로의 분화를 촉진하는 배양 배지를 의미하며, Ham's F12, 덱사메타손(Dexamethasone), IBMX(3-Isobutyl-methylxanthine), B27 보충제, N2 보충제, BSA(Bovine serum albumin), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 염화칼슘(CaCl2), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, Anti Antibiotic-Antimycotic, Ascobic acid, Glutamax, Recombinant Human BMP-4, 및 CHIR99021로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 AFM 배지는 Ham's F12 500 mL기준으로 IBMX 50 내지 150 μM, B27 보충제 0.5 내지 3%, N2 보충제 0.1 내지 2%, 덱사메타손 20 내지 70 nM, BSA 0.1 내지 2%, 염화칼슘(CaCl2) 0.5 내지 1.5 mM, HEPES 10 내지 20 mM, 8-BrcAMP 10 내지 200 μM, Recombinant Human KGF 1 내지 20 ng/ml, Recombinant Human FGF-10 1 내지 20 ng/ml, Anti Antibiotic-Antimycotic 0.1 내지 2%, Ascobic acid 20 내지 100 μg/ml, Glutamax 0.5 내지 5 mM, Recombinant Human BMP-4 1 내지 20 ng/ml, 및/또는 CHIR99021 1 내지 10 μM를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 b)의 배양 기간은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 1 내지 8일, 1 내지 5일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 2 내지 5일, 2 내지 4일, 2 내지 3일, 3 내지 7일, 3 내지 4일, 4 내지 7일, 4 내지 5일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 동안 수행될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 7일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "전구체 분화 배지"는 전방 전장 내배엽 세포의 전구체 세포로의 분화를 촉진하는 배양 배지를 의미하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, SAGM 배지를 사용할 수 있다.
상기 "SAGM 배지" 또는 "소기도 성장 배지"는 히드로코르티손, 표피 성장인자, 에피네프린, 트랜스페린, 인슐린, 레티노산, 트리아이오도티로닌, 및 소 혈청 알부민-지방산 무함유 중 하나 이상의 것을 포함하는 성장 배지를 의미한다.
본 발명에서 "전구체(progenitor)"는 특정 유형의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직을 형성하도록 된 세포를 의미하는 것으로, 줄기세포에서 부분적으로 분화가 진행된 상태로, 줄기세포는 전구체 단계를 거쳐 최종적인 성체세포로 분화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 c)의 배양 기간은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 1 내지 8일, 1 내지 5일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 2 내지 5일, 2 내지 4일, 2 내지 3일, 3 내지 7일, 3 내지 4일, 4 내지 7일, 4 내지 5일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 동안 수행될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 7일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폐포 전구체는 epithelial cell 인자인 EPCAM이 발현되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 d)의 배양 기간은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는, 최대 90일 동안 배양하는 것일 수 있으며, 배양기간 동안 세포 밀도가 너무 높아질 경우, Accutase를 사용하여 세포를 분리하여 다시 포매(embedding)하는 과정을 반복하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "AM(Alveolar Media) 배지"는 전구체 세포의 최종적인 성체세포로의 분화를 촉진하는 배양 배지를 의미하며, 본 발명에 있어서, 상기 AM 