KR20050097329A - 알에이디51 단백질과 에이에스케이1 단백질의 상호결합을 이용한 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RAD51 단백질과 ASK1 단백질간의 결합 능력을 기초로 하여 암 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 RAD51과 ASK1 단백질의 상호결합을 억제하여 세포내 세포사의 증가를 유도할 수 있는 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 항암물질 또는 세포사멸조절물질은 RAD51 과 ASK1의 결합을 억제함으로써 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 촉진하는 기작을 통해 암을 치료하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

알에이디51 단백질과 에이에스케이1 단백질의 상호결합을 이용한 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 방법{Screening methods for anticancer agents and materials for regulating apoptosis based on the protein-protein interaction between RAD52 and ASK1}

본 발명은 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 방법에 관한 것이고, 보다 상세하게는 RAD51 단백질과 ASK1 단백질간의 결합능을 기초로 하여, 면역측정법으로 RAD51 단백질과 ASK1 단백질의 결합을 저해하는 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 방법(screening)에 관한 것이다.

일반적으로 세포내에서는 DNA 손상 회복 기작과 세포 사멸 기작은 적절한 조화를 이루며 상호 조절됨으로써, 이 두 가지의 세포내 기작은 세포의 생명유지라는 측면에서 매우 중요한 역할을 하는 것이다.

그러나, 만일 세포내에서 두 기작 중 하나의 기작에 문제가 발생한다면, 세포의 생명유지는 매우 불안정한 상태가 될 수 있다.

따라서, 세포가 DNA 손상 회복 기작을 가지고 있지 않다면, 과다한 DNA 손상으로 세포의 죽음을 초래하게 될 것이고, 세포가 세포 사멸 기작을 가지고 있지 않다면, 세포는 과잉의 DNA 손상과 함께 생존하게 되고, 손상된 DNA의 반복적인 복제가 과다한 돌연변이화를 유도하여 세포의 암화(tumorization)를 초래하게 될 것이다.

하지만, 상기 두 기작의 상호 관련성에도 불구하고, 세포내에서 세포 사멸 기작과 손상 회복 기작이 어떻게 연결되어 있는 지는 명확히 알려져 있지 않은 실정이다.

그리고, 본 발명에 사용하고자 하는 RAD51 유전자는 포유류의 생존을 위해서 반드시 필요한 유전자인 것으로 알려져 있는데, 그 중 DNA 손상 회복 기작에서의 RAD51 단백질은 상동성 재조합 이중나선 유전자 손상 회복(homologous recombina- tional double strand break repair)에서 매우 중요한 역할을 하는 단백질로 알려져 있다(Takahashi, et al., Genomics, 19: 376-8, 1994).

또한, 사람의 RAD51은 종양 억제인자인 p53, BRCA-1 및 BRCA-2와 상호 결합 하는 것으로 알려져있다(Marmorstein, Ouchi, and Aaronson, Proc Natl Acad Sci USA 95: 13869-74, 1998).

그리고, RAD51의 발현이 정상세포보다 암 세포내에서 적게는 2배에서 많게는 약 9배까지 증가 되었다는 연구가 보고 되기도 하였다(Haaf et al., Cancer Reacher, 62;219-225, 2002).

이러한 사실은 RAD51 과다발현이 암세포의 진단시, 지표인자가 될 수 있음을 시사하는 것인데, 실례로 대표적인 발암 유전자로는 H-ras, N-ras, K-ras, C-myc, 및 N-myc 유전자가 알려져 있으며, 암 진담시 지표인자로 이용되고 있다.

따라서, 최근의 새로운 항암 치료제의 개발 경향은 과다발현된 발암유전자의 발현을 억제하거나 과다 발현된 단백질 양을 낮춰 주는 화학적 조성물의 개발에 중점을 두고 있으며, 이와 더불어 암 세포의 세포사멸을 유도하는 인자들이 항암제로 개발되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 암세포에 대한 DNA 돌연변이 회복과 세포 사멸 억제라는 기능을 가진 RAD51 단백질을 사용하여, 암세포에 대한 항암성질 및 세포사멸을 유도하는 인자를 찾을 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.

본 발명자는 다양한 암세포에서 DNA 손상 회복 기작에 관여하는 것으로 알려진 RAD51단백질이 세포사멸을 유도하는 ASK1 단백질과 상호 결합하고, 이로부터 RAD51과 ASK1 단백질간의 상호결합이 세포의 세포사멸을 저해하는 새로운 기작을 밝혀내었다.

따라서, 본 발명자는 상기의 새로운 연구 결과에 기초하여, RAD51과 ASK1 단백질간의 상호결합을 방해하는 저해물질을 1차적으로 선별하고 탐색할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.

이에, 본 발명의 목적은 RAD51과 ASK1 단백질간의 상호결합에 대한 기초적인 시스템을 수립하여, RAD51과 ASK1 단백질간의 상호결합을 억제하거나 증가시키는 세포사멸 촉진 또는 억제 물질의 선별방법을 제공하는 것이다.

이는 RAD51과 ASK1 단백질을 발현하는 대장균으로부터 상기 과량의 RAD51과 ASK1 단백질의 발현됨을 검색하고, 이를 친화성 아가로즈 비드로 순수분리하고, 상기 순수 분리된 RAD51과 ASK1 단백질간의 결합능은 웨스턴 브랏방법과 면역학적 방법을 통해 확인한 다음, 이의 결합구조에 대한 시스템으로부터 얻고자 하였다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 선별방법을 기초한 세포사멸 촉진 또는 억제 물질의 선별키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 포유류의 RAD51 단백질과 사람 ASK1 단백질간의 결합능에 미치는 영향을 확인함으로써, 상기 RAD51 단백질과 ASK1 단백질의 결합을 억제하거나 증가시키는 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 포유류 RAD51 단백질과 사람 ASK1 단백질간의 결합능에 미치는 영향을 확인함으로써, 상기 RAD51 단백질과 ASK1 단백질의 결합을 억제하거나 증가시키는 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 키트를 제공한다.

본 발명에서 기재된 항암물질 또는 세포사멸조절물질은 암 치료용 약학적 조성물을 의미한다.

본 발명에 따른 스크리닝 방법에서 사용되는 RAD51 단백질은 사람 혹은 쥐를 포함한 포유류의 RAD 51 단백질을 사용할 수 있다.

이는 사람 RAD51 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 집쥐(Mus musculus)는 99.12%이고 중국 햄스터(Cricetulus griseus)는 98.82%의 상동성을 가지기 때문이다.

이를 비교하고자 서열목록의 서열번호 1 내지 3 로 표시하였는데, 서열번호 1의 아미노산 서열은 미국 국립생물정보센터(NCBI)에 등재된 승인번호(accession number)D14134로, 서열번호 2는 NM011234로, 서열번호 3은 Y08202로, 그리고 서열번호 4는 D84476로 공지되어 있는 것이다.

또한, 본 발명의 사람 ASK1 단백질의 경우, 서열번호 4의 아미노산 서열에서 아미노산 서열이 300∼648, 941∼1,123, 941∼1,375이 RAD51 단백질과 결합하므로, RAD51 단백질과의 결합 소재로 상기 ASK1의 부분적인 아미노산 서열을 사용해도 된다.

