CN111418579B

CN111418579B - 一种脂肪组织的保存方法、脂肪组织的保存液及其制备方法

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Publication number: CN111418579B
Application number: CN202010285906.8A
Authority: CN
Inventors: 李文东; 宋云庆; 黎波; 卢瑞珊
Original assignee: Guangdong Huaxia Health Life Science Co ltd
Current assignee: Guangdong Huaxia Health Life Science Co ltd
Priority date: 2020-04-13
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2040-04-13
Also published as: CN111418579A

Abstract

本发明涉及一种脂肪组织的保存方法、脂肪组织的保存液及其制备方法，属于及生物离体组织或器官的保存领域。本发明提供的脂肪组织保存液，包括聚乙二醇400、营养成分、抗菌剂、右旋糖酐‑40和细胞凋亡抑制剂，其中，聚乙二醇400中含有终浓度为5％(v/v)的人血白蛋白、1×诺佛沙星、终浓度为1％(v/v)的右旋糖酐‑40和终浓度为5‑20ng/mL的Ac‑DEVD‑CHO。本发明提供的脂肪组织保存液成本低廉，成分稳定、安全、无任何毒副作用，且能用于离体脂肪组织长时间保存，能在72h内维持脂肪间充质干细胞原有的生物学特性，能很好的维持脂肪间充质干细胞活力，不引起细胞的功能性的变异。

Description

一种脂肪组织的保存方法、脂肪组织的保存液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种脂肪组织的保存方法、脂肪组织的保存液及其制备方法，属于及生物离体组织或器官的保存领域。

背景技术

脂肪组织(Adipose tissue)主要由大量群集的脂肪细胞构成，由疏松结缔组织分隔成小叶。根据脂肪细胞结构和功能的不同，脂肪组织分为两类。黄(白)色脂肪组织呈黄色(在某些哺乳动物呈白色)，即通常所说的脂肪组织，它由大量单泡脂肪细胞集聚而成，细胞中央有一大脂滴，胞质呈薄层，位于细胞周缘，包绕脂滴。在HE切片上，脂滴被溶解成一大空泡，胞核扁圆形，被脂滴推挤到细胞一侧，连同部分胞质呈新月形。黄色脂肪组织主要分布在皮下、网膜和系膜等处，约占成人体重的10％，是体内最大的贮能库，参与能量代谢，并具有产生热量、维持体温、缓冲保护和支持填充等作用。

此外，脂肪组织中含有大量的脂肪干细胞，但脂肪组织在离体情况下活力会逐渐下降，这直接影响了分离后的细胞质量。脂肪组织内的干细胞活力如何维持成为了首要解决的问题。在此之前，人们在DMEM/F12等基础培养基的基础上添加青霉素、链霉素、人血白蛋白等物质用于保存离体脂肪组织。但是由于营养成分单一、抗生素种类过多且浓度大、脂肪组织与保存液不相容出现分层等原因，导致脂肪组织中的干细胞在长期保存或运输中出现活力低下、甚至死亡等现象。

随后，人们进一步改善保存液的组成体系，以无机离子构成的缓冲液的基础上添加数种氨基酸和抗生素以维持离体脂肪组织活性、降低染菌率。这些措施虽然在较长时间内很好的维持了种子细胞的活性。但保存液的成分复杂，配制过程繁琐，不能便捷的应用。为了进一步的适应临床应用需要，开发一种营养成分多元且方便配制的脂肪组织保存液成为了当务之急。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种成本低廉、成分稳定、安全、无任何毒副，且能很好的维持脂肪间充质干细胞活力，不引起细胞的功能性变异的脂肪组织保存液。

本发明的另一目的是提供上述脂肪组织保存液的制备方法。

本发明的再一目的是提供脂肪组织的保存方法，将脂肪组织保存于脂肪组织保存液中。

本申请的发明人通过研究发现，本发明所述脂肪组织的保存液用于维持脂肪间充质干细胞活率的关键是提供合适的保存环境及营养供给，保证离体脂肪组织在保存液中长时间的维持活率。因此，本发明所述脂肪组织中的成分和运输过程中各条件成为提高细胞活率至关重要的因素。在本发明以前，白蛋白和氨基酸(组氨酸、还原型谷胱苷肽)常作为维持脂肪间充质干细胞的活力营养来源，而本申请在此基础上进一步改进了保存液的基础液的成分和营养体系，同时优化保存液中的成分组成和改良了运输条件，尽可能的维持细胞存活率，维持其生物特性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种脂肪组织保存液，包括聚乙二醇400、营养成分、抗菌剂、右旋糖酐-40和细胞凋亡抑制剂。

