WO2019147025A1 - Rad51 활성화제를 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달률을 향상시키는 방법 - Google Patents

Rad51 활성화제를 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달률을 향상시키는 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2019147025A1
WO2019147025A1 PCT/KR2019/000988 KR2019000988W WO2019147025A1 WO 2019147025 A1 WO2019147025 A1 WO 2019147025A1 KR 2019000988 W KR2019000988 W KR 2019000988W WO 2019147025 A1 WO2019147025 A1 WO 2019147025A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rad51
embryo
cell
activity
scnt
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/000988
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이동율
박경순
이아름
Original Assignee
차의과학대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 차의과학대학교 산학협력단 filed Critical 차의과학대학교 산학협력단
Priority to US16/964,439 priority Critical patent/US20210047615A1/en
Priority to CN201980009895.6A priority patent/CN111630176A/zh
Priority to CN202410121188.9A priority patent/CN117925511A/zh
Priority to JP2020540596A priority patent/JP2021511788A/ja
Publication of WO2019147025A1 publication Critical patent/WO2019147025A1/ko
Priority to JP2024053182A priority patent/JP2024102048A/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A61D19/04—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for embryo transplantation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B17/42—Gynaecological or obstetrical instruments or methods
    • A61B17/425—Gynaecological or obstetrical instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A61B17/435—Gynaecological or obstetrical instruments or methods for reproduction or fertilisation for embryo or ova transplantation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/065—Modulators of histone acetylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)