배지는 Ham's F12, 덱사메타손, IBMX(3-Isobutyl-methylxanthine), B27 보충제, N2 보충제, BSA(Bovine serum albumin), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 염화칼슘(CaCl2), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, 및 Anti Antibiotic-Antimycotic로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 AM 배지는 Ham's F12 500 mL 기준으로 IBMX 50 내지 150 μM, B27 보충제 0.5 내지 3%, N2 보충제 0.1 내지 2%, 덱사메타손 20 내지 70 nM, BSA 0.1 내지 2%, 염화칼슘(CaCl2) 0.5 내지 1.5 mM, HEPES 10 내지 20 mM, 8-BrcAMP 10 내지 200 μM, Recombinant Human KGF 1 내지 20 ng/ml, Recombinant Human FGF-10 1 내지 20 ng/ml, 및/또는 Anti Antibiotic-Antimycotic 0.1 내지 2%를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 a)는 2차원 배양용기에서 수행되고, 상기 단계 b) 내지 d)는 3차원 배양용기에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 각 단계의 세포의 분화에 적절한 배양용기에서 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 b) 내지 d)는 3차원 배양용기에서 배양되는 3차원 배양 방법에 의해 수행될 수 있다. 여기서 상기 3차원 배양을 위한 구체적인 조건은 특별히 제한하지 않으며 당해 기술분야에서 일반적으로 수행되는 방법에 의할 수 있으나, 예를 들면, 폴리에스테르, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리설폰, 셀룰로오스 아세테이트, 글래스 파이버, 세라믹 입자, 마트리겔(matrigel), 세포외 기질 성분(예, 피브로넥틴(fibronectin), 콘드로넥틴(chondronectin), 라미닌(laminin)), 콜라겐, 폴리 L 유산 및 불활성 금속 파이버로 구성된 군으로부터 선택되는 접착 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 마트리겔을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 a)의 내배엽성 세포(Endoderm cell)는 내배엽 특징 인자인 SOX17 및 FOXA2를 발현하고, 상기 단계　c)의 폐포 전구체는 epithelial cell 인자인 EPCAM을 발현하며, 상기 단계 d)에서 AM 배지에서 배양되어 폐포 오가노이드로 분화되는 폐포 전구체는 1형 폐포세포와 2형 폐포세포의 발현을 나타내므로, 본 발명은 유도만능줄기세포가 폐포 오가노이드로 분화되는 각 과정을 단계적으로 확인함으로써 효율적으로 폐포 오가노이드를 제작할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다른 양태로 내배엽 세포 분화 유도용 배지, AFM(Anterior Foregut endoderm Media) 배지, 전구체 분화 배지, 및 AM(Alveolar Media) 배지를 포함하는 폐포 오가노이드 제작용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 본 발명에 따른 폐포세포 유래 유도만능줄기세포로부터 폐포 오가노이드를 제작하는 방법이 기재된 지시서(instruction)를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 지시서는 용기에 부착될 수 있거나, 또는 용기와는 독립적으로 포장될 수 있다.
또한, 상기 키트에는 포함된 배지 외에 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 폐포 오가노이드로 분화시키는데 필요한 것으로 당업계에 공지된 구성이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 상기 키트에는 추가적으로 배양 접시가 포함될 수 있으며, 배양 접시는 부유 배양(suspension culture)용 배양 접시 또는 부착 배양(adherent culture)용 배양 접시일 수 있다.
상기 부착 배양용 배양 접시는 폴리펩티드가 코팅된 것일 수 있으며, 폴리펩티드는 예를 들어 비트로넥틴(vitronectin: VTN), 라미닌(laminine), 피브로넥틴(fibronectin), 폴리오르니틴(poly ornithine), 또는 마트리겔(Matrigel)일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다른 양태로 폐포 오가노이드 제작용 조성물을 제공한다.
