KR20080070015A - 인간 배아 줄기 세포의 생성을 위한 인간 난모 세포의 처녀생식에 의한 활성화 방법 - Google Patents

인간 배아 줄기 세포의 생성을 위한 인간 난모 세포의 처녀생식에 의한 활성화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 O2 분압을 조절하여 처녀 생식에 의해 인간의 난모 세포를 활성화하여 인간 줄기 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 높은 O2 분압 하에서 Ca2+를 조정하는 단계, 낮은 O2 분압 하에서 세린 트레오닌 키나제 억제제와 난모 세포를 접촉시키는 단계, 활성화된 난모 세포로부터 내부 세포괴(ICM)를 분리하는 단계, 그리고 높은 O2 분압 하에서 분리된 ICM을 이루는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 인간의 것이 아닌 동물성 생성물의 부재 하에서, 활성화된 난모 세포로부터 줄기 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 인간의 영양 세포/생성물을 사용하여 ICM/줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 줄기 세포에 관하여도 개시되어 있다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 생성을 위한 인간 난모 세포의 처녀 생식에 의한 활성화 방법{PARTHENOGENIC ACTIVATION OF HUMAN OOCYTES FOR THE PRODUCTION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS}
본 발명은 일반적으로 배아 줄기 세포, 더욱 구체적으로는 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포를 사용하여 인간 배아 줄기 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
배경에 관한 정보
인간 배아 줄기 세포(ES)는 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있는 다능성 세포(pluripotent cell)이다. 배아 줄기 세포가 면역 결핍성 마우스에 주입될 때, 이 세포는 분화된 종양(기형종)을 형성한다. 그러나, 시험관 내에서 유도되어 배상체(embroid body; EB)를 형성하는 배아 줄기 세포는, 임의의 성장 조건 하에서, 몇몇 조직의 특성을 갖는 다수의 세포 유형으로 분화되기 쉬운 배아 줄기 세포주의 공급원이 된다. 예를 들어, ES 세포는 신경 성장 인자와 레티논산이 존재할 때 뉴런으로 분화된다.
인간 ES 세포와 이의 분화된 자손은 치료를 위한 이식과 약물 실험 및 개발용으로서 정상적인 인간 세포의 중요한 공급원이다. 이와 같은 목적들을 위해서는, 환자의 요구에 적합하거나 또는 적당한 약물 실험에 적당한 조직 유형으로 분화되는 세포를 충분히 공급해야 한다. 이와 관련하여, 배아 줄기 세포로부터 분화된 세포를 생산하는 효율적이고도 신뢰성이 있는 방법이 필요하다.
최근 들어, 인간 배아 줄기 세포(hES)는 3가지 공급원으로부터 얻는다: 불임 처리 후 잔류하거나 연구를 위해 기증되는 배반포, 공여된 배우체(난모 세포 및 정자)로부터 생산된 배반포, 그리고 핵 운반(NT)의 결과물. 사망한 태아의 조직은 인간 배아 생식 세포(hEG)의 유일한 공급원이다. hES 세포 및 hEG 세포는 놀라운 과학적 가능성과 치료 가능성 예를 들어, 보다 특화된 세포나 조직을 생산할 수 있는 기능성을 제공한다. 그러나, hES 세포 및 hEG 세포의 공급원에 대한 윤리적인 문제와, 연구의 목적으로 NT를 사용하기 시작하면 인간 피험체를 생산하는데에도 NT를 사용할 수 있을 것이라는 우려는 전 인류적 논쟁과 분쟁의 소지가 되고 있다.
배아 줄기 세포 생산용 난모 세포를 제조하는데 있어서, 포유동물의 난모 세포를 처녀 생식에 의해 활성화하는 방법은, 정자/NT에 의해 수정시키는 방법의 대안으로 사용될 수 있다. 처녀 생식에 의한 활성화란, 수컷 배우체를 사용하지 않고서도 암컷 배우체로부터 성체를 영구적으로 또는 비 영구적으로 발생시켜 배세포를 생산하는 방법을 말한다.
포유동물 난모 세포의 처녀 생식에 의한 활성화는 다양한 방법으로 유도되고 있다. 이 과정을 활성화시키기 위하여 전기 자극을 사용하는 방법이 특히 많이 사용되고 있는데, 그 이유는 전기 주입법이 현재 핵 운반 방법의 일환을 이루고 있기 때문이다. 배 세포-난모 세포막 융합에 사용되는 전기 주입 장치를 이용하여 전기 자극을 줌으로써, 시험관 내에서 처녀 생식에 의한 활성화를 일으키는 방법이 보고된 바 있다.
마우스의 난모 세포는 Ca2 +-Mg2 +는 함유하지 않고, 히알유로니다제를 함유하는 배지에 노출시키고, 에탄올, Ca2 + 이오노포어 또는 킬레이트화제, 단백질 합성 억제제 및 전기 자극에 노출시킴으로써 활성화된다. 이러한 과정들은 처녀 생식에 의한 활성화 속도와 마우스 난모 세포의 발생 속도를 촉진하긴 하지만, 어린 소의 난모 세포의 발생은 활성화하지 않았으며/않았거나, 심지어는 이의 속도를 늦추기까지 하였다. 또한, 마우스 난모 세포의 수정 및 처녀 생식에 의한 활성화는 배란 후 성숙에도 의존적이다.
소의 난모 세포를 에탄올, 전기 자극 및 실온에 노출시키고, 전기 자극과 사이클로헥시미드에 의한 단백질 억제를 함께 일으켜 활성화하는 방법에 관하여도 보고된 바 있다. 이러한 방법들은 세포 내 Ca2+ 농도를 증가시키는 것으로 생각되며, 난모 세포가 28시간 이상 성숙하였을 때 가장 성공적이다.
발명의 개요
본 발명은 어떠한 조건이 인간 난모 세포를 처녀 생식에 의해 활성화하는데 최적인지를 발생학적으로 관찰한 결과를 바탕으로 한다.
하나의 구체예에서, 인간 줄기 세포를 생산하는 방법은 난모 세포를 처녀 생식에 의해 활성화하는 과정을 포함하는데, 여기서, 활성화 과정은 높은 산소(O2) 분 압 하에서 난모 세포와 이오노포어를 접촉시키는 단계와, 낮은 O2 분압 하에서 난모 세포와 세린-트레오닌 키나제 억제제를 접촉시키는 단계, 배반포가 형성될 때까지 낮은 O2 분압 하에서 활성화된 난모 세포를 배양하는 단계, 이 배반포를 영양 세포층으로 운반하는 단계, 그리고 운반된 배반포를 높은 O2 분압 하에서 배양하는 단계, 배반포의 영양외배엽 세포로부터 내부 세포괴(inner cell mass: ICM)를 물리적으로 분리하는 단계, 그리고 이 ICM의 세포를 영양 세포층에서 배양하는 단계[여기서, ICM 세포는 높은 O2 분압 하에서 배양됨]를 포함한다. 바람직하게, 난모 세포는 인간의 것이다.
관련 측면에서, O2 농도 약 2%∼약 5% O2인 혼합 기체 환경에서 항온 처리함으로써 낮은 O2 분압이 유지되며, 이 경우, 혼합 기체 환경은 약 5%의 CO2와 약 90∼93%의 질소(N2)를 추가로 포함한다.
다른 구체예에서, 인간의 중기 II 난모 세포를 활성화하는 방법은, 높은 O2 분압 하, 시험관 내 수정(IVF) 배지 중에서 인간의 중기 II 난모 세포를 항온 처리하는 단계, 이 세포를 높은 O2 분압 하에서 이오노포어를 포함하는 IVF 배지 중에서 항온 처리하여 활성화하는 단계, 그리고 낮은 O2 분압 하, 세린-트레오닌 키나제 억제제(STKI)를 포함하는 IVF 배지 중에서 이 세포를 항온 처리하는 단계와, 배반포가 낮은 O2 분압 하에서 형성될 때까지 이 STKI 처리된 세포를 항온 처리하는 단계 [여기서, 배반포로부터 얻어진 세포 덩어리(ICM)는 배양 가능한 줄기 세포를 생산함]를 포함한다. O2 분압은, CO2 약 5%, O2 약 20%, 그리고 N2 약 75%인 혼합 기체 환경 하에서 세포를 항온 처리함으로써 높게 유지될 수 있다.
관련 측면에서, 활성화 이후에 수행되는 항온 처리 단계에 있어서의 O2 분압은, O2 농도 약 2∼약 5% O2인 혼합 기체에서 세포를 항온 처리함으로써 유지되는데, 여기서, 이 혼합 기체 환경은 약 5%의 CO2와 약 90∼약 93%의 N2를 추가로 포함한다.
다른 관련 측면에서, IVF 배지는 본질적으로 인간의 것이 아닌 생산물을 포함하지 않는다.
추가의 관련 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 생산되어 분리된 난모 세포가 제공되는데, 이는 난모 세포로부터 제조되어 분리된 내부 세포괴(ICM)와, 이로부터 분리된 해당 줄기 세포를 포함한다.
다른 구체예에서, 배아 줄기 세포와 이의 분화된 자손을 생산하는 포유동물 난모 세포의 인간 처녀 생식에 의한 활성화 방법이 제공된다. 이러한 세포들과 자손은 실질적으로 난모 세포 공여체와 동계의 것으로서, 난모 세포 공여체와 관련된 세포의 자기 이식이 가능하므로, 통상적으로 난모 세포 공여체의 면역계에 의한 거부 현상이 일어나지 않을 수 있다.
관련 측면에서, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 유래한 hES 세포주의 세포 은행이 제공된다.
하나의 구체예에서, 냉동 보존된 난모 세포 또는 반수성체(parthenote)로부터 인간 줄기 세포를 생산하는 방법이 제공되는데, 이 방법은, 난모 세포 또는 반수성체의 세포질에 냉동 보존제를 미세 주입하는 단계, 난모 세포 또는 반수성체를 극저온으로 동결시켜 이 세포들을 휴지기 상태로 만드는 단계, 이 난모 세포 또는 반수성체를 휴지기 상태로 저장하는 단계, 난모 세포 또는 반수성체를 해동하는 단계, 난모 세포를 처녀 생식에 의해 활성화하는 단계[여기서, 활성화 과정은, 높은 O2 분압 하에서 이오노포어와 난모 세포를 접촉시키는 단계와, 낮은 O2 분압 하에서 세린-트레오닌 키나제 억제제와 난모 세포를 접촉시키는 단계를 포함함], 배반포가 형성될 때까지 낮은 O2 분압 하에서 반수성체 또는 활성화된 난모 세포를 배양하는 단계, 배반포의 영양외배엽 세포로부터 내부 세포괴(ICM)를 분리하는 단계, 그리고 이 ICM의 세포를 영양 세포층에서 배양하는 단계[여기서, 이 배양 과정은 높은 O2 분압 하에서 수행됨]를 포함한다.
다른 구체예에서, 인간 공여자로부터 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 유래하는 자기 줄기 세포가 제공된다. 하나의 측면에서, 줄기 세포는 공여 세포와 실질적으로 동일하게 반수체형(haplotype)이다. 관련 측면에서, 줄기 세포는 실질적으로 공여 세포와 유전학적으로 동일하다.
하나의 측면에서, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 마커에 의하면 줄기 세포는 공여체의 완전한 형제자매인 것으로 확인된다. 다른 측면에서, 줄기 세포는 공여체 기원에 따라서 게놈상 각인되어 있다.
하나의 구체예에는, 인간 공여자로부터 유래하며, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포에서 얻어진 줄기 세포에서 생산된 분화 세포가 개시되어 있다. 관련 측면에서, 분화된 세포로서는 뉴런 세포, 심장 세포, 평활근 세포, 가로무늬근 세포, 내피 세포, 조골 세포, 희소돌기아교세포, 조혈모세포, 지방 세포, 기질 세포, 연골 세포, 성상 세포, 수지상 세포, 각질 세포, 췌장도 세포, 림프계 전구 세포, 비만 세포, 중배엽 세포와 내배엽 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가의 관련 측면에서, 분화된 세포는 하나 이상의 마커 예를 들어, 신경 미세 섬유 68, NCAM, 베타 III-튜불린, GFAP, 알파-액티닌, 데스민, PECAM-1, VE-카데린, 알파-페토프로테인을 발현하거나 또는 이것들을 함께 발현한다.
다른 구체예에는, 자기 줄기 세포를 포함하는 세포주가 개시되어 있는데, 여기서, 상기 줄기 세포는 인간 공여자로부터 유래하며, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 얻어지는 것이다. 하나의 측면에서, 세포는 SSEA-1을 발현하지 않는다. 다른 측면에서, 세포주의 세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽 생식 계통으로 발생한다.
하나의 구체예에는, 세포 은행이 냉동 보존된 반수성체를 포함하는 것으로 개시되어 있는데, 여기서, 상기 반수성체는 한 사람의 인간 공여자로부터 유래하는, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 얻어지는 것이다. 관련 측면에서, 반수성체는 배반포가 형성될 때까지 낮은 O2 분압 하에서 배양된다.
하나의 구체예에는, 세포 은행이 냉동 보존된 자기 줄기 세포를 포함하는 것 으로 개시되어 있는데, 여기서, 상기 줄기 세포는 하나 이상의 인간 공여자로부터 유래하는, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 얻어지는 것이다.
다른 구체예에서, 치료를 필요로 하는 피험체를 치료하는 방법은, 분화된 세포를 포함하는 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 분화된 세포는 인간 공여자로부터 유래하는, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 얻어진 줄기 세포로부터 생성되는 것이다. 하나의 측면에서, 분화된 세포는 뉴런 세포, 심장 세포, 평활근 세포, 가로무늬근 세포, 내피 세포, 조골 세포, 희소돌기아교세포, 조혈모세포, 지방 세포, 기질 세포, 연골 세포, 성상 세포, 수지상 세포, 각질 세포, 췌장도 세포, 림프계 전구 세포, 비만 세포, 중배엽 세포와 내배엽 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포이다.
관련 측면에서, 피험체는 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, ALS, 척수 결손 또는 손상, 다발성 경화증, 근위축증, 낭포성 섬유증, 간 질환, 당뇨병, 심장 질환, 망막 질환(예를 들어, 황반 변성증 및 색소성 망막염), 연골 결손 또는 손상, 화상, 족부 궤양, 혈관 질환, 요로 질환, AIDS 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병이 발병한 환자이다.
하나의 구체예에는, 클로닝된 인간 배아 줄기 세포를 생산하는 방법이 개시되어 있는데, 이 방법은, 이미 수정된 인간의 난모 세포로부터 제1 전핵을 제거하는 단계, 제2 전핵을 상기 제핵 난모 세포로 운반하는 단계[여기서, 상기 제2 전핵은 공여자 난모 세포 또는 공여자의 모친으로부터 유래하는 난모 세포, 또는 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 유래하는 것이며, 상기 난모 세포의 전핵은 활성화 이전에 공여자의 체세포 핵으로 치환됨], 그리고 배반포가 형성될 때까지 상기와 같이 생성된 난모 세포를 배양하는 단계[여기서, 상기 배반포로부터 유래하는 내부 세포괴는 배아 줄기 세포를 함유함]를 포함한다.
본 발명에 의한 대표적 방법과 조성물에 관하여는 이하에 자세히 기술되어 있다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포에 있어서 알칼리성 포스파타제의 표면 마커 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1b는 표면 마커 Oct4의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1c는 표면 마커 SSEA-1의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1d는 표면 마커 SSEA-3의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1e는 표면 마커 SSEA-4의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1f는 표면 마커 TRA-1-60의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1g는 표면 마커 TRA-1-81의 발현 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2a는 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포의 텔로머라제 활성을 분석한 결과이다. 500, 1000 및 10000 (유닛)의 추출물을 사용하여 분석을 수행하였다. ΔH - 열 처리된 테스트 추출물(네거티브 대조군); 포지티브 대조군 - 텔로머라제 보유세포; CHAPS-용해 완충액; TSR8-대조군 주형.
도 2b는 9일 동안 배양한, 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포에서 생성된 배상체의 현미경 사진이다.
도 2c는 10일 동안 배양한, 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포에서 생성된 배상체의 현미경 사진이다.
도 2d는 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포의 핵형을 나타내는 것이다.
도 2e는 처녀 생식에 의해 유래된 hES 세포의 DNA 핑거 프린팅(DNA finger printing) 분석 결과를 나타내는 것이다. 1 → 난모 세포 공여자의 혈액으로부터 얻은 DNA; 2 → 동일한 공여자로부터 유래하는 처녀 생식 hES 세포로부터 얻은 DNA; 3 → 인간 영양 섬유아세포로부터 얻은 DNA.
도 3은 게놈 각인(genomic imprinting)과 관련된 유전자 발현의 특성을 나타내는 노던 블럿 결과를 나타내는 것이다. DNA 프로브: SNRPN, Peg1_2, Peg1_A, H19 및 GAPDH(내부 대조군). NSF, 신생아 피부 섬유아세포; hES, 수정된 난모 세포로부터 유래하는 인간 배아 줄기 세포주; 1, phESC-1; 2, phESC-3, 3, phESC-4, 4, phESC-5; 5, phESC-6; 6 phESC-7. NSF RT-, hES RT-, 1RT- 는 네거티브 대조군이다.
도 4는 phESC를 3개의 모든 생식 세포층의 유도체로 분화시킨 결과를 나타내는 것이다. 외배엽이 분화되었는지는, 뉴런 특이적 마커 68(A), NCAM(B), 베타 III-튜불린(C) 및 아교 세포 마커 GFAP(D, M)가 면역 세포학적 염색이 된 것을 통해 확인된다. 분화된 세포는 중배엽 마커: 근육 특이적 알파 액티닌(G) 및 데스민(J), 내피 세포 마커 PECAM-1(E) 및 VE-카데린(F)을 보유하였다. 내배엽이 분화되었는지는 알파-페토프로테인(H, L)이 염색된 것을 통해 확인된다. 상기 phESC는 색소성 내피-유사 세포(I, K)를 생산한다. 배율:(I), ×100; (A∼H, J∼M), ×400.
도 5a∼5b는 특이적 마커에 대한 phESC 세포주의 특성 규명 결과를 나타내는 것이다. 인간 영양 세포층 상 미분화 phESC 콜로니(A∼F), SSEA-1이 염색되지 않은 경우(G∼L), 세포 표면 마커인 SSEA-3 및 SSEA-4가 발현된 경우(각각 M∼R 및 S∼X). 배율: (A)∼(E), ×100; (F), ×200; (G)∼(X), ×400. 영양 세포(A-F), OCT-4(G∼L), TRA-1-60(K∼R) 및 TRA-1-81(S∼X)에서 phESC 콜로니가 알칼리성 포스파타제에 의해 염색됨. 배율: (A, B, O, R), ×100; (C-F, M, S, X), ×200; (G-L, N, P, Q, T-W), ×400.
도 6은 포지티브 대조군과 비교하였을 때, phESC 세포가 텔로머라제 활성을 높은 수준으로 나타냄을 입증하는 것이다: "+" = 500개의 세포로부터 유래하는 추출물; "-" = 불활성화된 텔로머라제를 사용하여 얻어진, 열 처리된 세포 추출물; "대조군 +" = 텔로머라제 활성을 나타내는 세포 추출물(트라페즈 키트(TRAPEZE Kit) 사용); "B" = CHAPS 용해 완충액, 프라이머-이량체/PCR 오염 대조군; TSR8-텔로머라제 정량 대조군 주형(0.1 및 0.2 mole/㎕); "M" = 마커, DNA 사다리.