Definitions

  • a rad51 activator and a method for enhancing embryo development rate using the same.
  • embryonic stem cell preparation through somatic cell nucleus replacement may be the most advantageous method.
  • somatic cell nuclear transfer technology has a very low production efficiency, and the cause of failure is not well understood. Therefore, identification of the cause of low production efficiency and improvement of production efficiency remain to be solved for the commercialization of somatic cell nucleated cells.
  • Rad51 is one of the proteins involved in the repair of the truncated DNA double strand.
  • RPA replication protein A
  • Rad51 changes the RPA again to form a filament-like complex.
  • the homologous DNA sequence is searched for homologous chromosomes, etc., and DNA strands are exchanged to complete homologous recombination repair.
  • RS-1 a chemical substance that increases the enzyme activity of Rad51, is known to enhance homologous recombination efficiency by increasing the DNA binding activity of Rad51.
  • One aspect is to provide a composition for embryo development comprising a substance that increases the activity of Rad51.
  • Another aspect is to provide a method of increasing embryonic development efficiency comprising culturing an oocyte in a medium containing a substance that increases the activity of Rad51.
  • One aspect provides a composition for increasing the formation or development efficiency of an embryo embryo, comprising a substance that increases Rad51 activity. Yet another aspect provides a composition for increasing the efficiency of embryo formation or development, including Rad51 activator.
  • embryo formation means that the zygote becomes a plurality of cells through cell division, and these cells undergo cell division and differentiation to form an embryo or an embryo .
  • the term "increase in efficiency” means an increase in blastocyst development or blastocyst development of a somatic cell-cloned oocyte.
  • the above-mentioned blastocysts can be divided into the inner cell mass to differentiate into the fetus and the trophectoderm that can differentiate into the placenta after the embryo is densified in the process of growing the embryos repeatedly.
  • the increase in efficiency is due to an increase in the efficiency of somatic cell nuclear transfer compared with somatic cell nuclear transfer performed in the absence of a formulation that reduces H3K9me3 methylation, in particular, an increase in the embryo development efficiency of somatic cell cloned oocytes, Increased development of somatic cell nuclear transfer embryo into blastocyst stage, increased incidence in blastocyst stage, increased production efficiency of blastocyst, increased efficiency of blastocyst acquisition, or increased rate of development of blastocyst .
  • Rad51 refers to a gene expressed in an advanced organism, which is involved in repairs of DNA double-strand breaks, that is, a kind of Rad51 protein family as a DNA correcting agent.
  • the sequence and location of the gene are known in the art (NCBI Gene ID: 5888, etc.).
  • the substance that increases the activity of Rad51 may be commercially available under the trade name of, for example, RS-1 (RAD51-stimulatory compound-1) or may be obtained by a method known in the art such as high throughput screening (3 - [(benzylamino) sulfonyl] -4-bromo-N- (4-bromophenyl) benzamide bromo-N- (4-bromophenyl) benzamide), 4- bromo-N- (4-bromophenyl) -3 - [[(phenylmethyl) amino] sulfonyl] (4-bromophenyl) -3 - [[(phenylmethyl) amino] sulfonyl] -benzamide) or a compound of the following formula 1 or a derivative thereof:
  • the substance that increases the activity of Rad51 enhances the activity of Rad51 protein by maintaining the binding stability of rad51 protein having ssRNA (single strand DNA) or dsDNA (double strand DNA) having the function of correcting damaged DNA, And the like.
  • the medium composition may contain a substance that increases the activity of Rad51 in the base medium at a concentration of 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • the basal medium may be a basic medium used for culturing mammalian oocytes.
  • the basic medium differs depending on the species of the mammal, but may include any one or more selected from the group consisting of inorganic salts, carbon sources, amino acids, bovine serum albumin, and coadjuvants, and may include all conventional media known to those skilled in the art.
  • the inorganic salts include NaCl, KCl, and NaHCO 3.
  • the carbon source include glucose, sodium, pyruvate, and calcium lactate.
  • amino acids examples include essential amino acids such as glutamine, Other auxiliaries may be other trace elements and buffers.
  • the medium may be, for example, MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), Keratinocyte Serum Free Medium (K-SFM), Iscove's Modified Dulbecco's Medium And DMEM / F12.
  • the medium may also be supplemented with a mixture of neutral buffer (e.g., phosphate and / or high concentration bicarbonate) and protein nutrients (e.g., serum, such as FBS, fetal calf serum, horse serum, serum replacement, albumin, Amino acids and non-essential amino acids such as glutamine, L-glutamine).
  • neutral buffer e.g., phosphate and / or high concentration bicarbonate
  • protein nutrients e.g., serum, such as FBS, fetal calf serum, horse serum, serum replacement, albumin, Amino acids and non-essential amino acids such as glutamine, L-glutamine.
  • lipid fatty acid, cholesterol, HDL or LDL extract of serum
  • other components found in most types of storage medium of this kind (for example, transferrin, nucleoside or nucleotide, pyruvate,
  • glucose glucocorticoids such as hydrocortisone and / or a reducing agent such as? -Mercaptoethanol
  • the base medium may further include an antibiotic.
  • the substance that increases the activity of Rad51 may be added to the basal medium in the range of 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, 0.1 ⁇ M to 40 ⁇ M, 0.1 ⁇ M to 30 ⁇ M, 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, 1 ⁇ M to 30 ⁇ M, 5 ⁇ M to 30 ⁇ M, 25 ⁇ M.
  • concentration of the substance that increases the activity of Rad51 contained in the basic medium is less than the above range, it is impossible to effectively remove active oxygen, thereby inhibiting the development efficiency of the blastocyst of the oocyte.
  • a substance which increases the activity of Rad51 acts on the oocyte for a long time, which hinders the maturation of the oocyte.
  • the composition may further comprise an agent that reduces H3K9me3 methylation.
  • the agent for decreasing methylation may be one that increases the expression of a member of the KDM4 family of histone demethylating enzymes.
  • the agent may be one that increases the expression or activity of KDM4A (JMJD2A), KDM4B (JMJD2B), KDM4C (JMJD2C), KDM4D (JMJD2D), or a combination thereof.
  • Another aspect provides a method of increasing the embryo development efficiency of an oocyte, comprising culturing the oocyte in a medium containing a substance that increases the activation of Rad51.
  • the specific content of the medium containing the substance that increases the activation of Rad51 is as described above.
  • the method may comprise contacting the oocyte with an agent that reduces H3K9me3 methylation.
  • agent that reduces H3K9me3 methylation.
  • the details of the agent for reducing H3K9me3 methylation are as described above.
  • the oocyte may be frozen and thawed.
  • the method may include incubating the oocyte for 1 to 10 days in a medium containing a substance that increases the activity of Rad51. Specifically, it may be cultured for 1 to 10 days, for 1 to 8 days, for 1 to 7 days, for 2 to 8 days, for 2 to 6 days, or for 3 to 6 days. If the incubation period is less than the above range, there is a problem that the embryo is not enough to develop into a blastocyst. If the incubation period is over the range, it is difficult to obtain an improved blastocyst because the oocyte is over maturated.
  • the method may further comprise the step of developing the embryo obtained in the culturing step as an individual.
  • the subject may be a morula, a blastula and / or a gastrula.
  • Another aspect provides an embryo, blastocyst and / or embryonic stem cell produced by the method.
  • Another aspect provides a graft composition comprising the embryo and / or the blastocyst produced by the above method as an active ingredient.
  • Another aspect provides a method of increasing the efficiency of somatic cell nuclear transfer using materials that increase the activity of Rad51.
  • the efficiency may be the success rate of the somatic cell nuclear transfer, or the embryo development rate of the cell generated by the somatic cell nuclear transfer.
  • the embryo development rate may be the development into the blastocyst through the 2-cell, 4-cell and 8-cell groups of the embryo.
  • the present inventors confirmed that the expression of Rad51 was extremely low in the replication process of cells prepared by somatic cell nuclear transfer and compared with the in vitro fertilization process, and the results showed that the Rad51 activity-increasing substance dramatically improved the somatic cell replication efficiency. Therefore, Rad51 activator can be useful for the cell production by somatic cell nuclear transfer. If the substance that increases Rad51 activity is selected, the efficiency of somatic cell nuclear transfer can be remarkably increased.
  • the method comprises: preparing a nucleus of a somatic cell and an oocyte removed from the nucleus; Culturing the somatic cell nucleus and the nucleus-removed oocyte together with a substance that increases the activity of Rad51; And somatic-cell nuclear transfer (SCNT) cells.
  • SCNT somatic-cell nuclear transfer
  • the method comprises the steps of removing the nuclei of oocytes, implanting one or more somatic cell nuclei (donor nuclei), activating reconstructed nuclear-transferred oocytes (embryos), and further culturing with a blastocyst Step < / RTI > Steps for such somatic cell nuclear transfer (SCNT) can be performed by a person skilled in the art according to a method disclosed in Nature 419, 583-587, 10 October 2002, etc., as appropriate.
  • the method may include adding one or more somatic cells, i. E., One or more nuclei of the donor cells, comprising injecting the donor nuclei directly into the germinating cells or fusing the nucleus and cells via electrical stimulation.
  • somatic cells i. E., One or more nuclei of the donor cells
  • matic cell nuclear transfer or “somatic cell nuclear transfer” refers to a technique of transplanting a nucleus harvested from a donor cell into a donor cell from which the nucleus has been removed.
  • the nucleus-free oocyte may be cumulus-oocyte complexes collected from the follicles of a subject, or may be obtained commercially.
  • the subject may be a mammal, including a human.
  • the mammal may include rats, pigs, sheep, dogs, cows, horses, chlorine, and the like.
  • the nucleated oocyte may be frozen and / or cryopreserved.
  • freezing method sloe-freezing or vitrification, which is a quick freezing method, may be used.
  • the method according to one embodiment may include a step of culturing the somatic cell nucleus and the nucleus-free oocyte in vitro to form a blastocyst.
  • the substance that increases the activity of Rad51 may be added to a medium for culturing the somatic cell nucleus and the oocyte from which the nucleus has been removed.
  • a medium for culturing the somatic cell nucleus and the oocyte from which the nucleus has been removed For example, before the SCNT cell generation, after the generation, the 2-cell group, the 4- - Taxis, or they may be present in the medium at the time of blastocyst formation.
  • the concentration of the substance that increases the activity of Rad51 may be appropriately controlled by a person skilled in the art depending on the degree of Rad51 activation or cytotoxicity of the substance.
  • the concentration of the substance that increases the activity of Rad51 may be 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, 0.1 ⁇ M to 40 ⁇ M, 0.1 ⁇ M to 30 ⁇ M, 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, 1 ⁇ M to 30 ⁇ M, 5 ⁇ M to 30 ⁇ M or 5 ⁇ M to 25 ⁇ M.
  • the method according to one embodiment may comprise contacting the agent with H3K9me3 methylation reducing agent.
  • the agent that reduces H3K9me3 methylation may be one that increases the expression of members of the KDM4 family of histone demethylating enzymes.
  • the agent may be one that increases the expression or activity of, for example, KDM4A (JMJD2A), KDM4B (JMJD2B), KDM4C (JMJD2C), KDM4D (JMJD2D) or a combination thereof.
  • the contact step may be performed on a nucleus-implanted embryo after the nucleus of the somatic cell and the nucleus-removed egg are fused.
  • the embryo may be an embryo before activation of a somatic cell nuclear transfer oocyte gene.
  • the embryo may be incubated for 5 hours post activation (5 hpa) or between 10 and 12 hpa (i. E., At the 1-cell stage), or at about 20 hpa Or between 20 and 28 hpa (i. E., 2-celled) with one or more histone demethylating enzyme KDM4 family.
  • the step of contacting or injecting may include contacting or donating one or more histone demethylase KDM4 families to a donor cell, e. G., A terminally differentiated somatic cell nucleus or cytoplasm, prior to injecting the donor cell nucleus into the nucleated oocyte. It can be injected.
  • the contact or infusion may be contact with the donor somatic cell for at least 1 hour, or more than 2 hours, and the contact may be from 1 day (24 hours) to 2 days prior to removal of the nucleus from the donor somatic cell Day, more than three days, or more than three days.
  • the developmental efficiency may be to increase the percentage of development of somatic cell nuclear transfer embryos that develop into 2-cell, 4-cell and 8-cell or blastocyst stages. That is, it is possible to increase the pre-implantation development efficiency of the somatic cell nuclear transfer embryo to the 8-cell or blastocyst stage.
  • changes in the embryo status and number of blastocysts were determined according to the presence or absence of substances that increase the activity of Rad51 in somatic cell nuclear transfer.
  • the treatment of the substance that increases the activity of Rad51 decreased the embryo number of the 2-cell development block and the embryo development rate was significantly increased (FIG. 3A). Therefore, the substance that increases the activity of Rad51 may overcome development of 2-cell development and maintains continuous embryo development, thereby increasing the development efficiency of the blastocyst.
  • the method further comprises administering a therapeutically effective amount of a Rad51 inhibitor that is at least about 5%, at least about 10%, at least about 13%, at least about 15% , About 30% or more, about 50% or more, 50 to 80% or more than 80%. That is, it is possible to increase the efficiency of the pre-implantation development of a somatic cell nuclear transfer embryo, or to increase the development of the embryo to the blastocyst stage or to increase the development of the embryo to the expanded blastocyst stage by about 5%, about 7% %, About 12 or more, or more than 12%.
  • the method is characterized by a successful development to a blastocyst stage compared to a somatic cell nuclear transfer performed in the absence of a substance that increases the activity of Rad51 is at least 3 times, at least 4 times, at least 5 times, at least 6 times, 7 times, 8 times or more than 8 times.
  • An increase in the somatic cell nuclear transfer efficiency means an increase or an increase in the production of blastocysts.
  • the increase or increase in the production or yield of the blastocyst is greater than or equal to about 110%, greater than about 120%, greater than about 130%, greater than about 140%, or less than about 120%, compared to somatic cell nuclear transfer performed in the absence of a material that increases the activity of Rad51. , More than about 150%, or more than about 150%.
  • the method according to one aspect can prevent the cell damage of somatic cell nuclear transfer oocyte by culturing the somatic cell nuclear transfer embryo in a medium containing a substance that increases the activity of Rad51, thereby improving the quality of the oocyte .
  • apoptosis of somatic cell nuclear transfer embryos frozen and thawed by the Rad51 activator is reduced, blastocyst formation and production efficiency can be improved.
  • the implantation rate of the somatic cell nuclear transfer embryo is improved, it is possible to produce an endangered animal through in vitro fertilization. As the induction of embryonic stem cells is promoted, the embryonic stem cell line can be efficiently produced.