상기 폐포 오가노이드 제작용 조성물은 상기 AFM 배지 또는 AM 배지와 동일한 조성을 가질 수 있으며, Ham's F12, 덱사메타손(Dexamethasone), IBMX(3-Isobutyl-methylxanthine), B27 보충제, N2 보충제, BSA(Bovine serum albumin), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 염화칼슘(CaCl2), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, Anti Antibiotic-Antimycotic, Ascobic acid, Glutamax, Recombinant Human BMP4, 및 CHIR99021로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 소기도 성장 배지(SAGM)를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "오가노이드 제작"은 오가노이드를 생성하거나 유지시킬 수 있는 모든 행위를 포함한다. 예를 들면, 세포 또는 특정 조직으로부터 분리된 세포를 특정 기능을 갖는 조직이나 기관 세포로 분화시키는 것일 수 있으며, 및/또는 오가노이드를 생존, 성장 또는 증식시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다른 양태로 본 발명에 따른 방법으로 제작된 폐포 오가노이드를 제공한다. 본 발명에서, 상기 폐포 오가노이드는 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 이용하여 제작되므로, 폐포세포의 후생학적 기억(epigenetic memory)으로 인해 폐포 오가노이드로 효율적으로 분화될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폐포 오가노이드는 2형 폐포세포 및 1형 폐포세포를 모두 내포하고 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다른 양태로 상기 폐포 오가노이드를 포함하는 조직 치료제를 제공할 수 있으며, 상기 조직은 페 조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다른 양태로 상기 폐포 오가노이드를 이를 필요로 하는 개체에 투여 및/또는 이식하는 단계를 포함하는 폐 관련 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드의 폐 관련 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폐포 오가노이드의 폐 관련 질환 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명에서 "개체"는 폐 관련 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 비-인간 포유동물은 예를 들어, 가축 및 애완동물, 예를 들어 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 뮤린과 같은 포유동물을 포함한다. 바람직하게, 상기 개체는 인간이다.
상기 "폐 관련 질환"은 예를 들어 비제한적으로 낭성 섬유증, 호흡곤란 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 폐결핵, 기침, 기관지 천식, 증가된 기도 과민반응에 기반한 기침, 독감 증후군, 기침억제, 기도 과민반응, 결핵 질병, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐기종, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 가역적인 기도 폐쇄, 성인 호흡기 질병 증후군, 비둘기 사육자병, 농부의 폐, 기관지폐 이형성증, 기도 질환, 폐기종, 알러지성 기관지폐 아스퍼질러스증, 알러지성 기관지염 기관지확장증, 직업성 천식, 반응성 기도 질병 증후군, 간질성 폐 질병, 및 기생충성 폐 질병 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에서 "예방"이란 본 발명에 따른 조직 치료제 또는 폐포 오가노이드의 투여/이식에 의해 폐 관련 질환을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 조직 치료제 또는 폐포 오가노이드의 투여/이식에 의해 폐 관련 질환 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 본 발명에 따른 조직 치료제 또는 폐포 오가노이드의 투여/이식에 의해 폐 관련 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조직 치료제는 상기 폐포 오가노이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물일 수 있으며, 상기 약학적 조성물(pharmaceutical composition)은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 "담체(carrier)"란 비이클(vehicle)이라고도 불리며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
본 발명에서 "희석제(diluent)"란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 체액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 분해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다른 양태로 본 발명에 따른 폐포 오가노이드를 이용하여 폐 관련 질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 폐 관련 질환 치료제를 스크리닝하는 방법은 상기 오가노이드에 피검 물질을 처리하는 단계; 및
상기 피검 물질의 처리 후 폐 관련 질환의 바이오마커 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현이 처리 전과 비교하여 증가 또는 감소되는 경우, 상기 피검 물질을 폐 관련 질환의 치료제로 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 피검 물질은 폐 관련 질환을 예방, 개선, 또는 치료하는 것으로 예측되는 물질로, 예를 들면, 피검 물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. "및/또는" 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 폐포세포(AT2 cell)의 분리 및 배양
본 실험에 이용한 사람 폐 조직은 폐 수술 시행과정에서 얻어진 조직으로서 수술 전 환자의 동의 하에 이용하였다. 정상 폐 조직을 채취한 후 항생-항진균용액(Giboco, amphotericin B, penicillin, streptomycin)이 포함된 HBSS 용액(Gibco, Gaithersberg, MD)으로 얼음에 넣어 운반하여 세포를 분리하였다. 구체적으로, 사람 2형 폐포세포 분리를 위해 수술과정에서 절제한 정상 폐 조직을 항생-항진균용액이 포함된 HBSS 용액으로 혈액이 보이지 않을 때까지 세척하였다. 혈액이 제거된 폐 조직을 수술용 가위를 이용하여 0.5 mm³ 이하의 크기로 작게 자른 후 0.375 ml 트립신(trypsin, 10 KU/ml; sigma), 75 ml 엘라스타제(elastase, 10 U/ml), 및 100 ml 콜라게네이즈(Type 1 collagenase, 60mg/ml)가 포함된 20 ml HBSS에 넣어 37 ℃ shaking incubator에서 30분간 반응시켰다.