본 발명은 상기와 같이 RAD51 단백질과 ASK1 단백질간의 결합능을 이용하여, 이의 결합력에 영향을 주는 물질에 대한 선별시스템을 수립하여, RAD51 단백질과 ASK1 단백질간의 결합을 억제하거나 증가시켜주는 항암물질 또는 세포사멸조절물질을 면역학적 방법이나 단백질칩 또는 리버스 이스트 투-하이브리드 방법(revers yeast two-hybrid)을 사용하여 선별(screening)하거나 탐색(detection)하는 것이 바람직하다.

이때, 본 발명의 면역학적 방법으로는 사용되는 표지의 종류에 따라 구분할 수 있는데, 방사성 동위원소를 표지로 이용하는 방사성 면역측정법(RIA)과 비방사성 동위원소, 예를 들면 효소나 형광물질을 표지로 이용하는 효소면역측정법 (ELISA)과 형광면역측정법(FEIA)이 포함되는 비방사성 면역측정법을 사용한다.

그리고, 본 발명에서는 RAD51 단백질과 ASK1 단백질간의 결합능을 기초로 하고, 이의 결합정도를 인지하여 정성, 정량을 측정할 수 있도록, RAD51 또는 ASK1 단백질과 상기 단백질에 대한 면역반응성을 가지는 효소나 형광물질로 표지된 항체를 사용하는 비방사성 면역측정방법을 사용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 효소 면역측정방법이 바람직하다.

이는, 방사성 동위원소를 이용한 면역측정법은 인체에 해로운 방사성 폐기물이 많이 나온다는 것이며 방사성 동위원소의 사용량과 종류가 규정에 의해 제한되어 있는 불편함이 있기때문이다.

따라서, 본 발명의 면역학적인 방법은 RAD51 단백질과 ASK1 단백질의 결합을 억제하는 항암물질 또는 세포사멸조절물질을 선별(screening) 또는 탐색 (detection)할 수 있도록, RAD51 단백질 및 ASK1 단백질과 미지의 시료를 함께 반응을 시킨 다음, RAD51 단백질 또는 ASK1 단백질에 대해 면역반응성을 가지는 표지 항체를 사용하여 RAD51 단백질과 ASK1 단백질이 결합된 단백질의 양을 측정하고, 이를 대조군과 비교하여 미지의 시료에 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 유무를 1차적으로 간편하게 알 수 있게 한다.

또한, 상기 단백질을 이용하여, 기판에 고정된 단백질의 탐침 분자와 표적 단백질의 상호작용에 기초한 단백질칩에 적용한다.

또한, 효모를 이용하여 두 단백질간의 상호결합을 확인하는 이스트 투-하이브리드 방법을 응용한 기지의 리버스 투-하이브리드 방법(reverse two-hybrid)을 사용하여 두 단백질 상호간의 결합을 방해하는 물질의 선별에도 적용한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 발명에서 사용하는 RAD51 단백질은 pQE 벡터(Quagen Co., CAT# ; 32915)를 이용하여 히스티딘으로 태크(His-tagging)된 융합 단백질을 과량으로 생산한 것과 T_NT T7 번역 키트 (T_NT T7 translation kit, Promega, Bioscience, CAT#; L4610)를 이용하여 제조된 ³⁵S로 표지된 RAD51 단백질을 사용하고, ASK1 단백질은 pGEX4T-1 벡터에 ASK1의 cDNA를 삽입한 재조합 벡터를 대장균 균주 BL21(DE3) 형질전환시켜 GST로 태그(GST-tagging)된 융합 단백질을 과다 발현하여 획득한 GST-ASK1 융합 단백질을 사용하였다. 그러나 표지된 RAD51 단백질과 ASK1 단백질을 대량으로 얻을 수 있는 것이라면 다른 방법을 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명에서는 RAD51 단백질이 결합 할 수 있는 ASK1의 결합 부위를 알기 위해, GST가 태그된 ASK1 단백질의 일부분만을 가진 다양한 클론들로 세분화하여 이와 RAD51 단백질과의 결합 유무를 확인할 수 있는 디자인을 제작한다.

이에, 본 발명은 서열번호 4에서 특정부분만을 포함한 돌연변이체의 유전자클론을 세분화하여 각각 pGEX4T-1 클로닝 벡터(Amersham Bioscience Co. CAT#; 2704580-01)에 삽입한 다음, 대장균 BL21(DE3) 내에서 과다 발현된 것을 사용하는 데, 서열번호 4에서 아미노산 서열이 GST-ASK1-N648 (1∼648 aa), GST-ASK1-N6N (1∼299 aa), GST-ASK1-N6C (300∼648 aa), GST-ASK1-KK (649∼940 aa), GST-ASK1-KCN (941∼1123 aa), 그리고 GST-ASK1-KC (941∼1375 aa)인 총 5개의 특정부분을 포함하는 돌연변이체를 사용하였다.

그리고, 본 발명은 RAD51 단백질과 상기 ASK1의 돌연변이체(truncation) 단백질들 사이의 결합을 확인하기 위해, GST 풀 다운 실험(Lin,and Green, 64, 971∼981, 1991)을 실행하였다.

그 결과, RAD51 단백질에 대한 ASK1 단백질의 상호결합은 다중 결합을 하고, 최소 3개 이상의 결합 부위가 있는 것을 알게 되었다.

이때, 상기 3개의 결합부위가 서열번호 4의 아미노산 서열이 298∼649을 가진 부분과 ASK1의 카이네이즈(kinase) 부분인 649∼941의 부분, 그리고 941∼1123의 부분으로 확인되었다.

이의 결과는 암 억제 단백질인 p53과 BRCA1이, RAD51 단백질과 상호 다중 결합하는 것으로 알려진 것과 유사한 결과이다.

또한, 상기 실험적인 방법(in vitro) 이외에 실제로 세포내에서 RAD51과 ASK1의 상호 결합 가능성(in vivo)을 알아내기 위하여, 본 발명에서는 포유류의 HEK 293 세포에 상기 두 단백질의 유전자를 삽입한 벡터를 트랜스펙션하고, 이의 세포를 배양한 다음, 세포를 파쇄하고, 상기 세포의 파쇄물과 두 단백질에 면역반응성을 갖는 표지 항체와 반응시켜서, 두 단백질 간의 상호 결합관계를 분석하는 방법을 사용하였으며, 항체 사용 이외에 세포 내의 두 단백질간의 결합 유무를 확인할 수 있다면, 어느 방법을 사용하여도 무방하다.

상기 방법을 사용한 결과, 본 발명에서는 RAD51과 ASK1이 포유류의 세포 HEK 293내에서 상호 결합하는 것을 확인하였다.

또한, RAD51과 ASK1의 상호 결합이 생화학적으로 어떤 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, 본 발명에서는 ASK1 단백질의 다운스트림 카이네이즈(down-stream kinase)로 알려져 있는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)와 p38의 카이네이즈 활성도를 사용한다.

이에, 본 발명에서는 ASK1의 과다발현에 의해 활성화된 JNK와 p38에 RAD51을 동시에 발현시키고, JNK과 p38의 활성도를 대조군과 비교한 결과, RAD51을 동시에 발현시킬 경우, JNK과 p38의 활성이 감소됨을 알게 되었다.