  • the embryo is genetically modified, and can be modified, for example, prior to somatic cell nuclear transfer (i. E., Prior to donor nuclei collection and fusion with the cytoplasm of the recipient oocyte) Lt; / RTI >
  • the embryo may comprise nuclear DNA derived from donor somatic cells, cytoplasm derived from recipient oocytes, and mitochondrial DNA derived from a third donor individual.
  • the embryonic stem cells are obtained by separating the cells from the inner cell mass in a blastocyst prepared according to the method; And culturing the undifferentiated inner cell mass-derived cells.
  • the embryonic stem cells may be pluripotent stem cells or pluripotent stem cells.
  • a method of preparing a cell Culturing the somatic cell nucleus and the oocyte from which the nucleus has been removed together with the candidate substance; And a step of evaluating Rad51 activity of the somatic cell nucleated cells generated after the culturing, thereby increasing the activity of Rad51, thereby screening a substance that increases somatic cell replication efficiency.
  • Cells derived from somatic cell nuclear transfer embryos or blastocysts may be used in a test to determine whether the agent affects differentiation or cell proliferation. For example, the ability of the cells to differentiate or proliferate is evaluated from the presence or absence of the agent and can be used for screening to select agents that affect cells derived from somatic cell nuclear transfer embryos or blastocysts .
  • the test compound may be any compound of interest, including chemical compounds, small molecules, polypeptides or other biological agents (e. G., Antibodies or cytokines, etc.).
  • the step of evaluating the activity of Rad51 is to confirm the degree of expression of Rad51, and may be performed using techniques well known in the art such as RT-PCR or immunostaining.
  • the step of evaluating the Rad51 activity may be performed together with the step of evaluating the somatic cell replication efficiency.
  • the candidate substance increases the activity of Rad51 , And can further be determined to be a substance that increases somatic cell replication efficiency by somatic cell nuclear transfer.
  • a method of preparing an oocyte Obtaining somatic cell nuclear transfer (SCNT) cells by culturing oocytes in which the nuclei and nuclei of the somatic cells have been removed in a medium containing a substance that increases the activity of Rad51; And a step of in vitro fertilization of the somatic cell nuclear transfer cells and the liquid semen of the somatic cell transplantation embryo.
  • SCNT somatic cell nuclear transfer
  • the somatic cell nuclear transfer cell may be a somatic cell nuclear transfer embryo, specifically, a cell line of a 2-cell line, a 4-cell line and an 8-cell line, and may be a cell that has developed into the blastocyst stage and has reached the blastocyst stage.
  • the method according to one embodiment comprises in vitro fertilization of the somatic cell nuclear transfer cell and the liquid semen.
  • the semen may be a semen taken from the body of the subject.
  • the subject may be a mammal, including a human.
  • the mammal may include rats, pigs, sheep, dogs, cows, horses, chlorine, and the like.
  • the somatic cell nuclear transfer cell and the liquid semen may be in vitro fertilized in the in vitro fertilization medium composition for 1 to 7 days. At this time, when the IVF period is less than the above range, there is a problem that it can not be corrected, and when it exceeds the above range, the embryo is degraded.
  • the above step may further include contacting or injecting a substance that increases the activity of Rad51.
  • the details of the substance that increases the activity of Rad51 are as described above.
  • the substance that increases the activity of Rad51 can be obtained by injecting semen into a somatic cell nuclear transfer cell, then injecting semen before pronuleus formation (18 hours after semen injection), specifically semen, It may be contacted or injected into the fertilized egg. Therefore, the somatic embryo-transferred embryo is successfully developed into a blastocyst through the 2-, 4-, and 8-cell stage without progression of the somatic cell nuclear transfer embryo (embryo), development defect, or loss of viability, Can be increased.
  • the present invention relates to a composition for embryo development comprising Rad51 activator and a method for improving the embryo development rate using the Rad51 activator.
  • the cell efficiently develops into a blastocyst without cell injury and / or developmental arrest, Can be used to produce somatic cell cloned embryos.
  • FIG. 1A shows the results of RT-PCR analysis of the expression level of Rad51 in the SCNT process in which IVF, SCNT using fresh egg, and Kdm4a mRNA are injected into the oocyte.
  • FIG. 1B shows the results of RT-PCR analysis of the expression level of Rad51 in SCNT using IVF, freeze-dried SCNT and fresh oocyte.
  • FIG. 2 shows the results of immunostaining analysis of the degree of Rad51 expression in IVF, SCNT using cryopreserved oocytes and SCNT using fresh oocytes.
  • FIG. 3A is a photograph showing changes in the number of embryos and blastocysts in a state where the 2-cellogenesis is stopped in the SCNT process depending on the presence or absence of Rad51 activator.
  • FIG. 3B is a photograph showing the correlation between autophagy and mitochondria in IVF, SCNT, and SCNT + RS-1 eggs.
  • FIG. 4 is a photograph showing mitochondrial activity in IVF, SCNT, and SCNT + Kdm4a eggs.
  • FIG. 5A is a photograph showing cell damage in IVF, SCNT, and SCNT + RS-1 eggs.
  • FIG. 5B is a photograph showing the expression of DNA damage biomarkers in IVF, SCNT, and SCNT + RS-1 eggs.
  • FIG. 5C is a photograph showing DNA damage by cell cycle in IVF, SCNT, and SCNT + RS-1 eggs.
  • FIG. 6 is a graph showing the DNA cleavage in IVF, SCNT, and SCNT + RS-1 eggs.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of RS-1 treatment on the SCNT oocyte through increase or decrease in gene expression.
  • Fig. 8 is a photograph showing the mechanism pattern of SCNT according to RS-1 treatment and Kdm4a mRNA treatment through H3K9me3 staining.
  • FIG. 9A is a table for confirming the replication yield of SCNT eggs according to RS-1 treatment.
  • FIG. 9B is a graph showing the embryonic stem cell induction rate of SCNT oocytes according to RS-1 treatment.
  • the cumulus cells injected into donor cells were artificially activated in the culture medium containing RS-1 (Rad51-stimulatimulatory compound 1). Then, the cells were cultured in the culture medium to which the RS-1 reagent was added for 22 hours, and cultured in the KSOM culture medium for 72 to 96 hours after 22 hours.
  • RS-1 Rad51-stimulatimulatory compound 1
  • Full-length mouse Kdm4a / Jhdm3a cDNA was cloned into a pcDNA3.1 plasmid containing poly (A) 83 at the 3 'end of the cloning site using an In-Fusion Kit (Clonetech # 638909).
  • MRNA was synthesized from a template plasmid linearized by in vitro transcription using mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Life Technologies # AM1345). The synthesized mRNA was dissolved in nuclease-free water. The concentration of mRNA was measured using a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies); Aliquots of mRNA were stored at -80 ° C until use.
  • Example 2 ⁇ g / ⁇ l of the Kdm4a mRNA prepared in Example 2-1 was treated with RS-1 and RS-1 treated with RS-1 for 6 hours in the active medium using a piezo-driven micromanipulator Respectively.
  • KSOM culture medium containing RS-1 and RS-1-free culture medium were cultured for 22 hours, respectively. After culturing for 72-96 hours, the blastocyst efficiency was observed .
  • IVF In vitro fertilization
  • SCNT somatic cell nuclear transfer embryos
  • F / T SCNT somatic cell nuclear transfer embryos
  • Kdm4a mRNA injected with SCNT + Kdm4a cloned oocytes
  • Rad51 which regulates homologous recombination.
  • the embryo mRNA was isolated using the Dynabeads mRNA DIRECT kit (Dynal Asa, Oslo, Norway). Twenty embryos of Pronuclear stage (PN), 2-cell and 4-cell stage were washed in dissolution / binding buffer and mixed with Dynabeads oligo dT 25 at room temperature.
  • Reverse primer 5'-GCTTCAGCTTCAGGAAGACA-3 '.
  • RNA expression of Rad51 was significantly reduced compared to the 4-cell group formed by IVF in the 4-cell group formed by somatic cell nuclear transfer (SCNT), and the result was re-analyzed by immunostaining.
  • somatic embryonated oocytes were activated for 30 hours and then washed with PBS containing 0.1% BSA at 2-cell stage and treated with 4% paraformaldehyde at room temperature for 30 minutes.
  • PBS / 0.1% BSA supplemented with 0.1% Triton X for 24 hours Rad 51, ⁇ H2AX, Mitotracker and LC3B antibodies were treated at room temperature for 2 hours.
  • the cells were then washed three times for 10 minutes in PBS supplemented with 0.1% BSA and treated with goat anti-mouse and donkey anti-rabbit antibodies for 1 hour each.
  • the cells were washed three times for 10 minutes in PBS / 0.1% BSA and stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • RS-1 a substance that increases the activity of Rad51, was treated with somatic cell replication, and then it was analyzed whether somatic cell replication efficiency was improved.
  • RS-1 0, 1, 5, and 10 ⁇ M were injected into the in vitro fertilization (IVF) oocyte and the somatic cell nuclear transfer embryo (SCNT) in Example 1 to determine if RS- , F / T SCNT) to select appropriate concentrations.
  • Control Based on the number of control oocytes + reconstructed oocytes.
  • the mitochondrion was used in dark conditions at 37 ° C for 30 min at a concentration of 300 nM in M16 medium supplemented with 0.3% BSA. After washing, oocytes were fixed, immunofluorescent stained with LC3B antibody, and stained with DAPI.
  • the autophagy and mitochondrial distribution condensed on the cytoplasm in the SCNT group were found to be expressed as small dots.
  • the SCNT group treated with RS-1 an expression pattern similar to that of the IVF group .
  • the expression of autophagy and mitochondria was uniformly distributed in the nucleus and cytoplasm of the IVF group.
  • the SCNT group and the SCNT + RS-1 group autophagy and mitochondria were intensively expressed in the nucleus.
  • the SCNT group which stopped development at the 2 - cell stage, could detect the singularity that is expressed only in the cytoplasm without expression in the nucleus.
  • the expression patterns were similar in all groups (Fig. 3B).
  • Example 5 In vitro fertilization Analysis of mitochondrial activity in somatic cell nuclear transfer embryos compared to oocytes
  • IVF In vitro fertilization
  • SCNT somatic cell nuclear transfer embryos
  • F / T SCNT somatic cell nuclear transfer embryos
  • Kdm4a mRNA cloned oocytes
  • JC-1 somatic cell oocytes of SCNT-derived 1-cellocyte, 2-cellocyte, and 4-cellocyte were quantitated by using JC-1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass., USA) Mu] g / ml, and cultured in the dark for 20 minutes. The nuclei were then stained with Hoechst (Sigma).
  • IVF In vitro fertilization
  • SCNT F / T SCNT
  • SCNT somatic cell nuclear transfer embryos
  • Example 1 In vitro fertilization (IVF) oocytes, SCNT (F / T SCNT), and somatic cell nuclear transfer embryos (SCNT) in Example 1 were examined in order to confirm whether or not the cells damaged by RS- 4-1, the presence of reactive oxygen species in the 2-cell group of somatic cell nuclear transfer embryos (SCNT + RS-1) treated with RS-1 was confirmed.
  • the IVF group, the SCNT + RS-1 group and the SCNT group of the 2-cell cytoplasm were incubated for 30 minutes in a culture medium supplemented with 5 ⁇ M of a CELLROX oxidative stress reagenent at 37 ° C. for 30 minutes in a dark condition . Thereafter, the cells were washed with D-PBS containing 0.1% PVA, and the nuclei were stained with Hoechst (Sigma).
  • IVF in vitro fertilization
  • SCNT F / T SCNT
  • SCNT somatic cell nuclear transfer embryos
  • Example 1 In vitro fertilization (IVF) oocytes, SCNT (F / T SCNT), and somatic cell nuclear transfer embryos (SCNT) in Example 1 were examined in order to confirm DNA damage of the somatic cell cloned oocytes according to RS- 4-1 showed the expression of the DNA-damaged biomarker (rH2AX) of RS-1-treated somatic cell nuclear transfer embryos (SCNT + RS-1).
  • rH2AX (Abcam, ab22551) and Rad51 (Abcam) were fixed after fixation of IVF group, SCNT group and SCNT + RS-1 group immobilized on 4% paraformaldehyde to 1-cell, 2- , ab63801) for 2 hours and incubated for 1 hour with a goat anti-rabbit antibody diluted 1: 200 with the same concentration of goat anti-mouse diluted in PBS / 0.1% BSA. Nuclei were then stained with DAPI.
  • Rad51 and rH2AX were very poor in the 4-cell nucleus of the SCNT group. That is, when RS-1 was treated in somatic cell nuclear transfer, DNA damage was significantly increased in the course of replication from the 2-cell stage to the 4-cell stage (FIGS. 5B and 5C).
  • SCNT oocytes SCNT, F / T SCNT
  • RS-1 treated SCNT oocytes in Example 1 above, single cell electrophoresis assay. Specifically, in order to confirm DNA damage, each sample was suspended in 1 ml of a 1 ml agarose solution at 37 ° C in a 1 ml tube removed from the culture solution, and then fixed on a previously coated slide (Trevigen). The slides were incubated at 4 ° C for 4 hours and then immersed in a 4 ° C solution of Trevigen for 4 hours.
  • the slides were removed from the lysis solution and immersed in 4 ° C 1X TAE buffer for 30 minutes and electrophoresed for 30-40 minutes.
  • the slides were immersed in 1 M ammonium acetate at room temperature for 30 minutes and then fixed at 75 < 0 > C. After being fixed at room temperature for 30 minutes, the agarose was incubated at 42 ° C for 20 minutes until completely dried. The cells were then stained with 1X SYBR green I staining solution for 5 minutes.
  • RS-1 was treated with RNA sequencing by oocytes of the 2-cell stage in the somatic cell replication process of Example 1 above.
  • IVF in vitro fertilization
  • oocytes were used as a negative control group.
  • complementary DNA (cDNA) was amplified using SMARTer Ultra Low Input RNA cDNA Preparation Kit (Takara, 634890) according to the manufacturer's instructions.
  • CDNA was fragmented into approximately 200 bp fragments using an M220 sonicator (Covaris). Fragmented cDNAs were ligated to the adapter and adapter.
  • the sequencing library was prepared using the ScriptSeq v2 kit (Illumina) according to the manufacturer's instructions. Single-ended sequencing was performed on HiSeq2500 (Illumina) and mapped to the mm9 mouse genome using STAR (v2.5.2b, https://github.com/alexdobin/STAR). Subsequently, fragments per kilobase per million read (FPKM) were calculated by the cufflink (v2.2.1) using the default option.
  • H3K9me3 staining it has been demonstrated through H3K9me3 staining that somatic cell nuclear transfer following RS-1 treatment and Kdm4a mRNA treatment is achieved through a separate mechanism.
  • the IVF group, the SCNT group, and the SCNT + RS-1 group immobilized on the paraformaldehyde were fixed to the 1-cell group, and then cultured for 2 hours with the H3K9me3 antibody (Millipore, 07-442) And incubated with goat anti-rabbit antibody diluted in PBS / 0.1% BSA for 1 hour. Nuclei were stained with DAPI.
  • somatic cell nuclear transfer according to RS-1 treatment and Kdm4a mRNA treatment is completely due to a separate mechanism (FIG. 8).
  • the production rate of replicated mice is reported to be about 1% after normal somatic cell cloning. Therefore, the rate of conception and replication of the somatic cell nuclear transfer embryos was confirmed by RS-1 treatment. Specifically, the embryos were transplanted into the uterus of a surrogate female ICR mouse that was 0.5 days after transplantation of the 2-cell group of SCNT and SCNT + RS-1 oocytes. On the day 19.5 days after transplantation, the somatic cell clone mouse was removed from the surrogate mother's uterus, and the embryo body was buried and raised together with the normal ICR mice born on the same day of the ICR mice raising the cloned mice.
  • SCNT somatic cell nuclear transfer embryo
  • the cells were incubated with 1.5X103 units / ml recombination mLif (Chemicon) containing 20% KSR, 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 1% nonessential amino acids, 100 units / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin ) was used as a culture solution. Trypsin-EDTA was used to transfect the established somatic cell cloned mouse embryonic stem cells and treated with alkaline phosphatase to evaluate the stem cells established by histochemical staining.
  • the induction rate of embryonic stem cells was significantly higher in the RS-1 treated group (SCNT + RS-1) than in the RS-1 untreated group (17% vs. 45%) 9b).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