도 7은 phESC 세포주의 G-밴드 핵형을 나타내는 것이다. phESC-1(A), phESC-3(B), phESC-4(C), phESC-5(D) 및 phESC-6(E) 세포주는 정상적인 46번, XX 핵형을 갖는다. phESC-7 세포주는 47번, XXX 핵형을 갖는다(F).
발명의 상세한 설명
본 발명의 조성물, 방법 및 배양 방법을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정의 조성물, 방법 및 실험 조건에 한정되지 않으므로, 이와 같은 조성물, 방법 및 조건들은 변할 수 있다는 점을 이해해야 할 것이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정의 구체예를 기술하기 위한 목적으로 제공된 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 오로지 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정될 것임도 이해해야 할 것이다.
본 발명의 명세서와 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "이", "그" 및 "상기"에는, 명세서에서 달리 언급하지 않는 한, 복수의 의미도 포함하는 것이다. 그러므로, 예를 들어, "상기 방법"이란 용어에는 하나 이상의 방법, 및/또는 본원에 개시된 유형의 단계들 즉, 본 명세서를 통하여 당 업자들에게 명백하게 될 방법 및/또는 단계들이 포함된다.
"분화"란, 세포 내에서 일어나는 변화로서, 이 세포를 임의의 특화된 기능을 가지도록 만들기도 하고, 임의의 기타 특화된 기능 단위로 변화시키는 능력을 상실하게 만들기도 하는 변화를 의미하는 것이다. 분화할 수 있는 세포는 전능(totipotent), 다능(pluripotent) 또는 만능(multipotent) 세포 중 임의의 세포일 수 있다. 분화는 성숙한 성체 세포에 따라서 부분적으로 또는 전체적으로 일어날 수 있다.
모계 생식이란, 세포 예를 들어, 난모 세포 또는 기타 배 세포류 즉, 모든 암컷 기원, 바람직하게는 인간의 여성 기원의 포유동물 DNA 예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류 난모 세포 DNA를 함유하는 세포 유형이 활성화될 때 생성되는, 식별 가능한 영양외배엽 세포 및 내부 세포괴를 함유하는 배를 생산하는 과정을 의미하는 것이다. 이러한 암컷 포유동물 DNA는 예를 들어, 하나 이상의 DNA 서열을 삽입, 결실 또는 치환하여 유전적으로 변형될 수 있거나, 또는 변형되지 않을 수도 있다. 예를 들어, DNA는 원하는 암호화 서열, 또는 배 발생을 촉진 또는 억제하는 서열을 삽입 또는 결실함으로써 변형될 수 있다. 통상적으로, 이러한 배는 모든 암컷 기원의 DNA를 함유하는 난모 세포의 시험관 내 활성화를 통하여 얻어질 것이다. 모계 생식에는 이하에 정의된 처녀 생식도 포함된다. 또한, 정자의 DNA가 활성화된 난모 세포 내 DNA에 전달되지 않는 활성화 방법도 포함된다.
관련 측면에서, 난모 세포는 IVF용으로 제조된 과배란 피험체로부터 얻어진다. "과배란" 기술 예를 들어, 암컷 피험체를 IVF에 사용되는 호르몬으로 처리하는 기술은, 자연적인 주기에서는 보통 하나의 난자가 생산되는 것을, 이보다 더 많은 수의 난자(난모 세포)를 생산하도록 난소를 자극하는 것으로서 디자인된다.
난자 생산을 촉진하는데 필요한 약품으로서는 다음과 같은 것들을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 루프론(Lupron)(성선 자극 호르몬 방출 호르몬-작동제), 오가루트란(Orgalutran), 안타곤(Antagon) 또는 세트로타이드(Cetrotide)(성선 자극 호르몬 방출 호르몬-길항제), 폴리스팀(Follistim), 브라벨(Bravelle) 또는 고날-F(Gonal-F)(FSH, 여포 자극 호르몬), 레프로넥스(Repronex)(FSH와 LH 즉, 황체 형성 호르몬의 혼합물) 및 프레그닐(Pregnyl) 또는 노바렐(Novarel)(hCG, 인간 융모성 성선 자극 호르몬).
관련 측면에서, 난자는 경질 초음파를 통해서 수집될 수 있다. 이를 위해서는, 각 여포의 위치 파악을 위해 초음파를 이용하여 질벽을 통해서 (예를 들어, IV 진정 상태 하에) 난소에 바늘을 삽입하여야 한다. 여포액을 채취하여 시험관에 넣어서 난자를 얻어낸다.
"처녀 생식"("처녀 생식에 의해 활성화된" 및 "단성 생식에 의해 활성화된"과 같은 어구는 호환되어 사용 가능함)은, 정자가 침투하지 않고서도 일어날 수 있는 난모 세포의 활성화 과정으로서, 모든 암컷 기원의 DNA를 포함하는, 난모 세포 또는 배 세포 예를 들어, 할구를 활성화하여 얻어진 내부 세포괴 및 영양외배엽 세포를 포함하는 초기 배의 발생 과정을 의미한다. 관련 측면에서, "생식 세포체"란, 이와 같은 활성화 과정에 의해 얻어진 세포를 의미하는 것이다. 기타 관련 측면에서, "배반포"란, 외부 영양 막과 내부 세포괴(ICM)로 이루어진, 속이 빈 공모양의 세포를 포함하는, 수정 또는 활성화 난모 세포의 분할 단계에 있는 세포를 의미하는 것이다. 추가의 관련 측면에서, "배반포 형성"이란, 난모 세포가 추후에 배지 중에서 이 난모 세포가 외부 영양막 세포 및 ICM으로 이루어진, 속이 빈 공 모양의 세포로 발생하는데 충분한 시간(예를 들어, 5∼6일) 동안에 배양되는 경우, 난모 세포 형성 또는 활성화 이후의 과정을 의미하는 것이다.
하나의 구체예에서, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포에 의해, 클로닝된 인간 배아 줄기 세포주를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 처녀 생식은 천연 상태에서 일반적으로 일어나는 생식의 한 형태이지만, 포유동물은 이와 같은 형태의 생식 과정을 수행할 수 있다고 알려져 있지는 않다. 그러나, 자발적인 처녀 생식은 본래의 마우스 변종 LT/Sv의 암컷으로부터 유래하는 난모 세포에서 10% 비율로 발견될 수 있다[Ozil and Huneau, Development (2001) 128:917-928; Vrana외 다수, Proc Natl Acad Sci USA (2003) 100(Supp11):11911-11916; Berkowitz and Goldstein, New Eng J Med (1996) 335(23): 1740-1748]. 포유동물 태반으로부터 유래하는 난모 세포는 시험관 내 처녀 생식을 수행하도록 유도될 수 있으나; 배의 발생 과정은 성공적이지 못하다.
포유동물 난모 세포의 처녀 생식에 의한 활성화 이후에, 활성화된 난모 세포를 대리모에게 옮기는데, 이때 배의 생존 기간에는 한계가 있다: 마우스의 경우에는 10일; 양의 경우에는 21일; 돼지의 경우에는 29일; 그리고 토끼의 경우에는 11.5일[Kure-bayashi외 다수, Theriogenology (2000) 53:1105-1119; Hagemann외 다수, Mol Reprod Dev (1998) 50:154-162; Surani and Barton, Science (1983) 222:1034-1036]. 이와 같이 발생이 지체되는 이유는 유전적 각인(genetic imprinting) 때문인 것으로 추정된다. 모계 및 부계 게놈은 후생적으로 상이한 것이며, 또한 이들 게놈들은 성공적인 배 발생에 필요한 것으로 파악된다[Surani, Cell (1998) 93:309-312; Sasaki외 다수, (1992) 6:1843-1856]. 반수성체에서, 유전 물질 전부는 모계 기원이어야 하므로, 부계 유전자 각인은 일어나지 않는다. 부계 각인은 배-외 조직의 발생에 관여하므로, 제핵 난모 세포의 수정 이후에 영양 세포 조직이 발생하는 것으로 생각된다[Stevens, Nature (1978) 276:266-267]. 그러므로, 동물에 있어서, 제핵 접합체는 추후의 처녀 생식 활성화시에 핵을 운반하는데 유용할 수 있다.
포유동물의 처녀 생식 과정은 배를 영구적으로 사멸시키는, 제한된 발생 과정만을 수행한다. 매커 섬유 다발(Macac fascicularis)에 있어서, 시험관 내 처녀 생식 활성화 이후 중기 II 단계에 있는 난모 세포 중 14%만이, 배양 8일 후 포배기로 발생하였다[Monk, Genes Dev (1988) 2:921-925]. 이와 유사하게, 핵 운반 후 시험관 내에서 처녀 생식으로 활성화된 인간 난모 세포 중 12%는 포배기로 발생하였다[Monk, 1988]. 상기 두 가지 경우에 있어서, 하나의 줄기 세포주가 생산된다.
본래의 마우스 변종 LT/Sv의 처녀 암컷에서 자발적으로 활성화된 반수성체로부터 형성되는 배는 수일 내에 사멸한다. 이와 같은 배의 내부 세포괴(ICM)를 포함하는 세포로부터 수정된 제핵 C57BL/6J 마우스 난모 세포로 핵이 운반될 때, LT/Sv 게놈으로 클로닝된 마우스가 얻어진다[Kaufman외 다수, Nature (1977) 265:53-55]. 그러므로, 수정된 난모 세포를 반수성체 발생 기간 내내 사용할 수 있다. 하나의 측면에서, 수정된 제핵 인간 난모 세포는, 포배기에 이를 때까지, 공여자의 핵을 함유하는 처녀 생식 배의 발생을 지지하는데 사용될 수 있다.
하나의 구체예에서, 처녀 생식에 의한 활성화 이후, 공여자의 난모 세포의 전핵 또는 공여자 모친의 난모 세포로부터 유래한 전핵은, 부계 및 모계의 전핵이 추출된 인간의 수정 난모 세포로 운반될 수 있다.
다른 구체예에는, 인간의 줄기 세포를 생산하는 2 단계 방법, 즉, 공여자의 체세포 핵을 공여자의 난모 세포로 운반하는 단계[여기서, 상기 난모 세포는 추후 처녀 생식에 의해 활성화됨]와, 활성화된 난모 세포의 전핵을 수정된 난모 세포로 운반하는 단계[여기서, 부계 및 모계 전핵은 추출되었음]를 포함하는 방법이 개시되어 있다.
다른 구체예에서, 공여자의 체세포로부터 유래하는 핵은, 추후 처녀 생식에 의해 활성화되는, 수정된 제핵 인간 난모 세포에 운반될 수 있다. 상기 3개의 구체예를 다음의 도표로 도시할 수 있다:
사례 1:
여성 환자 → 난모 세포 분리 → 처녀 생식에 의해 활성화 → 전핵 분리 → 수정된 제핵 난모 세포에 전핵 첨가.
남성 환자 → 환자의 모친으로부터 난모 세포 채취 → 처녀 생식에 의해 활성화 → 전핵 분리 → 수정된 제핵 난모 세포에 전핵 첨가.
사례 2:
공여자의 전핵 채취 → 난모 세포 분리 → 핵 운반에 의해 환자의 체세포에 전핵으로부터 유래하는 핵 첨가 → 처녀 생식에 의한 활성화 → 전핵 분리 → 수정된 난모 세포에 전핵 첨가.
사례 3:
공여자의 난모 세포 채취 → 수정 → 핵 분리 → 환자의 체세포 핵 첨가 → 처녀 생식에 의해 활성화.
"다능 세포"란, 장기간 동안(이론적으로는 무한정의 기간 동안) 시험관 내에서 미분화 상태로 유지되고 있다가, 상이한 분화 조직형 즉, 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 생성될 수 있는, 모든 암컷 또는 수컷 기원의 DNA를 함유하는 세포를 활성화하여 생산된 배로부터 유래하는 세포를 의미하는 것이다. 세포의 다능 상태는, 배의 내부 세포괴 또는 이 내부 세포괴로부터 유래하는 세포를 배양함으로써 유지되는 것이 바람직한데, 여기서, 상기 배의 내부 세포괴는 적당한 조건 하에서의 웅성 방법 또는 자성 방법 예를 들어, 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함하는 섬유아세포 영양 세포층 또는 기타 영양 세포층 또는 배양액에서 배양하는 방법에 의해 생산된다. 이와 같이 배양된 세포의 다능 상태는 다양한 방법 예를 들어, (i) 다능 세포의 특징을 이루는 마커가 발현되는지 확인하는 방법; (ii) 다능 세포의 유전자형을 발현하는 세포를 함유하는 키메라 동물을 생산하는 방법; (iii) 세포를 동물 예를 들어, SCID 마우스에 주입함으로써, 생체 내에서 상이하게 분화된 세포류를 생산하는 방법; 그리고 (iv) (예를 들어, 영양 세포층 또는 LIF의 부재 하에서 배양되었을 때) 세포가 시험관 내에서 배상체 및 기타 분화된 세포 유 분화되는지 여부를 관찰하는 방법에 의해 확인될 수 있다.
"2배체 세포"란, 모든 수컷 또는 암컷 기원의 2배체 DNA 함유물을 가지는 세포 예를 들어, 난모 세포 또는 할구를 의미하는 것이다.
"반수체 세포"란, 반수체 DNA가 모든 수컷 또는 암컷 기원의 것일 때, 반수체 DNA 함유물을 가지는 세포 예를 들어, 난모 세포 또는 할구를 의미하는 것이다.
활성화란, 수정된 난모 세포 또는 수정되지 않은 난모 세포 예를 들어, 감수 분열 중 중기 II에 있는 난모 세포가 통상적으로, 염색 분체 쌍의 분리, 제2의 극체 분출을 포함하는 과정을 수행하여, 각각이 하나의 염색 분체를 가지는 반수체인 염색체를 보유하는 난모 세포가 형성되는 과정을 의미하는 것이다. 활성화 방법으로서는 모든 수컷 또는 암컷 기원의 DNA를 함유하는 세포를 유도시켜, 분별 가능한 내부 세포괴 및 영양외배엽 세포를 가지는 배로 발생시키는 방법을 포함하는데, 여기서, 상기 배는 다능 세포를 생산하는데 유용하지만, 그것 자체는 다양한 자손으로 발생할 수 없다. 활성화는 예를 들어, 다음과 같은 조건들 중 하나에서 수행될 수 있다: (i) 제2의 극체를 분출시키지 않는 조건; (ii) 극체를 분출시키기도 하고, 극체를 분출시키지 않기도 하는 조건; 또는 (iii) 반수체 난모 세포의 제1 세포 분열을 억제하는 조건.
"중기 II"란, 세포의 DNA 함유물이 반수체인 염색체로 이루어져 있으며, 각각의 염색체는 2개의 염색 분체로 이루어진 세포의 발생 단계를 의미하는 것이다.
하나의 구체예에서, 중기 II 난모 세포는 이 난모 세포를 다양한 O2 분압 기체 환경 하에서 항온 처리함으로써 활성화된다. 관련 측면에서, O2 분압이 낮은 기체 환경은 O2 농도가 약 2%, 3%, 4% 또는 5%인 혼합 기체에 의해 조성된다. 추가의 관련 측면에서, 혼합 기체는 약 5%의 CO2를 포함한다. 뿐만 아니라, 혼합 기체는 약 90%의 N2, 91%의 N2 또는 93%의 N2를 포함한다. 이러한 혼합 기체는 5% CO2 공기 즉, 약 5%의 CO2, 20%의 O2 및 75%의 N2로 이루어진 공기와는 구별되는 것이다.
"O2 분압"이란, 유체(즉, 액체나 기체) 중 산소의 분압(혼합 기체를 이루는 하나의 성분에 의해 부여되는 압력)을 의미하는 것이다. 낮은 분압이란, 산소 분압(pO2)이 낮을 때를 의미하는 것이고, 높은 분압이란, pO2가 높을 때를 의미하는 것이다.
"제한-배지 조건(defined-medium condition)"이란, 세포의 최적 성장에 필요한, 배지 중 성분의 농도가 세분화된 세포 배양 환경을 의미하는 것이다. 예를 들어, 세포의 용도(예를 들어, 치료적 용도)에 따라서 이종 단백질을 함유하는 조건으로부터 세포를 분리하는 것이 중요한데; 즉, 배양 조건은 동물성 성분이 존재하지 않는 조건 또는 인간 이외의 동물의 단백질이 존재하지 않는 조건에 해당한다. 관련 측면에서, "시험관 내 수정(IVF) 배지"란, 화학적으로 제한된 물질을 함유하거나 수정된 난모 세포가 생육할 수 있는 영양 시스템을 의미하는 것이다.
"세포외 매트릭스(ECM) 기층"이란, 최적 성장을 지지하는, 세포 밑의 표면을 의미하는 것이다. 예를 들어, 이와 같은 ECM 기층으로서는 매트리겔(Matrigel), 라미닌, 젤라틴 및 피브로넥틴 기층을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 관련 측면에서, 이와 같은 기층들은 콜라겐 IV, 엔탁틴, 헤파린 황산염 프로테오글리칸을 포함할 수 있으며, 또한 다양한 성장 인자(예를 들어, bFGF, 상피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자-1, 혈소판 유래 성장 인자, 신경 성장 인자 및 TGF-β-1)도 포함할 수 있다.
"배"란, 변형될 수도 있는, 모든 수컷 또는 암컷 기원의 DNA를 함유하는 세포 예를 들어, 난모 세포나 기타 배 세포가 활성화됨에 따라서 생성되며, 다양한 자손을 생성할 수 없고, DNA는 모든 수컷 또는 암컷으로부터 기원하는 분별 가능한 영양외배엽 세포 및 내부 세포괴를 포함하는, 배를 의미한다. 내부 세포괴 또는 이에 포함된 세포는 상기 정의한 바와 같은 다능 세포를 생산하는데 유용하다.
"내부 세포괴(ICM)"란, 태아 조직으로 형성되는 배의 내부 부분을 의미하는 것이다. 본원에서, 이 세포는 시험관 내 다능 세포의 연속적인 공급원을 제공하는데 사용된다. 뿐만 아니라, ICM은 웅성 생식 또는 자성 생식으로부터 생산된 배 즉, 모든 수컷 또는 암컷 기원의 DNA를 함유하는 세포가 활성화됨에 따라서 생산되는 배의 내부 부분을 포함한다. 예를 들어, 이와 같은 DNA는 유전적으로 변형될 수 있거나 또는 변형될 수 없었던 인간의 DNA 예를 들어, 인간의 난모 세포 또는 정자 DNA일 것이다.
"영양외배엽 세포"란, 예를 들어, 웅성 생식 또는 자성 생식으로부터 생성되는 배의 조직과 같은 태반 조직으로 형성되는, 초기 배의 다른 부분을 의미하는 것으로서, 여기서 상기 배는 모든 수컷 또는 암컷 기원 DNA 예를 들어, 인간의 난소 또는 정자의 DNA를 함유하는 세포를 활성화함으로써 생성되는 것이다.
"분화된 세포"란, 특정의 분화된 상태 즉, 배가 아닌 상태인 비-배 세포를 의미하는 것이다. 3개의 초기 분화 세포 유형으로서는 내배엽, 중배엽 및 외배엽이 있다.
"실질적으로 동일한"이란, 특정 성질이 매우 밀접하게 관련되어 있어서, 차이점을 측정하는 방법(예를 들어, 조직 적합 항원 검사(HLA typing) 및 SNP 분석법 등)에서 본질적으로 동일한 것으로서 파악되는 정도의 동일성을 가지는 경우를 의미한다.