따라서, RAD51과 ASK1의 상호결합이 ASK1의 활성을 저해하여 다운스트림 카이네이즈를 모두 저해하는 것으로 판단된다.

이는 ASK1 단백질이 활성화되면 다운스트림 카이네이즈인 MKK4/7(Mitogen-activated protein kinase kinase 4/7) 및 MKK3/6가 활성화 되고, 상기 활성화된 MKK4/7 및 MKK3/6이 다시 JNK와 p38을 인산화시키는 특성(Ichijo, et al., Science, 275; 90-4, 1997)으로부터 유추된 것이다.

또한, RAD51에 의한 ASK1 활성도 감소의 원인을 찾기 위해, 본 발명에서는 ASK1 단백질간의 중합체화(oligomerization)되는 특성을 조사하는 방법을 사용한다.

이는 ASK1간의 중합체화에 의해, ASK1이 활성화 된다는 특성이 이미 보고 (Yukiko and Jonathan, J Biol Chem, 273; 17477-82 1998) 된 바 있으며, 다른 ASK1 활성 저해 단백질들의 경우에서도 ASK1들간의 중합체화를 방해하는 특성이 보고 된 바가 있기 때문이다.

그래서, 본 발명에서도 과다 발현된 RAD51 단백질과 ASK1 단백질들 간에 반응을 시키고, ASK1 간의 중합체화(oligomerization)에 어떤 영향을 주는 지에 대해 분석한 결과, ASK1간의 중합체화를 저해하는 것을 확인하게 되었다.

ASK1간 중합체화의 저해 결과는 ASK1의 자가-인산화가 저해되어 그 활성을 감소시키는 것으로 판단된다.

그리고, RAD51에 의한 ASK1과의 상호 결합 및 카이네이즈 활성 저해가 세포내에서 직접적으로 세포사멸을 억제할 수 있는지를 조사하기 위해, 본 발명에서는 HEK(human embryonic kidney) 293 세포와 섬유아세포(fibroblast) L929 세포에 RAD51을 발현시킨 실험군과 RAD51을 발현시키지 않은 대조군에 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)를 처리하여 세포사멸을 유도하는 실험방법을 사용한다.

그 결과, 본 발명에서 RAD51 단백질이 과다 발현된 경우 TNF-α에 의한 세포사멸이 RAD51 단백질이 발현되지 않은 경우에 비해 현저하게 감소됨을 알게 되었다.

상술한 결과들은 본 발명에서 RAD51과 ASK1 단백질간의 결합구조의 기본적인 시스템을 수립하여, 본 발명의 항암물질 또는 세포사멸조절물질을 선별할 수 있는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1] RAD51 단백질의 확보

1. ³⁵ S가 표지된 RAD51 단백질 확보

T_NT 표지 키트(T_NT labelling kit, Promega, Bioscience, CAT#; L4610))를 이용한 ³⁵S-RAD51 단백질의 발현을 위하여, 사람 RAD51 cDNA 유전자를 T7 프로모터가 포함된 pcDNA3 벡터(Invitrogen Co, CAT#;V79020)에 클로닝하였다.

그런다음, 상기 클로닝된 1 ㎍의 pcDNA-RAD51 DNA와 T_NT 표지 키트에 있는 40 ㎕의 T_NT T7 퀵 혼합물(T_NT T7 Quick Mix), 2 ㎕의 ³⁵S-메티오닌 및 멸균된 증류수를 첨가하여 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 혼합하고, 30℃에서 90분간 반응시켜서 순수한 ³⁵S-RAD51 단백질을 얻었다.

2. His-tagged RAD51 단백질 확보

대장균주 BL21(DE3) 내에서 순수한 히스티딘이 태그된 RAD51 단백질(His-tagged RAD51, 이하 His-RAD51)을 얻기 위해, 우선 사람 RAD51 유전자를 pQE 벡터(Quagen Co., CAT# ; 32915)에 접합하여 pQE-RAD51 벡터를 제조하고, 상기 제조된 pQE-RAD51 벡터를 대장균주 BL21(DE3)로 형질전환시켰다.

그리고, 대장균주 BL21(DE3)에서 His-RAD51의 발현을 확인하기 위하여, 1 mM IPTG 농도를 가진 LB배지에서 37℃에서 3시간동안 발현을 유도하였다.

그리고, His-RAD51이 과다 발현된 상기 균주의 배양액 200 ㎖을 용해 용액 [200 mM Tris(pH 8.0), NaCl 150mM, 1mM EDTA, 0.1 % Triton X-100, 0.4 mM Phenylmethanesulfonyl fluoride] 20 ㎖에 넣고, 초음파로 분쇄하여 용해하였다.

그리고, 상기 용해물은 그대로 샘플로 사용하거나 1,500 rpm에서 원심분리하여 상등액(supernatant)과 침전물(pellet)로 분리한 샘플을 사용하였다.

또한, His-RAD51이 봉입체(inclusion body)에 존재하는 지를 알아내기 위해, 상기 분리된 침전물에 1 % 의 N-라우로일 사르코신(N-Lauroyl-sarcosine)이 첨가된 용해 용액을 첨가하고 상기와 동일한 방법으로 용해하였다.

그런다음, 상기 준비된 각 샘플에서 His-RAD51을 순수 분리하기 위하여, 니켈 아가로즈가 패킹된 컬럼(nickel agarose column)을 사용하고, 이미다졸 용출용액[50 mM Tris(pH8.0), 1 mM Imidazole]으로 용출하여, His-RAD51을 분리하였다.

그리고, 각 샘플에서 순수 분리된 His-RAD51은 10 %의 SDS-PAGE로 분리하여 확인하였다.

이의 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, RAD51 단백질은 전체 혹은 상등액 샘플보다 침전물 샘플에서 가장 많이 분리되었기 때문에, RAD51 단백질은 가용성 단백질보다는 세포막 등과 결합하여 봉입체를 형성하는 불용성 단백질이 더 많이 존재하는 것으로 판단된다.

[실시예 2] GST-tagged ASK1 단백질의 확보

GST-ASK1 융합 단백질(GST-tagged ASK1,이하 GST-ASK1)을 과량으로 확보하기 위하여, 사람 ASK1 유전자를 pGEX4T-1 벡터와 접합하여 pGEX4T-ASK1을 제조하고, 상기 pGEX4T-ASK1 벡터를 대장균주 BL21(DE3)로 형질전환시켰다.

그리고, 대장균주 BL21(DE3)에서 GST-ASK1의 발현을 확인하기 위하여, 1 mM IPTG 농도를 가진 LB배지에서 37℃에서 3시간동안 발현을 유도하였다.

그리고, GST-ASK1이 과량발현된 상기 균주의 배양액 200㎖을 용해 용액[200 mM Tris(pH 8.0), NaCl 150mM, 1mM EDTA, 0.1 % Triton X-100, 0.4 mM Phenylmethanesulfonyl fluoride] 20 ㎖에 넣고, 초음파로 분쇄하여 용해하였다.