일 양상은 Rad51의 활성을 증가시키는 물질(RS-1)을 이용하여 체세포 핵 이식의 효율을 증가시키는 방법 및 이에 따라 제조된 체세포 핵 치환 세포를 제공한다. 다른 양상은 체세포 핵 치환의 효율을 증가시키기 위해 Rad51의 활성을 증가시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. Rad51의 활성을 증가시키는 물질을 이용하면 체세포 핵 치환의 효율을 증가시킬 수 있다.

Description

RAD51 활성화제를 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달률을 향상시키는 방법
Rad51 활성화제를 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달률을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
환자 면역 적합성 줄기세포를 제작하기 위한 목적으로는 체세포 핵 치환을 통해 배아 줄기세포를 제조하는 것이 가장 유리한 방법일 수 있다. 그러나, 체세포 핵 치환 기술은 그 제조 효율이 매우 낮으며, 실패하는 원인 또한 제대로 규명되어 있지 않다. 따라서, 제조 효율이 낮은 원인을 규명하고 제작 효율을 높이는 것이 체세포 핵 치환 줄기세포의 상용화를 위해 해결해야 할 과제로 남아있다.
유전체의 항상성을 위해서 DNA는 손상 없이 보존되어야 하는데, 그 중 가장 치명적인 DNA 손상은 DNA 이중나선의 절단이며, 절단된 DNA 이중나선의 복구에 관여하는 단백질 중 하나로 Rad51이 있다. DNA 이중나선 절단이 발생하면 먼저 엑소뉴클리에이스(exonuclease)에 의해 절단부위에 단일나선 DNA가 형성되고, 이 단일나선은 복제 단백질 A(replication protein A: RPA)에 의해 코팅되면서 보호된다. 그 후, 재조합 단백질 Rad51이 다시 RPA를 교체하면서 필라멘트 형태의 복합체를 형성하고, 상동염색체 등을 탐색하여 상동염기서열을 찾은 후 DNA 가닥을 교환하는 과정을 거쳐 상동재조합 수선이 완성된다.
또한, Rad51의 효소 활성을 증가시키는 화학물질인 RS-1은 Rad51의 DNA 결합 활성(binding activity)을 증가시킴으로써, 상동재조합 효율을 향상시키는 것으로 알려져 있다.
일 양상은 Rad51의 활성을 증가시키는 물질을 포함하는, 배아 발달용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 난자를 Rad51의 활성을 증가시키는 물질이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 배아 발달 효율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 Rad51 활성을 증가시키는 물질을 포함하는, 수정란의 배아의 형성 또는 발달 효율을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다. 또 다른 양상은 Rad51 활성화제를 포함하는, 배아의 형성 또는 발달의 효율을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "배아의 형성"은 접합체(zygote)가 세포분열을 통해 여러 개의 세포가 되고, 이 세포들이 세포분열과 분화를 거쳐 배아(embryo)를 형성하는 것 또는 배아로 발생하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "효율의 증가"은 체세포 복제된 난자의 배반포 발달 또는 배반포 발달의 증가를 의미한다. 상기 배반포란 수정란이 난할을 거듭하여 자라는 과정에서 치밀화된 상실배 이후에 배반포강을 형성하여 태아로 분화할 내세포피(inner cell mass)와 태반으로 분화할 영양막세포(trophectoderm)로 구분이 될 정도로 발육된 상태의 수정란을 의미한다. 따라서, 상기 효율의 증가는 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제의 부존재 하에서 수행된 체세포 핵 이식과 비교하여 체세포 핵 이식의 효율이 증가하는 것, 구체적으로 체세포 복제된 난자의 배아 발달 효율이 증가하는 것, 체세포 핵 이식 배아의 배반포 단계로의 발달이 증가하는 것, 배반포 단계로의 발생이 증가하는 것, 배반포의 생성 효율이 증가하는 것, 배반포의 수득 효율이 증가하는 것 또는 배반포의 발달 형성율이 증가하는 것을 의미한다.
본 명세서 내 용어, "Rad51"은 진행 생물에서 발현되는 유전자로서, DNA 이중 가닥 절단의 수리에 관여하는, 즉 DNA 교정제로서 Rad51 단백질 패밀리의 일종을 의미한다. 상기 유전자의 서열 및 위치 등은 당해 분야에 공지되어 있다(NCBI Gene ID: 5888 등).
상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질은 예를 들면 RS-1(RAD51-stimulatory compound-1)이라는 품명으로 상업적으로 구매 가능한 것이거나, 고속 대량 스크리닝(high throughput screening: HTS) 등 당업계에 알려진 방법에 따라 Rad51과 결합하는 물질을 선별한 것 또는 3-[(벤질아미노)설포닐]-4-브로모-N-(4-브로모페닐)벤자마이드(3-[(benzylamino)sulfonyl]-4-bromo-N-(4-bromophenyl)benzamide), 4-브로모-N-(4-브로모페닐)-3-[[(페닐메틸)아미노]설포닐]-벤즈아미드(4-Bromo-N-(4-bromophenyl)-3-[[(phenylmethyl)amino]sulfonyl]-benzamide) 또는 아래 화학식 1의 화합물 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2019000988-appb-I000001
.
상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질은 손상된 DNA의 교정기능이 있는 Rad51 단백질의 ssRNA(single strand DNA) 또는 dsDNA(double strand DNA)에의 결합 안정성을 유지시켜 줌으로써 Rad51 단백질의 활성을 높이는 바, DNA 교정 효과를 지속시키는 기능을 가질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 배지 조성물은 기본 배지에 Rad51의 활성을 증가시키는 물질이 0.1 μM 내지 50 μM의 농도로 포함된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 기본 배지는 포유동물 난자의 배양에 사용되는 기본배지인 것일 수 있다. 상기 기본배지는 포유동물의 종에 따라 차이가 있으나, 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청 알부민 및 보조인자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하며, 당업자에게 알려진 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있다. 상기 무기염류로는, NaCl, KCl 및 NaHCO3 등을 사용할 수 있고, 탄소원으로는 글루코스, 나트륨, 피루베이트 및 젖산칼슘염 등을 사용할 수 있으며, 아미노산으로는 글루타민을 비롯한 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 보조인자로는 기타 미량 원소 및 완충액 등을 사용할 수 있다. 상기 배지는 예를 들어, MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), F12 및 DMEM/F12로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다. 또한, 배지는 등장액 중의 중성 완충제(예를 들면 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예를 들면 FBS, FCS (fetal calf serum), horse serum, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예를 들면 글루타민, L-글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예를 들면 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예를 들면 글루코스, 글루코코르티코이드, 예를 들면 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예를 들면 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다. 또한, 상기 기본배지에는 항생제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질은 상기 기본배지에 0.1 μM 내지 50 μM, 0.1 μM 내지 40 μM, 0.1 μM 내지 30 μM, 1 μM 내지 50 μM, 1 μM 내지 30 μM, 5μM 내지 30 μM 또는 5μM 내지 25 μM로 포함될 수 있다. 이때, 상기 기본배지에 포함되는 Rad51의 활성을 증가시키는 물질의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 활성산소를 효과적으로 제거할 수 없으므로, 난자의 배반포 발달 효율을 저해하는 바, 좋은 품질의 난자를 수득할 수 없다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, Rad51의 활성을 증가시키는 물질이 난자에 오랜 시간 동안 작용하여 난자의 성숙을 방해하는 문제점이 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 메틸레이션을 감소시키는 제제는 히스톤 탈 메틸화효소의 KDM4 패밀리의 구성원의 발현을 증가시키는 제제인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 제제는 KDM4A(JMJD2A), KDM4B(JMJD2B), KDM4C(JMJD2C), KDM4D(JMJD2D) 또는 이의 조합의 발현 또는 활성을 증가시키는 것일 수 있다.
다른 양상은 Rad51의 활성화를 증가시키는 물질이 포함된 배지에서 난자를 배양하는 단계를 포함하는, 난자의 배아 발달 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 Rad51의 활성화를 증가시키는 물질이 포함된 배지의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 구체예에서, 난자에 H3K9me3 메틸레이션(methylation)을 감소시키는 제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 H3K9me3 메틸레이션(methylation)을 감소시키는 제제의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 또한, 상기 난자는 냉동 후 융해된 것일 수 있다.
상기 방법은 Rad51의 활성화를 증가시키는 물질이 포함된 배지에서 난자를 1 내지 10일 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 1 내지 10일, 1 내지 8일, 1 내지 7일, 2 내지 8일, 2 내지 6일, 또는 3 내지 6일 동안 배양하는 것일 수 있다. 이때, 배양 기간이 상기 범위 미만인 경우, 배아가 배반포로 발달하기에 충분하지 못하다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 난자가 과도하게 성숙하여 질적으로 향상된 배반포의 수득이 어렵다는 문제점이 있다.
또한, 상기 방법은 상기 배양하는 단계에서 얻어진 배아를 개체로 발달시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 개체는 상실배(morula), 포배(blastula) 및/또는 낭배(gastrula)인 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 배아, 배반포 및/또는 배아줄기세포를 제공한다. 또 다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 배아 및/또는 배반포를 유효성분으로 포함하는 이식용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 Rad51의 활성을 증가시키는 물질을 이용하여 체세포 핵 이식의 효율을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 효율은 체세포 핵 이식의 성공률, 상기 체세포 핵 이식에 의해 생성된 세포의 배아 발달률인 것일 수 있다. 상기 배아 발달률은 배아의 2-세포기, 4-세포기 및 8-세포기를 거쳐 배반포로의 발달을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명자들은 체세포 핵 이식에 의해 제조된 세포의 복제 과정에서 체외 수정 과정에 비해 Rad51의 발현도가 매우 낮음을 확인하고, Rad51 활성 증가 물질이 이 체세포 복제효율을 획기적으로 향상시키는 결과를 확인하였다. 따라서 Rad51 활성화제는 체세포 핵 이식에 의한 세포 제조에 유용하게 사용될 수 있으며, Rad51 활성을 증가시키는 물질을 선별해 내면 체세포 핵 이식의 효율을 현저히 상승시킬 수 있다.
