CN116783287A

CN116783287A - 从干细胞诱导生成视网膜外层细胞的方法及包含通过该方法生成的细胞的用于预防或治疗视网膜疾病的组合物

Info

Publication number: CN116783287A
Application number: CN202280012758.XA
Authority: CN
Inventors: 曹明洙; 南承择; 严场铉
Original assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University
Current assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2023-09-19
Also published as: EP4289942A4; JP2024506286A; US20240124837A1; EP4289942A1; CA3207040A1; WO2022169209A1; KR20220111822A; AU2022216137A1

Abstract

本发明涉及从球状神经团(spherical neural mass，SNM)向视网膜外层细胞(retinal outer layer cells)的分化方法及包含通过上述分化方法生成的视网膜外层细胞的组合物。在利用本发明的分化方法的情况下，可以从球状神经团有效地分化为视网膜外层细胞，因此可以在相关研究开发及产品化中有效使用该方法。

Description

从干细胞诱导生成视网膜外层细胞的方法及包含通过该方法生成的细胞的用于预防或治疗视网膜疾病的组合物

【技术领域】

本发明涉及从球状神经团(spherical neural mass，SNM)向视网膜外层细胞(retinal outer layer cells)的分化及生成方法。

本申请要求于2021年02月02日向韩国专利厅提交且申请号为第10-2021-0015038号的韩国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

【背景技术】

失明是指在医学上没有光感的现象，是占全世界人口0.2％-0.5％的数千万患者罹患的疾病，无论在个人还是在社会及经济方面都带来巨大的损失。全世界范围内失明的最大原因之一为视网膜的视细胞(感光细胞，photoreceptor cell)及视网膜色素上皮细胞的变性，这是由于先天性因素或其他多种因素引起的。该疾病相当于视网膜未形成、视网膜变性(retinal degeneration)、老年性黄斑变性(aged macular degeneration)、糖尿病性视网膜疾病(diabetic retinopathy)、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa)、先天性视网膜萎缩、莱伯先天性黑内障(leber congenital amaurosis)、视网膜脱落、青光眼(glaucoma)、视神经病症及外伤等多种疾病。至今尚无用于从根本上治疗这些疾病的药物治疗方法，而将作为这些疾病的病因及结果的功能障碍的视细胞及视网膜色素上皮细胞再生为新的功能性细胞并移植的方法为最具可行性的治疗方法。据评估，视细胞及视网膜色素上皮细胞移植方法延迟或抑制视网膜变性，可以通过再生退化或变性的视网膜后提高视网膜功能来防止失明或者再生受损的视力。

利用骨髓干细胞(bone marrow stem cell：BMS)、视网膜干细胞(retinal stemcell：RSC)、胚胎干细胞(embryonic stem cell：ESC)、诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cell：iPSC)及体细胞核移植干细胞(somatic cell nuclear transfercell：SCNT)等的眼球疾病的治疗可能性正日益抬头。然而，有关从干细胞向视网膜细胞的分化及利用其的细胞治疗的研究成果仍处于不振的状态。在能够从这些干细胞向视网膜细胞分化的情况下：1)用于有效的细胞治疗的无限的细胞供应成为可能；2)将查明至今尚未查明的从胚胎细胞(embryonic cell)及视网膜祖细胞(retinal progenitor)向视网膜细胞的分化机制；3)将发现与视网膜的分化相关的基因及分子以及查明有关于它们的病变；4)将掌握视网膜变性疾病的发病机制；以及5)可以在防止视网膜变性及用于视网膜神经保护的药剂开发中使用。

从确立最初的人胚胎干细胞株后开始，就提出人胚胎干细胞具有的能够分化为非常多种类的细胞的能力，能够应用于上述分化的细胞能够治疗在各种器官中引起的疾病的人体细胞疗法中。即，人胚胎干细胞被看作可以明确查明性状，能够充分提供在临床治疗时用于替换功能障碍的细胞的新的细胞的强力的候选细胞。从人胚胎干细胞中诱导的构成各种器官的分化细胞一直假设能够具有与通过正常分化过程形成的相关细胞相同的性状及功能。基于该可能性，在胰腺激素表达内分泌细胞、神经细胞、肌肉细胞、血管内皮细胞分化等方面尝试了提供与发育阶段相似的环境的分化诱导方法。在视网膜疾病中，尽管为了生产从人胚胎干细胞分化的作为视网膜代表细胞的视细胞及视网膜色素上皮细胞而进行了无数尝试，但成果寥寥。