그리고, 상기 분쇄된 용해액에서 ASK1 단백질을 순수 분리하기 위해, GSH 아가로즈 컬럼(GSH agarose column, Amersham Bioscience, CAT#; 17-0575-01)을 사용하고, 글루타치온 용출용액[50 mM Tris(pH8.0), 10 mM glutathione]으로 용출하여, GST-ASK1을 분리하였다.

[실시예 3] ³⁵ S-RAD51 단백질과 GST-ASK1 돌연변이 단백질의 상호 결합.

본 실시예에서는 RAD51과 ASK1 돌연변이 단백질(ASK1 truncation)사이의 결합을 확인하기 위하여 in vitro 상에서 결합을 시도하였다.

이때, ASK1 돌연변이 단백질은 도 2에 도시된 바와 같이, (GST-ASK1 융합 단백질의 일부분만 있는 단백질의 유전자를 pGEX4T-1 클로닝 벡터(Amersham Bioscience Co. CAT#; 2704580-01)에 연결하여 발현벡터를 제조하고, 이를 대장균주 BL21(DE3)에 형질전환시키고 과다 발현을 유도하여 ASK1 돌연변이 단백질을 확보하였다.

이때, 확보된 ASK1 돌연변이 단백질 클론은 GST-ASK1-N648 (1∼648 aa), GST-ASK1-N6N (1∼299 aa), GST-ASK1-N6C (300∼648 aa), GST-ASK1-KK (649∼940 aa), GST-ASK1-KCN (941∼1123 aa), 및 GST-ASK1-KC (941∼1375 aa)이었다.

그리고, In vitro 결합 실험은 각각의 GST-ASK1 돌연변이 융합단백질 1 ㎍과 ³⁵S-RAD51 10 ㎕을 결합용액[50 mM HEPES(pH 7.6), 50 mM NaCl, 0.1 % NP-40, 5 mM EDTA, 10% Glycerol]에서 각각 혼합한 후 4℃에서 5 시간 동안 교반하면서 반응시켜 5종류의 시료를 준비하였다. 이때, 대조군은 GST 단백질을 사용하였다.

그리고, 결합 부위를 확인하기 위하여 상기 시료를 GSH-아가로즈 비드에 결합시키고, 결합된 GST 융합 단백질 시료들을 상기 용출용액으로 3번 세척하여 용출하였다.

그리고, 상기 시료별로 용출된 용액을 10 % SDS-PAGE 상에서 전기영동하고, 전기영동이 완료된 다음, 니트로셀룰로즈막(nitro-cellulose membrane)에 이동시키고(transfer), 이를 바스 1500 포스포-이메이저 (BAS 1500 phospho-Imager,Fugi 사)로 분석하였다.

이의 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, RAD51 단백질은 ASK1의 kinase 부위를 포함하여 3 부위에 결합 가능한 것으로 조사 되었다.

[실시예 4] HEK 293 및 293T 세포내에서 RAD51과 ASK1의 상호 결합.

본 실시예에서는 포유류 세포 HEK 293에 일시적으로 ASK1과 RAD51을 트랜스펙션(transfection)하여 두 단백질간의 상호결합 여부를 조사하고자 하였다.

이 실험을 위하여, RAD51은 pCMV-Myc(BD Bioscience Clontech사, CAT# K6003)벡터에 클로닝하였으며, ASK1은 pCMV-HA 벡터에 클로닝하여 사용하였다.

Myc-RAD51 0.5 ㎍과 HA-ASK1 1 ㎍을 HEK 293 세포 균주(ATCC사, CAT#; CRL-1573)에 인산칼슘(calcium phosphate)방법을 이용하여 일시적으로 트랜스펙션 한 후, 36 시간동안 배양을 하였다.

그런다음, 상기 배양물 3 ㎖을 원심분리하여 포스포살린버퍼로 세척후 500㎕ 용해 용액[50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1mM NaVO₄) 과 혼합하여 용해하였다.

그리고, 상기 용해물은 항 Myc 항체(anti-Myc,introgen사, CAT# R950-25)와 항HA 항체(anti-HA, Roche Molecular Biochemicals, CAT# 12CA5)로 확인하였다.

각각의 세포의 용해물들은 항 Myc 항체를 이용하여 면역침강 한 뒤, 항HA 항체로 결합 여부를 확인하였다.

또한, HEK 293T 세포를 사용하여 내생적 단백질인 RAD51과 ASK1의 상호 결합관계를 확인하였다.

우선, 1X 10⁷의 293T 세포에는 상기 HEK 293 세포의 방법을 동일하게 적용하였다.

그런다음, 배양에서 용해과정을 거치고 상기 용해물에 각각 다른 항 ASK1, 항 RAD51 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc. CAT#, H-92 ; SC8349과 C-20 ; SC6862)와 항 토끼 전 명역혈청(anti-rabbit pre-immuneserum)항체를 이용하여 면역침강(immune precipitation)을 수행하였다.

그리고, 동시에 면역침강된 단백질을 10%의 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로즈막에 전이시키고, 항 ASK1 항체와 항 RAD51 항체를 이용한 웨스턴 블랏 (western blot)을 수행하였다.

이의 결과, 도 4에 나타난 바와같이, (A)에서 HEK 293 세포 내에서 Myc-RAD51과 HA-ASK1이 결합하는 것을 알 수 있었다.

또한, 도 4의 (B)의 결과, 동시에 면역침강된 단백질에서는 항 RAD51 항체와 항 ASK1 항체 모두에 반응을 보이기 때문에, HEK 293T 세포 내에서도 RAD51과 ASK1과의 상호결합의 존재를 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에서 AD51 단백질과 ASK1 단백질과의 상호 결합은 실제 세포내에서도 존재하는 것을 알게 되었다.

[실시예 5] RAD51과 ASK1의 동시발현에서 RAD51에 의한 ASK1 활성 저해.

본 실시예에서는 RAD51과 ASK1의 상호결합이 생화학적으로 어떤 영향을 미치는가를 조사하기 위하여, ASK1의 다운스트림 카이네이즈로 알려져 있는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)과 p38 카이네이즈의 활성도를 조사하였다.

먼저, 상기 실시예 4의 HA-ASK1 발현벡터와 Myc-RAD51 발현벡터를 단독 또는 두개를 HEK 293 세포에 일시적으로 트랜스펙션하였다.

그리고, 48 시간 후, 상기 실시예4의 용해방법과 동일하게 세포를 용해하였다.

그리고, 각 세포 용해물에 항JNK 항체(1 ㎍, BD Bioscience Pharmingen Co. CAT#; 551196)를 이용하여, 세포내에 있는 JNK(endo-JNK)의 면역침강을 유도하였다.

상기 면역침강된 시료에 순수 분리된 GST-JUN(1-79 a.a) 단백질과 γ-P³² 및 ATP를 첨가하고 30℃에서 30분간 반응을 시켰다.

그런다음, 상기 반응물은 10% SDS-PAGE를 수행하여, 겔에서 반응물 내의 단백질을 분리하였다. 그리고, 겔을 건조시킨 다음, BAS 1500 포스포-이메이저로 분석 하였다.

또한, p38 카이네이즈 활성도를 조사하기 위하여 GST-p38 융합단백질의 발현벡터를 상기 실시예 4의 HA-ASK1 또는 Myc-RAD51의 발현벡터와 함께 HEK 293 세포에 일시적으로 코트랜스펙션(co-transfection)하였다.