상기 방법은 체세포의 핵 및 핵이 제거된 난자를 준비하는 단계; 상기 체세포의 핵 및 핵이 제거된 난자를 Rad51의 활성을 증가시키는 물질과 함께 배양하는 단계; 및 체세포 핵 치환(somatic-cell nuclear transfer: SCNT) 세포를 얻는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 난모세포의 핵을 제거하는 단계, 하나 또는 그 이상의 체세포의 핵(공여 핵)을 이식하는 단계, 재구축된 핵 이식된 난모세포(배아)를 활성화하는 단계, 및 배반포로 추가적으로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 체세포 핵 이식(somatic-cell nuclear transfer: SCNT)을 위한 단계들은 문헌(Nature 419, 583-587, 10 October 2002) 등에 공개된 방법에 따라 통상의 기술자가 적절히 변형하여 수행할 수 있다.
상기 방법은 공여 핵을 난모 세포에 직접 주입 또는 전기 자극을 통해 핵과 세포를 융합시키는 것을 포함하는 하나 이상의 체세포, 즉 공여체 세포의 하나 이상의 핵을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
"체세포 핵 치환" 또는 "체세포 핵 이식"은 공여 세포에서 채취한 핵을, 핵이 제거된 수여 세포에 이식하는 기술로서, 공여 세포와 유전적으로 동일한 세포를 발생시키는 기술을 의미한다.
상기 핵이 제거된 난자는 개체의 난포로부터 채취한 난구세포-난모세포 복합체(cumulus-oocyte complexs)인 것일 수 있으며, 상업적으로 수득한 것일 수 있다. 상기 개체는 인간을 포함한 포유동물인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 쥐, 돼지, 양, 개, 소, 말, 염소 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵이 제거된 난자는 동결되거나 및/또는 냉동보존된 것일 수 있다. 상기 동결 방법으로는 완만동결법(sloe-freezing) 또는 초급속동결법인 유리화동결법(vitrification)이 사용될 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 체세포의 핵 및 핵이 제거된 난자를 체외(in vitro)로 배양하여 배반포를 형성하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질은 체세포의 핵 및 핵이 제거된 난자를 배양하는 배지에 첨가될 수 있으며, 예를 들면 SCNT 세포 생성 전, 생성 후, 2-세포기, 4-세포기, 8-세포기, 또는 배반포 형성시에 배지에 존재하는 것일 수 있다. 상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질의 농도는 상기 물질의 Rad51 활성화 정도 또는 세포 독성에 따라 통상의 기술자가 적절히 조절할 수 있으며, 예를 들면, 상기 배지에 0.1 μM 내지 50 μM, 0.1 μM 내지 40 μM, 0.1 μM 내지 30 μM, 1 μM 내지 50 μM, 1 μM 내지 30 μM, 5μM 내지 30 μM 또는 5μM 내지 25 μM의 농도로 존재할 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 H3K9me3 메틸레이션(methylation)을 감소시키는 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제는 히스톤 탈메틸화효소의 KDM4 패밀리의 구성원의 발현을 증가시키는 제제인 것일 수 있다. 상기 제제는 예를 들어, KDM4A(JMJD2A), KDM4B(JMJD2B), KDM4C(JMJD2C), KDM4D(JMJD2D) 또는 이의 조합의 발현 또는 활성을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 접촉시키는 단계는 체세포의 핵 및 핵이 제거된 난자가 융합된 후, 핵 이식된 배아에 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배아는 체세포 핵 이식 난모세포 유전자의 활성화가 시작되기 전의 배아인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 배아를 활성화 후 5시간(5 hours post activation, 5 hpa) 이 또는 10~12 hpa 사이에(즉, 1-세포기에), 또는 약 20 hpa(즉, 초기 2-세포기) 또는 20~28 hpa 사이에(즉, 2-세포기) 하나 이상의 히스톤 탈메틸화효소 KDM4 패밀리와 접촉시키는 것일 수 있다.
또한, 상기 접촉 또는 주입시키는 단계는 공여자 세포의 핵을 핵이 제거된 난모세포로 주입하기 전에 공여자 세포, 예를 들어, 최종 분화된 체세포 핵 또는 세포질에 하나 이상의 히스톤 탈메틸화효소 KDM4 패밀리가 접촉 또는 주입되는 것일 수 있다. 상기 접촉 또는 주입은 공여자 체세포와 1시간 이상, 또는 2 시간 이상 동안 접촉하는 것일 수 있고, 상기 접촉은 공여자 체세포로부터 핵이 제거된 난모세포로의 핵 제거 이전에 1일(24시간) 이상, 2일 이상, 3일 이상, 도는 3일 초과로 수행되는 것일 수 있다.
따라서, 상기 체세포의 핵 및 핵이 제거된 난자를 H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제와 접촉시킴으로써 체세포 핵 이식 배아에서 복제를 저해했던 히스톤메틸효소의 활성을 감소시고, 배아 발생 관련 유전자의 발현을 증진시키는 바, 배반포의 발생 및 발달 효율을 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 발달 효율은 2-세포, 4-세포 및 8-세포 또는 배반포 단계로 발달하는 체세포 핵 이식 배아의 발달%를 증가시키는 것일 수 있다. 즉, 체세포 핵 이식 배아의 8-세포 또는 배반포 단계로의 이식 전 발달 효율을 증가시킬 수 있다. 일 실시예에서는, 체세포 핵 이식 과정에서 Rad51의 활성을 증가시키는 물질의 유무에 따라 배아의 상태 및 배반포 수의 변화를 확인하였다. 그 결과, Rad51의 활성을 증가시키는 물질의 처리에 의해 2-세포기 발달 정지(block)의 배아 수가 감소하였으며, 배아 발달률이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(도 3a). 따라서, 상기 Rad51 활성을 증가시키는 물질은 2-세포기 발달 정지 현상을 극복하고 지속적인 배아 발달을 유지함으로써, 배반포 발달 효율이 증가되는 것일 수 있다.
일 구체예에서 상기 방법은 Rad51의 활성을 증가시키는 물질의 부재 하에서 수행된 체세포 핵 이식과 비교하여 핵 이식의 효율이 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 13% 이상, 약 15% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 50 내지 80% 또는 80% 초과로 증가한다. 즉, 체세포 핵 이식 배아의 이식 전 발달의 효율을 증가시키거나, 또는 배아의 배반포 단계로의 발달을 증가시키거나 또는 배아의 확장된 배반포 단계로의 발달을 약 5%, 약 7%, 약 10%, 약 12 이상, 또는 12% 초과로 확장된 배반포 단계로 발달시킨다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 Rad51의 활성을 증가시키는 물질의 부재 하에서 수행된 체세포 핵 이식과 비교하여 배반포 단계로의 성공적인 발달은 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상 또는 8배 초과로 증가시킨다. 상기 체세포 핵 이식 효율의 증가는 배반포의 생성 또는 수득의 증가를 의미한다. 상기 배반포의 생성 또는 수득의 증가는 Rad51의 활성을 증가시키는 물질의 부재 하에서 수행된 체세포 핵 이식과 비교하여 배반포의 생성 또는 수득이 약 110% 이상, 약 120% 이상, 약 130% 이상, 약 140% 이상, 약 150% 이상 또는 약 150% 초과로 증가되는 것일 수 있다.
상기한 바와 같이, 일 양상에 따른 방법은 체세포 핵 이식 난자를 Rad51의 활성을 증가시키는 물질이 포함된 배지에서 배양함으로써, 체세포 핵 이식 난자의 세포 손상을 방지할 수 있는바, 난자의 품질을 향상시킬 수 있다. 또한, Rad51 활성화제에 의해 동결 및 융해된 체세포 핵 이식 난자의 세포사멸이 감소하는바, 배반포 형성 및 생산 효율성을 증진시킬 수 있다. 또한, 체세포 핵 이식 난자의 착상률이 향상됨에 따라 체외수정을 통한 멸종 위기의 동물을 생산할 수 있으며, 배아줄기세포 유도가 증진됨에 따라, 배아줄기세포주를 효율적으로 생산할 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 따라 제조한 체세포 핵 이식 배아, 배반포, 배아줄기세포 또는 복제 생식 세포를 제공한다. 상기 배아는 유전적으로 변형된 것이며 예를 들어, 체세포 핵 이식 단계 이전에(즉, 공여자 핵을 수집하고 수용자 난모세포의 세포질과 융합하기 이전에) 공여자 핵의 유전 물질 내 하나 이상의 이식 유전자가 변형된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 배아는 공여자 체세포 유래 핵 DNA, 수용자 난모세포 유래 세포질 및 제3 공여자 개체 유래 미토콘드리아 DNA를 포함한 것일 수 있다. 상기 배아줄기세포는 상기 방법에 따라 제조된 배반포에서 내부 세포 덩어리로부터 세포를 분리하는 단계; 및 미분화된 상기 내부 세포 덩어리 유래 세포를 배양함으로써 형성되는 것일 수 있다. 또한, 상기 배아줄기세포는 다능성줄기세포 또는 전능성줄기세포인 것일 수 있다.
다른 양상은 세포의 핵 및 핵이 제거된 난자를 준비하는 단계; 상기 체세포의 핵 및 핵이 제거된 난자를 후보 물질과 함께 배양하는 단계; 및 상기 배양 후 발생한 체세포 핵 치환 세포의 Rad51 활성을 평가하는 단계를 포함하는 Rad51의 활성을 증가시켜 체세포 복제 효율을 증가시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 체세포 핵 이식 배아 또는 배반포로부터 유도된 세포, 예를 들어 배아 줄기 세포 등은 제제가 분화 또는 세포 증식에 영향을 주는지 결정하기 위한 시험에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포의 분화 또는 증식하는 능력이 제제의 존재 또는 부재로부터 평가되는 바, 상기 체세포 핵 이식 배아 또는 배반포로부터 유도된 세포에 영향을 주는 제제를 선택하기 위한 스크리닝을 하기 위해 사용할 수 있다. 시험 화합물은 화학적 화합물, 소분자, 폴리펩티드 또는 기타 생물학적 제제(예를 들어, 항체 또는 사이토카인 등)를 포함하는 관심있는 임의의 화합물인 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법에서, 상기 Rad51 활성을 평가하는 단계는 Rad51의 발현 정도를 확인하는 것으로서, RT-PCR 또는 면역 염색법 등 당해 분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 상기 Rad51 활성을 평가하는 단계는 상기 체세포 복제 효율을 평가하는 단계와 함께 수행될 수 있다. 상기 후보 물질을 첨가하기 전과 비교하여, 첨가 후 배양물 내의 SCNT 난모세포, 2-세포기 세포, 4세포기 세포 또는 배반포 단계의 세포의 수가 변화한다면, 상기 후보 물질이 상기 Rad51의 활성을 증가시키고, 나아가 체세포 핵 이식에 의한 체세포 복제 효율을 증가시키는 물질인 것으로 결정할 수 있다.
다른 양상은 체세포의 핵 및 핵이 제거된 난자를 준비하는 단계; 상기 체세포의 핵 및 핵이 제거된 난자를 Rad51의 활성을 증가시키는 물질이 포함된 배지에서 배양하여 체세포 핵 이식(somatic-cell nuclear transfer: SCNT) 세포를 얻는 단계; 및 상기 체세포 핵 이식 세포와 액상 정액을 체외 수정하는 단계를 포함하는 체세포 이식 수정란을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 체세포의 핵 및 핵이 제거된 난자를 Rad51 활성화제가 포함된 배지에서 배양하는 방법의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 체세포 핵 이식 세포는 체세포 핵 이식 난자, 구체적으로 2-세포기, 4-세포기 및 8-세포기의 배아인 것일 수 있으며, 상기 배아가 발달하여 배반포 단계에 도달한 세포인 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 체세포 핵 이식 세포와 액상 정액을 체외 수정하는 단계를 포함한다. 상기 정액은 개체의 정관에서 채취된 정액인 것일 수 있다. 상기 개체는 인간을 포함한 포유동물인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 포유동물은 쥐, 돼지, 양, 개, 소, 말, 염소 등을 포함할 수 있다. 상기 체세포 핵 이식 세포와 액상 정액을 체외수정용 배지 조성물에서 1 내지 7일 동안 체외 수정시키는 것일 수 있다. 이때, 체외 수정 기간이 상기 범위 미만인 경우, 수정이 안되는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우 배아가 퇴화하는 문제점이 있다. 또한, 상기 단계에서, Rad51의 활성을 증가시키는 물질과 접촉 또는 주입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질은 체세포 핵 이식 세포에 정액을 주입한 이후, 전핵(pronuleus) 형성 전(정액 주입 후 18시간 이내), 구체적으로 정액을 주입한 이후, 2-세포기 전에 체세포 이식 수정란에 접촉 또는 주입되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 체세포 이식 수정란은 체세포 핵 이식 세포(배아)가 발달 정지 없이 효율적으로 진행하고 발달 결함 또는 생존력의 손실 없이 2-, 4- 및 8-세포기를 거쳐 배반포로 성공적으로 발달하는바 생산의 효율성을 증가시킬 수 있다.