그런 다음, 반응시킨 용액을 40 mm strainer로 통과시킨 후 50 ml 팔콘 튜브(falcon tube)에 모아 1500 rpm에서 10분 동안 실온에서 원심분리하였다. 상층액을 버리고 3 ml Red Blood Cell Lysis Buffer(11814389001 Roche)를 첨가하여 상온에서 3분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 1500 rpm에서 3분 동안 실온에서 원심분리하였으며, dish에 세포를 SAGM media(Lonza) 10 ml (10 μM ROCK inhibitor가 포함됨.)에 부유시킨 후 넣고 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
2-3일에 1회씩 SAGM media를 교환하고 AT2 cell이 60% 이상 자라면 Animal Component-Free Cell Dissociation Kit(Catalog # 05426)를 이용하여 세포를 떼어서 계대배양하였다.
또한, 배양한 폐포세포가 AT2 cell임을 확인하기 위해 AT2 cell의 특징적인 marker인 lamellar body를 Lysotracker 형광(초록색)으로 30분동안 반응시킨 후 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 배양한 세포가 핵 주변에서 lamellar body를 나타내는 것을 확인하였는바, AT2 cell임을 확인하였다.
실시예 2. 센다이바이러스(Sendai virus)를 이용한 iPSC (induced pluripotent stem cell) 재프로그램화(Reprogramming)
2-1. 센다이바이러스를 이용한 트랜스덕션(transduction)
트랜스덕션에 적합한 상태로 폐포세포를 배양하기 위해 상기 실시예 1에서 얻은 사람 폐포세포를 6-well plate에 동일한 양으로 시딩(seeding)하였으며, 폐포세포가 2-well 이상 dish의 70 ~ 80% 정도 자랐을 때 well 하나의 세포 수를 확인하였다.
SAGM media 1 ml에 Cytotune™2.0 Sendai mix(Invitrogen사 제조)를 MOI=5-5-3(KOS MOI=5, hc-Myc MOI=5, hKlf4 MOI=3)로 믹스하여 6-well plate에 넣고 24시간 뒤 새 SAGM media로 교체하였으며, 2~3일마다 배지를 교체해 주었다.
상기 Cytotune™2.0 Sendai mix를 이용하여 트랜스덕션을 수행한지 7일째 되는 날 계대배양 하였다. 상기 계대배양을 하는 시점은 세포의 증식 속도에 따라 유동적일 수 있으며, Sendai mix 처리 후 플레이트 내의 세포밀도(density)가 약 70% 에서 80%가 되면 계대배양할 수 있다. 상기 세포가 자란 웰에서 SAGM media를 제거한 다음 PBS로 세척 후 TrypLE로 세포를 떼어내었다. 떨어진 세포를 SAGM media로 모아준 다음 1500 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 미리 준비한 세포배양플레이트(cell cultureplate)에 세포를 시딩하였다. 상기 세포배양플레이트는 PBS에 1/100 비율로 희석한 비트로넥틴(vitronectin, Gibco사 제조)으로 상온에서 1시간 코팅한 후, 잔존하는 비트로넥틴을 제거한 다음 PBS로 세척한 것이다. 세포를 시딩한지 7일 이내에 E8 배지로 교체해주고, 이후 매일 배지를 교체해주면서 3 ~ 4주까지 콜로니가 형성되는지 여부를 현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, 일정 기간이 지나면 콜로니가 형성되는 것을 확인할 수 있었으며, 이후 일정 기간이 더 경과하면, 상기 iPSC 콜로니는 외형적으로 커지고, 기존에 시딩한 세포 대비 세포의 가장자리 부분이 구분될 정도로 자라면서 iPSC 콜로니의 동그란 부분이 입체감있게 형성되는 모습을 확인할 수 있었다.