至今最大成功之一的报告的研究成果尽管从人胚胎干细胞中有效诱导视网膜祖细胞，但从诱导的视网膜祖细胞向视细胞的分化以失败告终(分化率小于0.01％)(Lamba,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2006；103:12769-74)。

因此，有必要开发能够临床应用的视细胞及视网膜色素上皮细胞的分化方法。

【发明内容】

【技术问题】

本发明人为了开发能够临床应用的视网膜外层细胞，即，视细胞及视网膜色素上皮细胞的分化方法而经数番努力研究。结果，查明在单一培养基中一同培养球状神经团单一细胞与球状神经团的囊状结构物时，向视细胞及视网膜色素上皮细胞的分化效率高，从而完成本发明。

因此，本发明的目的在于，提供从球状神经团向视网膜外层细胞的分化方法，包括：

在单一培养基中一同培养球状神经团单一细胞与球状神经团的囊状结构物的步骤；以及

从球状神经团向视网膜外层细胞分化的步骤。

本发明的再一目的在于，提供包含通过上述分化方法生成的视网膜外层细胞的用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物。

本发明的另一目的在于，提供治疗视网膜疾病的方法，包括向个体给药通过上述分化方法生成的视网膜外层细胞的步骤。

本发明的还一目的在于，提供通过上述分化方法生成的视网膜外层细胞的治疗视网膜疾病的用途。

【技术方案】

根据本发明的一实施方式，本发明提供从球状神经团向视网膜外层细胞的分化方法，包括：

从球状神经团向视网膜外层细胞分化的步骤。

本说明书中的术语“视网膜外层细胞”是指存在于以多层构成视网膜的细胞中最外层的视细胞和视网膜色素上皮细胞(retinal pigmented epithelium cell)。

本说明书中的术语“视细胞”是指存在于视网膜外层的视杆细胞(rod cell)及视锥细胞(cone cell)。视细胞也称为感光细胞。

本说明书中的术语“视网膜色素上皮细胞”是指构成位于视网膜最外层并与脉络膜(choroid)相接的视网膜色素上皮的细胞。

本说明书中的术语“球状神经团”是指从人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞等多能干细胞制备的神经祖细胞或从神经组织中分离的神经祖细胞凝集为球形态。

本发明中使用的球状神经团可以具有300μm至700μm的大小。根据本发明的实施例，上述球状神经团可以具有450μm至550μm的大小。

球状神经团单一细胞可以通过使球状神经团单一细胞化的步骤来分离。上述单一细胞化可以包括使用微型切片工具对球状神经团进行切片化。在此情况下，若使用细胞分离酶切片化，则因细胞损伤多而回收率低，因此可以使用物理方法。用于切片化的工具，只要是可以在解剖显微镜下切割直径500μm以下的凝集物的就都可以使用，具体地，可以使用通过玻璃巴斯德吸管拉细的方式、使用直径100μm以下的金属线及具有微米(μm)大小的孔的金属网等。根据本发明的实施例，上述切片化使用钨线来进行。

并且，上述切片化的球状神经团可以利用作为细胞分离用酶的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)、分散酶、Accutase及胶原酶等通常的本发明所属技术领域中广为人知的酶来单一化。根据本发明的实施例，细胞的单一化可以利用Accutase来进行。

根据本发明的实施例，切片化的球状神经团可以在包被CellStart的直径60mm的培养皿中使用加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和N2添加剂的培养基附着培养12小时-24小时后去除培养基，放入3ml-5ml的Accutase并在37℃的培养期中处理1小时-3小时来单一细胞化。