"조직 적합성인(histocompatible)"이란, 유기체가 외래 조직의 이식 편을 허용하게 될 상태를 의미하는 것이다.
"유전자 각인(genomic imprinting)"이란, 게놈 전체에 부계 기원에 따라서 단일 대립 형질로서 발현되는(monoallelically expressed) 다수의 유전자에 의한 기작을 의미하는 것이다.
"동형상태(Homoplasmy)" 및 이 용어의 문법적 변형어는, 세포 또는 피험체 내에 동종 유형의 미토콘드리아 DNA(mtDNA)가 존재하는 경우를 의미하는 것이다.
"이형상태(Heteroplasmy)" 및 이 용어의 문법적 변형어는, 세포 또는 피험체 내에 한가지 이상의 유형의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 혼합물이 존재하는 경우를 의미하는 것이다.
"단위 생식의(Uniparental)"이란, 하나 이상의 세포 또는 피험체가 다른 세포 또는 피험체로부터 생산되어, 이것이 종속적인 상태를 유지하는 경우를 의미하는 것이다.
"물리적으로 분리함"이란, 물리적 힘에 의해 세포 응집체를 분리하는 과정을 의미하는 것이다. 예를 들어, 이와 같은 과정에서는 인간으로부터 유래하지 않는 물질을 함유할 수 있는 효소(또는 기타 세포 절단 생산물)를 사용하지 않는다.
천연의 환경에서, 난소로부터 유래하는 미성숙 난모 세포(난자)는 감수 분열을 통하여 감수 분열의 중기 II로 진행되는 성숙의 과정을 수행한다. 이후, 난모 세포는 중기 II에 머무르게 된다. 중기 II에 있어서, 세포의 DNA 함유물은 반수체인 염색체를 포함하는데, 이 염색체들은 각각 2개의 염색 분체로 이루어져 있다.
이러한 난모 세포는 저온 보존법 예를 들어, 당과 함께 미세 주입하는 방법에 의해 무한정 보존될 수 있다.
하나의 구체예에서, 냉동 보존된 난모 세포 또는 반수성체로부터 인간 줄기 세포를 생산하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 난모 세포 또는 반수성체의 세포질에 냉동 보존제를 미세 주입하는 단계, 난모 세포 또는 반수성체를 휴지기 상태로 유도하는 극저온으로 동결시키는 단계, 이 난모 세포 또는 반수성체를 휴지기 상태로 저장하는 단계, 난모 세포 또는 반수성체를 해동하는 단계, 이오노포어의 존재하에, 높은 O2 분압에서 난모 세포를 처녀 생식에 의해 활성화한 후, 낮은 O2 분압 하에서 난모 세포와 세린-트레오닌 키나제 억제제를 접촉시키는 단계, 배반포가 형성될 때까지 활성화된 난모 세포 또는 반수성체를 배양하는 단계, 배반포로부터 내부 세포괴(ICM)를 분리하는 단계, 그리고 인간의 영양 세포층에서 ICM 세포를 배양하는 단계[여기서, ICM 세포를 배양하는 단계는 높은 O2 분압 하에서 수행됨]를 포함한다.
하나의 측면에서, 전술한 바와 같이 얻어진 난모 세포는 배-테스트된 무기 오일(Sigma)로 덮인 변형된 등장성 IVF, 또는 임의의 기타 적당한 배지로 운반된다. 원한다면, 난모 세포는 미세 주입할 농도와 동일한 농도의 세포외 당과 함께 배양될 수 있다. 예를 들어, 0.1M의 당을 주입하기 위해서, 난모 세포는 DMEM/F-12 중에서 0.1M의 당으로 평형화될 수 있다. 하나의 측면에서, 저온 보존 제제는 표준적인 DMEM보다 낮은 농도의 Na+를 포함한다(즉, 저 Na+ 배지). 관련 측면에서, 저온 보존 제제는 표준적인 DMEM보다 높은 농도의 K+(즉, 고 K+ 배지)를 포함한다. 추가의 관련 측면에서, 저온 보존 제제는 표준적인 DMEM보다 낮은 농도의 Na+와 높은 농도의 K+를 포함한다(즉, 저 Na+/고 K+ 배지). 하나의 측면에서, 저온 보존 제제는 유기 완충액 예를 들어, HEPES를 포함한다. 다른 측면에서, 저온 보존 제제는 세포 사멸 단백질(예를 들어, 카파제)을 억제하는 일부를 포함한다.
대안적으로, 난모 세포는 임의의 기타 실질적으로 비-투과성인 용질 예를 들어, NaCl로 평형화되어, 미세 주입 이전에 세포 부피를 감소시킬 수도 있다. 이와 같이 초기에 세포 부피가 감소하면, 미세 주입 이전에 고장성 배지 내에서 항온 처리되지 않은 난모 세포에 비하여, 미세 주입된 난모 세포의 최종 부피가 작아질 수 있다. 이와 같이 최종 부피가 작아지면, 난모 세포가 팽창함에 따라서 발생할 수 있는 임의의 부작용을 최소화할 수 있다. 이와 같이 미세 주입을 위한 일반적인 세포 제조 방법은 또한 기타 세포 유형(예를 들어, 활성화된 난모 세포 및 hES 세포 등)에도 사용될 수 있다.
이후, 난모 세포는 냉동 보존제와 함께 미세 주입된다. 미세 주입 장치 및 방법에 관하여는 당 업계에 널리 특성 규명되어 있으며, 본 발명에서는 소형 분자를 세포에 주입하는데 사용되는 것으로 알려진 미세 주입 장치를 사용할 수 있다. 전형적인 미세 주입 단계에 있어서, 난모 세포는 30msec 동안 10psi의 압력에서 미세 주입될 수 있다. 표준적인 미세 주입 기술의 다른 예로서는 문헌[Nakayama and Yanagimachi, Nature Biotech. 16:639-642, 1998]에 개시된 방법이 있다.
본 방법에 유용하게 사용되는 냉동 보존제로서는 동결 방지 특성을 보유하며, 보통 비투과성인 임의의 화학 물질을 포함한다. 특히, 냉동 보존제는 당만을 포함할 수 있거나 기타 통상의 냉동 보존제와 함께 혼합된 당을 포함할 수 있다. 탄수화물 당 예를 들어, 트레할로스, 수크로스, 프록토스 및 라피노스는 약 1.0M 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.4M 이하의 농도로 미세주입될 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 농도는 0.05∼0.20M이다. 부가적으로, 저장하기 이전에, 세포외에 존재하는 당 또는 통상의 냉동 보존제가 첨가될 수 있다. 만일 세포가 미세 주입 이전에 고장성 용액에서 항온 처리되면, 실질적으로 비투과성인 용질은 미세 주입 이후에 배지 중에 잔류할 수 있거나, 상기 용질을 낮은 농도로 포함하거나 또는 포함하지 않는 배지로 상기 세포를 세척함으로써 배지로부터 분리할 수 있다.
그 크기가 너무 커서 일반적으로는 세포막을 투과하지 않는 임의의 당 또는 다당류는 저온 보존을 위한 물리 화학적 특성 및 생물학적 특성이 우수하다. 이와 같은 당은 일반적으로 그 자체로서는 세포막을 투과하지 못하지만, 본원에 기술된 방법을 사용하면, 이와 같이 일반적으로 비투과성인 당도 세포 내에 미세 주입되어, 유리한 효과를 얻을 수 있게 된다.
본 발명의 방법에 냉동 보존제로서 특히 유용하며, 세포를 안정화시키거나 보존하는 효과를 갖는 비투과성 당으로서는 수크로스, 트레할로스, 프록토스, 덱스트란 및 라피노스를 포함한다. 이와 같은 당 중에서, 글루코스의 비 환원성 이당류인 트레할로스는 예상외로 낮은 농도에서도 세포의 구조를 안정화시킬 수 있는 것으로 파악된다. 세포외 당지질 또는 당 단백질을 첨가하면, 세포막을 안정화시킬 수도 있다.
냉동 보존제를 미세 주입한 후, 세포를 저장용으로 제조한다. 다수의 동결 및/또는 건조 방법이 저장용 세포를 제조하는데 사용될 수 있다. 특히, 3가지의 방법이 본원에 기술되어 있다: 진공 건조법 또는 공기 건조법, 동결 건조법 및 동결-해동법. 건조 방법은 안정화된 생물학적 물질을 상온에서 운반 및 저장할 수 있다는 점에서 유리하다.
통상적으로, 1∼2M의 DMSO가 로딩된 난모 세포는 매우 느린 냉각 속도(0.3∼0.5℃/분)로 냉각되기 시작하여, 저장용 액체 질소에 담가두기 이전에는 중간 정도의 온도(-60∼-80℃)가 된다. 이후, 시료는 이 온도에서 저장될 수 있다.
이후, 예를 들어, 바이알을 액체 질소(LN2) 중에 원하는 시간 동안 담가 둠으로써, 현탁된 물질을 저온 보존 온도에 저장할 수 있다.
단백질을 진공 건조 또는 공기 건조하는 방법과 동결 건조하는 방법에 관하여는 당 업계에 널리 특성 규명되어 있으며[Franks외 다수, "Materials Science and the Production of Shelf-Stable Biologicals," BioPharm, October 1991, p. 39; Shalaev외 다수, "Changes in the Physical State of Model Mixtures during Freezing and Drying: Impact on Product Quality," Cryobiol. 33, 14-26 (1996)], 이러한 방법은 본원에 기술된 방법으로 저장용 세포 현탁액을 제조하는데 사용될 수 있다. 공기 건조법 이외에도, 세포 현탁액으로부터 물을 제거하는데 사용될 수 있는 기타 대류 건조법은 질소 또는 기타 기체를 대류시키는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한, 대표적인 증발 진공 건조 방법은 20㎕의 각 시료를 12웰 평판의 웰에 넣는 단계와, 상온에서 2시간 동안 진공 건조하는 단계를 포함한다. 물론, 기타 건조 방법 예를 들어, 바이알 내에서 세포를 건조시키는 방법도 사용될 수도 있다. 이러한 방식으로 제조된 세포는 건조 상태로 저장할 수 있으며, DMEM 또는 임의의 기타 적당한 배지 중에 희석함으로써 재수화될 수도 있다.
저장용 세포를 제조하기 위해 동결 건조법을 사용하는 본 발명의 방법은 세포 현탁액을 동결시키는 것에서 시작된다. 당 업계에 공지된 동결 방법이 사용될 수도 있지만, 본원에 기술된, 동결-해동 방법용으로서 간편한 침지 동결법도 동결 건조 프로토콜 중 동결 단계에 사용할 수 있다.
동결시킨 후, 2단계 건조 방법이 사용될 수 있다. 첫 번째 단계에서는, 승화 에너지를 가하여, 동결된 물을 증발시킨다. 두 번째 건조 단계는 시료 중 순수한 결정성 얼음을 승화시킨 이후에 수행된다. 동결 건조된 세포는 진공 건조법에 관하여 전술한 바와 동일한 방식으로 저장 및 수화될 수 있다. 이후 자생력 있는 세포가 회수될 수 있다.
동결 또는 건조된 상태의 세포를 회수한 후, 외부에 잔류하는 임의의 냉동 보존제를 배양 배지로부터 회수할 수도 있다. 예를 들어, 배지는 낮은 농도의 냉동 보존제를 포함하는 해당 배지를 첨가함으로써 희석될 수 있다. 예를 들어, 회수된 세포는 세포 저장에 사용된 당의 농도보다 낮은 농도의 당을 함유하는 배지 중에서 약 5분 동안 항온 처리될 수 있다. 이와 같은 항온 처리 과정에 있어서, 배지는 냉동 보존제로서 사용되는 것과 동일한 당; 상이한 냉동 보존제 예를 들어, 갈락토스; 또는 실질적으로 비투과성인 기타 임의의 용질을 함유할 수 있다. 배지의 삼투성을 감소시켜 유도된 임의의 삼투압 충격을 최소화하기 위하여, 이와 같은 희석 단계를 수회 수행함으로써(각 회마다 점점 낮은 농도의 냉동 보존제를 사용함) 세포외 냉동 보존제의 농도를 천천히 낮출 수 있다. 이와 같은 희석 단계는 세포외 냉동 보존제가 존재하지 않게 되거나 또는 냉동 보존제의 농도나 배지의 삼투성이 원하는 수준으로 감소할 때까지 반복될 수 있다.
처녀 생식에 의하여 활성화된 난모 세포, 배반포, ICM 및 자기 줄기 세포는 장래에 필요할 때를 대비하여 세포를 재생할 수 있는 방식으로 저장 또는 "저장(banking)"될 수 있다. 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포 및 자기 줄기 세포의 분취액을 임의의 시기에 분리하여, 다수의 미분화 세포로 이루어진 배양액 중에서 생육시키면, 상기 난모 세포 및 줄기 세포는 특정의 세포 유형 또는 조직 유형으로 분화될 수 있으며, 또한 이후에 피험체의 질병을 치료하거나 기능 부전 조직을 대체하는데 사용될 수 있다. 세포는 공여체로부터 처녀 생식에 의해 유래할 수 있기 때문에, 피험체 또는 밀접하게 관련된 유도체가 장기간 동안 세포를 이용할 수 있도록 세포를 저장할 수 있다.
하나의 구체예에서, 세포 은행은 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포, 배반포, ICM 및/또는 자기 줄기 세포 시료를 저장하기 위하여 제공된다. 다른 구체예에서, 이러한 세포 은행(cell bank)을 제공하는 방법이 제공된다. 공표된 미국 특허 출원 제20030215942호(본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)는 줄기 세포 은행 시스템의 일례를 제공한다.
전술한 바와 같은 방법을 수행함에 있어서, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포, 배반포, ICM 및 자기 줄기 세포 시료를 분리 및 시험관 내 증식시키고, 이것들을 저온 보존하면, 이식 가능한 인간 줄기 세포의 "은행"의 확립이 촉진된다. 보다 소량의 세포를 저장하는 경우도 있을 수 있기 때문에, 저장 과정에는 비교적 작은 공간이 필요할 수도 있다. 그러므로, 다수의 피험체를 구성하는 세포는 단기간 또는 장기간 동안 비교적 저렴한 비용으로 저장 또는 "저장"할 수 있었다.
하나의 구체예에서, 시료의 일부는 가공 및 저장 이전 또는 이후에 테스트용으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 시료의 위치 파악이 필요할 때 용이하게 탐색할 수 있도록, 처녀 생식에 의하여 활성화된 난모 세포, 배반포, ICM 및/또는 자기 줄기 세포 시료를 기록 또는 색인하는 방법을 제공한다. 임의의 색인 및 탐색 시스템을 사용하면 본 목적을 이룰 수 있다. 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포, 배반포, ICM 및/또는 자기 줄기 세포를 저장할 수 있도록 임의의 적당한 유형의 저장 시스템을 사용할 수 있다. 시료는 각각의 시료를 저장하도록 디자인될 수 있거나, 또는 수백, 수천 및 수 백만개의 상이한 세포 시료들을 저장하도록 디자인될 수 있다.
저장된 처녀 생식 활성화 난모 세포, 배반포, ICM 및/또는 자기 줄기 세포 시료는, 신뢰할 수 있으며 정확한 탐색을 위해 색인할 수 있다. 예를 들어, 각각의 시료에 알파벳과 숫자를 혼용한 코드, 바코드 또는 임의의 기타 방법이나 이러한 방법을 혼용하여 표식을 붙일 수 있다. 뿐만 아니라, 처녀 생식에 의해 활성화된 각각의 난모 세포, 배반포, ICM 및/또는 자기 줄기 세포 시료를 식별할 수 있도록 만드는 정보와, 저장소에서의 위치를 파악할 수 있도록 만드는 정보, 그리고 저장소 이외의 세포 시료의 공급원 및/또는 세포 시료의 유형을 식별할 수 있도록 만드는 정보에 관한 접근 가능하고 가독성인 목록을 작성할 수도 있다. 이와 같은 색인 시스템은 당 업계에 공지된 임의의 방식 예를 들어, 수동 방식 또는 비-수동 방식 예를 들어, 컴퓨터 및 통상의 소포트웨어를 사용하는 방식으로 관리할 수 있다.
하나의 구체예에서, 세포 시료는 색인 시스템을 사용하여 조직적으로 관리되므로, 시료를 필요로 하는 때라면 언제든지 공여자가 사용할 수 있을 것이다. 다른 구체예에서, 세포 시료는 원래 공여자와 관련된 개인이 사용할 수 있다. 일단 색인 시스템에 등록되면, 세포 시료는 매칭(matching) 용으로 활용될 수 있는데, 예를 들어, 매칭 프로그램을 통하여 매치하는 유형 정보를 가지는 개인을 찾을 수 있을 것이고, 또한 그 개인은 경우에 따라서 매치하는 시료를 제공받을 수 있게 될 것이다.
저장용 저장 시스템은 다수의 피험체 및 다수의 세포 시료와 관련된 다수의 기록들을 저장하는 시스템을 포함할 수 있다. 각각의 기록은 세포 시료 또는 특정 피험체와 관련된 유형 정보, 유전자형 정보 또는 표현형 정보를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 시스템은 시료의 유형과 시료를 투여받기를 원하는 피험체의 유형을 매치시키는 교차-매치 표(cross-match table)를 포함할 것이다.
하나의 구체예에서, 데이터베이스 시스템은 저장소 내에 있는, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포, 배반포, ICM 및/또는 자기 줄기 세포 시료 각각에 대한 정보를 저장한다. 임의의 정보는 각각의 시료와 함께 저장된다. 정보 예를 들어, 공여자의 동일성과 공여자의 의료 기록은 특정의 공여자와 관련될 수 있다. 예를 들어, 각각의 시료는 조직 적합 항원 검사를 받을 수 있으며, 이 조직 적합 항원 검사 정보는 각각의 시료와 함께 저장될 수 있다. 저장된 정보는 또한 사용 가능한 정보일 수 있다. 각각의 시료와 함께 저장된 정보를 검색할 수 있으며, 이와 같이 검색함으로써 고객에게 즉시 위치를 파악하여 공급할 수 있도록 시료를 찾을 수 있다.
그러므로, 본 발명의 구체예는 정보 예를 들어, 공여자, 제공일, 제공된 세포의 유형, 존재하는 세포 표면 마커의 유형, 공여자와 관련된 유전 정보 또는 기타 관련 정보와, 저장물에 관한 설명 예를 들어, 유지 기록과 저장된 시료의 위치, 그리고 기타 유용한 정보를 포함하는, 컴퓨터를 바탕으로 한 시스템을 이용한다.
"컴퓨터를 바탕으로 한 시스템(computer-based system)"이란 용어는, 저장된 세포에 관한 정보를 저장, 검색 및 탐색하는데 사용되는 임의의 데이터베이스, 소프트웨어 및 하드웨어를 의미하는 것이다. 컴퓨터를 바탕으로 한 시스템은 전술한 바와 같은 저장 매체와, 데이터에 접근하여 조작할 수 있는 프로세서를 포함하는 것이 바람직하다. 본 구체예의 컴퓨터를 바탕으로 한 시스템의 하드웨어는 중앙 처리 장치(CPU)와 데이터베이스를 포함한다. 당업자는 현재 사용되고 있는, 컴퓨터를 바탕으로 한 시스템 중 임의의 것이 적당함을 쉽게 알 수 있다.