Rad51 활성화제을 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달률을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 상기 세포는 세포 손상 및/또는 발달 정지 없이 배반포로의 발달이 효율적으로 진행되는바, 체외수정 절차를 이용하여 체세포 복제 수정란을 생산할 수 있다.
도 1a는 IVF, 신선 난자를 이용한 SCNT, 난자에 Kdm4a mRNA를 주입하는 SCNT 과정에서의 Rad51 발현 정도를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
도 1b는 IVF, 냉동 난자를 이용한 SCNT 및 신선 난자를 이용한 SCNT 과정에서의 Rad51 발현 정도를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 IVF, 냉동 난자를 이용한 SCNT 및 신선 난자를 이용한 SCNT 과정에서의 Rad51 발현 정도를 면역 염색법으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 3a는 Rad51 활성화제의 유무에 따른 SCNT 과정에서의 2-세포기 발생 정지 상태의 배아 및 배반포의 수의 변화를 나타내는 사진이다.
도 3b는 IVF 난자, SCNT 난자 및 SCNT+RS-1 난자에서의 오토파지 및 미토콘드리아의 상관 관계를 확인한 사진이다.
도 4는 IVF 난자, SCNT 난자 및 SCNT+Kdm4a 난자에서의 미토콘드리아 활성을 확인한 사진이다.
도 5a는 IVF 난자, SCNT 난자 및 SCNT+RS-1 난자에서의 세포 손상을 확인한 사진이다.
도 5b는 IVF 난자, SCNT 난자 및 SCNT+RS-1 난자에서의 DNA 손상 바이오마커의 발현을 확인한 사진이다.
도 5c는 IVF 난자, SCNT 난자 및 SCNT+RS-1 난자에서의 세포 주기별 DNA 손상을 확인한 사진이다.
도 6은 IVF 난자, SCNT 난자 및 SCNT+RS-1 난자에서의 DNA 절단 여부를 확인한 그래프이다.
도 7은 RS-1 처리가 SCNT 난자에 미치는 영향을 유전자 발현의 증감 여부를 통해 확인한 그래프이다.
도 8은 RS-1 처리 및 Kdm4a mRNA 처리에 따른 SCNT의 메커니즘 패턴을 H3K9me3 염색을 통해 확인한 사진이다.
도 9a는 RS-1 처리 여부에 따른 SCNT 난자의 복제 생성율을 확인한 표이다.
도 9b는 RS-1 처리 여부에 따른 SCNT 난자의 배아줄기세포 유도율을 확인한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 체세포 핵 이식(somatic cell nuclear transfer, SCNT)
8주-10주 된 암컷 BDF/1 마우스에, 5IU PMSG와 5IU hCG 호르몬을 투여하였다. hCG 투여 14시간 후, 과잉 배란된 마우스에서 히알루로니데이즈(hyaluronidase)를 사용하여 난구세포를 분리하고, 난자를 수집하였다. 분리된 난구세포는 체세포 복제 공여 세포로 사용하기 위해 냉장보관하고, 분리된 난자는 37℃ 인큐베이터 KSOM 배양액에 실험 시작 전까지 보관하였다. 이후, 체세포 복제 실험을 위해 성숙된 난자에서 핵을 제거하고, 미리 분리해 둔 난구세포를 공여세포로 직접 주입하였다. 6시간 동안 RS-1 (Rad51-stimulatimulatory compound 1)이 포함된 배양액에서 공여세포로 주입한 난구세포를 인위적으로 활성화 시켰다. 이후 22시간 동안 상기 RS-1 시약이 첨가된 배양액에서 배양하고, 22시간 후 KSOM 배양액에 72 내지 96시간 동안 배양하였다.
실시예 2. Kdm4a mRNA의 준비 및 체세포 복제 난자에 Kdm4a mRNA의 주입
2-1. Kdm4a mRNA의 준비
전장(full-length) 마우스 Kdm4a / Jhdm3a cDNA를 In-Fusion Kit (Clonetech # 638909)를 사용하여 클로닝 부위의 3'말단에 poly(A)83이 포함된 pcDNA3.1 플라스미드로 클로닝 하였다. 인 비트로(in vitro) 전사에 의해 선형화된 주형 플라스미드로부터 mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Life Technologies # AM1345)를 사용하여 mRNA를 합성하였다. 합성된 mRNA를 nuclease-free water에 용해시켰다. mRNA의 농도는 NanoDrop ND-1000 분광 광도계(NanoDrop Technologies)를 사용하여 측정하였다; mRNA의 분취량을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
2-2. 체세포 복제 난자에 Kdm4a mRNA의 주입
상기 실시예 2-1에서 준비한 Kdm4a mRNA 2 ㎍/㎕를 piezo-driven micromanipulator를 사용하여, 활성화 배양액에서 대조군 ~10 pl와 함께 6시간 동안 RS-1 처리한 복제 난모세포와 RS-1을 처리하지 않은 복제 난모세포에 각각 주사하였다. 주사 후 RS-1이 첨가된 KSOM 배양액과 RS-1이 첨가되지 않은 배양액에 각각 22시간 동안 배양하였고, 이후 RS-1이 첨가되지 않은 배양액에 72-96시간 동안 배양하여, 배반포 효율을 관찰 하였다.
실시예 3. 체외 수정(In vitro fertilization) 난자 대비 체세포 핵 이식 난자에서의 Rad51 발현량 비교 분석
체외 수정(in vitro fertilization: IVF) 난자, 상기 실시예 1에서 체세포 핵 이식 난자(SCNT, F/T SCNT) 및 상기 실시예 2에서 체세포 핵 이식 과정에서 Kdm4a mRNA가 주입된 복제 난자(SCNT+Kdm4a)에서의 상동재조합 기작을 조절하는 Rad51의 발현 정도를 qRT-PCR로 비교 분석하였다. 구체적으로, 배아의 mRNA는 Dynabeads mRNA DIRECT kit (Dynal Asa, Oslo, Norway)를 이용하여 분리하였다. 전핵기(Pronuclear stage, PN), 2-세포기, 4-세포기의 배아 20여 개를 용해/결합 버퍼에서 세척한 후, Dynabeads oligo dT25와 섞어서 실온에서 결합시켰다. mRNA를 비드에 결합시킨 후, Buffer-A로 두 번 세척하고, Buffer-B로 추가 세척하였다. 이후, Tris-HCl 용액을 첨가하여 73℃에서 비드로부터 mRNA를 분리하였다. 분리된 mRNA로부터 올리고 dT 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형(template)으로 하여, 마우스 Rad51의 발현을 qRT-PCR로 분석하였다. 이때 사용된 프라이머 염기서열은 하기와 같다:
정방향 프라이머: 5'-AGCTTTCAGCCAGGCAAAT-3',
역방향 프라이머: 5'-GCTTCAGCTTCAGGAAGACA-3'.
전핵기와 2-세포기, 4-세포기 배아에서의 Rad51 발현을 비교 분석한 결과, IVF의 1-세포기에서는 Rad51이 매우 풍부하게 발현이 되었다가, 2-세포기에서는 유의적으로 감소하는 경향을 보였으며 4-세포기에서는 1-세포기와 비슷하게 Rad51의 발현이 증가하는 추세를 나타냈다. 반면, SCNT에서는 1-세포기, 2-세포기 까지는 IVF와 비슷한 발현 양상을 보였으나, 4-세포기에서는 IVF와 비교하여 SCNT의 1-세포기와 유사한 발현의 증가를 확인할 수 없었다. 그러나 SCNT+Kdm4a 에서는 IVF와 비슷한 발현 패턴을 확인할 수 있었다(도 1a).
신선난자 및 냉동난자를 이용한 SCNT에서 형성된 4-세포기에서의 Rad51의 발현이 IVF에 의해 형성된 4-세포기에 비해 현저히 낮은 것을 확인하였다 (도 1b).
다음으로, 체세포 핵치환(SCNT)에 의해 형성된 4-세포기에서 IVF에 의해 형성된 4-세포기에 비해 Rad51의 RNA 발현이 현저히 낮은 결과를 면역염색법으로 재분석하였다. 구체적으로, 체세포 복제 난자를 활성화한 후 30시간, 2-세포 단계에서 0.1% BSA가 첨가된 PBS에서 세척하여 4% 파라포름알데하이드에 실온에서 30분간 처리하였다. Triton X가 0.1% 첨가된 PBS/ 0.1% BSA에 24 시간 처리 후, Rad 51, γH2AX, Mitotracker, LC3B 항체를 실온에서 2시간 처리하였다. 이후 0.1% BSA가 첨가된 PBS에 10분간 3번 세척하고, 염소 항-마우스(goat anti-mouse), 당나귀 항-토끼(donkey anti-rabbit) 항체에 각각 1시간 처리한다. 이 후 PBS/0.1% BSA에 10분간 3번 washing 하고, 핵은4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 염색한다. 염색이 된 난자는 슬라이드 글라스에 고정하여, 공초점 형광 현미경으로 관찰하고 분석하였다.
그 결과, 2-세포기 상태까지는 Rad51 단백질량이 IVF, SCNT, 냉동난자를 이용한 SCNT에서 차이가 없었으나, 체세포 핵치환에 의해 형성된 4-세포기에서는 Rad51 단백질량이 유의하게 낮음을 확인하였다 (도 2).
실시예 4. Rad51의 활성 증가 화합물 처리에 의한 체세포 복제 효율 향상 확인 및 바이오마커 확인
4-1. 체세포 복제 효율 향상 확인
상기 실시예 3의 결과에 근거하여, Rad51의 활성을 증가시키는 물질인 RS-1을 체세포 복제과정에 처리한 후, 체세포 복제 효율이 향상되는지의 여부를 분석하였다. 먼저, RS-1이 난자 발생에 독성을 유발하는지 확인하기 위해 RS-1 0, 1, 5, 10 μM 를 상기 체외 수정(in vitro fertilization: IVF) 난자 및 실시예 1에서 체세포 핵 이식 난자(SCNT, F/T SCNT)에 처리하여, 적정 농도를 선별하였다.
그 결과, 10 μM의 농도에서 배아(embryo)의 발달률이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(표 1)(대조군: 31%, RS-1: 76%). 또한, 예상한 바와 같이, RS-1 처리에 의해 2-세포기 발달 정지(block) 상태의 배아 수도 감소하였으며 (대조군: 39%, RS-1 5%), 배아 발달률도 유의성 있게 증가한 것을 확인하였다 (대조군: 17%, RS-1 59%)(도 3a).
처리 농도(μM) NT 난모세포 수 2-세포기 배아 수(%)+ 4-세포기 배아 수(%)# 2-세포기 중지 배아 수(%)# 배반포(blastocyst) 수(%)#
대조군 - 48 42 30 12(28.6) 10(23.8)
RS-1 1 45 42 35 7(16.7) 8(19)
RS-1 5 46 43 36 7(16.3) 18(41.9)
RS-1 10 54 50 47 3(6) 28(56)
대조군: 대조군 난모세포.+ 재구축 난모세포(reconstructed oocyte)의 수에 기초.
# 2세포기 배아의 수에 기초.
4-2. 바이오마커의 발현 및 상관관계 확인
체외 수정(in vitro fertilization: IVF) 난자, 상기 실시예 1에서 체세포 핵 이식 난자(SCNT, F/T SCNT) 및 상기 실시예 4-1에서 RS-1을 처리한 체세포 핵 이식 난자(SCNT+RS-1)의 각각 1-세포기, 2-세포기, 및 4-세포기에서 오토파지(autophage) 마커인 LC3B와 미토콘드리아 마커인 미토트랙커(mitotracker) 염색을 통해 오토파지 및 미토콘드리아의 상관 관계를 확인하였다. 구체적으로, SCNT-유래 1-세포기, 2-세포기 및 4-세포기의 체세포 복제 난자를 미토콘드리아 분포를 평가하기 위해, MitoTracker Orange CMTMRos (Molecular Probes)를 사용하여 염색하였다. 미토트랙커는 0.3% BSA가 첨가된 M16 배양액에서 300nM 농도로 37℃에서 30분 동안 어두운 조건에서 사용되었다. 세척 후, 난모세포를 고정시키고 LC3B 항체로 면역 형광 염색 한 다음 DAPI로 핵을 염색 하였다.
그 결과, 1-세포기에서는 SCNT 그룹에서만 세포질에 오토파지와 미토콘드리아의 분포가 응축하여 작은 점(dot)로 발현되는 특이점을 발견하였고, RS-1을 처리한 SCNT 그룹에서는 IVF 그룹과 비슷한 발현 패턴을 확인할 수 있었다. 또한, 2-세포기에서 IVF 그룹은 핵과 세포질에 오토파지와 미토콘드리아의 발현이 고루 분포되었으나, SCNT 그룹과 SCNT+RS-1 그룹에서는 핵에 오토파지 및 미토콘드리아가 집중적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 2-세포기에 발달 중지를 한 SCNT 그룹에서는 핵에서 발현이 나타나지 않고 세포질에서만 발현되는 특이점을 확인할 수 있었다. 4-세포기에서는 발현 패턴이 모든 그룹에서 비슷한 양상을 보였다(도 3b).