그리고, 48 시간이 지난 후, 상기 실시예 4와 같은 방법으로 세포를 용해하였다.

그런다음, 각 세포의 용해물에 항 GST 항체(1 ㎍, Amersham Bioscience Co, CAT#; 27457701)를 이용하여 GST-p38을 면역침강을 유도하였고, 상기 면역침강된 시료에 순수 분리된 GST-ATF2 와 γ-P³² 를 첨가하고 위와 동일한 방법으로 p38 카이네이즈 활성도를 조사하였다.

이의 결과, 도 5 (A)에 도시된 바와 같이, HA-ASK1이 단독으로 과발현된 세포의 용해물에서는 ³²p-JUN의 생성물이 가장 많이 생산되었으나(3 레인 참조), Myc-RAD51과 HA-ASK1이 동시에 과발현된 용해물에서는 ³²p-JUN의 생성물 양이 HA-ASK1가 발현되지 않는 세포의 용해물과 같이 미미한 것을 알 수 있었다.

또한, 도 5 (B)에서는 상기 도 5 (A)의 결과와 같이, HA-ASK1이 단독으로 과발현된 세포의 용해물에서는 ³²p-ATF2의 생성물이 Myc-RAD51과 HA-ASK1이 동시에 과발현된 용해물이나 HA-ASK1가 발현되지 않는 세포의 용해물과 비교하여 월등히 많이 생산된 것을 알 수 있었다(3 레인 참조).

따라서, RAD51과 ASK1의 상호결합이 ASK1의 활성을 저해하고, 이에 ASK1의 다운스트림 카이네이즈의 활성도 저해한다는 사실을 알게 되었다.

[실시예 6] 포유류 세포 HEK 293 세포내에서 RAD51 단백질 발현에 의한 ASK1 단백질 간의 중합체화(oligomerization) 저해

본 실시예는 ASK1과 RAD51의 상호결합이 ASK1간의 결합에 어떤 영향을 주는 가를 조사하기위하여, 서로 다른 표지의 ASK1과 RAD51를 동시 발현시켜, 세포내에서 발생되는 결합관계를 확인하고자 하였다.

HEK 293 세포주에서 Myc-RAD51 (0.5 ㎍)과 HA-ASK1(0.25 ㎍), 그리고 Flag-ASK1(0.25 ㎍)의 발현벡터를 HEK 293 세포에 인산칼슘(calcium phosphate)방법으로 동시에 트랜스펙션하였다.

그리고, 상기 세포주를 36시간동안 배양한 후, 상기 배양물을 상기 실시예 4의 방법으로 용해하였다.

그런다음, 상기 용해물에 항 HA 항체를 사용하여 면역침강을 유도하였다.

그리고, 상기 면역침강된 단백질을 10%의 SDS-PAGE로 분리하여, 니트로셀룰로즈막에 전이시키고, 항 Flag 항체(Sigma Chemical사., CAT# F3165) 또는 항 Myc 항체를 이용한 웨스턴 블랏(western blot)을 하여 동시 침강 여부를 확인하였다.

이의 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, RAD51가 존재하에서는 ASK1간의 중합체화가 저해되는 것을 알 수 있었다(3 레인 참조).

따라서, 상기 실시예 5에 의한 ASK1의 다운스트림 카이네이즈의 활성화 억제 결과는 RAD51이 ASK1의 활성화를 위해 필수적으로 알려져 있는 ASK1간의 중합체화를 억제한 결과임을 유추할 수 있었다.

[실시예 7] HEK 293 및 섬유아세포 L929 세포주 내에서 RAD51 단백질 발현에 의한 세포 사멸.

Myc-RAD51 발현벡터(0.5 ㎍)와 형광발현단백질(Enhanced Green fluoroscent protein, 이하 EGFP)의 발현벡터인 pEGFP-C2(1 ㎍, BD Bioscience Clontech Co. CAT#; 6083-1)를 HEK 293과 섬유아세포 L929 세포에 리포펙타민(LipofectAmine reagent, GIBCO BRL Co, CAT#; 50470)과 안산칼슘의 방법을 이용하여 트랜스팩션하였다.

그리고, 상기 세포를 36시간동안 배양한 다음, 상기 배양액에 (10 ㎍/㎖)의 시클로헥사미드(cyclohexamide)를 1시간동안 전처리를 하고, 100 ng/㎖의 TNF-α를 20 시간 동안 처리하여 세포사멸을 유도하였다.

이때, 세포의 관찰을 형광현미경을 이용하여 관찰하였다.

이의 결과, 도 7에서 도시된 바와같이, TNF-α에 의한 세포 사멸 유도에서 RAD51 단백질을 발현시킨 세포주의 경우는 세포사멸을 억제하는 항-세포사멸의 결과를 보였다.

이는 RAD51 단백질이 TNF- 에 의한 ASK1 단백질의 활성화를 억제함으로써, 나타나는 현상일 것으로 판단된다.

이와같이, 본 발명에서는 RAD51 단백질이 기존에 알려진 DNA 회복기작 이외에 세포사멸기작에서도 직접 관여하는 것을 알아내었으며, ASK1 단백질과의 결합 구조의 관계를 밝혀내고, 이로부터 세포사멸 촉진 또는 억제 물질을 탐색할 수 있는 방법을 제공할 수 있게 되어, 간편하게 미지의 시료에서 1차적으로 항암물질 또는 세포사멸조절물질을 스크리닝하는데 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 RAD51의 발현량을 저해할 수 있는 물질을 개발함으로써, 암세포의 세포사멸을 촉진하는 물질을 검색할 수 있는 연구의 기초를 제공하게 되었다.

따라서, 암 환자에게 발생하는 화학적 약물 또는 방사능 요법에 의한 암세포의 저항성을 줄여줌과 동시에 세포사멸촉진의 결과를 보이는 새로운 항암물질의 스크리닝 방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1의 (A)는 T_NT 표지 키트를 이용한 ³⁵S-RAD51 단백질의 발현을 전기영동 젤에 나타낸 것이고, (B)는 RAD51 재조합 단백질을 생산하는 대장균주 BL21(DE3) 에서 발현시킨 6×His-RAD51 단백질이 상등액 및 침전물에서 가용성 및 불용성으로 발현됨을 보여주는 10% SDS 폴리아크릴아마이드 젤의 전기영동 사진,

도 2는 RAD51 단백질이 ASK1 단백질과 결합하는 부위를 확인하기 위해, GST-ASK1 단백질을 일부분만을 클로닝한 ASK1 돌연변이체를 간략하게 나타낸 모식도,

도 3은 GST-ASK1 돌연변이 단백질들과 ³⁵S-RAD51과의 상호 결합의 결과를 보여주는 BAS 1500 포스포-이메이저 사진,

도 4는 In vivo로 HEK(Human Embryonic Kidney) 293 세포(A) 또는 293T 세포(B)내에서 RAD51과 ASK1이 실제적으로 상호 결합하는 것을 보여주는 웨스턴 블랏의 사진,

도 5는 RAD51과 ASK1 단백질의 동시 발현 하에서, ASK1의 다운스트림 카이네이즈인 JNK(A)와 p38 카이네이즈(B)의 활성이 저해되는 것을 보여주는 웨스턴 블랏과 BAS 1500 포스포-이메이저로 C-JUN과 ATF2의 인산화를 나타낸 사진,

도 6은 RAD51과 ASK1 단백질의 결합에 의해 ASK1 간의 중합체화 (oligomerization)의 저해를 보여주는 웨스턴 블랏 사진,

도 7은 RAD51의 세포내 과다발현이 TNF-α에 의한 세포사멸을 저해하는 효과를 보여주는 형광현미경 사진,

도 8은 본 발명의 RAD51과 ASK1 단백질 사이의 상호 결합을 방해하는 저해제의 처리에 의해 기대되는 암 세포 내에서의 세포 사멸 기작을 나타낸 모식도.