하나의 구체예에서, 컴퓨터 시스템은 주 메모리(바람직하게는 RAM으로서 장착됨)와 다수의 2차 저장 장치 예를 들어, 하드 드라이브 및 분리 가능한 매체 저장 장치에 연결되어 있는 버스(bus)와 연결된 프로세서를 포함한다. 분리 가능한 매체 저장 장치로서는 예를 들어, 플로피 디스크 드라이브, DVD 드라이브, 광 디스크 드라이브, 컴팩트 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브 등이 있을 수 있다. 컨트롤 로직(control logic) 및/또는 여기에 기록된 데이터를 포함하는, 분리 가능한 저장 매체 예를 들어, 플로피 디스크, 컴팩트 디스크, 자기 테이프 등은 분리 가능한 저장 장치에 삽입될 수 있다. 컴퓨터 시스템은 컨트롤 로직을 판독하는데 적당한 소프트웨어 및/또는 분리 가능한 매체 저장 장치에 삽입되어 있는 분리 가능 매체 저장 장치로부터 유래하는 데이터를 포함한다. 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포, 배반포, ICM 및/또는 자기 줄기 세포와 관련된 정보는 널리 공지된 방식으로, 주 메모리, 2차 저장 장치 중 임의의 것 그리고/또는 분리 가능한 저장 매체에 저장될 수 있다. 이러한 데이터에 접근하여 이 데이터를 처리하기 위한 소프트웨어(예를 들어, 검색 툴 및 비교 툴 등)는 실행 중인 주메모리 내에 존재한다.
본원에 있어서, "데이터베이스"란 용어는, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포 및/또는 자기 줄기 세포 집합체 및 공여체와 관련된 임의의 유용한 정보를 저장할 수 있는 메모리를 의미한다.
저장된 처녀 생식 활성화 난모 세포, 배반포, ICM 및/또는 자기 줄기 세포와 관련된 데이터는 다양한 형태로 다수의 데이터 프로세서 프로그램에 저장되어 여기에서 조작될 수 있다. 예를 들어, 데이터는 당업자에게 널리 공지된 다양한 데이터베이스 프로그램 예를 들어, DB2, SYBASE 또는 ORACLE에, 워드 프로세서 파일 예를 들어, 마이크로소프트 워드(Microsoft WORD) 또는 워드퍼팩트(WORDPERFECT), ASCII 파일, html 파일, 또는 pdf 파일의 텍스트 파일로서 저장될 수 있다.
"검색 프로그램"이란, 데이터베이스 내 냉동 보존된 시료와 관련된 정보를 비교하거나, 이 시료와 관련된 상세한 정보를 검색하기 위해, 컴퓨터를 바탕으로 한 시스템에서 실행되는 하나 이상의 프로그램을 의미한다. "탐색 프로그램"이란, 데이터베이스 내 목적으로 하는 매개 변수를 확인하기 위하여, 컴퓨터를 바탕으로 하는 시스템에서 실행될 수 있는 하나 이상의 프로그램을 의미한다. 예를 들어, 탐색 프로그램은 특정 프로필과 부합하는 시료, 특이적인 마커 또는 DNA 서열을 가지는 시료, 또는 특정 피험체와 상응하는 시료의 위치를 찾는데 사용될 수 있다.
하나의 세포 은행에 저장될 수 있는 세포 시료의 수에는 상한이 존재하지 않는다. 하나의 구체예에서, 상이한 피험체로부터 유래하는 수백 개의 생산물은 하나의 저장소 또는 저장 시설에 저장될 것이다. 다른 구체예에서, 수백만 개 이하의 생산물이 하나의 저장 시설에 저장될 수 있다. 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포 및/또는 자기 줄기 세포 시료를 저장하는데 하나의 저장 시설이 사용될 수 있으며, 때로는 다수의 저장 시설이 사용될 수도 있다.
본 발명에 관한 몇몇 구체예에서, 저장 시설은 저장된 세포 시료를 조직적으로 관리하고 이를 색인하는 임의의 수단 예를 들어, 자동화 로보트 탐색 기구 및 세포 시료 조작 기구를 보유할 수 있다. 이러한 시설은 세포 시료를 처리하는 미세조작 장치를 포함할 수 있다. 공지된 종래의 기술은 세포 시료를 효율적으로 저장하고 탐색하는데 사용될 수 있다. 대표적인 기술로서는 머신 비젼(Machine Vision), 로보틱스(Robotics), 자동화 가이드 비이클 시스템(Automated Guided Vehicle System), 자동화 저장 및 탐색 시스템(Automated Storage and Retrieval Systems), 컴퓨터 통합 제조 기술(Computer Integrated Manufacturing), 컴퓨터 보조 처리 계획(Computer Aided Process Planning) 및 통계학적 처리 제어 기술(Statistical Process Control) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
유형 정보 또는 기타 시료를 필요로 하는 개인과 관련된 정보는 적당한 매칭 생산물을 동정하는데 사용될 수 있는 시스템 예를 들어, 데이터베이스 시스템 및 색인 시스템 등에 기록될 수 있다. 일단 이 시스템에 기록되면, 피험체의 유형과 공여자 세포 시료 간에 매칭을 수행할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 공여자 시료는 시료를 필요로 하는 피험체와 동일한 피험체로부터 유래하는 것이다. 그러나, 유사하되 동일하지는 않은 공여자/수용자 간 매칭도 이용할 수 있다. 매치하는 시료는 매치 유형 식별자를 보유하는 피험체에 사용할 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 피험체의 식별 정보는 세포 시료와 연계하여 저장된다. 몇몇 구체예에서, 매칭 과정은 시료를 회수할 즈음에 진행되거나, 또는 처리 또는 저장 중 어느 때라도 진행될 수 있으며, 아니면 필요할 때마다 진행될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 몇몇 구체예에서, 매칭 과정은, 피험체가 세포 시료를 실제로 필요로 하기 이전에 진행된다.
피험체가 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포, 배반포, ICM 및/또는 자기 줄기 세포 시료를 필요로 할 때, 이 시료들을 탐색할 수 있으며, 또한 원한다면 수 분 내에 검색, 이식 또는 기타 목적으로 사용될 수 있다. 시료는 또한 추가로 가공되어 이식용 또는 기타 필요에 따라서 제조될 수도 있다.
일반적으로, 난모 세포는 이 단계에서 배란되어 정자에 의해 수정된다. 정자는 활성화라고 불리는 과정 중 감수 분열을 끝마칠 준비를 하기 시작한다. 활성화 진행 중, 염색 분체 쌍은 분리되고, 제2의 극체가 분출되며, 난모 세포는 반수체인 염색체(각각 하나의 염색 분체를 가짐)를 보유하게 된다. 정자는 염색체의 또 다른 반수체인 보충물의 형성을 도와, 하나의 염색 분체를 가지는 완전한 2배체 세포를 생산하도록 만들어 준다. 이후, 염색체에서는 제1 세포 주기 동안 DNA 합성 과정이 진행된다. 이후, 이와 같은 세포들은 배로 발생한다.
이와는 대조적으로, 본원에 개시된 배는 세포, 통상적으로 모든 수컷 또는 암컷 기원의 DNA를 함유하는 세포, 통상적으로 포유동물의 난모 세포나 할구를 인공적으로 활성화함으로써 발생된다. 본 발명의 배경 기술에서 언급한 바와 같이, 미수정 난모 세포를 인공적으로 활성화하기 위한 다수의 방법들이 문헌에 보고된 바 있다. 그러한 방법으로서는 물리적인 방법 예를 들어, 물리적 방법 예를 들어, 배양액 중 난모 세포를 찌르거나(pricking) 또는 조작하는 방법, 열에 의한 반법 예를 들어, 냉각 및 가열하는 방법, 반복적으로 전기 자극을 주는 방법, 효소 예를 들어, 트립신, 프로나제, 히알루로니다제로 처리하는 방법, 삼투압 처리 방법, 이온 처리 방법 예를 들어, 2가 양이온 및 칼슘 이오노포어 예를 들어, 이오노마이신 및 A23187에 의한 처리 방법, 마취제를 사용하는 방법 예를 들어, 에테르, 에탄올, 테트라카인, 리그노카인, 프로카인, 페노티아진을 사용하는 방법, 안정제를 사용하는 방법 예를 들어, 티오리다진, 트리플루오페라진, 플루페나진, 클로르프로마진을 사용하는 방법, 단백질 합성 억제제를 사용하는 방법 예를 들어, 사이클로헥시미드, 퓨로마이신을 사용하는 방법, 인산화 억제제를 사용하는 방법 예를 들어, 단백질 키나제 억제제 예를 들어, 스타우로스포린, 2-아미노퓨린, 스핑고신과 DMAP, 그리고 이들의 혼합물을 사용하는 방법, 그리고 기타 방법을 포함한다.
이와 같은 활성화 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,945,577호에도 개시되어 있다.
하나의 구체예에서, 중기 II에 있는 인간 세포, 통상적으로는 모든 남성 또는 여성 기원인 DNA를 포함하는 난모 세포나 할구가 인공적으로 활성화되면, 난모 세포를 인공적으로 활성화할 수 있다.
관련 측면에서, 2배체인 활성화된 세포 예를 들어, 난모 세포는 영양외배엽 세포와 내부 세포괴를 포함하는 배로 발생할 수 있다. 이 과정은 배반포 발생을 촉진하는 공지의 방법과 배양 배지를 사용하여 수행될 수 있다.
모계 생식에 의한 배를 배양하여 분별 가능한 영양외배엽 세포와 내부 세포괴를 생산한 후, 내부 세포괴를 이루는 세포를 사용하여 원하는 다능 세포주로 생산할 수 있다. 이 과정은 내부 세포괴 또는 전체 내부 세포괴로부터 유래하는 세포를, 분화를 억제하는 배양액으로 옮김으로써 이루어질 수 있다. 이 과정은 내부 세포괴를 이루는 세포 예를 들어, 섬유아세포 또는 상피 세포 예를 들어, 출산 직후 인간 조직 등으로부터 유래하는 섬유아세포, 또는 LIF를 생산하는 기타 세포를, 분화를 억제하는 영양 세포층으로 옮김으로써 이루어질 수 있다. 세포를 미분화 상태로 유지시키는데 적당한 배양 조건을 제공하기 위하여, 기타 인자/성분 예를 들어, 컨디셔닝된 배지(Amit외 다수, Developmental Biol (2000) 227:271-278), bFGF 및 TGF-β1(LIF 포함 또는 불포함)(Amit외 다수, Biol Reprod (2004) 70:837-845), gp130/STAT3 경로를 활성화하는 인자(Hoffman and Carpenter, Nature Biotech (2005) 23(6):699-708), PI3K/Akt, PKB 경로를 활성화하는 인자(Kim외 다수, FEBS Lett (2005) 579:534-540), 골 형태 형성 단백질(BMP) 상과의 일원인 인자(Hoffman and Carpenter (2005), 상동), 그리고 정규의/β-카테닌 Wnt 신호 전달 경로를 활성화하는 인자(예를 들어, GSK-3-특이 억제 인자; Sato외 다수, Nat Med (2004) 10:55-63)를 사용할 수 있다. 관련 측면에서, 이러한 인자들은 영양 세포 및/또는 ECM 기층을 포함하는 배양 조건을 포함할 수 있다[Hoffman and Carpenter (2005), 상동].
하나의 측면에서, 내부 세포괴를 이루는 세포는 인간의 출산 직후 포피 또는 진피 섬유아세포의 세포, 또는 백혈병 억제 인자를 생산하는 기타 세포상에서, 또는 백혈병 억제 인자의 존재 하에 배양된다. 관련 측면에서, 영양 세포는 ICM을 접종하기 이전에 불활성화된다. 예를 들어, 영양 세포의 유사 분열은 항생제를 사용하여 불활성화할 수 있다. 관련 측면에서, 항생제는 미토마이신 C일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양은 세포를 미분화된 다능 상태로서, 장시간 동안(이론적으로는 무한정) 유지하는 조건 하에서 이루어질 것이다. 하나의 구체예에서, 난모 세포는 높은 O2 분압 하에서 칼슘 이오노포어와 함께 처녀 생식 활성화되며, 이후, 상기 난모 세포는 낮은 O2 분압 하에서 세린-트레오닌 키나제 억제제와 접촉된다. 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 생성된 ICM은 높은 O2 분압 하에서 배양되는데, 이때, 이 세포는 예를 들어, 20%의 O2를 포함하는 혼합 기체를 사용하여 유지시킨다. 하나의 측면에서, 배양 가능하다는 의미는, 배양될 수 있거나 또는 배양에 적합한 상태를 말한다. 관련 측면에서, ICM은 배반포 배양 과정 중 4일 경과 시에 물리적으로 분리되는데, 이때, 배양은 영양 세포 상에서 이루어진다. 예를 들어, 이와 같은 배양을 통하여, 면역 절제술의 경우에서와 마찬가지로, 동물성 공급원으로부터 유래하는 물질을 사용할 필요가 없어지게 된다.
관련 측면에서, ICM용 배양 배지는 비-동물성 혈청 예를 들어, 인간 제대 혈청으로 보충되는데, 여기서 상기 혈청은 제한된 배지[예를 들어, IVF(MediCult A/S, Denmark; Vitrolife, Sweden; 또는 Zander IVF, Inc.(Vero Beach, FL)] 중에 존재한다. 다른 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 배지와 처리 과정에는 동물성 생산물을 사용하지 않는다. 관련 측면에서, 동물성 생산물로서는 인간이 아닌 공급원으로부터 유래하는 것 예를 들어, 혈청, 인터페론, 케모카인, 사이토카인, 호르몬 및 성장 인자가 있다.
본 발명에 의하여 생산된 세포의 다능 상태는 다양한 방법에 의하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 세포는 특징적인 ES 세포 마커가 존재하는지 여부에 대해 테스트될 수 있다. 인간 ES 세포의 경우, 이와 같은 마커의 예로서는 상기 정의한 바와 같은 것들이 있으며, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60, TRA-1-81 및 OCT4를 포함하기도 하고, 또한 당 업계에도 공지되어 있다.
또한 다능성(pluripotency)은 적당한 동물 예를 들어, SCID 마우스에 세포를 주입하고, 분화된 세포 및 조직이 생산되는지 여부를 관찰함으로써 확인할 수 있다. 다능성을 확인하는 또 다른 방법으로서는 상기 다능 세포를 사용하여 키메라 동물을 생산하고, 이 동물에 도입된 세포가 상이한 세포 유형으로 분화하는지 여부를 관찰하는 방법이 있다. 키메라 동물을 생산하는 방법에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제6,642,433호에도 개시되어 있다.
다능성을 확인하는 또 다른 방법으로서는, 분화를 촉진하는 조건(예를 들어, 섬유아세포 영양 세포층을 제거한 조건) 하에서 배양될 때, ES 세포가 배상체 및 기타 분화된 세포 유형으로 분화하는지 여부를 관찰하는 방법이 있다. 이 방법을 사용하면, 상기 다능 세포가 조직 배양액 중에서 배상체 및 상이한 분화 세포 유형으로 발생함을 확인할 수 있다.
결과로 생성된 다능 세포 및 세포주, 바람직하게는 인간의 다능 세포 및 세포주[전부가 암컷 기원인 DNA로부터 유래하는 세포 및 세포주]는 다양한 치료 분야 및 진단 분야에서 사용된다. 이와 같은 다능 세포는 다양한 질병 병상의 치료에 있어서, 세포 이식 요법 또는 유전자 요법(유전자 변형되었을 경우)용으로서 사용될 수 있다.
이러한 관점에서, 마우스의 배아 줄기(ES) 세포는 거의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 의하여 생산된 인간의 다능(ES) 세포들은 유사한 분화 능을 보유할 것이다. 본 발명에 의한 다능 세포는 공지의 방법에 따라서 원하는 세포 유형으로 분화하도록 유도될 것이다. 예를 들어, 본 발명에 의하여 생산된 인간의 ES 세포는, 세포를 분화시키는 조건 하에 분화 배지 중에서 이 세포를 배양함으로써, 조혈 모 줄기 세포, 근육 세포, 심근 세포, 간 세포, 도 세포, 망막 세포, 연골 세포, 상피 세포, 요로 세포 등으로 분화하도록 유도될 수 있다. ES 세포를 분화시키는 배지 및 방법은 당 업계에 적당한 배양 조건인 것으로 공지되어 있다.
예를 들어, 문헌[Palacios외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7530-7537 (1995)]에는, 줄기 세포를 유도 과정에 도입함으로써 배 세포주로부터 조혈 모 줄기 세포를 생산하는 방법에 관하여 개시되어 있는데, 여기서 상기 유도 과정은, 우선 이러한 세포의 응집체를 레티논산이 결여된 현탁 배양 배지 중에서 배양한 후, 다시 레티논산을 함유하는 동일한 배지 중에서 배양하고, 이후에 세포 응집체를 세포 부착용 기판에 옮기는 단계를 포함한다.
뿐만 아니라, 문헌[Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6:543-552 (1994)]에는, 배아 줄기 세포를 시험관 내 분화하여, 다양한 분화 세포 유형 예를 들어, 조혈 모 세포, 근육 세포, 심근 세포 및 신경 세포 등을 생산하는 방법에 관하여 개시하고 있는 다양한 논문들이 수록되어 있다.
또한, 문헌[Bain외 다수, Dev. Biol., 168:342-357 (1995)]에는, 배아 줄기 세포를 시험관 내에서 분화시켜, 뉴런의 특성을 갖는 신경 세포를 생산하는 방법에 관하여 개시되어 있다. 이와 같은 참고 문헌에는 배 세포나 줄기 세포로부터 분화된 세포를 얻는 대표적인 방법이 개시되어 있다. 이와 같이 배아 줄기 세포를 분화하는 방법에 관한 참고 문헌, 특히 이 문헌에 개시된 사항들은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다. 그러므로, 공지의 방법과 배양 배지를 사용함으로써, 당 업자는 목적 ES 세포 예를 들어, 유전자 조작된 ES 세포 또는 트랜스게닉 ES 세포를 배양하여, 원하는 분화 세포 유형 예를 들어, 신경 세포, 근육 세포, 조혈 모 세포 등을 얻을 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 다능 세포는 원하는 임의의 분화 세포 유형을 얻는데 사용될 수 있다. 분화된 인간 세포를 치료용으로 사용할 수 있음은 더할 나위 없다. 예를 들어, 인간의 조혈 모 줄기 세포는 골수 이식이 필요한 의학적 치료에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 질병 예를 들어, 말기 암 예를 들어, 난소암 및 백혈병뿐만 아니라, 면역계를 무력화시키는 질병 예를 들어, AIDS를 치료하는데 사용된다. 조혈 모 줄기 세포는 예를 들어, 남성 또는 여성 암 또는 AIDS 환자로부터 유래하는 남성 또는 여성 DNA를 제핵 난모 세포와 통합하고, 전술한 바와 같이 다능 세포를 얻어내어, 분화를 촉진하는 조건 하에서 조혈 모 줄기 세포가 얻어질 때까지 상기 세포를 배양함으로써 얻어질 수 있다. 이와 같은 조혈 모 세포는 질병 예를 들어, 암과 AIDS의 치료에 사용될 수 있다.
대안적으로, 상기 다능 세포는, 신경 세포주를 생산하는 분화 조건 하에서 이 세포를 배양함으로써, 신경학적 질환이 발병한 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 이와 같이 인간의 신경 세포를 이식함으로써 치료될 수 있는 구체적인 질병으로서는 예를 들어, 파킨슨병, 알츠하이머병, ALS 및 뇌성 마비 등을 포함한다. 파킨슨병과 같은 구체적인 경우에 있어서, 이식된 태아의 뇌 신경 세포는 주위 세포와 적당히 연계되어 도파민을 생산한다는 사실이 입증된 바 있다. 이로써, 파킨슨병의 증상들을 장기간 동안 억제할 수 있다. 관련 측면에서, 신경 전구체는 망가진/손상된 신경 섬유들을 다시 연결하여, 손, 다리 및 척수 손상 이후에도 다시 움직일 수 있도록 만들 수 있다.