실시예 5. 체외 수정(In vitro fertilization) 난자 대비 체세포 핵 이식 난자에서의 미토콘드리아 활성 분석
체외 수정(in vitro fertilization: IVF) 난자, 상기 실시예 1에서 체세포 핵 이식 난자(SCNT, F/T SCNT) 및 상기 실시예 2에서 체세포 핵 이식 과정에서 Kdm4a mRNA가 주입된 복제 난자(SCNT+Kdm4a)에서의 미토콘드리아 활성 및 잠재력을 분석하기 위하여 각각의 난자를 JC-1로 염색하였다. 구체적으로, SCNT-유래 1-세포기, 2-세포기 및 4-세포기의 체세포 복제 난자를 미토콘드리아 활성을 측정하기 위해 JC-1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여, 1 ㎍/㎖의 농도로 배양액에 첨가하여 20분간 어두운 조건에서 배양하였다. 이후, Hoechst (Sigma)로 핵을 염색 하였다.
그 결과, IVF 그룹에서는 2-세포기에 미토콘드리아가 세포질과 핵 주위에 풍부하게 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, SCNT 그룹과 SCNT+Kdm4a 그룹에서는 미토콘드리아가 세포질에 부분적으로 응축하여 불안정하게 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, SCNT 그룹 및 SCNT+Kdm4a 그룹의 4-세포기에서는 상대적으로 세포질 표면에서만 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, IVF 그룹과 SCNT 그룹에서의 미토콘드리아 발현 양상은 전혀 다른 것을 알 수 있다(도 4).
실시예 6. RS-1 처리 여부에 따른 세포 손상 및 DNA 손상 확인
6-1. 세포 손상 확인
RS-1 처리 여부에 따른 체세포 복제 난자의 세포 손상 여부를 확인하기 위하여 체외 수정(in vitro fertilization: IVF) 난자, 상기 실시예 1에서 체세포 핵 이식 난자(SCNT, F/T SCNT) 및 상기 실시예 4-1에서 RS-1을 처리한 체세포 핵 이식 난자(SCNT+RS-1)의 2-세포기에서의 활성산소 발생 여부를 확인하였다. 구체적으로, IVF 그룹, 2-세포기의 SCNT+RS-1 그룹 및 SCNT 그룹을 30분 동안 CellROX 산화 스트레스 제제(oxidative stress reagenent) 5μM을 첨가한 배양액에서 37℃, 30분 동안 어두운 조건으로 배양하였다. 이후, PVA 0.1%를 첨가한 D-PBS로 세척하고, 핵을 Hoechst (Sigma)로 염색하였다.
그 결과, IVF 그룹에서는 전체적으로 활성 산소가 감소하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 반면, SCNT+RS-1 그룹 및 SCNT 그룹의 핵에서 활성산소가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.(도 5a).
6-2. DNA 손상 확인
RS-1 처리 여부에 따른 체세포 복제 난자의 DNA 손상 여부를 확인하기 위하여 체외 수정(in vitro fertilization: IVF) 난자, 상기 실시예 1에서 체세포 핵 이식 난자(SCNT, F/T SCNT) 및 상기 실시예 4-1에서 RS-1을 처리한 체세포 핵 이식 난자(SCNT+RS-1)의 DNA 손상 바이오마커(rH2AX)의 발현 여부를 확인하였다. 구체적으로, 4% paraformaldehyde에 고정된 IVF 그룹, SCNT 그룹 및 SCNT+RS-1 그룹을 1-세포기, 2-세포기 및 4-세포기에 고정 시킨 후, rH2AX (Abcam,ab22551)와 Rad51(Abcam, ab63801)으로 2시간 동안 배양하고, 1:200로 PBS/0.1% BSA로 희석된 goat anti-mouse와 같은 농도로 희석된 goat anti-rabbit 항체로 1시간 동안 배양하였다. 이후, DAPI로 핵을 염색하였다.
그 결과, IVF 그룹의 1-세포기에서는 rH2AX와 Rad51의 발현이 매우 미비한 것을 확인할 수 있었다. 반면, SCNT 그룹에서는 Rad51과 rH2AX가 핵에서 강하게 발현하였으며, SCNT+RS-1 그룹에서는 DNA 손상이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, SCNT+RS-1의 2-세포기 발달 정지 그룹에서는 다른 그룹에 비하여 핵에서 DNA 손상이 매우 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 특이적으로 IVF 그룹의 4-세포기 핵에서는 Rad51 및 rH2AX가 매우 강하게 발현되었으며, SCNT+RS-1 그룹의 4-세포기 핵에서 Rad51 및 rH2AXIVF 발현도 이와 유사한 것을 확인할 수 있었다. 반면, SCNT 그룹의 4-세포기 핵에서는 Rad51 및 rH2AX이 매우 미비한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 체세포 핵 이식 과정에서 RS-1을 처리할 경우, 2-세포기에서 4-세포기로 복제되는 과정에 DNA 손상이 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있다(도 5b 및 도 5c).
실시예 7. DNA 절단(break) 확인
체외 수정(in vitro fertilization: IVF) 난자, 상기 실시예 1에서 체세포 핵 이식 난자(SCNT, F/T SCNT) 및 RS-1이 처리된 SCNT 난자에서의 DNA 절단을 확인하기 위해 단세포전기영동법(comet assay)을 수행하였다. 구체적으로, DNA 손상을 확인하기 위하여 각 샘플을 배양액에 제거된 1㎖ 튜브에 담은 상태로 1% 아가로즈 37℃에 현탁 시킨 후, 미리 코팅 된 슬라이드 (Trevigen)에 고정하였다. 슬라이드는 4℃에서 4시간 동안 항온 배양한 후 4시간 동안 Trevigen의 4℃ 용액에 담갔다. 슬라이드를 용해 용액으로부터 제거하고 30분 동안 4℃ 1X TAE 완충액에 담그고 30분~40분 동안 전기영동 하였다. 슬라이드를 30분 동안 1M 암모늄 아세테이트 실온에서 침지시킨 다음 75℃에 고정하였다. 실온에서 30분간 고정한 후 아가로즈가 완전히 건조될 때까지 42℃에서 20분간 배양하였다. 이후, 5분 동안 1X SYBR green I 염색 용액으로 염색하였다.
그 결과, IVF 그룹과 비교하여 SCNT 그룹에서 3' 말단이 유의적으로 길어지면서 DNA 절단이 많이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, RS-1을 처리한 SCNT+RS-1 그룹에서는 3' 말단이 유의적으로 감소하면서 DNA 절단이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, SCNT 그룹에서 비정상적인 3' 말단이 생성되는 것을 확인할 수 있었는데, SCNT+RS-1 그룹에서는 비정상적인 3' 말단의 생성이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).
실시예 8. RS-1 처리가 체세포 핵 이식 난자에 미치는 영향 확인
RS-1 처리가 체세포 핵 이식 난자에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 실시예 1의 체세포 복제 과정에서 2-세포기 단계의 복제 난자에 RS-1을 처리하여 RNA 시퀀싱을 하였다. 이때, 음성 대조군으로 체외 수정(in vitro fertilization: IVF) 난자를 사용하였다. 구체적으로, 상보적인 DNA (cDNA)는 SMARTer 초 저 입력 RNA cDNA 준비 키트 (Takara, 634890)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 증폭시켰다. M220 소니 케이터 (Covaris)를 사용하여 cDNA를 약 200 bp 단편으로 단편화하였다. 단편화된 cDNAs는 말단 수선 및 어댑터 연결되었다. 시퀀싱 라이브러리는 제조사의 지시에 따라 ScriptSeq v2 키트 (Illumina)를 사용하여 준비하였다. HiSeq2500 (Illumina)에서 단일 종단 시퀀싱을 수행하고 STAR (v2.5.2b, https://github.com/alexdobin/STAR)를 사용하여 mm9 마우스 게놈에 맵핑(mapping)하였다. 이후, FPKM (kilobase per million read) 당 조각을 기본 옵션을 사용하여 커프스 링크 (v2.2.1)에 의해 계산하였다.
그 결과, 번역, 면역반응, 대사 과정, 미토콘드리아 번역 관련 유전자들의 발현이 증가하여 SCNT+RS-1 그룹에서 IVF 그룹과 유사한 발현 양상을 나타내는 것으로 확인할 수 있었다. 또한, 세포 증식 관련 유전자가 증가하고 세포 분화 관련 유전자가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 7).
실시예 9. RS-1 처리 및 mRNA mRNA 주입에 따른 체세포 핵 이식 효율 확인
상기 실시예 3에서 RS-1 처리 체세포 핵 이식 난자(SCNT+RS-1) 및 상기 실시예 2에서 체세포 핵 이식 과정에서 Kdm4a mRNA가 주입된 복제 난자(SCNT+Kdm4a)의 복제 메커니즘을 확인하기 위하여 각각의 난자에서 발현하는 유전자를 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, SCNT+RS-1 그룹에서 유의적으로 증가하는 유전자는 190개였고, SCNT+Kdm4a 그룹에서 유의적으로 증가하는 유전자는 45개(1,314개 중)임을 확인할 수 있었다. 또한, SCNT+RS-1 그룹에서 유의적으로 감소하는 유전자는 414개였고, SCNT+Kdm4a 그룹에서 유의적으로 증가하는 유전자는 3개(478개 중)임을 확인할 수 있었다.
또한, H3K9me3 염색을 통하여 RS-1 처리와 Kdm4a mRNA 처리에 따른 체세포 핵 이식은 별개의 메커니즘을 통해 이루어짐을 입증하였다. 구체적으로, 파라포름알데하이드에 고정된 IVF 그룹, SCNT 그룹, SCNT+RS-1 그룹을 1-세포기에 고정 시킨 후, H3K9me3항체(Millipore, 07-442)으로 2시간 동안 배양하고, 1:200로 PBS/0.1%BSA로 희석된 goat anti-rabbit항체로 1시간 동안 배양하였다. 이후 DAPI로 핵을 염색하였다.
즉, RS-1 처리와 Kdm4a mRNA 처리에 따른 체세포 핵 이식은 전혀 별개의 메커니즘에 의한 것임을 알 수 있다(도 8).
실시예 10. RS-1 처리 여부에 따른 복제 생성율 및 줄기세포 유도율 확인
10-1. 복제 마우스 생산을 통한 복제 생성율 확인
일반적으로 복제 마우스의 생산율은 정상적인 체세포 복제 후, 1% 내외인 것으로 보고되고 있다. 따라서, 체세포 핵 이식 난자의 RS-1 처리 여부에 따른 마우스에의 착상 및 복제생성율을 확인하였다. 구체적으로, SCNT 및 SCNT+RS-1 난모세포의 2-세포기를 가임신 후 0.5일이된 대리모 암컷 ICR 생쥐의 자궁에 배아를 이식하였다. 이식 후 19.5일이 되는 날 체세포 복제 생쥐를 대리모의 자궁에서 착출 한 후, 복제 쥐를 양육하는 ICR 생쥐의 같은 날 태어난 일반 ICR 생쥐와 함께 대리모의 체취를 묻히고, 양육 시켰다.
그 결과, RS-1을 처리한 SCNT+RS-1 그룹에서의 복제 마우스 생성율이 5%까지 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 발생 과정 중에 독성의 문제가 전혀 없었다. 따라서, 체세포 핵 이식 난자의 제조시 RS-1을 처리하면 독성의 문제 없이 복제 마우스를 효율적으로 생산할 수 있다는 이점이 있다(도 9a).
10-2. 줄기세포 수립 효율 확인
RS-1 처리 여부에 따른 줄기세포 수립 효율을 확인하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 체세포 핵 이식 난자(SCNT) 및 상기 실시예 3에서 RS-1 처리 체세포 핵 이식 난자(SCNT+RS-1)의 배반포로부터 배아줄기세포를 유도하였다. 구체적으로, 각 그룹의 배반포를 마우스 배아줄기 세포 배양 배지가 들어있는 마우스 배아섬유 아세포(MEF cells) 피더 세포위에 배양하였다. 20% KSR, 0.1mM β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1% 비필수 아미노산, 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(모든 제품은 GIBCO) 1.5X103 units/㎖ recombination mLif (Chemicon)을 배양액으로 사용하였다. Trypsin-EDTA를 사용하여 계대하였으며, 확립된 체세포 복제 마우스 배아 줄기세포에 알칼리 포스파타아제를 처리하여 조직 화학 염색으로 수립된 줄기세포를 평가하였다.
그 결과, RS-1 비처리 그룹(SCNT)에 비하여 RS-1 처리 그룹(SCNT+RS-1)에서 배아줄기세포 유도율이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다(17% vs. 45%)(도 9b).