球状神经团的囊状结构物是指存在于球状神经团中的水泡形态的透明囊，它们在球状神经团中能够以水泡形态的透明囊突出或者整体被透明囊包裹的形态存在。上述球状神经团的囊状结构物可以使用金属线及具有微米(μm)大小的孔的金属网等来分离。根据本发明的实施例，上述球状神经团的囊状结构物可以使用钨线来分离。

上述球状神经团的囊状结构物可以切片化。

在单一培养基中一同培养球状神经团单一细胞与球状神经团的囊状结构物的步骤

本步骤为将球状神经团单一细胞与球状神经团的囊状结构物一同在单一培养基中培养的步骤。

在本发明的一实例中，在上述培养步骤中，在以多孔结构物上下隔开的空间中，使球状神经团单一细胞位于上端部上，使球状神经团的囊状结构物位于下端部上来培养。

在本发明的一实例中，上述多孔结构物为多孔网状物(mesh)。

在本发明的一实例中，上述球状神经团单一细胞从球状神经团的非囊状结构物中分离而来。

在本发明的一实例中，上述球状神经团囊状结构物从球状神经团来源透明囊中分离而来。

上述球状神经团的囊状结构物可以切片化来培养。上述球状神经团的囊状结构物的切片大小不受限制。

上述球状神经团的囊状结构物可以在包被CELLstart的培养皿中每个培养皿放入15个至20个囊状结构物切片后在加入N2、B27添加剂的DMEM/F12培养基中附着培养，但不限定于此。上述球状神经团的囊状结构物位于以多孔结构物上下隔开的空间中的下端部上。

球状神经团单一细胞可以向包被CELLstart的培养皿中放入0.5×10⁵至1.5×10⁵个低聚细胞后，与球状神经团的囊状结构物一同培养1周-3周，但不限定于此。上述球状神经团单一细胞位于以多孔结构物上下隔开的空间中的上端部上。

上述各步骤中使用的包被物质可以为CELLstart，但不限定于此，还可以包含用于细胞附着的细胞外基质(extracellular matrix；ECM)。这是因为未分化干细胞及神经细胞无法靠自己的力量附着在培养皿中生长，只能在细胞外基质或其他支撑细胞的帮助下维持培养。

除CELLstart以外，细胞外基质还可以单独使用其他物质或混合其他物质来使用。

在本发明的一实例中，上述球状神经团从干细胞分化而来。

在本发明的一实例中，上述干细胞为多能干细胞。

在本发明的一实例中，上述干细胞选自由胚胎干细胞(embryonic stem cells)、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)、成体干细胞(adult stemcells)、体细胞核移植胚胎干细胞(somatic cell nuclear transfer embryonic stemcell)及通过基因直接重组法(direct reprogramming)生成的干细胞组成的组中。根据本发明的实施例，上述干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。

在本发明的一实例中，上述球状神经团通过如下步骤从干细胞分化而来：

从干细胞(stem cell)形成胚状体(embryoid body)的步骤；

上从述胚状体形成神经玫瑰花结(neural rosette)及神经管样结构(neuraltube-like structure)的步骤；以及

从上述神经玫瑰花结及神经管样结构形成球状神经团的步骤。

从干细胞形成胚状体的步骤可以进行4天-6天，但不限定于此。

从干细胞形成胚状体的步骤可以利用Essential 6细胞培养基来进行，但不限定于此。

本说明书中的术语“胚状体”是指以胚胎干细胞为代表的多能干细胞的三维集合体，多能干细胞可以通过胚状体再现初期胚胎发育阶段的分化过程并分化为内胚层、中胚层以及外胚层等所有三胚层体细胞。

上述从胚状体形成神经玫瑰花结及神经管样结构的步骤可以进行4天-6天，但不限定于此。

上述从胚状体形成神经玫瑰花结及神经管样结构的步骤可以利用包被CELLstart的培养皿来进行，但不限定于此。

上述从胚状体形成神经玫瑰花结及神经管样结构的步骤可以通过如下方式来进行：将通过上述胚状体形成过程形成的胚状体在包被CELLstart的培养皿中使用只加入1/2含量的N2添加剂的DMEM/F12最低培养基培养4天-6天，然后将1/2含量的N2添加剂的DMEM/F12最低培养基更换为加入碱性成纤维细胞生长因子和N2的DMEM/F12培养基并培养5天-10天来增殖。但不限定于此。