2-2. 센다이바이러스를 이용하여 제조된 유도만능줄기세포의 단백질 특성 분석
상기 사람 폐포세포로부터 제조된 유도만능줄기세포(iPSC)가 실제로 만능줄기세포의 성질을 가지는지 확인하기 위하여, Oct3/4, SSEA-4, 및 NANOG 등의 발현여부를 면역형광염색법을 통해 확인하였다. 염색 과정은 우선 4% 파라포름알데히드를 이용하여 세포를 고정한 후, PBS로 세정을 하고 1% BSA 용액으로 블로킹(blocking)을 하였다. Oct3/4, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, LIN28 및 NANOG에 대한 1차 항체(각각 Santa Cruz Biotechnology사 제조)를 처리하여 4 ℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, PBS로 세정 하고, 1차 항체인 Oct3/4, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, LIN28 및 NANOG에 대한 형광이 붙은 2차 항체(Alexa Fluor 594-conjugates, Santa Cruz Biotechnology사 제조)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세정을 하고, 마운팅(mounting) 용액으로 마운팅을 한 후 공초점현미경(confocal microscopy)을 사용하여 발현 여부를 분석하였다. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)는 DNA 염색을 통한 세포 내 핵의 시각화를 위해 사용되었다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 사람 폐포세포로부터 제조된 유도만능줄기세포에서 상기 iPSC 미분화 마커인 Oct3/4, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, LIN28 및 NANOG가 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 3. 사람 폐포세포로부터 제조된 유도만능줄기세포(iPSC)의 계대배양(subculture, passaging) 및 대량 배양
상기 실시예 2의 2-1에서 트랜스덕션을 수행한 후 계대배양한 세포 중에는 바이러스에 의해 트랜스덕션 되지 않은, 즉 재프로그램밍 되지 않은 세포도 함께 섞여 있다. 이에 유도만능줄기세포만 선택적으로 배양하고자 하기와 같은 방법으로 계대배양을 수행하였다. 새로운 세포배양접시를 PBS로 희석한 비트로넥틴으로 상온에서 1시간 코팅한 후 잔존 비트로넥틴을 제거한 다음 PBS로 세척해주었다. 상기 실시예 2의 2-1에서 트랜스덕션을 수행한 후 계대배양한 세포를 3 ~ 4주 가량 배양하면 콜로니가 형성되는데, 이 때, 세포에서 배지를 제거한 다음 PBS로 세척하고 10 μM ROCK inhibitor(Sigma사 제조)가 첨가된 E8 배지를 넣어준 후 현미경으로 관찰하면서 100 μl 파이펫 팁을 이용하여 유도만능줄기세포의 가장자리부터 세포를 조각내었다. 새로운 세포배양접시에 E8(w/ 10 μM ROCK inhibitor) 배지를 넣은 다음, 상기 조각낸 유도만능줄기세포를 E8 배지로 수확하여 상기 새로운 배양접시에 넣어주고 인큐베이터에서 배양하였다.
그 결과, 1일차에는 크기가 작고 가장자리 부분이 길쭉한 모양으로 붙어있지만, 시간이 경과할수록 상기 가장자리 부분이 둥글게 변하고 콜로니의 크기 또한 커지게 되는 것을 확인하였다. 또한, 세포 가운데에 존재하는 인(nucleolus)을 확인함으로써 유도만능줄기세포 콜로니가 정상적으로 분열하는 것을 확인하였다.