본 발명의 하나의 목적은 난모 세포 공여자에 대한 자기 이식에 적합한 분화 세포를 생산하는데 사용될 수 있는, 인간의 다능 세포를 본질적으로 무한정 제공하는 것에 있다. 불임 처리 후에 잔류하는 배반포로부터 유래하거나, NT를 사용하여 생산된 인간 배아 줄기 세포와 이것의 분화된 자손은, 동종의 세포 이식 요법에 사용될 때 수용체의 면역계에 의해 거부될 것이다. 처녀 생식에 의하여 유래된 줄기 세포는 현재의 이식법과 관련된 심각한 문제점 즉, 난모 세포 공여자에 대한 숙주-대-이식편 또는 이식편-대-숙주 거부 현상으로 인해 발생할 수 있는, 이식된 조직의 거부 현상을 경감시킬 수 있었던 분화 세포가 될 수 있다. 통상적으로, 거부 현상은 항-거부 약물(anti-rejection drug) 예를 들어, 사이클로스포린을 투여함으로써 예방 또는 경감된다. 그러나, 이러한 약물은 심각한 부작용 예를 들어, 면역 억제 현상 및 발암 위험성을 가지며, 또한 매우 비싸다는 단점이 있다. 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생산된 세포는 난모 세포 공여자에 대하여, 항-거부 약물을 투여할 필요성을 없애거나, 아니면 적어도 이러한 필요성을 상당 수준 줄일 수 있어야 한다.
본 발명의 다른 목적은, 난모 세포 공여자의 가족(예를 들어, 형제자매) 구성원에게 동종 이식하기 적합한 분화 세포를 생산하는데 사용될 수 있는, 인간의 다능 세포를 본질적으로 무한정 공급하는 것에 있다. 이 경우 세포는 난모 세포 공여자의 직계 가족 구성원의 세포와 면역학적으로나 유전적으로 유사하므로, 공여자의 가족 구성원에 의해 거부될 가능성은 줄어들 것이다.
본 방법의 다른 목적은, SCNT에 비하여 비교적 간단한 과정인 포유동물 난모 세포의 처녀 생식에 의한 활성화를 통하여, 세포 조작 단계 수를 줄여서 줄기 세포를 간단하게 생산함에 있다.
포유동물 난모 세포의 처녀 생식에 의한 활성화는 줄기 세포를 생산함에 있어서, 난모 세포를 물리적으로 조작할 필요가 있는 방법(예를 들어, SCNT)에 비하여 더욱 효율적인 것으로 생각된다.
SCNT의 한 가지 단점은, 미토콘드리아 호흡 연쇄 활성이 결핍된 피험체가 SCNT 태아와 자손에서 일반적으로 발생할 수 있는 이상 현상과 거의 유사한 표현형을 나타낸다는 점이다[Hiendleder외 다수, Repro Fertil Dev (2005) 17(1-2):69-83]. 세포는 일반적으로 한가지 종류의 미토콘드리아 DNA(mtDNA, 동형상태라고도 칭함)만을 함유하지만, 일반적으로 이형상태도 또한 돌연 변이체 및 야생형 mtDNA 분자의 조합체로서 존재하거나 또는 야생형 변이체의 조합체의 형태로서 존재하기도 한다[Spikings외 다수, Hum Repro Update (2006) 12(4):401-415]. 이형상태는 미토콘드리아 관련 질병을 일으킬 수 있으며, 다양한 기작들은 모계만을 통하여 전달된다. 그러나, 동형상태를 유지하기 위한 보통의 기작을 우회하는 방법(예를 들어, 세포질 운반(CT) 및 SCNT)을 점점 많이 사용함으로써, 교란된 미토콘드리아의 기능은 이러한 공급원으로부터 유래한 줄기 세포에 내재할 수 있게 되었다.
하나의 측면에서, 반수성체는 단위 생식 세포로서, 이형상태 가질 가능성이 최소화된 세포이다.
세포 요법에 의해 치료 가능한 기타 질병 몇 병상으로서는 예를 들어, 척수 손상, 다발성 경화증, 근위축증, 당뇨병, 간 질환 예를 들어, 급성 질환(바이러스성 간염 및 약물의 과복용(아세타미노펜) 등), 만성 질환(만성 간염 및 기타(일반적으로 간경변을 일으키는 간염)), 유전적 간 결손(B형 혈우병, 인자 IX 결핍증, 불리루빈 대사 결손, 요소 회로 결손, 리소좀 축적병 및 a1-항 트립신 결핍증 등), 심장병, 연골 치환, 화상, 족부 궤양, 위장관 질환, 혈관 질환, 신장 질환, 망막 질환, 요로 질환 및 노화 관련 질환 및 병상을 포함한다.
본 방법은 결손 유전자 예를 들어, 결손 면역계 유전자, 섬유성 낭종 유전자를 치환하거나, 또는 치료적으로 유용한 단백질 예를 들어, 성장 인자, 림포카인, 시토킨, 효소 등을 발현하는 유전자를 도입하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 뇌 유래 성장 인자를 암호화하는 유전자는 본 발명에 의하여 생산되는 인간의 다능 세포에 도입될 수 있으며, 신경 세포로 분화된 세포와 파킨슨병 환자에 이식된 세포가 이러한 질병이 발병하였을 때 신경 세포의 손상을 늦출 수 있는 것이다.
또한, 본 발명의 다능 인간 ES 세포는 분화에 관한 시험관 내 모델, 특히, 초기 발생 과정을 조절하는데 관여하는 유전자 연구용 모델로서 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 ES 세포를 사용하여 생산된 분화 세포 조직 및 기관은 약물 연구에 사용될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 ES 세포 또는 이로부터 유래하는 분화 세포는 기타 ES 세포 및 세포 콜로니의 생산을 위한 핵 공여체로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 의하여 얻어진 다능 세포는 배 발생에 관여하는 단백질 및 유전자를 동정하는데 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 차등적 발현(differential expression)에 의해 이루어질 수 있는데, 즉, 본 발명에 의하여 생산된 다능 세포 내 발현된 mRNA와, 상이한 세포 유형 예를 들어, 신경 세포, 심근 세포, 기타 근육 세포 및 피부 세포 등으로 분화되는 세포로서 발현되는 mRNA를 비교함으로써 이루어질 수 있다. 그러므로, 어떠한 유전자가 특정 세포 유형의 분화에 관여하는지를 판단할 수 있다.
또한, 특이적인 유전적 결함 예를 들어, 듀케네 근 발육 이상(Duchene's Muscular Dystrophy)을 유발하는 유전적 결함을 가지는 ES 세포 및/또는 이것의 분화된 자손은, 유전적 결함과 관련된 특정 질병을 연구하는 모델로서 사용될 수 있다.
또한, 본원에 개시된 방법에 의하여 생산된 다능 세포주를, 상이한 성장 인자들을 상이한 농도로 포함하는 혼합물에 노출시키고, 또한 상이한 세포 배양 조건 하 예를 들어, 상이한 세포 매트릭스 상에서 배양한다거나 또는 상이한 기체 분압 하에서 배양한다거나 하여, 원하는 분화 세포 유형을 생산 및 증식시킬 수 있는 조건을 확인하는 것도 본 발명의 또 다른 목적이다.
이하, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
인간 처녀 생식 배아 줄기 세포의 생산
재료 및 방법
어떠한 금전적 대가도 지불하지 않고 자발적으로 공여된 난모 세포, 난구 세포(cumulus cell) 및 혈액(DNA 분석용). 공여자는 포괄적으로 공지하고 있는 동의 서류에 서명을 하였으며, 이들에게는, 공여한 모든 재료가 연구에 사용되는 것이지 복제용으로 사용되는 것이 아니라는 것을 주지시켰다. 난소를 자극하기 이전에, 난 모 세포 공여자를 대상으로 의료 검사[인간 세포, 조직 및 세포계 생산물 및 조직계 생산물의 공여자에 관한 FDA 적격성 심사에 따른 적합성에 관한 검사]가 행하여졌다[Food and Drug Administration. (Draft) Guidance for Industry: Eligibility Determination for Donors of Human Cells, Tissues, and Cellular and Tissue Based Products (HCT/Ps), 2004년 5월, 및 명령 N 67 (02.26.03) of Russian Public Health Ministry]. 상기 의료 검사에는 X-선, 혈액 및 소변 분석, 그리고 간 기능 테스트를 포함한다. 공여자는 또한 매독, HIV, HBV 및 HCV 존재 여부에 대해 스크리닝되었다.
대상 공여자에서 과배란을 유도하기 위해 표준적인 호르몬 자극에 의해 난모 세포를 얻었다. 각 공여자의 월경 주기 중 제3일∼제13일에 FSH를 사용하여 난소를 자극해 줌으로써 각 공여자로부터 난자를 얻었다. 이때 사용된 FSH는 총 1500IU였다. 공여자의 월경 주기 중 제10일∼제14일에는 고나도리베린 길항제인 오르가루트란(Orgalutran; Organon, Holland)을 0.25㎎/일의 투여량으로 주입하였다. 공여자의 월경 주기 중 제12일∼제14일에는 매일 75IU FSH + 75IU LH(Menopur, Ferring GmbH, Germany)을 주입하였다. 만일 초음파 검사에서 여포 지름이 18∼20㎜인 것으로 확인되면, 공여자의 월경 주기 중 제14일에 hGC(Choragon, Ferring GmbH, Germany)를 8000IU만큼 1회 투여하였다. hGC를 주입한 후 35시간 경과시(약 제16일) 경질 천공을 수행하였다. 초음파-가이드 바늘을 사용하여, 마취된 공여자의 방난포로부터 난포액을 채취하여 멸균 튜브에 넣었다.
난구 난모 세포 복합체(Cumulus oocyte complex; COC)를 난포액으로부터 골 라내어, 플러시 배지(Flushing Medium; MediCult)로 세척한 후, 보편적인 IVF 배지(MediCult, 표 1 참조) 중에서 액체 파라핀(MediCult) 도말층과 함께 항온 처리하였다[20% O2, 5% CO2, 37℃ 및 습한 공기].
IVF 배지
조성
염화칼슘
EDTA
글루코스
인간 혈청 알부민
황산마그네슘
페니실린 G
염화칼륨
인산 이수소 칼륨
중탄산나트륨
염화나트륨
젖산나트륨
피루브산 나트륨
물
활성화하기 이전에, 난구-난모 세포 복합체(COC)를 신 비트로 하이아다제(SynVitro Hyadase; MediCult, A/S, Denmark)로 처리하여, 난구 세포를 제거한 다음, 이를 30분 동안 파라핀 도말층과 함께 보편적 IVF 배지 중에서 항온처리하였다.
이 시점에서, 난모 세포와 배를, 37℃의 습한 대기 중에서 O2-감소 혼합 기체(90% N2 + 5% O2 + 5% CO2)를 사용하여 배양하였으며, 이때 이오노마이신은 처리하지 않았다. 난모 세포를 5μM의 이오노마이신 중에서 5분 동안 항온 처리한 후(CO2 항온 처리기 내, 37℃, 기체 환경 = 20% O2 및 5% CO2)한 후, 1mM의 6-디메틸아미노퓨린(DMAP)과 함께 IVF 배지 중에서 4시간 동안 배양하였다(파라핀 도말층 포함, 기체 환경 = 90% N2, 5% O2 및 5% CO2, 37℃). 이후, 난모 세포를 IVF 중에서 3회 세척하였다. 액체 파라핀 오일(MediCult, A/S, Denmark)로 도말된 500㎕의 배지 중 4-웰 평판(Nunclon, A/S, Denmark)에서 활성화 및 배양을 수행하였다.
활성화된 난모 세포를 5% O2, 5% CO2 및 90% N2를 포함하는 기체 환경 하에 IVF 배지 중에서 배양하고, 활성화된 난모 세포로부터 생산된 배를 동일한 혼합 기체 중에서 배양하였다.
활성화된 난모 세포를, 상기 조건 하(즉, 낮은 O2 분압 하)의 IVF 배지 중에서, 완전히 증식된 내부 세포괴(ICM) 함유 배반포의 배반포 스코어링 변형 등급(Blastocyst Scoring Modification; Shady Grove Fertility Center, Rockville, MD, 및 Georgia Reproductive Specialists, Atlanta, GA)이 1AA 또는 2AA로 관찰될 때까지 항온 처리하였다.
0.5% 프로나제(Sigma, St. Louis)로 처리하여 투명대를 제거하였다. 배반포로부터 유래하는 ICM을 면역 절제술에 의해 분리해내었는데, 이때, 상기 배반포를 인간의 비장 세포에 대한 말의 항혈청과 함께 항온 처리한 후, 다시 기니아 피그 보체에 노출시켰다. 상기와 같이 처리된 배반포를 가만히 피펫팅(pipetting)하여 ICM으로부터 영양외배엽 세포를 분리하였다.
전체 배반포로부터 ICM을 유도하기 위하여, 10% 인간 제대혈 혈청, 5ng/㎖의 인간 재조합 LIF(Chemicon Int'l, Inc., Temecula, CA), 4ng/㎖의 재조합 인간 FGF(Chemicon Int'l, Inc., Temecula, CA) 및 페니실린-스트렙토마이신(lOOU/lOOμg)이 보강된, phESC 배양용으로 디자인된 배지(즉, VitroHES™ 배지(예를 들어, DMEM/고 글루코스 배지, VitroLife, Sweden)) 중 영양 세포층에 배반포를 넣었다. 배반포가 부착되고 영양막이 퍼져서 생육될 때, ICM을 눈으로 확인할 수 있었다. 3∼4일 동안 더 배양하고 나서, 미세한 것도 흡인할 수 있는 유리 피펫을 사용하여 영양외배엽 세포 파생물로부터 유래하는 ICM을 물리적으로 스플라이싱(slicing)하여 이 ICM을 분리해냈다. 또한, 상기 IMC 세포를, 96-웰 평판 중 VirtroHES™ 배지(전술한 바와 같이 조제함)에서, 유사 분열이 정지된 출산 후 인간 진피 섬유아세포의 영양 세포층 상에서 배양하였다(5% CO2 및 20% O2, 37℃). 이와 같은 혼합 기체는 줄기 세포를 배양하는데 사용되었다. 비-동물성 물질을 사용하여 인간의 섬유아세포 배양액을 제조하였다. 10㎍/㎖의 미토마이신 C(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 3시간 동안 섬유아세포를 불활성화하였다.
별도의 방법에서, 배반포를 인간 비장 세포에 대한 말의 항혈청과 함께 항온 처리하여 면역 절제술을 수행한 후, 이를 토끼의 보체에 노출시켰다. 상기 처리된 배반포를 가만히 피펫팅하여 ICM으로부터 영양외배엽 세포를 분리하였다. 인간 제대혈 혈청을 함유하는 배지를 사용하여 얻어진, 유전적으로 무관한 피험체로부터 얻은 신생아의 피부 섬유아세포(HSF)의 영양 세포층에서, 분리된 ICM을 추가로 배양하였다(부모 동의 받음). 미토마이신 C를 사용하여 상기 HSF 영양 세포층의 유사 분열을 정지시켰다.
HSF 배양용 배지는 90% DMEM(고 글루코스, L-글루타민(Invitrogen), 10% 인간 제대혈 혈청 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/100㎎)(Invitrogen) 포함)을 포함하였다.
ICM 및 phESC를 배양하기 위하여, 4ng/㎖ hrbFGF, 5ng/㎖ hrLIF 및 10% 인간 제대혈 혈청이 보강된 VitroHES™(Vitrolife)를 사용하였다. ICM은 신선한 영양 세포층 상에 물리적으로 도말하여, 3∼4일 동안 배양하였다. 제1 콜로니를 물리적으로 절단하여, 배양 후 5일 경과시에 다시 도말하였다. 배양 5∼6일 경과 시 모든 후속 계대 배양을 실시하였다. 초기 계대 배양에 있어서, 콜로니를 물리적으로 2개의 군집으로 나누어 다시 도말하였다. 여기에 콜라게나제 IV를 처리하고 물리적으로 분리하여 phESC를 추가로 계대 배양하였다. phESC를 습한 대기 중에 5%의 CO2 및 37℃에서 증식시켰다.
난모 세포의 활성화
초기 공여자로부터 얻은 4개의 난모 세포를 활성화하였으며, 활성화된 난모 세포를 5% O2, 5% CO2 및 90% N2를 포함하는 기체 환경 하의 IVF 배지 중에서 배양한 다음, 5일 이상을 더 배양하였다. 표 2는 활성화된 난모 세포의 성숙 과정을 나타낸 것이다. 각각의 난모 세포를 4-웰 평판에 나누었다.
배양된 활성화 난모 세포 *
제1일 제2일 제3일 제5일
N1 1개의 전핵(pn), 1개의 극체(pb) 2개의 할구(bl)(등할), 무사 분열(fr) - 0% 4개의 bl(등할), fr - 2% 1개의 상실배, fr - 15%
N2 0개의 pn, 1개의 pb 4개의 bl(부등할), fr - 4% 5개의 bl(부등할), fr - 20% 4개의 bl(부등할), fr - 40%
N3 1개의 pn, 1개의 pb 2개의 bl(부등할), fr - 0% 6개의 bl(등할), fr - 0% 초기 배반포
N4 1개의 pn, 1개의 pb 4개의 bl(등할), fr - 10% 4개의 bl(등할), fr - 20% 완전히 증식된 배반포 (ICM 1AA 양호)
* 상기 표 2에 있어서, 제1일에는 세포를 M1™ 배지(MediCult) 중에서 항온 처리하였으며, 제2일∼제5일에는 M2™ 배지(MediCult) 중에서 항온 처리하였다. 배지는 매일 바꾸어 주었다. 상기 M1™ 및 M2™는 인간 혈청 알부민, 글루코스 및 유도 대사 생성물, 생리 염, 필수 아미노산, 불필수 아미노산, 비타민, 뉴클레오티드, 중탄산나트륨, 스트렙토마이신(40㎎/ℓ)와 페니실린(40.000IU/ℓ), 그리고 페놀 레드를 함유한다.
N4로부터 내부 세포괴를 분리하여, 이를 전술한 바와 같이, 인간 섬유아세포의 영양 세포로 옮겼다. N1 및 N2는 제6일째 되는 날에 퇴화하였다. 또한, 제6일째 되는 날, N3은 ICM 2AB인, 완전히 증식된 배반포를 생산하였다. 이후, N3을 인간 섬유아세포의 영양 세포로 옮겼다(제6일). N4로부터 생성된 ICM에서는 변화가 일어나지 않았다. N3을 줄기 세포를 분리하는데 사용하였다.
ICM을, 5% CO2 및 95% N2를 포함하는 기체 환경 하의, VitroHES™ 배지 중에서 45일 이상 배양하였다. 표 2a는 N3 ICM 세포 배양의 진행 과정을 요약한 것이다.
N3-ICM 배양의 진행 과정 *
제3일 신선한 영양 세포 상에 ICM을 이식함
제8일 세포 콜로니를 물리적으로 6개로 나눈 후, 이를 96-웰 평판 중 3개의 웰 내에서 배양함(1차 계대 배양).