优选地，所述营养成分为人血白蛋白。

本发明首次采用了聚乙二醇400(PEG-400)作为基础成分，该物质与油脂类物质具有良好的相容性，还能与水类物质相容后，分理出脂类物质；人血白蛋白作为脂肪间充质干细胞保存液的营养成分。此外，添加的凋亡抑制剂可以大大的提高细胞的抗逆性，维持细胞活力，使得脂肪组织在离体和长期运输的条件下，仍能保证脂肪干细胞在离体的情况下仍能维持原有细胞形态及生物特性。

优选地，所述抗菌剂为诺佛沙星。

诺佛沙星是喹诺酮类药物中的一种，具有广谱抗菌作用，抗菌作用强，能够有效地抑制女性阴道各类型的菌群，对多数肠杆菌科细菌，如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门菌属、志贺菌属和流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、淋病奈瑟菌等革兰阴性菌有较强的抗菌活性；对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌等革兰阳性菌和肺炎支原体、肺炎衣原体也有抗菌作用。

优选地，所述细胞凋亡所述抑制剂为Ac-DEVD-CHO。

Ac-DEVD-CHO又称Caspase 3抑制剂，其作为凋亡信号通路的启动物质，从凋亡起始分子进行抑制，增强细胞抗凋亡的效果，直接抑制细胞凋亡，保存细胞的生物特性。

优选地，所述聚乙二醇400中含有终浓度为5％(v/v)的人血白蛋白、1×诺佛沙星、终浓度为1％(v/v)的右旋糖酐-40和终浓度为5-20ng/mL的Ac-DEVD-CHO。

另一方面，本发明提供所述的脂肪组织保存液的制备方法，往聚乙二醇400中加入人血白蛋白、诺佛沙星、右旋糖酐-40和Ac-DEVD-CHO，使各组分的含量如下：5％(v/v)人血白蛋白、1×诺佛沙星、1％(v/v)右旋糖酐-40和5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO，即可制得所述脂肪组织保存液。

所述右旋糖酐-40的别称为低分子右旋糖酐，本发明所述的脂肪组织保存液中，所述右旋糖酐-40的终浓度为1％(v/v)，其能维持保存液渗透压，为了脂肪间充质干细胞的活性，使得脂肪在一个等渗等压的环境下保存。

作为本发明所述制备方法的一种优选实施方式，往聚乙二醇400中加入20％(v/v)的人血白蛋白、100×诺佛沙星、6％(v/v)的右旋糖酐-40和Ac-DEVD-CHO，使各组分的含量如下：5％(v/v)人血白蛋白、1×诺佛沙星、1％(v/v)右旋糖酐-40和5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO，即可制得所述脂肪组织保存液。

作为本发明所述制备方法的一种优选实施方式，所述5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO的制备方法为：称取Ac-DEVD-CHO，溶解于聚乙二醇400中，获得5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO溶液，0.22μm过滤，即可制得所述所述5-20ng/mLAc-DEVD-CHO。

再一方面，本发明提供一种脂肪组织的保存方法，将离体的脂肪组织静止后排弃肿胀液，然后将所述脂肪组织转移至本发明所述的脂肪组织保存液中，在4℃条件下保存。

本发明能低温保存脂肪组织，一方面可避免营养成分变性，另一方面则很好的保持了脂肪组织中种子细胞的生物活性。

作为本发明所述脂肪组织的保存方法的一种优选实施方式，所述脂肪组织与所述脂肪组织保存液的体积比为1:1。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明选用了聚乙二醇400作为基础成分，添加抗凋亡物质，同时选用了诺佛沙星该类广谱抗菌物质，全方面的解决了保存液与组织自然分层的现象，还能通过溶液与组织充分融合达到真正的保存效果。

(2)本发明提供的脂肪组织保存液，选用聚乙二醇400作为基础成分，可从试剂公司购置，这样保证了脂肪组织保存液质量的稳定性，避免了人为配置所引起的质量差异，另外，脂肪组织保存液中的人血白蛋白，能直接被细胞利用，提高细胞的抵抗能力，维持了细胞的活性。