<110> PAI CHAI UNIVERSITY <120> Method for screening anti-cancer and anti-apoptotic modulating agent by using RAD51 and ASK1 protein <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 340 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Met Gln Met Gln Leu Glu Ala Asn Ala Asp Thr Ser Val Glu 1 5 10 15 Glu Glu Ser Phe Gly Pro Gln Pro Ile Ser Arg Leu Glu Gln Cys Gly 20 25 30 Ile Asn Ala Asn Asp Val Lys Lys Leu Glu Glu Ala Gly Phe His Thr 35 40 45 Val Glu Ala Val Ala Tyr Ala Pro Lys Lys Glu Leu Ile Asn Ile Lys 50 55 60 Gly Ile Ser Glu Ala Lys Ala Asp Lys Ile Leu Ala Glu Ala Ala Lys 65 70 75 80 Leu Val Pro Met Gly Phe Thr Thr Ala Thr Glu Phe His Gln Arg Arg 85 90 95 Ser Glu Ile Ile Gln Ile Thr Thr Gly Ser Lys Glu Leu Asp Lys Leu 100 105 110 Leu Gln Gly Gly Ile Glu Thr Gly Ser Ile Thr Glu Met Phe Gly Glu 115 120 125 Phe Arg Thr Gly Lys Thr Gln Ile Cys His Thr Leu Ala Val Thr Cys 130 135 140 Gln Leu Pro Ile Asp Arg Gly Gly Gly Glu Gly Lys Ala Met Tyr Ile 145 150 155 160 Asp Thr Glu Gly Thr Phe Arg Pro Glu Arg Leu Leu Ala Val Ala Glu 165 170 175 Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Ser Asp Val Leu Asp Asn Val Ala Tyr Ala 180 185 190 Arg Ala Phe Asn Thr Asp His Gln Thr Gln Leu Leu Tyr Gln Ala Ser 195 200 205 Ala Met Met Val Glu Ser Arg Tyr Ala Leu Leu Ile Val Asp Ser Ala 210 215 220 Thr Ala Leu Tyr Arg Thr Asp Tyr Ser Gly Arg Gly Glu Leu Ser Ala 225 230 235 240 Arg Gln Met His Leu Ala Arg Phe Leu Arg Met Leu Leu Arg Leu Ala 245 250 255 Asp Glu Phe Gly Val Ala Val Val Ile Thr Asn Gln Val Val Ala Gln 260 265 270 Val Asp Gly Ala Ala Met Phe Ala Ala Asp Pro Lys Lys Pro Ile Gly 275 280 285 Gly Asn Ile Ile Ala His Ala Ser Thr Thr Arg Leu Tyr Leu Arg Lys 290 295 300 Gly Arg Gly Glu Thr Arg Ile Cys Lys Ile Tyr Asp Ser Pro Cys Leu 305 310 315 320 Pro Glu Ala Glu Ala Met Phe Ala Ile Asn Ala Asp Gly Val Gly Asp 325 330 335 Ala Lys Asp *** 340 <210> 2 <211> 340 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Met Gln Met Gln Leu Glu Ala Ser Ala Asp Thr Ser Val Glu 1 5 10 15 Glu Glu Ser Phe Gly Pro Gln Pro Ile Ser Arg Leu Glu Gln Cys Gly 20 25 30 Ile Asn Ala Asn Asp Val Lys Lys Leu Glu Glu Ala Gly Tyr His Thr 35 40 45 Val Glu Ala Val Ala Tyr Ala Pro Lys Lys Glu Leu Ile Asn Ile Lys 50 55 60 Gly Ile Ser Glu Ala Lys Ala Asp Lys Ile Leu Thr Glu Ala Ala Lys 65 70 75 80 Leu Val Pro Met Gly Phe Thr Thr Ala Thr Glu Phe His Gln Arg Arg 85 90 95 Ser Glu Ile Ile Gln Ile Thr Thr Gly Ser Lys Glu Leu Asp Lys Leu 100 105 110 Leu Gln Gly Gly Ile Glu Thr Gly Ser Ile Thr Glu Met Phe Gly Glu 115 120 125 Phe Arg Thr Gly Lys Thr Gln Ile Cys His Thr Leu Ala Val Thr Cys 130 135 140 Gln Leu Pro Ile Asp Arg Gly Gly Gly Glu Gly Lys Ala Met Tyr Ile 145 150 155 160 Asp Thr Glu Gly Thr Phe Arg Pro Glu Arg Leu Leu Ala Val Ala Glu 165 170 175 Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Ser Asp Val Leu Asp Asn Val Ala Tyr Ala 180 185 190 Arg Gly Phe Asn Thr Asp His Gln Thr Gln Leu Leu Tyr Gln Ala Ser 195 200 205 Ala Met Met Val Glu Ser Arg Tyr Ala Leu Leu Ile Val Asp Ser Ala 210 215 220 Thr Ala Leu Tyr Arg Thr Asp Tyr Ser Gly Arg Gly Glu Leu Ser Ala 225 230 235 240 Arg Gln Met His Leu Ala Arg Phe Leu Arg Met Leu Leu Arg Leu Ala 245 250 255 Asp Glu Phe Gly Val Ala Val Val Ile Thr Asn Gln Val Val Ala Gln 260 265 270 Val Asp Gly Ala Ala Met Phe Ala Ala Asp Pro Lys Lys Pro Ile Gly 275 280 285 Gly Asn Ile Ile Ala His Ala Ser Thr Thr Arg Leu Tyr Leu Arg Lys 290 295 300 Gly Arg Gly Glu Thr Arg Ile Cys Lys Ile Tyr Asp Ser Pro Cys Leu 305 310 315 320 Pro Glu Ala Glu Ala Met Phe Ala Ile Asn Ala Asp Gly Val Gly Asp 325 330 335 Ala Lys Asp *** 340 <210> 3 <211> 340 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 3 Met Ala Met Gln Met Gln Leu Glu Ala Asn Ala Asp Thr Ser Val Glu 1 5 10 15 Glu Glu Ser Phe Gly Pro Gln Pro Ile Ser Arg Leu Glu Gln Cys Gly 20 25 30 Ile Ser Ala Asn Asp Val Lys Lys Leu Glu Glu Ala Gly Phe His Thr 35 40 45 Val Glu Ala Val Ala Tyr Ala Pro Lys Lys Glu Leu Ile Asn Ile Lys 50 55 60 Gly Ile Ser Glu Ala Lys Ala Asp Lys Ile Leu Ala Glu Ala Ala Lys 65 70 75 80 Leu Val Pro Met Gly Phe Thr Thr Ala Thr Glu Phe His Gln Arg Arg 85 90 95 Ser Glu Ile Ile Gln Ile Thr Thr Gly Ser Lys Glu Leu Asp Lys Leu 100 105 110 