제14일 1차 계대 배양 콜로니 중 5개의 콜로니로부터 세포를 물리적으로 나누고, 2차 계대 배양 콜로니 중 20개의 콜로니를 24-웰 평판 중 3개의 웰 내에서 배양함.
제20일 세포를 35㎜의 접시에 도말함(3차 계대 배양).
제24일 35㎜ 접시 5개에 세포를 접종함(4차 계대 배양). 하나의 접시를 5% 프로나제(Sigma)를 사용하여 실온에서 화학적으로 나눔.
제30일 35㎜ 접시 25개에 세포를 접종함(5차** 계대 배양)
제34일 6차** 계대 배양
제35일 6차 계대 배양한 시료가 담긴 11개의 앰플을 동결시킴.
제37일 7차** 계대 배양
제44일 7차 계대 배양한 시료가 담긴 12개의 앰플을 동결시킴.
제45일 8차 계대 배양
* 세포는 M2™ 배지(MediaCult) 중에서 생육됨. **표시가 된 회차의 계대 배양은 프로나제 분해를 이용하여 실시함.
줄기 세포 분리
5명의 공여자로부터 얻은 난모 세포를 메디컬트(MediCult) 배지에 넣은 후 낮은 산소 분압 하에서 배양한 결과, 배양 과정 중 제5일 또는 제6일째 되는 날에 23개의 배반포를 생산할 수 있었다. 상기 배반포 중 11개는 눈으로 확인할 수 있는 ICM을 보유하였다(표 3).
반수성체 및 처녀 생식에 의한 배아 줄기 세포주의 형성
공여자 번호 채집된 난모 세포 공여된 난모 세포 정상적으로 활성화된 난모 세포 생산된 반수성체 유도된 배반포 생산된 세포주
ICM 존재 가시적 ICM 부재
1 8 4 4 4 2 - phESC-1 면역 절제술
2 15 8 8 8 3 3 phESC-3 phESC-4 phESC-5 모두 전체 배반포로부터 유래함
3 27 14 121 112 3 2 phESC-6 (전체 배반포로부터 유래함)
4 22 11 103 10 2 3 phESC-7 (전체 배반포로부터 유래함)
5 20 94 7 7 1 4 세포주가 생산되지 않음
1: 2개의 난모 세포가 활성화되지 않았음; 2: 활성화 이후 1개의 난모 세포가 퇴화됨 3: 1개의 난모 세포가 활성화되지 않았음; 4: 제I 중기의 난모 세포 중 2개가 폐기됨
상기 결과를 통하여, 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 약 57.5%의 성공률로 배반포가 생성됨을 알 수 있다.
면역 조직 화학적 염색
면역 염색을 위해, 영양 세포층 상의 hES 세포 콜로니와 phESC 세포를 미세 커버 글라스 위에 놓고, 이를 PBS로 2회 세척한 다음, 100% 메탄올로 5분 동안 고정시켰다(-20℃). 세포를 PBS + 0.05% 트윈(Tween) X-100로 2회 세척하고, 다시 PBS + 0.1% 트리톤(Triton) X-100으로 실온에서 10분 동안 투과 처리하였다. 세포를 세척한 후, 차단 용액(PBS + 0.05% 트윈-20 + 4%의 염소 혈청 및 3%의 인간 제대혈 혈청)과 함께 항온 처리하여 비-특이적 결합을 차단하였다(30분, 실온(RT)). 모노클로날 항체는 차단 용액 중에서 1시간 동안 희석하였다(실온): SSEA-1 (MAB4301)(1:30), SSEA-3(MAB4303)(1:10), SSEA-4(MAB4304)(1:50), OCT-4 (MAB4305)(1:30), TRA-1-60(MAB4360)(1:50) 및 TRA-1-81(MAB4381)(1:50)[Chemicon]. 세포를 세척한 다음, 2차 항체인 알렉사 플루오 546(Alexa Fluor 546)(오렌지색 형광) 및 488(녹색 형광)(Molecular Probes, Invitrogen)을 PBS + 0.05% 트윈-20 중에 1:1000으로 희석시키고, 이를 실온에 1시간 동안 방치하였다. 세포를 세척하고, 핵을 PBS + 0.05% 트윈-20 중 DAPI(Sigma) 0.1㎍/㎖으로 염색하였다(10분, 실온). 세포를 세척하고, 이를 모위올(Mowiol; Calbiochem)과 함께 슬라이드 위에 놓았다. 형광 현미경을 사용하여 형광 이미지를 가시화하였다.
3주령 된 배상체 또는 수축성 배상체의 중배엽 마커를 검출하기 위하여, 모노클로날 마우스 항-데스미나 항체 항-인간 알파 액티닌 항체(Chemicon)(근육 특이적 마커)와, 항-인간 CD31/PECAM-1 항체(R&D Systems), 항-인간 VE 카데린(DC 144) 항체(R&D Systems)(내피 마커)를 사용하였다.
배상체의 내배엽 마커를 검출하기 위하여, 모노클로날 항-인간 알파-페토프로테인 항체(R&D Systems)를 사용하였다.
알칼리성 포스파타제 및 텔로머라제 활성
제조자의 지침에 따라서, AP 키트 및 트라페즈™ 키트(Chemicon)를 사용하여, 알칼리성 포스파타제 및 텔로머라제 활성을 분석하였다.
핵형 분석
핵형을 분석하기 위하여, hES 세포를 10㎍/㎖의 데메콜신(Demecolcine; Sigma)으로 2시간 동안 처리하고, 0.05% 트립신/EDTA(Invitrogen)를 사용하여 상기 세포를 수집한 다음, 이를 3분 동안 700×rpm에서 원심 분리하였다. 펠릿을 5㎖의 0.56% KCl에 재현탁하고, 이를 실온에서 15분 동안 항온 처리하였다. 원심 분리를 반복하여 수행한 후, 상청액을 제거한 다음 세포를 재현탁하고, 이를 다시 5㎖의 얼음 냉각 메탄올/아세트산 혼합물(3:1)로 고정하였다(5분, 4℃). 세포 고정 과정을 2회 반복 수행한 후, 세포 현탁액을 현미경의 슬라이드 글라스 위에 놓고, 이 제제를 김사 개질 염색약(Giemsa Modified Stain; Sigma)으로 염색하였다. 이러한 방법으로 제조된 중기 세포를 표준적 G-밴딩 방법(G-banding method)으로 분석하였다. 5/1000만큼의 중기 세포가 퍼져 생장하였음을 알 수 있었으며, 또한 이들 중 63개의 중기 세포를 분석하였다.
배상체 형성
hES 및 phESC 세포 콜로니를 물리적으로 여러 덩어리로 나누고, 이들을 85% 녹아웃 DMEM(Knockout DMEM), 15% 인간 제대혈 혈청, 1× MEM NEAA, 1mM 글루타맥스, 0.055 mM β-머캡토에탄올, 페니실린-스트렙토마이신(50U/50㎎), 4ng/㎖ hrbFGF(이들 모두는 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 구입함. 다만, 혈청은 제외)를 함유하는 배지 중, 1.5% 아가로스(Sigma)로 미리 코팅한 24웰 평판의 각 웰에 넣었다. 인간 EB를 14일 동안 현탁 배양액 중에서 배양하고, 이를 배양 접시에 도말하여 파생물을 얻어내거나, 또는 현탁액 중에서 1주 더 배양하였다.
배양 접시의 표면에 부착된 2주령 배상체를, 분화 배지[DMEM/F12, B27, 2 mM 글루타맥스, 페니실린-스트렙토마이신(lOOU/lOO㎍) 및 20ng/㎖ hrbFGF(모두 "인비트로겐"으로부터 입수함)] 중에서 1주일 동안 배양하여, 신경의 분화를 유도하였다. 일부 배상체에서는 신경의 형태를 띠는 분화 세포가 생산되었으며, 다른 배상체를 해부하여 이를 더 배양한 결과 신경 세포구가 생산되었다.
배상체 생산에서 사용하였던 배지와 동일한 배지 중에 있는 부착성 표면에 도말한 후, 5일 동안 배양시켰더니, 규칙적으로 맥동성 배상체가 자발적으로 나타났다.
조직 적합 항원 검사(HLA typing)
다이날(Dynal)의 다이나비드 DNA 다이렉트 블러드(Dynabeads DNA Direct Blood(Invitrogen))를 사용하여, 공여자의 혈액, hES, phESC 세포, 그리고 신생아 피부 섬유아세포(NSF)로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 제조자의 지시에 따라서, 대립 형질 특이적 서열 결정용 프라이머(PCR-SSP, Protrans)를 사용하는 PCR에 의해, 조직 적합 항원 검사를 수행하였다. HLA 클래스 I 유전자(HLA A*,B*,Cw*)는 A*01-A*80, B*07-B*83, Cw*01-Cw*18 부위를 한정하는 PROTRANS HLA A* B* Cw*를 사용하여 조직 적합 항원 검사하였다. HLA 클래스 II 유전자(HLA DRB1*, DRB3*, DRB4*, DRB5*, DQA1*, DQB1*)는 DRB1*O1-DRB1*16(DR1-DR18), DRB3*, DRB4*, DRB5* 부위를 한정하는 PROTRANS HLA DRB1*과, DQB1*02-DQB1*06(DQ2-DQ9), DQA1*0101-DQA1*0601 부위를 한정하는 PROTRANS HLA DQB1* DQA1*을 사용하여 분석하였다. PCR 증폭을 수행하였다: 94℃, 2분 → 94℃, 10초 및 65℃, 1분(10회) → 94℃, 10초; 61℃, 50초; 72℃, 30초(20회). 증폭된 생산물을 2% 아가로스 겔 상에서 확인하였다.
아피메트릭스 SNP 마이크로어레이 ( Affimetrix SNP microarray ) 분석
페놀/클로로포름 추출법에 의하여, 혈액, 난구 세포, phESC 및 NSF로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 4명의 백인 피험체로부터 얻은 DNA 시료를 아피메트릭스 맵핑 50K 하인드 240 어레이(Affimetrix Mapping 5OK Hind 240 Array; 아피메트릭스 진 칩 맵핑 100 K 키트(Affimetrix GeneChip Mapping 1OOK kit)의 일부)를 사용하여 유전자 분석을 실시하였다. 우선, 데이터세트는 57,244 2진 SNP 마커를 포함하였다. 마커 수는 게놈 시료의 등가성을 확인하고 이형성을 연구하는데 필요한 수보다 더욱 많으므로, 22개의 상 염색체 중 15개(1∼15번 염색체)를 선택하였다. 길이가 보다 짧은 7개의 염색체를 제거하여, 마커가 나오지 않을 가능성을 줄였으며, 또는 무작위 시료 채취 중 소정의 염색에체 대한 하나의 마커만을 선별하였다. 렐첵(Relcheck; 0.67 버젼, Copyright ⓒ 2000 Karl W. Broman, Johns Hopkins University, Licensed under GNU General Public License version 2 (June 1991))을 이용하여, 1,459개의 마커를 분석하였다.
게놈 각인 분석
문헌[Li외 다수, J Biol Chem (2002) 277(16):13518-13527]에 개시된 바와 같이 총 핵산을 제조하였다. 트리-시약(Tri-reagent; Sigma)을 사용하거나, 또는 RNA 제조 키트(Qiagen; Valencia, CA)를 사용하여 세포로부터 RNA 및 DNA를 추출하였다.
다양한 시료로부터 얻은 RNA를, 표준적 방법에 의하여 필터상에 블럿팅하여 노던 블럿을 수행하였다(도 3 참조)[예를 들어, Sambrook외 다수, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, 2nd ed, Cold Spring Harbor Press]. mRNA에 특이적으로 혼성화하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 상기 노던 블럿 필터에 혼성화하였다. [γ32P]ATP(Amersham Biosciences)를 사용하여, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 말단을 표지화하였다. 이후, 상기 필터를 10분 동안 3회 세척하고[각 세척 과정에서는 0.1% SDS를 함유하는 0.2×SSC(1×SSC = 0.15M NaCl 및 0.015 M 시트르산나트륨)를 사용하였으며, 이때의 온도는 60℃였음], 포스포이미저(PhosphorImager; Molecular Dynamics)로 분석하였다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 서열은 다음과 같은 등록 번호를 가지는 서열로부터 얻었다: NP002393(Peg1_2 및 Peg1_A; 이 유전자에 있어서, 인간 PEG1은 2개의 대안적 프로모터로부터 전사되어, 2개의 아형 전사체를 생성하였으며, 이들 전사체중, 오로지 하나만이(아형 1_2) 각인되었음). 부계로부터 발현된 아형 1은 부계 대립 형질의 엑손 1내 메틸화되지 않은 CpG 부위와 함께 생성되었던 반면에, 모계 유전자(아형 1_A) 내 상응하는 CpG 부위는 완전히 메틸화되었다. 예를 들어, 문헌[Li외 다수 (2002), 상동]을 참조하시오; CAG29346(SNRPN); AF087017(H19); NR_001564(비활성 X 특이적 전사체-XIST); 및 P04406(GAPDH).
DNA 핑거프린팅 분석법
페놀/클로로포름 추출법에 의하여, 게놈 DNA를 혈액, hES 세포 및 NSF로부터 분리하고, 이를 HinfI 제한 효소(Fermentas)로 분해하여, 0.8% 아가로스 겔에 로딩하였다. 전기 영동 후, 변성된 DNA를 나일론 막(Hybond N, Amersham)으로 옮기로, 서던 블럿을 수행하여, 32P-표지화된(CAC) 5개의 올리고뉴클레오티드 프로브로 혼성화하였다. 상기 막을 크로넥스 강화 스크린(Cronex intensifying screen)을 사용하는 X-선 필름(Kodak XAR) 상에 노출시켜 m데이터(mData)를 분석하였다.
1위치 PCR 유전자 분석(Monolocus PCR genotyping)
혈액 공여자 DNA와 줄기 세포 DNA 사이의 미세 부수체(minisatellite) 위치에 대한 대립 형질상 동일성을 측정하기 위하여, 11개의 다형성 위치들[(1) 3' 아포 지방 단백질 B 과변이 미세 부수체 위치(3'ApoB); (2) D1S80(PMCT118) 과변이 미세 부수체 위치(D1S80); (3) D6S366; (4) D16S359; (5) D7S820; (6) 인간 폰 빌레브란트 인자 유전자 과변이 미세 부수체 위치 II(vWFII); (7) D13S317; (8) 인간 폰 빌레브란트 인자 유전자 과변이 미세 부수체 위치(vWA); (9) CFS-1 수용체 유전자 미세 부수체 위치(CSF1PO)에 대한 인간 c-fms 전암 유전자; (10) 인간 갑상선 퍼옥시다제 유전자 미세 부수체 위치(TPOX); 및 (11) 인간 티로신 하이드록실라제 유전자 미세 부수체 위치(TH01)]을 PCR 유전자 분석법으로 분석하였다. 전술한 다형성 위치에 대하여 측정된 공지의 군집(즉, 러시아인 군집 및 백인인 미국인 군집)에 있어서 대립 형질 출현 빈도수를, 테스트 시료(즉, hES, NSF 및 공여자의 혈액 DNA) 내 상기 위치의 대립 형질 출현 빈도수와 비교하였다. 염색체의 위치, Genbank에서의 위치, 그리고 위치 한정, 반복 서열 데이터, 대립 형질 사다리의 범위, VNTR 사다리 크기 범위, 기타 공지의 대립 형질, 대립 형질 크기, PCR 프로토콜, 그리고 대립 형질의 출현 빈도수를, 개시된 군집의 11개의 미세 부수체 위치에 대해 측정하여 분석한 결과를 이하에 제시하였다.
(1) 3' 아포 지방 단백질 B 과변이 미세 부수체 위치(3 'ApoB VNTR)
염색체 위치: 2p23-p23
GenBank 위치 및 위치의 한정:
APOB, 아포 지방 단백질 B(Ag(x) 항원 포함) 비번역 부위
반복 서열 5'-3': (TATAATTAAATATT TTATAATTAAAATATT)n (서열 번호 1)
대립 형질 리더 크기 범위(염기): 450 + 10 + 2 프라이머 + 링크
VNTR 사다리 크기 범위(반복 부의 수, 문헌(Ludwig외 다수, 1989)에 의함: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52
기타 공지의 대립 형질(반복 부의 수): 25, 27, 28, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 54, 55
프로메가 K562 DNA® 대립 형질 크기(반복 부의 수): 36/36
PCR 프로토콜
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(DNA Technology Ltd., Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 1분
연장 및 프라이머 결합 60℃, 2분
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[Verbenko외 다수; Apolipoprotein B 3'-VNTR polymorphism in Eastern European populations. Eur J Hum Gen (2003) 11(1):444-451]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 4를 참조하시오.
[표 4]
러시아인 군집에 있어서의 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00001
동형 접합체 = 94
이형 접합체 = 333
총 시료 = 427
(2) D1S80(pMCT118) 과변이 미세 부수체 위치(D1S80 VNTR)
염색체 위치: 1p35-36
GenBank 위치 및 위치 한정: 인간 D1S80 및 MCT118 유전자
반복 서열 5'-3': (GAAGACAGACCACAG)n (서열 번호 2)
대립 형질 사다리 크기 범위(염기): 387∼762
VNTR 사다리 크기 범위(반복 부의 수): 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 40, 41
기타 공지의 대립 형질(반복 부의 수): 13, 14, 15, 38, 39, >41
프로메가 K562 DNA® 대립 형질의 크기(반복 부의 수): 18/29
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 45초
프라이머 결합 60℃, 30초
연장 72℃, 45초
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[Verbenko외 다수; Allele frequencies for D1S80 (pMCT118) locus in some Eastern European populations. J Forensic Sci (2003) 48(l):207-208]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 5를 참조하시오.
[표 5]
러시아인 군집에 있어서의 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00002
동형 접합체 = 15
이형 접합체 = 44
총 시료 = 59
(3) D6S366
염색체 위치: 6q21-qter
GenBank 위치 및 위치 한정: NA
대립 형질 사다리 크기 범위(염기): 150∼162
STR 사다리 크기 범위(반복 부의 수): 12, 13, 15
기타 공지의 대립 형질(반복 부의 수): 10, 11, 14, 16, 17
프로메가 K562 DNA® 대립 형질의 크기(반복 부의 수): 13/24
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 1분
연장 및 프라이머 결합 60℃, 2분
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[Efremov외 다수; An expert evaluation of molecular genetic individualizing systems based on the HUMvWFII and D6S366 tetranucleotide tandem repeats. Sud Med Ekspert (1998) 41(2):33-36]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 6을 참조하시오.
[표 6]
러시아인 군집에 있어서의 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00003
(4) D16S539
염색체 위치: 16q24-qter
GenBank 위치 및 위치 한정: NA
반복 서열 5'-3': (AGAT)n
대립 형질 사다리 크기 범위(염기): 264∼304
STR 사다리 크기 범위(반복 부의 수): 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
프로메가 K562 DNA® 대립 형질의 크기(반복 부의 수): 11/12
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 45초
프라이머 결합 64℃, 30초
연장 72℃, 30초
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[GenePrint® STR Systems(Silver Stain Detection) Technical Manual No. D004. Promega Corporation, Madison, WI USA: 1993-2001]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 7을 참조하시오.