(3)本发明提供的脂肪组织保存液中添加了1％的低分子右旋糖酐，维持保存液渗透压，为了脂肪间充质干细胞的活性，使得脂肪在一个等渗等压的环境下保存。

(4)本发明提供的脂肪组织保存液成本低廉，成分稳定、安全、无任何毒副作用，且能用于离体脂肪组织长时间保存，能在72h内维持脂肪间充质干细胞原有的生物学特性。

(5)本发明提供的脂肪组织保存液能很好的维持脂肪间充质干细胞活力，不引起细胞的功能性的变异。

(6)本发明提供的脂肪组织保存液的制备方法，操作简便，能在短时间内配制大量。

(7)本发明在低温(4℃)下保存脂肪组织，一方面可避免营养成分变性，另一方面则很好的保持了脂肪组织中种子细胞的生物活性。

附图说明

图1为使用实施例1所述脂肪保存液保存的脂肪干细胞形态图(40倍)；

图2为使用实施例2所述脂肪保存液保存的脂肪干细胞形态图(40倍)；

图3为使用实施例3所述脂肪保存液保存的脂肪干细胞形态图(40倍)。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

实施例1

本实施例为本发明的一种脂肪组织保存液，所述脂肪组织保存液为含有5％(v/v)人血白蛋白、1×诺佛沙星、1％(v/v)右旋糖酐-40和5ng/mL Ac-DEVD-CHO的聚乙二醇400。

上述脂肪组织保存液的制备方法为：往聚乙二醇400中加入20％(v/v)的人血白蛋白、100×诺佛沙星、6％(v/v)的右旋糖酐-40和Ac-DEVD-CHO，使各组分的含量如下：5％(v/v)人血白蛋白、1×诺佛沙星、1％(v/v)右旋糖酐-40和5ng/mL Ac-DEVD-CHO，即可制得所述脂肪组织保存液。其中，所述5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO的制备方法为：称取Ac-DEVD-CHO，溶解于聚乙二醇400中，获得5ng/mL Ac-DEVD-CHO溶液，0.22μm过滤，即可制得所述所述5ng/mL Ac-DEVD-CHO。

实施例2

本实施例为本发明的一种脂肪组织保存液，所述脂肪组织保存液为含有5％(v/v)人血白蛋白、1×诺佛沙星、1％(v/v)右旋糖酐-40和20ng/mL Ac-DEVD-CHO的聚乙二醇400。

上述脂肪组织保存液的制备方法为：往聚乙二醇400中加入20％(v/v)的人血白蛋白、100×诺佛沙星、6％(v/v)的右旋糖酐-40和Ac-DEVD-CHO，使各组分的含量如下：5％(v/v)人血白蛋白、1×诺佛沙星、1％(v/v)右旋糖酐-40和20ng/mL Ac-DEVD-CHO，即可制得所述脂肪组织保存液。其中，所述5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO的制备方法为：称取Ac-DEVD-CHO，溶解于聚乙二醇400中，获得20ng/mL Ac-DEVD-CHO溶液，0.22μm过滤，即可制得所述所述20ng/mL Ac-DEVD-CHO。

实施例3

本实施例为本发明的一种脂肪组织保存液，所述脂肪组织保存液为含有5％(v/v)人血白蛋白、1×诺佛沙星、1％(v/v)右旋糖酐-40和10ng/mL Ac-DEVD-CHO的聚乙二醇400。

上述脂肪组织保存液的制备方法为：往聚乙二醇400中加入20％(v/v)的人血白蛋白、100×诺佛沙星、6％(v/v)的右旋糖酐-40和Ac-DEVD-CHO，使各组分的含量如下：5％(v/v)人血白蛋白、1×诺佛沙星、1％(v/v)右旋糖酐-40和15ng/mL Ac-DEVD-CHO，即可制得所述脂肪组织保存液。其中，所述5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO的制备方法为：称取Ac-DEVD-CHO，溶解于聚乙二醇400中，获得15ng/mL Ac-DEVD-CHO溶液，0.22μm过滤，即可制得所述所述15ng/mL Ac-DEVD-CHO。