Leu Gln Gly Gly Ile Glu Thr Gly Ser Ile Thr Glu Met Phe Gly Glu 115 120 125 Phe Arg Thr Gly Lys Thr Gln Ile Cys His Thr Leu Ala Val Thr Cys 130 135 140 Gln Leu Pro Ile Asp Arg Gly Gly Gly Glu Gly Lys Ala Met Tyr Ile 145 150 155 160 Asp Thr Glu Gly Thr Phe Arg Pro Glu Arg Leu Leu Ala Val Ala Glu 165 170 175 Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Ser Asp Val Leu Asp Asn Val Ala Tyr Ala 180 185 190 Arg Gly Phe Asn Thr Asp His Gln Thr Gln Leu Leu Tyr Gln Ala Ser 195 200 205 Ala Met Met Val Glu Ser Arg Tyr Ala Leu Leu Ile Val Asp Ser Ala 210 215 220 Thr Ala Leu Tyr Arg Thr Asp Tyr Ser Gly Arg Gly Glu Leu Ser Ala 225 230 235 240 Arg Gln Met His Leu Ala Arg Phe Leu Arg Met Leu Leu Arg Leu Ala 245 250 255 Asp Glu Phe Gly Val Ala Val Val Ile Thr Asn Gln Val Val Ala Gln 260 265 270 Val Asp Gly Ala Ala Met Phe Thr Ala Asp Pro Lys Lys Pro Ile Gly 275 280 285 Gly Asn Ile Ile Ala His Ala Ser Thr Thr Arg Leu Tyr Leu Arg Lys 290 295 300 Gly Arg Gly Glu Thr Arg Ile Cys Lys Val Tyr Asp Ser Pro Cys Leu 305 310 315 320 Pro Glu Ala Glu Ala Met Phe Ala Ile Asn Ala Asp Gly Val Gly Asp 325 330 335 Ala Lys Asp *** 340 <210> 4 <211> 1375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Thr Glu Ala Asp Glu Gly Ile Thr Phe Ser Val Pro Pro Phe 1 5 10 15 Ala Pro Ser Gly Phe Cys Thr Ile Pro Glu Gly Gly Ile Cys Arg Arg 20 25 30 Gly Gly Ala Ala Ala Val Gly Glu Gly Glu Glu His Gln Leu Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Gly Ser Phe Trp Asn Val Glu Ser Ala Ala Ala Pro Gly 50 55 60 Ile Gly Cys Pro Ala Ala Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Arg Gly Arg 65 70 75 80 Gly Ser Ser Val Gly Gly Gly Ser Arg Arg Thr Thr Val Ala Tyr Val 85 90 95 Ile Asn Glu Ala Ser Gln Gly Gln Leu Val Val Ala Glu Ser Glu Ala 100 105 110 Leu Gln Ser Leu Arg Glu Ala Cys Glu Thr Val Gly Ala Thr Leu Glu 115 120 125 Thr Leu His Phe Gly Lys Leu Asp Phe Gly Glu Thr Thr Val Leu Asp 130 135 140 Arg Phe Tyr Asn Ala Asp Ile Ala Val Val Glu Met Ser Asp Ala Phe 145 150 155 160 Arg Gln Pro Ser Leu Phe Tyr His Leu Gly Val Arg Glu Ser Phe Ser 165 170 175 Met Ala Asn Asn Ile Ile Leu Tyr Cys Asp Thr Asn Ser Asp Ser Leu 180 185 190 Gln Ser Leu Lys Glu Ile Ile Cys Gln Lys Asn Thr Met Cys Thr Gly 195 200 205 Asn Tyr Thr Phe Val Pro Tyr Met Ile Thr Pro His Asn Lys Val Tyr 210 215 220 Cys Cys Asp Ser Ser Phe Met Lys Gly Leu Thr Glu Leu Met Gln Pro 225 230 235 240 Asn Phe Glu Leu Leu Leu Gly Pro Ile Cys Leu Pro Leu Val Asp Arg 245 250 255 Phe Ile Gln Leu Leu Lys Val Ala Gln Ala Ser Ser Ser Gln Tyr Phe 260 265 270 Arg Glu Ser Ile Leu Asn Asp Ile Arg Lys Ala Arg Asn Leu Tyr Thr 275 280 285 Gly Lys Glu Leu Ala Ala Glu Leu Ala Arg Ile Arg Gln Arg Val Asp 290 295 300 Asn Ile Glu Val Leu Thr Ala Asp Ile Val Ile Asn Leu Leu Leu Ser 305 310 315 320 Tyr Arg Asp Ile Gln Asp Tyr Asp Ser Ile Val Lys Leu Val Glu Thr 325 330 335 Leu Glu Lys Leu Pro Thr Phe Asp Leu Ala Ser His His His Val Lys 340 345 350 Phe His Tyr Ala Phe Ala Leu Asn Arg Arg Asn Leu Pro Gly Asp Arg 355 360 365 Ala Lys Ala Leu Asp Ile Met Ile Pro Met Val Gln Ser Glu Gly Gln 370 375 380 Val Ala Ser Asp Met Tyr Cys Leu Val Gly Arg Ile Tyr Lys Asp Met 385 390 395 400 Phe Leu Asp Ser Asn Phe Thr Asp Thr Glu Ser Arg Asp His Gly Ala 405 410 415 Ser Trp Phe Lys Lys Ala Phe Glu Ser Glu Pro Thr Leu Gln Ser Gly 420 425 430 Ile Asn Tyr Ala Val Leu Leu Leu Ala Ala Gly His Gln Phe Glu Ser 435 440 445 Ser Phe Glu Leu Arg Lys Val Gly Val Lys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 450 455 460 Lys Lys Gly Asn Leu Glu Lys Leu Gln Ser Tyr Trp Glu Val Gly Phe 465 470 475 480 Phe Leu Gly Ala Ser Val Leu Ala Asn Asp His Met Arg Val Ile Gln 485 490 495 Ala Ser Glu Lys Leu Phe Lys Leu Lys Thr Pro Ala Trp Tyr Leu Lys 500 505 510 Ser Ile Val Glu Thr Ile Leu Ile Tyr Lys His Phe Val Lys Leu Thr 515 520 525 Thr Glu Gln Pro Val Ala Lys Gln Glu Leu Val Asp Phe Trp Met Asp 530 535 540 Phe Leu Val Glu Ala Thr Lys Thr Asp Val Thr Val Val Arg Phe Pro 545 550 555 560 Val Leu Ile Leu Glu Pro Thr Lys Ile Tyr Gln Pro Ser Tyr Leu Ser 565 570 575 Ile Asn Asn Glu Val Glu Glu Lys Thr Ile Ser Ile Trp His Val Leu 580 585 590 Pro Asp Asp Lys Lys Gly Ile His Glu Trp Asn Phe Ser Ala Ser Ser 595 600 605 Val Arg Gly Val