다음으로 유도만능줄기세포를 대량으로 배양하기 위하여 하기와 같은 방법으로 계대배양을 수행하였다. 상기 조각낸 유도만능줄기세포를 E8 배지에서 계대배양함으로써 유도만능줄기세포로만 구성된 콜로니를 얻었으며, 여기에 iPSC 전용 세포 분리 용액인 ReLeSR™(STEMCELL Technologies사 제조)을 상온에서 1분간 처리하였다. ReLeSR™ 용액을 제거한 다음, E8 배지로 세포를 수확한 후 1500 rmp에서 5분간 원심분리하였다. 상등액은 제거하고 펠릿을 E8(w/ 10 μM ROCK inhibitor) 배지로 현탁하였다. 상기 현탁한 세포를 미리 준비한 E8(w/ 10 μM ROCK inhibitor) 배지가 담긴 세포배양접시에 넣어 준 뒤 인큐베이터에서 배양하였다.
그 결과, 1일차와 비교하여 4일차에 세포의 콜로니가 증식하는 것을 확인할 수 있었다. 이처럼 ReLeSR™ 용액을 사용하면 단일 세포로 분리되므로, 콜로니가 증식하는 속도가 느려질 수 있다.
실시예 4. 유도만능줄기세포(iPSC)의 폐포 오가노이드로의 분화
도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 3에서 얻은 AT2 cell 유래 iPSC(AT2 iPSC)를 폐포 오가노이드로의 분화를 유도하여 폐포 오가노이드를 제조하였으며, 구체적인 방법은 하기와 같다.
4-1. AT2 iPSC의 내배엽성 세포(Endoderm cell)로의 분화
상기 실시예 3에서 얻은 AT2 iPSC는 비트로넥틴(vitronectin)이 코팅된 dish에서 배양하였으며, 배지는 하루에 한번 교체하였다. 배지는 TeSR™-E8™(STEMCELL #05990) 배지를 사용하였다. dish 내의 AT2 iPSC가 70~80%의 세포 밀집도에 도달하면 STEMdiff™ Definitive Endoderm Kit (STEMCELL #05110) 분화 배지를 사용하여 배양하였으며, 제조사의 지침에 따라, 배양 시 배지에 MR 및 CJ supplement를 넣고 2일간 배양한 뒤, CJ supplement만 넣고 2 ~ 4일간 배양하였다.
AT2 iPSC가 내배엽성 세포로 분화되었는지 확인하기 위하여 상기 실시예 2의 2-2에서 기술한 면역형광염색법을 사용하여 내배엽 특징 인자인 SOX17 및 FOXA2의 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 내배엽 특징 인자인 SOX17 및 FOXA2가 발현된 것을 확인할 수 있었다.
4-2. 내배엽성 세포의 폐포 오가노이드로의 분화
상기 실시예 4의 4-1에서 AT2 iPSC의 내배엽성 세포로의 분화까지는 culture dish에서 2차원 배양 방법으로 수행하였으며, 이후 과정은 Matrigel　 (Corning　 #356231)을 사용하여 Dome 형태의 3차원 배양 방법으로 진행하였고, Matrigel　은 60%로 사용하였다.