本步骤中使用的培养基可以为加入碱性成纤维细胞生长因子和N2的DMEM/F12细胞培养基，但可以选择性地不受限制地使用能够使神经玫瑰花结形成/保持的培养液。

【从球状神经团向视网膜外层细胞分化的步骤】

本步骤为在单一培养基中一同培养球状神经团单一细胞与球状神经团的囊状结构物后球状神经团单一细胞和囊状结构物分化为视网膜外层细胞的步骤。

在本发明的一实例中，上述球状神经团为球状神经团单一细胞、球状神经团的囊状结构物或球状神经团单一细胞及球状神经团的囊状结构物。

在本发明的一实例中，上述视网膜外层细胞为视细胞、视网膜色素上皮细胞或者视细胞及视网膜色素上皮细胞。

在本发明的一实例中，上述视网膜外层细胞的视紫红质(rhodopsin)及微管蛋白βIII(tubulin)表达增加，或者RPE65及斑萎蛋白(Bestrophin)的表达增加。

在本发明的一实例中，上述视网膜外层细胞改善或预防失明。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含通过上述分化方法生成的视网膜外层细胞的用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物。

在本发明的一实例中，上述视网膜疾病选自由视网膜未形成、视网膜变性、老年性黄斑变性、糖尿病性视网膜疾病、视网膜色素变性、青光眼、视神经病症、外伤、视网膜脱落、莱伯先天性黑内障及先天性视网膜萎缩症组成的组中。

上述视网膜外层细胞为与上述分化方法中记载的视网膜外层细胞相同的细胞，因此，为了避免说明书过度的复杂性，将省略有关视网膜外层细胞的记载。

根据本发明的另一实施方式，本发明涉及治疗视网膜疾病的方法，包括向个体给药通过上述分化方法生成的视网膜外层细胞的步骤。

上述“个体”是指需要治疗疾病的对象，更具体地，是指人类或非人灵长类、小鼠(mouse)、狗、猫、马及牛等哺乳动物。

根据本发明的另一实施方式，本发明涉及通过上述分化方法生成的视网膜外层细胞的治疗视网膜疾病的用途。

【发明的效果】

概括本发明的特征及优点如下。

本发明提供从球状神经团向视网膜外层细胞分化的方法及包含通过上述分化方法生成的视网膜外层细胞的组合物。

在利用本发明的分化方法的情况下，可以在除培养基与基本培养添加剂以外无需其他化学构成物或其他支撑细胞的情况下只使用球状神经团有效地将神经祖细胞分化为视网膜外层细胞，可以在研究开发及产品化中有效使用该方法。

【附图说明】

图1a示出本发明一实施例的视网膜外层细胞诱导分化不同步骤的细胞形态及分离培养中使用的培养皿。

图1b示出本发明一实施例的视网膜外层细胞诱导分化不同步骤的细胞形态及分离培养中使用的培养皿。

图2示出根据本发明一实施例来分析球状神经团的特性的结果。

图3a示出在视网膜外层细胞分化中确认最佳分离培养方法的结果(只培养球状神经团单一细胞)。

图3b示出在视网膜外层细胞分化中确认最佳分离培养方法的结果(球状神经团单一细胞与囊性切片混合培养)。

图3c示出在视网膜外层细胞分化中确认最佳分离培养方法的结果(在插入式细胞培养器中培养囊性切片，在6孔(6-well)细胞培养皿中培养球状神经团单一细胞1天后，分离培养)。