[표 7]
백인인 미국인에 있어서의 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00004
(5) D7S820
염색체 위치: 7q11.21-22
GenBank 위치 및 위치 한정: NA
반복 서열 5'-3': (AGAT)n
대립 형질 사다리 크기 범위(염기): 215∼247
VNTR 사다리 크기 범위(반복 부의 수): 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14
프로메가 K562 DNA® 대립 형질의 크기(반복 부의 수): 9/11
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 45초
프라이머 결합 64℃, 30초
연장 72℃, 30초
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[GenePrint® STR Systems(Silver Stain Detection) Technical Manual No. D004. Promega Corporation, Madison, WI USA: 1993-2001]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 8을 참조하시오.
[표 8]
상이한 군집 내 D7S820에 대한 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00005
(6) 인간 폰 빌레브란트 인자 유전자 과변이 미세 부수체 위치 II(vWFII)
염색체 위치: 12p13.3-12p13.2
GenBank 위치 및 위치 한정: HUMvWFII, 인간 폰 빌레브란트 인자 유전자
반복 서열 5'-3': (ATCT)n/(AGAT)n
대립 형질 사다리 크기 범위(염기): 154∼178
STR 사다리 크기 범위(반복 부의 수): 9, 11, 12, 13
기타 공지의 대립 형질(반복 부의 수): 8, 10, 14, 15
프로메가 K562 DNA® 대립 형질의 크기(반복 부의 수): 13/13
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 1분
연장 및 프라이머 결합 60℃, 2분
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[Efremov외 다수; An expert evaluation of molecular genetic individualizing systems based on the HUMvWFII and D6S366 tetranucleotide tandem repeats. Sud Med Ekspert (1998) 41(2):33-36]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 9를 참조하시오.
[표 9]
러시아인 군집에 있어서의 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00006
(7) D13S317
염색체 위치: 13q22-q31
GenBank 위치 및 위치 한정: NA
반복 서열 5'-3': (AGAT)n
대립 형질 사다리 크기 범위(염기): 165∼197
STR 사다리 크기 범위(반복 부의 수): 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
기타 공지의 대립 형질(반복 부의 수): 7
프로메가 K562 DNA® 대립 형질의 크기(반복 부의 수): 8/8
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 45초
프라이머 결합 64℃, 30초
연장 72℃, 30초
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[GenePrint® STR Systems (Silver Stain Detection) Technical Manual No. D004. Promega Corporation, Madison, WI USA: 1993-2001]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 10을 참조하시오.
[표 10]
상이한 군집 내 D13S317에 대한 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00007
(8) 인간 폰 빌레브란트 인자 유전자 과변이 미세 부수체 위치(vWA)
염색체 위치: 12p12pter
GenBank 위치 및 위치 한정: HUMVWF A31, 인간 폰 빌레브란트 인자 유전자
반복 서열 5'-3': (AGAT)n
대립 형질 사다리 크기 범위(염기): 139∼167
STR 사다리 크기 범위(반복 부의 수): 14, 16, 17, 18
기타 공지의 대립 형질(반복 부의 수): 11, 12, 13, 15, 19, 20, 21
프로메가 K562 DNA® 대립 형질의 크기(반복 부의 수): 16/16
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 1분
연장 및 프라이머 결합 60℃, 2분
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[GenePrint® STR Systems(Silver Stain Detection) Technical Manual No. D004. Promega Corporation, Madison, WI USA: 1993-2001]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 11을 참조하시오.
[표 11]
상이한 군집 내에 HUMVWFA31에 대한 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00008
(9) CSF-1 수용체 유전자 미세 부수체 위치에 대한 인간 c-fms 전암 유전자(CSF1PO)
염색체 위치: 5q33.3-34
GenBank 위치 및 위치 한정: HUMCSF1PO, 인간 c-fms 전암 유전자
반복 서열 5'-3': (AGAT)n
대립 형질 사다리 크기 범위(염기): 295∼327
STR 사다리 크기 범위(반복 부의 수): 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
기타 공지의 대립 형질(반복 부의 수): 6
프로메가 K562 DNA® 대립 형질의 크기(반복 부의 수): 9/10
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 45초
프라이머 결합 64℃, 30초
연장 72℃, 30초
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[GenePrint® STR Systems(Silver Stain Detection) Technical Manual No. D004. Promega Corporation, Madison, WI USA: 1993-2001]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 12를 참조하시오.
[표 12]
백인인 미국인에 있어서의 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00009
(10) 인간 갑상선 퍼옥시다제 유전자 미세 부수체 위치(TPOX)
염색체 위치: 2p25.1-pter
GenBank 위치 및 위치 한정: HUMTPOX, 인간 갑상선 퍼옥시다제 유전자
반복 서열 5'-3': (AATG)n
대립 형질 사다리 크기 범위(염기): 224∼252
STR 사다리 크기 범위(반복 부의 수): 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13
기타 공지의 대립 형질(반복 부의 수):무
프로메가 K562 DNA® 대립 형질의 크기(반복 부의 수): 8/9
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 45초
프라이머 결합 64℃, 30초
연장 72℃, 30초
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[GenePrint® STR Systems(Silver Stain Detection) Technical Manual No. D004. Promega Corporation, Madison, WI USA: 1993-2001]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 13을 참조하시오.
[표 13]
백인인 미국인에 있어서의 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00010
(11) 인간 티로신 하이드록실라제 유전자 미세 부수체 위치(TH01)
염색체 위치: 5q33.3-34
GenBank 위치 및 위치 한정: HUMTHO1, 인간 티로신 하이드록실라제 유전자
반복 서열 5'-3': (AATG)n
대립 형질 사다리 크기 범위(염기): 179∼203
STR 사다리 크기 범위(반복 부의 수): 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11
기타 공지의 대립 형질(반복 부의 수): 9.3
프로메가 K562 DNA® 대립 형질의 크기(반복 부의 수): 9.3/9.3
PCR 프로토콜:
고온 순환기: DNA 테크놀로지社(Russia)
초기 항온 처리: 95℃, 2분
30회 순환:
변성 94℃, 45초
프라이머 결합 64℃, 30초
연장 72℃, 30초
연장 단계: 72℃, 5분
중지 단계: 4℃, 무한정
본 분석은 문헌[GenePrint® STR Systems(Silver Stain Detection) Technical Manual No. D004. Promega Corporation, Madison, WI USA: 1993-2001]에 개시된 바와 같이 실행할 수 있다. 표 14를 참조하시오.
[표 14]
백인인 미국인에 있어서의 대립 형질 출현 빈도 수
Figure 112008035564915-PCT00011
결과
본 방법을 통하여 얻어진 hES 세포는 배아 줄기 세포에서 통상적으로 관찰되는 다수의 특징들을 나타내었다: 세포질 지질체, 낮은 세포질/핵 비율 및 명백히 식별 가능한 인. 상기 hES 세포 콜로니는 시험관 내 수정을 통해 유도된 인간의 배아 줄기 세포에 대하여 이미 보고된 바 있는 것과 유사한 형태를 나타낸다. 세포는 알칼리성 포스파타제(도 1a), 8량체-결합 전사 인자 4 mRNA(Oct-4)(도 1b), 단계-특이적 배 항원 1(SSEA-1)(도 1c), 단계-특이적 배 항원 3(SSEA-3)(도 1d), 단계-특이적 배 항원 4(SSEA-4)(도 1e), 종양 거부 항원 1-60(TRA-1-60)(도 1f), 종양 거부 항원 1-81(TRA-1-81)(도 1g)에 대해 면역 반응을 나타냈으며, 단계-특이적 배 항원 1(SSEA-1)(도 1c)에 대해서는 면역 반응을 나타내지 않았다[마우스 배아 줄기 세포에 대해서는 면역 반응을 나타내었으나, 인간의 배아 줄기 세포에 대해서는 면역 반응을 나타내지 않음]. 텔로머라제 활성은 종종 복제에 의한 무한 증식성과 상관성이 있으며, 통상적으로는, 생식 세포, 암 세포 그리고 다양한 줄기 세포 예를 들어, 줄기 세포에서 발현되나, 대부분의 체세포 유형에서는 존재하지 않는다. 시험관 내 증식 후 3개월 경과시 본 방법에 의하여 생산된 세포는 미분화 형태를 유지하였으며, 또한 텔로머라제의 활성 수준도 높았다(도 2a). 배상체 형성(도 2b 및 2c) 여부를 통하여 세포의 다능성을 시험관 내에서 관찰하였으며, G-밴드 핵형 분석 결과, 세포는 정상인 인간의 46XX 핵형을 가진다는 사실을 알 수 있다(도 2d).
난모 세포 공여자의 혈액, ES 세포 및 HNSF 영양 세포에 대해 DNA 핑거프린팅 분석법을 수행하였는데(서던 블럿팅에 의함), 즉, 32P-표지화된(CAC) 올리고뉴클레오티드 프로브(도 2e)와 혼성화시키고, 또한 상이한 위치에서 단일 위치 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 분석하였다.
단일 위치 PCR을 통하여 유전자 분석한 결과, 혈액(공여자) DNA 및 OL1 DNA 간 모든 위치(다만, D7S820 제외)에 대한 대립 형질은 동일하다는 사실을 알 수 있었다. 표 15를 참조하시오.
[표 15]
단일 위치 PCR 유전자 분석 결과
Figure 112008035564915-PCT00012
모든 이형 접합 공여자 위치(다만, D7S820 제외)의 이형성(이형 접합형)은 hES 위치에서 변화가 없었다. hES DNA 내 D7S820 위치의 이형성(이형 접합형)은, DNA 복제 및 DNA 수선 중 빗나간 가닥(slipped-strand)의 쌍 형성 오류로 인한 돌연 변이(미세 부수체 반복 부 내 하나의 AGAT 단량체 삽입)로 말미암은 것이다.
상기 결과는 (공여자 DNA 및 hES DNA에 대한 실질적으로 동일한 핑거프린팅 패턴이 발견될 때) 다수 위치 DNA 핑거프린팅을 통하여 얻어진 결과와 일치한다.
도 2e는 난모 세포 공여자의 혈액을 사용하여 hES 세포의 이형성과 이 세포의 동일성을 입증한 결과로서, hES 세포와 영양 세포 간에는 유사성이 없었음을 알 수 있었다. hES 세포의 DNA 프로필은, MHC 제I군과 제II군 내 다형성 유전자를 사용하는, PCR계 반수체 분석법에 의해 확인하였다. 난모 세포 공여자 혈액 세포, hES 세포 및 영양 세포 HNSF로부터 유래하는 총 게놈 DNA의 유전자를 분석하고 이들을 비교하였다. 데이터를 통하여, 공여자 혈액에서 얻은 hES 세포와 기타 세포는 각각 구별이 불가능하였으므로, 자기의 것으로서 간주하여야 하며, 이들 두 세포는 영양 세포의 DNA와는 구별되었다(표 16).
[표 16]
조직 적합 항원 검사의 결과
Figure 112008035564915-PCT00013
DNA 핑거프린팅 및 조직 적합 항원 검사에 의한 분석 결과, hES 세포는 이종 접합형이며, 공여자의 전 유전 물질을 함유함을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 처녀 생식에 의해 생성된 원숭이 줄기 세포주에서 얻어지는 데이터와 일치하며[Vrana외 다수, Proc Natl Acad Sci USA (2003) 100(Suppl 1):11911-11916], 공여자의 유전 물질의 절반만을 함유하는, 처녀 생식에 의해 생성된 마우스 줄기 세포주에서 얻어지는 데이터와는 일치하지 않는다[Lin외 다수, Stem Cells (2003) 21:153-161].
phESC 세포주는 hES 세포에서 예상되는 형태를 나타내었는데, 즉, 세포가 조밀하게 모여있는 콜로니를 형성하고, 인의 형태도 명확하며, 세포질 대 핵의 비율도 낮았다(도 4). 상기 세포는 통상의 hES 마커 즉, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 및 OCT-4를 발현하나, 미분화 마우스 배아 줄기 세포에 대한 포지티브 마커인 SSEA-1은 발현하지 않는다(도 4). 모든 세포주로부터 유래하는 세포는 알칼리성 포스파타제 및 텔로머라제 활성이 높았음을 알 수 있다(도 5 및 도 6). G-밴드 형성 핵형 분석을 통하여, phESC 세포주는 정상의 인간 46XX 핵형을 가진다는 사실을 알 수 있다(다만, phESC-7 세포주 제외)(도 7). pESC-7 세포주로부터 유래하는 세포 중 약 91%는 47, XXX 핵형을 가지며, 세포의 9%는 48, XXX, + 6 핵형을 가진다. 세포주에서 X 염색체의 변형이 상이한 정도로 관찰되었는데; phESC-1 및 phESC-6 세포주에 대해서는 약 12%; phESC-5 세포주에 대해서는 42%; 그리고 세포주 phESC-7, phESC-3 및 phESC-4에 대해서는 각각 70%, 80% 및 86%로 관찰되었다(도 7).
비교용 DNA 프로파일링을 모든 phESC 세포주, 공여자 체세포 및 영양 세포에 대해 실시하였다. 이와 같은 연구에서는 아피메트릭스 SNP 마이크로어레이(맵핑 50K 하인드 240 어레이)를 사용하였는데, 그 결과, 염색체 변화를 연구할 수 있었으며, 또한 공여자의 체세포에 대한 phESC의 유전적 유사성도 확인할 수 있었다. phESC 세포주와 이의 관련 공여자 체세포 간에 쌍을 이루는 경우의 모든 유전자형의 관계를 "완전 형제자매(full siblings)"라 정의하였으며, 또한 나머지 쌍의 모든 조합을 "무관(unrelated)"으로 정의하였다. "일란성 쌍둥이(monozygotic twins)"와 동일한 phESC로부터 유래하는 배양 분취액 간에 쌍을 이루는 경우의 유전자형 관계를 내부 대조군으로 삼았다(표 17, 데이터베이스 S1).
[표 17]
Figure 112008035564915-PCT00014
표 17에 있어서, DNA 시료들에 다음과 같이 번호를 메겼다: 1 - 신생아 피부 섬유아세포; 2 - phESC-7 세포주 공여자; 3 - phESC-7 세포주; 4 - phESC-1 세포주; 5 - phESC-1 세포주; 6 - phESC-3 세포주; 7 - phESC-4 세포주; 8 - phESC-5 세포주; 9 - phESC-6 세포주; 10 - phESC-6 세포주 공여자; 11 - phESC-3 ∼ phESC-5 세포주 공여자; 및 12 - phESC-1 세포주 공여자.
상기 결과를 통하여, 하나의 쌍(시료 4∼5)만이 일란성(MZ) 쌍둥이임이 확인되었다. 다른 10개의 쌍(시료 2∼3, 4∼12, 5∼12, 6∼7, 6∼11, 7∼8, 7∼11, 8∼11, 9∼10)은 완전 형제자매임이 확인되었으며, 또 다른 쌍의 조합체는 무관한 것으로 확인되었다. 출력물 중 IBS 컬럼에는, 2가지 유형으로 분석되고, 상태에 따라서 0개, 1개 또는 2개의 동일한 대립 형질을 공유하는 마커의 수를 표시하였다[유전자 분석상 오류가 없는 이상적인 조건 하에 있는 MZ 쌍둥이에 대하여, 모든 마커들은 IBS = 2 이하에 두었음]. 출력물은 P(관찰된 마커|소정의 관계)를 직접적으로 나타내지는 않지만, 유사성의 척도로서 LOD 스코어 - log10{P(관찰된 마커|추정 관계/P(관찰된 마커|유사성이 최대인 것으로 명명되는 관계)}로서 나타내었다. LOD 스코어가 낮을수록, 2개의 시료 간 관계의 추정이 어려운 것으로 생각된다.
1,459개의 SNP 마커들을 비교 분석한 결과, phESC 이형성을 파악할 수 있었고, 또한, 관련 공여자 체세포 유전자형에 비하여, phESC 세포의 유전자형에 변이가 발생함을 알 수 있었다. 이전에는 이종 접합형이었던 체세포 게놈의 몇몇 분절들은 관련 phESC 세포주 게놈이 동형 접합형으로 되었다. 이와 같이 phESC-1, PhESC-3, phESC-4, phESC-5 및 phESC-6 세포주 중 11∼15%에서, 그리고 phESC7 세포주에 대해서는 19%에서, 이형 접합형 대 동형 접합형 패턴이 나타났다(데이터베이스 S2). 더욱이, 동일한 난모 세포 공여자로부터 유래하는 phESC 및 phESC-5 세포주 간에는 유전적 차이점이 관찰되었다(표 18, 데이터베이스 S2).
[표 18a]
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상기 결과들을 통하여, 유래된 phESC 세포주의 이형성을 알 수 있으며, 또한 관련된 공여자의 유전자형과 비교함으로써 유전자형에 변이가 일어났음을 말해준다. 공여자 게놈의 이종 접합형 분절의 부분들은 phESC에서 동종 접합형으로 되었다. 염색체-염색체 번호; RS ID - dbSNP 데이터베이스 중 RS 번호; 염기쌍 - 아피메트릭스 진 칩에 의해 기록된 염기쌍 거리; 백인에 있어서의 출현 빈도 수 A - 백인 군집 내 A 대립 형질의 출현 빈도 수.
선행 연구에 있어서, 마우스 난모 세포의 처녀 생식에 의한 활성화를 통하여, 동형 접합형 배아 줄기 세포주를 얻었다[Lin외 다수, Stem Cells (2003) 21:152]. 인간의 난모 세포에 있어서, 난모 세포의 처녀 생식에 의한 활성화 및 2배체 배생성 후 제2 감수 분열이 억제될 경우, 전체가 동형 접합형인 hES 세포는 유도되지 않는다.
조직 적합 항원 검사 결과를 바탕으로 하여, 모든 phESC 세포주로부터 유래하는 분화된 세포들은 난모 세포 공여자와 완전히 조직 적합성이 부합함에 틀림이 없으며, 이러한 특성이 본 방법을 통하여 치료용 세포를 생산할 수 있도록 만들어 준다(표 19).
[표 19]
phESC 세포주에 대한 조직 적합 항원 검사 결과
Figure 112008035564915-PCT00061
영양 세포로 사용된 인간 섬유아세포로부터 유래하는 유전 물질의 DNA-프로파일링을 통하여, phESC 세포주는 인간 섬유아세포로부터 유래하는 물질과 섞이지 않음을 알 수 있다(표 19).
phESC-1 세포주는 배양 10개월(35회 계대 배양) 동안 미분화 상태로 잔류하였다. 다른 세포주는 21회 이상의 계대 배양시 성공적으로 배양되었다. 시험관 내 분화 이후, 모든 phESC 세포주로부터 유래하는 세포는 현탁 배양액 중 낭종 배상체를 형성하였으며, 또한 3가지 배엽 모두(내배엽, 중배엽 및 외배엽)를 생산하였다(도 4). phESC-1 세포주로부터 유래하는 배상체중 약 5%에서는 도말 후 5일 경과시 역동적 세포가 생산되었다. phESC-6 세포주는 색소 상피-유사 세포를 생산하였다(도 4의 I, K). 외배엽이 분화되면 뉴런 특이적 마커 신경미세섬유 68(도 4의 A), NCAM(도 4의 B), 베타 III-튜불린(도 4의 C) 및 아교 세포 마커 GFAP(도 4의 D 및 M)에 대해 면역 세포 화학적 염색에 의해 염색된다. 분화된 세포는 중배엽 마커 예를 들어, 알파-액티닌(도 4g) 및 데스민(도 4j) 즉, 근육 특이적 마커와, 내피 마커 PECAM-1(도 4의 E) 및 VE-카데린(도 4의 F)가 존재하였다. 내배엽이 분화되면 알파-페토프로테인에 대한 분화 유도체가 염색된다. 이러한 데이터를 통하여, phESC는 인간 몸을 이루는 모든 유형의 세포로 발생시키는 3개의 배엽으로 분화될 수 있음이 입증된다.
phESC-7의 핵형은 변형되었으므로 의학용으로 사용하지 않는 이유가 될 수 있다. 인간의 배 내 게놈 각인이 변형되면, 모계 또는 부계 발현 유전자와 관련된 질환이 발생할 수 있다[Gabriel외 다수, Proc Natl Acad Sci USA (1998) 95:14857]. phESC 세포주의 기타 특성을 관찰하기 위하여, 그리고 이 세포주를 세포 요법에 사용함에 있어서의 적합성을 측정하기 위하여, 각인 분석법을 수행하였다.