实施例4

本实施例为脂肪组织的保存：

脂肪组织运输：将离体的脂肪组织静止后排弃肿胀液，然后将所述脂肪组织转移至本发明实施例1配制好的脂肪组织保存液中，所述脂肪组织与实施例1配制好的脂肪组织保存液以体积比1:1混合，在4℃条件下保存，运送至实验室中。

实施例5

本实施例为脂肪组织的运输：

实施例4保存后的离体脂肪组织分别在24h、48h、96h小时内进入实验程序(运输过程应保持4℃)。

实验例1

本实验例对实施例5获得的保存、运输后的脂肪间充质干细胞的质量评价(活力与体积、贴壁率、形态、增殖速度、表面抗原)。

实验方法：

a.活力与体积检测：

取刚分离出来的脂肪干细胞，调整细胞密度为1×10⁶cell/mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝＝3:1(v:v)充分混匀，取20uL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞活率及体积检测。

b.贴壁率

脂肪间充质干细胞在分离培养后，调整密度为5×10⁵cell/mL，接种8mL至直径为9cm的平皿中，待其自然贴壁生长48小时后，去除未贴壁的细胞后，用0.25％胰蛋白酶进行酶解，计算出贴壁细胞的数量，从得出贴壁率。

c.形态检测：取处于对数生长期的脂肪干细胞，置倒置显微镜下观察细胞的形态。

d.流式结果检测

取处于对数生长期的脂肪干细胞，调整细胞密度为1×10⁶cells的细胞悬液，分别取抗人CD105、CD90、CD73、CD45、CD34、HLA-DR的单克隆抗体各2.5μL,加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照；1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL1640重悬后上机检测。

实验结果：

a.脂肪组织在本发明所述的脂肪组织保存液中保存24h、48h、72h后，分离间充质干细胞的活力

表1脂肪间充质干细胞的活率

脂肪组织保存时间	24h	48h	72h
				实施例1脂肪间充质细胞的活率	95.56±2.54％	89.71±1.86％	85.97±3.45％
实施例2脂肪间充质细胞的活率	96.27±1.83％	92.25±3.04％	88.41±2.32％
				实施例3脂肪间充质细胞的活率	94.89±2.09％	89.58±3.19％	85.97±3.45％

由上表1可知，使用实施例1、实施例2、实施例3的脂肪保存液保存实施例5获得的保存、运输后的脂肪间充质干细胞，在保存24h后，其细胞活率均在94.0％以上，细胞活率没有统计学差异。

使用实施例1、实施例2、实施例3的脂肪保存液保存实施例5获得的保存、运输后的脂肪间充质干细胞，在保存48h后，其细胞活率均在89.0％以上，细胞活率没有统计学差异。

使用实施例1、实施例2、实施例3的脂肪保存液保存实施例5获得的保存、运输后的脂肪间充质干细胞，在保存72h后，其细胞活率子85％以上，细胞活率没有统计学差异。

b.贴壁率

表2脂肪间充质干细胞的贴壁率

脂肪保存时间	24h	48h	72h
				实施例1	98.65％±1.57％	92.24％±1.53％	86.81％±5.47％
实施例2	97.87％±2.61％	94.07％±2.41％	89.74％±6.15％
				实施例3	98.21％±2.32％	90.86％±3.62％	85.13％±6.24％

由表2可知，使用实施例1、实施例2、实施例3的脂肪保存液保存实施例5获得的保存、运输后的脂肪间充质干细胞，在保存24h后，贴壁率97.0％以上，细胞贴壁率没有统计学差异。

使用实施例1、实施例2、实施例3的脂肪保存液保存实施例5获得的保存、运输后的脂肪间充质干细胞，在保存48h后，贴壁率90.0％以上，细胞贴壁率没有统计学差异。

使用实施例1、实施例2、实施例3的脂肪保存液保存实施例5获得的保存、运输后的脂肪间充质干细胞，在保存72h后，贴壁率85％以上，细胞贴壁率没有统计学差异。

c.形态检测

由图1-图3可知，使用实施例1、实施例2、实施例3的脂肪保存液保存实施例5获得的保存、运输后的脂肪间充质干细胞，其均为典型的间充质干细胞，其在体外培养时贴壁生长，细胞边缘清晰可见，折光性强；并未见漂浮的死亡细胞。当细胞分裂增殖时，呈长梭形；符合间充质干细胞的生物学特征。