Ser Ile Ser Lys Phe Glu Glu Arg Cys Cys Phe Leu 610 615 620 Tyr Val Leu His Asn Ser Asp Asp Phe Gln Ile Tyr Phe Cys Thr Glu 625 630 635 640 Leu His Cys Lys Lys Phe Phe Glu Met Val Asn Thr Ile Thr Glu Glu 645 650 655 Lys Gly Arg Ser Thr Glu Glu Gly Asp Cys Glu Ser Asp Leu Leu Glu 660 665 670 Tyr Asp Tyr Glu Tyr Asp Glu Asn Gly Asp Arg Val Val Leu Gly Lys 675 680 685 Gly Thr Tyr Gly Ile Val Tyr Ala Gly Arg Asp Leu Ser Asn Gln Val 690 695 700 Arg Ile Ala Ile Lys Glu Ile Pro Glu Arg Asp Ser Arg Tyr Ser Gln 705 710 715 720 Pro Leu His Glu Glu Ile Ala Leu His Lys His Leu Lys His Lys Asn 725 730 735 Ile Val Gln Tyr Leu Gly Ser Phe Ser Glu Asn Gly Phe Ile Lys Ile 740 745 750 Phe Met Glu Gln Val Pro Gly Gly Ser Leu Tyr Ala Leu Leu Arg Ser 755 760 765 Lys Trp Gly Pro Leu Lys Asp Asn Glu Gln Thr Ile Gly Phe Tyr Thr 770 775 780 Lys Gln Ile Leu Glu Gly Leu Lys Tyr Leu His Asp Asn Gln Ile Val 785 790 795 800 His Arg Asp Ile Lys Gly Asp Asn Val Leu Ile Asn Thr Tyr Ser Gly 805 810 815 Val Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Thr Ser Lys Arg Leu Ala Gly Ile 820 825 830 Asn Pro Cys Thr Glu Thr Phe Thr Gly Thr Leu Gln Tyr Met Ala Pro 835 840 845 Glu Ile Ile Asp Lys Gly Pro Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Ala Asp Ile 850 855 860 Trp Ser Leu Gly Cys Thr Ile Ile Glu Met Ala Thr Gly Lys Pro Pro 865 870 875 880 Phe Tyr Glu Leu Gly Glu Pro Gln Ala Ala Met Phe Lys Val Gly Met 885 890 895 Phe Lys Val His Pro Glu Ile Pro Glu Ser Met Ser Ala Glu Ala Lys 900 905 910 Ala Phe Ile Leu Lys Cys Phe Glu Pro Asp Pro Asp Lys Arg Ala Cys 915 920 925 Ala Asn Asp Leu Leu Val Asp Glu Phe Leu Lys Val Ser Ser Lys Lys 930 935 940 Lys Lys Thr Gln Pro Lys Leu Ser Ala Leu Ser Ala Gly Ser Asn Ala 945 950 955 960 Glu Tyr Leu Arg Ser Ile Ser Leu Pro Val Pro Val Leu Val Glu Asp 965 970 975 Thr Ser Ser Ser Ser Glu Tyr Gly Ser Val Ser Pro Asp Thr Glu Leu 980 985 990 Lys Val Asp Pro Phe Ser Phe Lys Thr Arg Ala Lys Ser Cys Gly Glu 995 1000 1005 Arg Asp Val Lys Gly Ile Arg Thr Leu Phe Leu Gly Ile Pro Asp Glu 1010 1015 1020 Asn Phe Glu Asp His Ser Ala Pro Pro Ser Pro Glu Glu Lys Asp Ser 1025 1030 1035 1040 Gly Phe Phe Met Leu Arg Lys Asp Ser Glu Arg Arg Ala Thr Leu His 1045 1050 1055 Arg Ile Leu Thr Glu Asp Gln Asp Lys Ile Val Arg Asn Leu Met Glu 1060 1065 1070 Ser Leu Ala Gln Gly Ala Glu Glu Pro Lys Leu Lys Trp Glu His Ile 1075 1080 1085 Thr Thr Leu Ile Ala Ser Leu Arg Glu Phe Val Arg Ser Thr Asp Arg 1090 1095 1100 Lys Ile Ile Ala Thr Thr Leu Ser Lys Leu Lys Leu Glu Leu Asp Phe 1105 1110 1115 1120 Asp Ser His Gly Ile Ser Gln Val Gln Val Val Leu Phe Gly Phe Gln 1125 1130 1135 Asp Ala Val Asn Lys Val Leu Arg Asn His Asn Ile Lys Pro His Trp 1140 1145 1150 Met Phe Ala Leu Asp Ser Ile Ile Arg Lys Ala Val Gln Thr Ala Ile 1155 1160 1165 Thr Ile Leu Val Pro Glu Leu Arg Pro His Phe Ser Leu Ala Ser Glu 1170 1175 1180 Ser Asp Thr Ala Asp Gln Glu Asp Leu Asp Val Glu Asp Asp His Glu 1185 1190 1195 1200 Glu Gln Pro Ser Asn Gln Thr Val Arg Arg Pro Gln Ala Val Ile Glu 1205 1210 1215 Asp Ala Val Ala Thr Ser Gly Val Ser Thr Leu Ser Ser Thr Val Ser 1220 1225 1230 His Asp Ser Gln Ser Ala His Arg Ser Leu Asn Val Gln Leu Gly Arg 1235 1240 1245 Met Lys Ile Glu Thr Asn Arg Leu Leu Glu Glu Leu Val Arg Lys Glu 1250 1255 1260 Lys Glu Leu Gln Ala Leu Leu His Arg Ala Ile Glu Glu Lys Asp Gln 1265 1270 1275 1280 Glu Ile Lys His Leu Lys Leu Lys Ser Gln Pro Ile Glu Ile Pro Glu 1285 1290 1295 Leu Pro Val Phe His Leu Asn Ser Ser Gly Thr Asn Ile Glu Asp Ser 1300 1305 1310 Glu Leu Thr Asp Trp Leu Arg Val Asn Gly Ala Asp Glu Asp Thr Ile 1315 1320 1325 Ser Arg Phe Leu Ala Glu Asp Tyr Thr Leu Leu Asp Val Leu Tyr Tyr 1330 1335 1340 Val Thr Arg Asp Asp Leu Lys Cys Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Leu 1345 1350 1355 1360 Cys Thr Leu Trp Lys Ala Ile Ile Asp Phe Arg Asn Lys Gln Thr 1365 1370 1375

Claims (3)

1. 포유류의 RAD51 단백질과 사람 ASK1 단백질간의 결합능에 미치는 영향을 확인함으로써, 상기 RAD51 단백질과 ASK1 단백질의 결합을 억제하거나 증가시키는 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 면역학적 방법인 것을 특징으로 하는 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 방법.
3. 포유류 RAD51 단백질과 사람 ASK1 단백질간의 결합능에 미치는 영향을 확인함으로써, 상기 RAD51 단백질과 ASK1 단백질의 결합을 억제하거나 증가시키는 항암물질 또는 세포사멸조절물질의 스크리닝 키트.