상기 요약된 바와 같이, 노던 블럿팅을 수행하여 이를 DNA 프로브 SNRPN, Peg1_2, Peg1_A, H19 및 GAPDH(내부 대조군)로 스크리닝하였다. KSF 즉, 신생아 피부 섬유아세포; 수정된 난모 세포로부터 유래하는 hES 즉, 인간 배아 줄기 세포주; 1, phESC-1; 2, phESC-3, 3, phESC-4, 4, phESC-5; 5, phESC-6; 6 phESC-7로부터, 블럿팅된 핵산을 얻었다. NSF RT-, hES RT-, 1 RT-는 네거티브 대조군이다. 도 3은 각인 블럿팅 결과를 나타내는 것이다.
모계 각인 유전자, Peg1_A는 테스트된 세포주 모두에서 강력하게 결합하였다. 모계 각인 유전자 H19는 세포주 전부에서 (Peg1_A에 비하여는) 약하지만, 일정하게 결합하였다. SNRPN를 통하여는, NSF, hES, phESC-4 및 phESC-6에서 우세하게 결합함을 알 수 있다. Peg1_2를 통하여는, NSF, hES, phESC-1(신호는 미약함), phESC-3, phESC-5 및 phESC-6에서 우세하게 결합함을 알 수 있다. GAPDH 결합 결과를 통하여, 모든 래인에서 RNA가 유사하게 로딩되는 것을 확인하였다.
비록 본 발명은 상기 실시예를 참고로 하여 기술되긴 하였지만, 이에 가하여진 변형 및 변화는 본 발명의 사상과 범위 내에 포함됨을 이해할 것이다. 그러므로, 본 발명은 이하 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정되는 것이다.
참고 문헌
Figure 112008035564915-PCT00062

Claims (93)

  1. 인간 줄기 세포를 생성하는 방법으로서,
    a) 인간 난모 세포를 처녀 생식에 의하여 활성화하는 단계로서, 활성화는 i) 높은 O2 분압 하에서 난모 세포를 이오노포어(ionophore)와 접촉시키고, ii) 낮은 O2 분압 하에서 난모 세포를 세린-트레오닌 키나제 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는 단계;
    b) 배반포가 형성될 때까지 낮은 O2 분압 하에서 상기 단계 a)의 활성화된 난모 세포를 배양하는 단계;
    c) 상기 배반포를 영양 세포층으로 전달하고, 전달된 배반포를 높은 O2 분압 하에서 배양하는 단계;
    d) 상기 단계 c)의 배반포의 영양외배엽(trophectoderm)으로부터 내부 세포괴(inner cell mass: ICM)를 물리적으로 분리하는 단계; 및
    e) 상기 단계 d)의 ICM의 세포를 영양 세포층에서 배양하는 단계를 포함하고, 배양 단계 e)는 높은 O2 분압 하에서 수행하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 낮은 O2 분압은 약 2%∼약 5% O2의 O2 농도를 포함하는 혼합 기체 환경에서 항온 처리함으로써 유지하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 혼합 기체 환경은 약 5%의 CO2와 약 90∼93%의 N2를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 높은 O2 분압은 약 5%의 CO2와 약 20%의 O2를 포함하는 혼합 기체 환경에서 항온 처리함으로써 유지하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 이오노포어는 이오노마이신 및 A23187로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세린-트레오닌 키나제 억제제는 스타우로스포린, 2-아미노퓨린, 스핑고신 및 6-디메틸아미노퓨린(DMAP)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 활성화, 분리 및 배양 단계는 치료 적용시 제한 배지 조건 하에서 수행하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 배지는 인간 제대 혈청을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 배지는 약 10%의 인간 제대 혈청을 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 영양 세포층은 인간 섬유아세포를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 섬유아세포는 출생 직후의 인간 진피 섬유아세포인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 영양 세포는 항생제에 의해 불활성화되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항생제는 미토마이신 C인 방법.
  14. 제1항의 방법에 의하여 생성되는 분리된 줄기 세포.
  15. 인간의 중기 II 난모 세포를 활성화하는 방법으로서,
    a) 시험관 내 수정(IVF) 배지 중에서 인간 중기 II 난모 세포를 항온 처리하는 단계;
    b) 이오노포어를 포함하는 IVF 배지 중에서 상기 단계 a)의 세포를 항온 처리하는 단계;
    c) 세린-트레오닌 키나제 억제제를 포함하는 IVF 배지 중에서 상기 단계 b)의 세포를 항온 처리하는 단계; 및
    d) 배반포가 형성될 때까지 신선한 IVF 배지 중에서 상기 단계 c)의 세포를 항온 처리하는 단계를 포함하고,
    상기 단계 a) 및 단계 b)는 높은 O2 분압 하에서 수행하고, 상기 단계 d)의 배반포로부터 얻어진 내부 세포괴(ICM)가 배양 가능한 줄기 세포를 생성하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항온 처리 단계 c) 및 d)에 있어서의 O2 분압은 약 2∼5% O2의 O2 농도를 포함하는 혼합 기체 환경에서 세포를 항온 처리함으로써 유지하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 혼합 기체 환경은 약 5%의 CO2와 약 90∼93%의 N2를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 히알유로니다제를 난모 세포와 항온 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 항온 처리 단계 a)는 약 2시간 동안, 약 37℃에서 수행하는 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 항온 처리 단계 b)는 약 5분 동안, 약 37℃에서 수행 하는 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 항온 처리 단계 c)는 약 4시간 동안, 약 37℃에서 수행하는 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 항온 처리 단계 d)는 약 24시간 동안, 약 37℃에서 수행하는 방법.
  23. 제15항에 있어서, 상기 IVF 배지는 비인간 생성물을 포함하지 않는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 이오노포어는 이오노마이신 및 A23187로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 이오노포어는 이오노마이신인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 세린-트레오닌 키나제 억제제는 스타우로스포린, 2-아미노퓨린, 스핑고신 및 6-디메틸아미노퓨린(DMAP)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 세린-트레오닌 키나제 억제제는 DMAP인 방법.
  28. 제15항의 방법에 의해 생성되는 분리된 난모 세포.
  29. 제28항의 난모 세포로부터 생성되는 분리된 내부 세포괴(ICM).
  30. 냉동 보존된 난모 세포 또는 반수성체(parthenote)로부터 인간 줄기 세포를 생성하는 방법으로서,
    a) 난모 세포 또는 반수성체의 세포질에 냉동 보존제를 미세 주입하는 단계;
    b) 난모 세포 또는 반수성체를 극저온으로 동결시켜, 이 난모 세포 또는 반수성체를 휴지기 상태로 만드는 단계;
    c) 상기 난모 세포 또는 반수성체를 휴지기 상태로 저장하는 단계;
    d) 난모 세포 또는 반수성체를 해동하는 단계;
    e) i) 높은 O2 분압 하에서 난모 세포를 이오노포어와 접촉시키고, ii) 낮은 O2 분압 하에서 난모 세포를 세린-트레오닌 키나제 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 단계 d)의 난모 세포를 처녀 생식에 의해 활성화하는 단계;
    f) 배반포가 형성될 때까지 낮은 O2 분압 하에서 상기 단계 d)의 반수성체 또는 상기 단계 e)의 난모 세포를 배양하는 단계;
    g) 배반포의 영양외배엽으로부터 내부 세포괴(ICM)를 분리하는 단계; 및
    h) 상기 단계 g)의 ICM의 세포를 영양 세포층 또는 세포외 매트릭스(ECM) 기 질상에서 배양하는 단계
    를 포함하고, 상기 배양 단계 g)는 높은 O2 분압 하에서 수행하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 영양 세포는 인간 공급원으로부터 유래한 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 냉동 보존제는 (i) 당을 포함하고, (ii) 포유동물 세포막에 대해 실질적으로 비투과성이며, (iii) 난모 세포 또는 반수성체가 일시적으로 휴지기 상태로 저장되고, 실질적으로 활성인 상태로 회복될 수 있도록 난모 세포 또는 반수성체의 생존력을 유지시키는 방법
  33. 제28항에 있어서, 포유동물 세포막에 대해 실질적으로 비투과성이며, 난모 세포 또는 반수성체의 세포막을 안정화시키는 세포외 냉동 보존제와 상기 난모 세포 또는 반수성체를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 냉동 보존제는 수크로스, 트레할로스, 프록토스, 덱스트란 및 라피노스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 당을 포함하는 방법.
  35. 제30항에 있어서, 상기 냉동 보존제는 글루코스, 소르비톨, 만니톨, 락토스, 말토스 및 스타키오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 당을 포함하는 방법.
  36. 제30항에 있어서, 상기 난모 세포 또는 반수성체는 침지 동결(plunge freezing)되는 방법.
  37. 제30항에 있어서, 상기 냉동 보존제는 저 Na+/고 K+ 배지를 포함하는 방법.
  38. 제30항에 있어서, 상기 냉동 보존제는 유기 완충액을 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 유기 완충액은 HEPES인 방법.
  40. 제30항에 있어서, 상기 냉동 보존제는 세포 사멸 단백질을 억제하는 부분을 포함하는 방법.
  41. 제30항에 있어서, 상기 부분은 카파제인 방법.
  42. 제36항에 있어서, 상기 난모 세포 또는 반수성체는 1분당 약 0.3∼6℃의 속도로, 약 -50℃ 이상의 최종 온도로 냉각하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 난모 세포 또는 반수성체는 1분당 약 0.3∼3℃의 속도로, 약 -50∼-10℃의 최종 온도로 냉각하는 방법.
  44. 제30항에 있어서, 상기 단계 b)는 난모 세포 또는 반수성체를 건조 저장하는데 충분한 수준으로 건조하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제30항에 있어서, 상기 단계 b)는 난모 세포 또는 반수성체를 동결 건조하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제30항에 있어서, 상기 단계 b)는 난모 세포 또는 반수성체를 진공 건조 또는 대류 건조시키는 것을 포함하는 방법.
  47. 제30항에 있어서, 상기 단계 d)는 난모 세포 또는 반수성체를 재수화하는 것을 포함하는 방법.
  48. 처녀 생식에 의해 활성화된 인간 공여자로부터의 난모 세포로부터 유도된 자기 줄기 세포.
  49. 제48항에 있어서, 상기 줄기 세포는 공여자의 난모 세포와 실질적으로 동일 한 반수체형(haplotype)을 갖는 줄기 세포.
  50. 제48항에 있어서, 상기 세포는 (i) 1년 이상 동안 시험관 내 배양액 중에서 증식할 것이고, (ii) 배양 내내 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직의 유도체로 분화할 가능성을 유지하며, 또한 (iii) 섬유아세포 영양 세포층 상에서 배양시 분화가 억제되는 줄기 세포.
  51. 제50항에 있어서, 상기 세포는, 염색체가 정배수체이고 장기간 배양시에도 변화되지 않는 핵형을 유지하는 줄기 세포.
  52. 제48항에 있어서, 상기 줄기 세포는 실질적으로 공여자의 난모 세포와 유전자적으로 동일한 줄기 세포.
  53. 제52항에 있어서, 상기 줄기 세포는 46, XX 핵형을 가지는 줄기 세포.
  54. 제52항에 있어서, 상기 줄기 세포는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 마커에 따라서 공여자의 완전 형제자매(full sibling)인 것으로 확인되는 줄기 세포.
  55. 제52항에 있어서, 상기 줄기 세포는 공여자와 조직 적합성인 줄기 세포.
  56. 제48항에 있어서, 상기 줄기 세포는 공여자의 기원에 따라서 게놈상 각인된 줄기 세포.
  57. 제56항에 있어서, 상기 줄기 세포는 SNRPN, Peg1_2, Peg_1A, XIST 및 H19로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 줄기 세포.
  58. 제48항에 있어서, 상기 줄기 세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 및 OCT-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는 줄기 세포.
  59. 제48항에 있어서, 상기 줄기 세포는 동형상태의(homoplasmic) 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 포함하는 줄기 세포.
  60. 처녀 생식에 의해 활성화된 인간 공여자로부터의 난모 세포로부터 얻은 줄기 세포로부터 유도된 분화 세포.
  61. 제60항에 있어서, 상기 분화된 세포는 난모 세포 공여자와 조직 적합성인 분화된 세포.
  62. 제60항에 있어서, 상기 분화된 세포는 뉴런 세포, 심장 세포, 평활근 세포, 가로무늬근 세포, 내피 세포, 조골 세포, 희소돌기아교세포, 조혈모세포, 지방 세 포, 기질 세포, 연골 세포, 성상 세포, 수지상 세포, 각질 세포, 췌장도 세포, 림프계 전구 세포, 비만 세포, 중배엽 세포 및 내배엽 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 분화된 세포.
  63. 제62항에 있어서, 상기 세포는 신경미세섬유 68, NCAM, 베타 III-튜불린, GFAP 또는 이의 조합을 발현하는 분화된 세포.
  64. 제62항에 있어서, 상기 세포는 알파-액티닌, 데스민 또는 이의 조합을 발현하는 분화된 세포.
  65. 제62항에 있어서, 상기 세포는 PECAM-1, VE-카데린 또는 이의 조합을 발현하는 분화된 세포.
  66. 제62항에 있어서, 상기 세포는 알파-페토프로테인을 발현하는 분화된 세포.
  67. 제62항에 있어서, 상기 세포는 동형상태의 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 포함하는 분화된 세포.
  68. 처녀 생식에 의해 활성화된 인간 공여자로부터의 난모 세포로부터 유도된 자기 줄기 세포를 포함하는 세포주.
  69. 제68항에 있어서, 상기 세포는 각각 46, XX 핵형을 가지는 것인 세포주.
  70. 제68항에 있어서, 상기 세포는 각각 실질적으로 공여자의 난모 세포와 유전자적으로 동일한 것인 세포주.
  71. 제68항에 있어서, 상기 세포는 각각 공여자 기원에 따라서 유전자적으로 각인된 세포주.
  72. 제68항에 있어서, 상기 세포는 SSEA-1을 발현하지 않는 것인 세포주.
  73. 제68항에 있어서, 상기 세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽 생식 계통으로 발생하는 것인 세포주.
  74. 제68항에 있어서, 각각의 별개 세포주의 세포는 동형상태의 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 포함하는 것인 세포주.
  75. 처녀 생식에 의해 활성화된 1 이상의 인간 공여자로부터의 난모 세포로부터 유도된 자기 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포의 라이브러리.
  76. 제75항에 있어서, 각 라이브러리의 구성원은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 마커에 따라서 완전 형제자매(full siblings), 반 형제자매(half siblings) 또는 무관한(unrelated) 것으로 확인되는 라이브러리.
  77. 제75항에 있어서, 상기 난모 세포 공여자는 라이브러리의 구성원과 조직 적합성인 라이브러리.
  78. 제75항에 있어서, 라이브러리의 구성원은 난모 세포 공여자 기원에 따라서 유전자적으로 각인된 라이브러리.
  79. 제75항에 있어서, 각 구성원은 인간 군집에 존재하는 하나 이상의 MHC 대립 유전자에 대해 동종접합성인 라이브러리.
  80. 제75항에 있어서, 각 구성원은 라이브러리의 기타 구성원과 다른 MHC 대립 유전자 조합에 대하여 동종접합성인 라이브러리.
  81. 제75항에 있어서, 각 구성원은 하나 이상의 HLA 클래스 I 유전자와 HLA 클래스 II 유전자에 대해 최소한 동종접합성인 라이브러리.
  82. 제81항에 있어서, 상기 HLA 클래스 I 유전자는 HLA A*, HLA B*, HLA 및 Cw* 반수체형의 조합으로부터 선택되는 라이브러리.
  83. 제81항에 있어서, 상기 HLA 클래스 II 유전자는 HLA DRB1*, DRB3*, DRB4*, DRB5*, DQA1* 및 DQB1* 반수체형의 조합으로부터 선택되는 라이브러리.
  84. 제75항에 있어서, 각 구성원은 (i) 1년 이상 동안 시험관 내 배양액 중에서 증식할 것이고, (ii) 배양 내내 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직 중 하나 또는 전부의 유도체로 분화할 가능성을 유지하며, 또한 (iii) 섬유아세포 영양 세포층 상에서 배양시 분화가 억제되는 라이브러리.
  85. 제84항에 있어서, 각 구성원은, 염색체가 정배수체이고 장기간 배양시에도 변화되지 않는 핵형을 유지하는 라이브러리.
  86. 제75항에 있어서, 상기 구성원은 각각 외배엽, 중배엽 및 내배엽 생식 계통 세포로 분화될 수 있는 라이브러리.
  87. 처녀 생식에 의해 활성화된 1 이상의 인간 공여자로부터의 난모 세포로부터 유도된 냉동 보존된 반수성체를 포함하는 세포 은행.
  88. 제87항에 있어서, 상기 반수성체는 배반포가 형성될 때까지 낮은 O2 분압 하에서 배양한 것인 세포 은행.
  89. 처녀 생식에 의해 활성화된 1 이상의 인간 공여자로부터의 난모 세포로부터 유도된 냉동 보존된 자기 줄기 세포를 포함하는 세포 은행.
  90. 분화된 세포를 포함하는 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 피험체를 치료하는 방법으로서, 상기 분화된 세포는 처녀 생식에 의해 활성화된 인간 공여자로부터의 난모 세포로부터 얻은 줄기 세포로부터 유도되는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 분화된 세포는 뉴런 세포, 심장 세포, 평활근 세포, 가로무늬근 세포, 내피 세포, 조골 세포, 희소돌기아교세포, 조혈모세포, 지방 세포, 기질 세포, 연골 세포, 성상 세포, 수지상 세포, 각질 세포, 췌장도 세포, 림프계 전구 세포, 비만 세포, 중배엽 세포 및 내배엽 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  92. 제90항에 있어서, 상기 피험체는 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, ALS, 척수 결손 또는 손상, 다발성 경화증, 근위축증, 낭포성 섬유증, 간 질환, 당뇨병, 심장 질환, 황반 변성, 연골 결손 또는 손상, 화상, 족부 궤양, 혈관 질환, 요로 질환, AIDS 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병이 있는 방법.
  93. 클로닝된 인간 배아 줄기 세포주를 형성하는 방법으로서,
    a) 이미 수정된 인간의 난모 세포로부터 제1 전핵을 제거하는 단계;
    b) 제2 전핵을 상기 단계 a)의 제핵 난모 세포로 전달하는 단계
    [이 때, 상기 제2 전핵은
    i) 공여자 난모 세포 또는 공여자의 모친으로부터의 난모 세포, 또는
    ii) 처녀 생식에 의해 활성화된 난모 세포로부터 유도되며, 상기 난모 세포의 전핵은 활성화 이전에 공여자의 체세포 핵으로 치환된 것임]; 및
    iii) 배반포가 형성될 때까지 상기 단계 b)에서 생성된 난모 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 배반포로부터의 내부 세포괴가 배아 줄기 세포를 함유하는 방법.
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