상기 실시예 4의 4-1의 내배엽성 세포를 폐와 기도 세포의 전구체인 전방 전장 내배엽 세포(Anterior Foregut endoderm cell)로 전환하기 위하여, AFM(Anterior Foregut endoderm Media) 배지를 사용하여 7일간 배양하였다. 그런 다음, alveolar progenitor로의 분화를 유도하기 위하여 SAGM™(Lonza #CC-3118) 배지를 사용하여 7일간 배양하고, SAGM 배지에서 배양이 끝나면 폐포 오가노이드의 성숙을 위하여 AM(Alveolar Media) 배지에서 계속 배양하였다. AM 배지에서 배양하는 동안 세포가 지속적으로 분열하여 spheroid의 세포 밀도가 너무 높아질 경우, Accutase (Corning　 #25-058-CI)를 사용하여 spheroid를 분리한 뒤, 다시 Matrigel　에 embedding하는 re-dome 과정을 반복하며 최대 90일간 배양하였다. 한편, spheroid가 구형을 유지하고 있으며, 적당한 세포 밀도를 유지하고 있고, 내강이 확인되는 경우, re-dome 과정 없이 AM 배지에서 계속 배양하였으며, spheroid를 구성하는 세포가 Alveolar epithelial 세포를 포함하는지 형광염색을 통하여 확인하였다. 사용한 AFM 배지 및 AM 배지의 구체적인 조성은 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2023009885-appb-img-000001
Figure PCTKR2023009885-appb-img-000002
4-3. 폐포 오가노이드의 분화 특성 확인
폐포 오가노이드의 분화 진행 과정별 특성을 확인하기 위하여 면역형광염색을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 분화 초기에 epithelial cell 인자인 EPCAM이 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 분화가 진행됨에 따라 2형 폐포세포(AT2)와 1형 폐포세포(AT1)의 발현이 나타나, 분화가 더 이루어지면 오가노이드 내부에 AT2 세포와 AT1 세포를 내포하고 있는 폐포 오가노이드(alveolar organoid)가 형성된 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따라 제조된 폐포 오가노이드는 사람 폐포세포 유래 유도만능줄기세포로부터 분화된 것으로 폐포세포의 후생학적 기억(epigenetic memory)으로 인해 반복적으로 폐포 오가노이드로 효율적으로 분화될 수 있고, 실제 폐포와 유사하게 재현될 수 있어 생체 호흡기 질환의 발병 과정에 대한 연구 및 치료 약물 발굴을 위한 스크리닝 등에 유용하게 활용될 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (8)

  1. 하기 단계를 포함하는 폐포세포 유래 유도만능줄기세포로부터 폐포 오가노이드를 제작하는 방법:
    a) 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 내배엽 세포 분화 유도용 배지에서 배양하여 내배엽성 세포(Endoderm cell)로 분화를 유도하는 단계;
    b) 상기 단계 a)의 내배엽성 세포를 AFM(Anterior Foregut endoderm Media) 배지에서 전방 전장 내배엽 세포(Anterior Foregut Endoderm cell)로 분화를 유도하는 단계;
    c) 상기 단계 b)의 전방 전장 내배엽 세포를 전구체 분화 배지에서 폐포 전구체(alveolar progenitor)로 분화를 유도하는 단계; 및
    d) 상기 단계 c)의 폐포 전구체를 AM(Alveolar Media) 배지에서 배양하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폐포세포는 2형 폐포세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 AFM 배지는 Ham's F12, 덱사메타손, IBMX(3-Isobutyl-methylxanthine), B27 보충제, N2 보충제, BSA(Bovine serum albumin), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 염화칼슘(CaCl2), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, Anti Antibiotic-Antimycotic, Ascobic acid, Glutamax, Recombinant Human BMP-4, 및 CHIR99021로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 AM 배지는 Ham's F12, 덱사메타손, IBMX(3-Isobutyl-methylxanthine), B27 보충제, N2 보충제, BSA(Bovine serum albumin), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 염화칼슘(CaCl2), 8-Br-cAMP, Recombinant Human KGF, Recombinant Human FGF-10, 및 Anti Antibiotic-Antimycotic로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 b) 내지 d)는 3차원 배양 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제작된 폐포 오가노이드.
  7. 내배엽 세포 분화 유도용 배지, AFM(Anterior Foregut endoderm Media) 배지, 전구체 분화 배지, 및 AM(Alveolar Media) 배지를 포함하는 폐포 오가노이드 제작용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    제1항의 폐포세포 유래 유도만능줄기세포로부터 폐포 오가노이드를 제작하는 방법이 기재된 지시서(instruction)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
PCT/KR2023/009885 2022-08-26 2023-07-11 폐포세포 유래 유도만능줄기세포를 이용한 폐포 오가노이드 제작 방법 WO2024043521A1 (ko)

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