Claims (21)

  1. Rad51의 활성을 증가시키는 물질을 포함하는, 배아 발달의 효율 또는 배아의 형성을 증가시키기 위한 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 유도체인 것인 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019000988-appb-I000002
    .
  3. 청구항 1에 있어서, H3K9me3 메틸레이션(methylation)을 감소시키는 제제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, H3K9me3 메틸레이션을 감소시키는 제제는 히스톤 탈메틸화효소의 KDM4 패밀리의 구성원의 발현을 증가시키는 제제인 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 제제는 KDM4A(JMJD2A), KDM4B(JMJD2B), KDM4C(JMJD2C), KDM4D(JMJD2D) 또는 이의 조합의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질의 농도는 5 μM 내지 15 μM인 방법.
  7. 상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질은 배아의 4 세포기(4-cell)에 존재하는 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 배아 발달은 배아의 배반포로의 발달 또는 배반포의 형성인 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 배아는 체외에서 인공수정을 통하여 형성된 것인 조성물.
  10. 구항 9에 있어서, 상기 인공수정에서 난자에 정액을 주입한 이후, 전핵(pronucleus) 형성 전에 상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질이 존재하는 것인 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 배아는 핵이 제거된 난자에 체세포의 핵을 이식하여 형성된 것인 조성물.
  12. Rad51의 활성을 증가시키는 물질이 포함된 배지에서 난자를 배양하는 단계를 포함하는, 배아 발달의 효율 또는 배아의 형성을 증가시키는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 난자에 H3K9me3 메틸레이션(methylation)을 감소시키는 제제를 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 난자는 냉동 후 융해된 것인 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 배양에 의해 얻어진 배아는 DNA 복제 중 손상이 유발되는 것인 방법.
  16. 청구항 12에 있어서, 상기 손상은 2-세포기 후 4-세포기 전 유발되는 것인 방법.
  17. 청구항 12에 있어서, 상기 Rad51의 활성을 증가시키는 물질은 상기 배양에 의해 얻어진 배아의 2-세포기 발달 정지를 감소시키는 것인 방법.
  18. 청구항 12에 있어서, 배양하는 단계에서 얻어진 배아를 개체로 발달시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 12의 방법에 따라 제조된 배아(embryo).
  20. 청구항 12의 방법에 따라 제조된 배반포(blastocyst).
  21. 청구항 12의 방법에 따라 제조된 배아줄기세포.
PCT/KR2019/000988 2018-01-23 2019-01-23 Rad51 활성화제를 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달률을 향상시키는 방법 WO2019147025A1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/964,439 US20210047615A1 (en) 2018-01-23 2019-01-23 Composition for embryonic development, comprising rad51 activator, and method for improving embryonic development rate using same
CN201980009895.6A CN111630176A (zh) 2018-01-23 2019-01-23 一种包括Rad51激活剂的用于胚胎发育的组合物以及用其提高胚胎发育率的方法
CN202410121188.9A CN117925511A (zh) 2018-01-23 2019-01-23 提高经体细胞复制的卵子的胚胎发育或胚胎形成的效率的方法
JP2020540596A JP2021511788A (ja) 2018-01-23 2019-01-23 Ｒａｄ５１活性化剤を含む胚芽発達用組成物、及びそれを利用して胚芽発達率を向上させる方法
JP2024053182A JP2024102048A (ja) 2018-01-23 2024-03-28 Ｒａｄ５１活性化剤を含む胚発達用組成物、及びそれを利用して胚発達率を向上させる方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2018-0008250 2018-01-23
KR20180008250 2018-01-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019147025A1 true WO2019147025A1 (ko) 2019-08-01

Family

ID=67396145

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/000988 WO2019147025A1 (ko) 2018-01-23 2019-01-23 Rad51 활성화제를 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달률을 향상시키는 방법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210047615A1 (ko)
JP (2) JP2021511788A (ko)
KR (1) KR102204413B1 (ko)
CN (2) CN111630176A (ko)
WO (1) WO2019147025A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110607325A (zh) * 2019-09-19 2019-12-24 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023196677A1 (en) * 2022-04-08 2023-10-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Increasing developmental potential of human preimplantation embryos by reducing genetic instability, aneuploidies and chromosomal mosaicism

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050097329A (ko) * 2004-04-01 2005-10-07 배재대학교 산학협력단 알에이디51 단백질과 에이에스케이1 단백질의 상호결합을 이용한 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 방법
KR20110044082A (ko) * 2009-10-22 2011-04-28 차의과학대학교 산학협력단 역분화 줄기세포 형성 확인용 바이오마커 및 이의 이용
KR20120057784A (ko) * 2010-11-29 2012-06-07 주식회사 알앤엘바이오 줄기세포의 안정성 증진용 조성물
KR101632108B1 (ko) * 2013-07-03 2016-06-27 서울대학교병원 인간 세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법
KR20170141505A (ko) * 2016-06-15 2017-12-26 차의과학대학교 산학협력단 Rad51 단백질을 이용한 미성숙 난자로부터 성숙 난자를 얻기 위한 방법

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007003033A1 (en) * 2005-06-17 2007-01-11 Mount Sinai Hospital Methods and compositions for enhancing developmental potential of oocytes and preimplantation embryos
US8597949B2 (en) 2007-07-28 2013-12-03 The University Of Chicago Methods and compositions for modulating RAD51 and homologous recombination
US20170014360A1 (en) 2014-03-10 2017-01-19 The University Of Chicago Methods of treating cancer using rad51 small molecule stimulators
EP3194581A4 (en) * 2014-09-15 2018-04-25 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions to increase somatic cell nuclear transfer (scnt) efficiency by removing histone h3-lysine trimethylation
US20170081679A1 (en) * 2015-09-22 2017-03-23 Jie Xu Methods of improving nuclease mediated homologous recombination
WO2017062706A1 (en) * 2015-10-09 2017-04-13 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions to increase human somatic cell nuclear transfer (scnt) efficiency by removing histone h3-lysine trimethylation, and derivation of human nt-esc
KR101808934B1 (ko) * 2016-01-07 2017-12-13 충북대학교 산학협력단 멜라토닌을 이용한 난자의 노화방지 및 배아 발달율 향상 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050097329A (ko) * 2004-04-01 2005-10-07 배재대학교 산학협력단 알에이디51 단백질과 에이에스케이1 단백질의 상호결합을 이용한 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 방법
KR20110044082A (ko) * 2009-10-22 2011-04-28 차의과학대학교 산학협력단 역분화 줄기세포 형성 확인용 바이오마커 및 이의 이용
KR20120057784A (ko) * 2010-11-29 2012-06-07 주식회사 알앤엘바이오 줄기세포의 안정성 증진용 조성물
KR101632108B1 (ko) * 2013-07-03 2016-06-27 서울대학교병원 인간 세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법
KR20170141505A (ko) * 2016-06-15 2017-12-26 차의과학대학교 산학협력단 Rad51 단백질을 이용한 미성숙 난자로부터 성숙 난자를 얻기 위한 방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110607325A (zh) * 2019-09-19 2019-12-24 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法
CN110607325B (zh) * 2019-09-19 2021-03-23 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 一种提高修正的人三原核受精卵体外培养囊胚发育率的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN117925511A (zh) 2024-04-26
JP2024102048A (ja) 2024-07-30
KR102204413B1 (ko) 2021-01-18
JP2021511788A (ja) 2021-05-13
CN111630176A (zh) 2020-09-04
US20210047615A1 (en) 2021-02-18
KR20190089781A (ko) 2019-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gao et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells
US11773368B2 (en) Culture method for differentiating primordial germ cells into functionally mature oocytes
Tada et al. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells
US10280397B2 (en) Feeder-free method for culture of bovine and porcine spermatogonial stem cells
SG187699A1 (en) Simplified basic media for human pluripotent cell culture
KR20080070015A (ko) 인간 배아 줄기 세포의 생성을 위한 인간 난모 세포의 처녀생식에 의한 활성화 방법
Nolte et al. PSCDGs of mouse multipotent adult germline stem cells can enter and progress through meiosis to form haploid male germ cells in vitro
JP2024102048A (ja) Ｒａｄ５１活性化剤を含む胚発達用組成物、及びそれを利用して胚発達率を向上させる方法
WO2019147026A1 (ko) 멜라토닌을 포함하는, 배아 발달용 조성물 및 이를 이용하여 배아 발달의 효율을 향상시키는 방법
Esmaeilian et al. Putative germline and pluripotent stem cells in adult mouse ovary and their in vitro differentiation potential into oocyte-like and somatic cells
US20210198697A1 (en) Methods for making and using modified oocytes
WO2019245278A1 (ko) 돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물
CN106085951B (zh) 一种建立可持续传代的树鼩精原干细胞细胞系的方法
WO2017014513A1 (ko) Nt세포의 보관방법 및 뱅킹 시스템
Darzi et al. Immunohistochemistry and immunocytochemistry analysis of PLZF and VASA in mice testis during spermatogenesis
KR20160142249A (ko) 고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법
WO2024177208A1 (ko) 배외내배엽 줄기세포의 배양용 배지 조성물
Aizawa et al. Comprehensive comparison of female germ cell development in vitro and in vivo identifies epigenetic gene regulation crucial for oocyte development and embryonic competence
WO2023177181A1 (ko) 돼지 만능성 줄기세포 배양용 배지 조성물
US20220025323A1 (en) Methods for generating, evaluating, gene editing and cloning pluripotent stem cells comprising a lethal haplotype
WO2016195391A1 (ko) 고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법
WO2019066161A1 (ko) 세포질 이식을 이용한 복제배아의 재프로그래밍 효율 향상 방법
Yuan-yi et al. Research progress on in vitro culture of animal spermatogonial stem cells.
WO2023085505A1 (ko) 파킨슨 병 유도 벡터 및 이를 이용한 개 모델의 제조 방법
WO2022169209A1 (ko) 줄기세포로부터 망막외곽층세포의 유도 생성 방법 및 그에 의해 생성된 세포를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19743759

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020540596

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19743759

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1