e.脂肪间充质干细胞的流式鉴定

表3脂肪间充质干细胞的流式鉴定结果

Marker

CD73

CD90

CD105

CD11b

CD19

CD34

CD45

HLA-DR

实施例1

99.9％

98.2％

97.5％

1.2％

0.4％

0.1％

0.0％

实施例2

98.7％

97.8％

98.4％

1.0％

0.5％

0.0％

0.1％

实施例3

99.1％

99.6％

98.3％

0.8％

1.0％

0.2％

由上表3可知，使用实施例1、实施例2、实施例3的脂肪保存液保存实施例5获得的保存、运输后的脂肪间充质干细胞，其脂肪干细胞P1代细胞高表达CD73、CD90、CD105，表达量分别为95.0％以上；低表达CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR，表达量分别为低于2.0％；符合2006年ISCT颁布的《间充质干细胞最低鉴定标准》。从检测结果可知，脂肪干细胞P1代细胞仍具有干细胞特有的表面抗原，维持着原有的细胞干性，并未出现分化或退化现象。

实验例2

本实验例是验证对比组1、对比组2和实施例1脂肪组织保存液，保存脂肪组织24h、48h、72h后，分离间充质细胞的活力。对比组1、对比组2和实施例1脂肪组织保存液，除脂肪组织保存液配方不同外，其他条件均相同。

对比组1：聚乙二醇中含有聚乙二醇400(PEG-400)含有1×诺佛沙星。

对比组2：聚乙二醇中含有聚乙二醇400(PEG-400)含有5％人血白蛋白、1×诺佛沙星。

实施例1：聚乙二醇中含有聚乙二醇400(PEG-400)含有5％人血白蛋白、1×诺佛沙星、1％低分子右旋糖苷、5ng/mL Ac-DEVD-CHO(又称Caspase 3抑制剂)

上述对比组1、对比组2和实施例1脂肪组织保存液的制备方法，均同实施例1.

脂肪组织在对比组1、对比组2和实施例1脂肪组织保存液保存24h、48h、72h后，分离间充质细胞的活力，结果如表4所示。

表4不同脂肪组织保存液保存脂肪干细胞后的活率

由上表4可知，使用对比组1、对比组2、实施例1的脂肪保存液保存脂肪干细胞24h、48h和72h后，其脂肪间充质细胞的活率，均是实施例1的脂肪保存液保存脂肪干细胞的活率最高，分别为95.56±2.54％、89.71±1.86％和85.97±3.45％。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种脂肪组织保存液，其特征在于，包括聚乙二醇400、人血白蛋白、诺佛沙星、右旋糖酐-40和Ac-DEVD-CHO；各组分的具体含量为：所述聚乙二醇400中含有终浓度为5%(v/v)的人血白蛋白、1×诺佛沙星、终浓度为1%(v/v)的右旋糖酐-40和终浓度为5-20ng/mL的Ac-DEVD-CHO；

所述的脂肪组织保存液的制备方法，往聚乙二醇400中加入人血白蛋白、诺佛沙星、右旋糖酐-40和Ac-DEVD-CHO，使各组分的含量如下：5%(v/v)人血白蛋白、1×诺佛沙星、1%(v/v)右旋糖酐-40和5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO，即可制得所述脂肪组织保存液。

2.如权利要求1所述的脂肪组织保存液，其特征在于，往聚乙二醇400中加入20%(v/v)的人血白蛋白、100×诺佛沙星、6%(v/v)的右旋糖酐-40和Ac-DEVD-CHO，使各组分的含量如下：5%(v/v)人血白蛋白、1×诺佛沙星、1%(v/v)右旋糖酐-40和5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO，即可制得所述脂肪组织保存液。

3.如权利要求1或2所述的脂肪组织保存液，其特征在于，所述5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO的制备方法为：称取Ac-DEVD-CHO，溶解于聚乙二醇400中，获得5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO溶液，0.22μm过滤，即可制得所述5-20ng/mL Ac-DEVD-CHO。

4.一种脂肪组织的保存方法，其特征在于，将离体的脂肪组织静止后排弃肿胀液，然后将所述脂肪组织转移至权利要求1所述的脂肪组织保存液中，在4℃条件下保存。

5.如权利要求4所述的保存方法，其特征在于，所述脂肪组织与所述脂肪组织保存液的体积比为1:1。