图3d示出在视网膜外层细胞分化中确认最佳分离培养方法的结果(在插入式细胞培养器中培养球状神经团单一细胞，在6孔细胞培养皿中培养囊性切片1天后，分离培养)。

图3e示出在视网膜外层细胞分化中确认最佳分离培养方法的结果(在插入式细胞培养器底面中培养球状神经团单一细胞，在6孔细胞培养皿中培养囊性切片1天后，分离培养)。

图4a示出根据本发明一实施例通过标记物的表达与否来确认从胚胎干细胞分化的视细胞的分化与否的结果。

图4b示出根据本发明一实施例通过标记物的表达与否来确认从诱导性多能干细胞分化的视细胞的分化与否的结果。

图4c示出根据本发明一实施例通过测定环鸟苷酸(cyclic GMP)来确认视细胞的分化与否的结果。

图4d示出根据本发明一实施例通过视紫红质、微管蛋白βIII(βIII-tubulin)、巢蛋白(Nestin)的基因表达确认从胚胎干细胞分化的视细胞的分化与否的结果。

图4e示出根据本发明一实施例通过RPE65、斑萎蛋白(Bestrophin)、ZO-1标记物确认从胚胎干细胞分化的视细胞的分化与否的结果。

图4f示出根据本发明一实施例通过RPE65、斑萎蛋白、ZO-1标记物确认从诱导性多能干细胞分化的视细胞的分化与否的结果。

图5a示出根据本发明一实施例通过动物实验确认分化的视细胞及视网膜上皮细胞在生物体内的移植存活的结果。

图5b为示出根据本发明一实施例为了测定分化的视细胞及视网膜上皮细胞的功效而实施视网膜电图的图。

图5c为示出根据本发明一实施例通过视网膜电图测定确认分化的视细胞及视网膜上皮细胞的功效的结果。

【具体实施方式】

以下，通过实施例更为详细地说明本发明。本发明所属技术领域的普通技术人员应该自明的是，这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不限定于这些实施例。

【实施例】

在本说明书全文中，若无其他定义，则用来表示特定物质的浓度的“％”，固体/固体为(重量/重量)％，固体/液体为(重量/体积)％，液体/液体为(体积/体积)％。

【培养人胚胎干细胞(human Embryonic stem cells，hESC)】

用于视网膜外层细胞分化的未分化的人胚胎干细胞(SNUhES32)是在包被玻连蛋白(Vitronectin)(GIBCO公司，A27940)的培养皿中使用Essential 8(GIBCO公司，A15169-01)培养液来培养的。

在此情况下，未分化干细胞培养为集落(Colony)形态。原则上培养7天，若要在集落中心部分诱导分化，则利用玻璃移液器的末端做成钩子形态的工具划分为20个-30个左右的格子纹，将100个碎片移到包被玻连蛋白的新的培养皿中传代培养，从第三天开始到第七天，每天在超过24小时前更换培养液来保持。

【培养诱导性多能干细胞】

通过与上述人胚胎干细胞的培养方法相同的方法培养用于视细胞分化的未分化的诱导性多能干细胞(hFSiPS1)。

【免疫细胞化学(Immunocytochemistry)分析】

在4％的多聚甲醛溶液中固定细胞10分钟。

为了使各个抗体从细胞质中顺利透过，使用0.1％的Trition X-100(包含在磷酸盐缓冲溶液中(in PBS))溶液反应15分钟后，使用2％的牛血清白蛋白(BSA，包含在磷酸盐缓冲溶液中)溶液在室温下反应1小时。

然后，在4℃的温度下使一抗与细胞结合。为了确认上述结合一抗的细胞，使用与各一抗来源种类相匹配的二抗(参照下述表1)。

最后，为了确认细胞核，在包含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中反应10分钟来染色细胞核后，使用荧光显微镜获得图像，确认及分析重要标记物。

【表1】

【从人多能干细胞向视网膜外层细胞的分化】

从解冻的时间点开始对作为多能干细胞株的未分化的人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞进行2代传代培养来稳定后，第3代传代培养后保持培养7天。

去除培养7天的人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞(多能干细胞)的培养液后，使用DPBS(-)洗涤一次后，放入1ml的分散酶在37℃的培养器中反应3分钟来分离细胞。为了形成胚状体(Embryoid body，EB)，在EB培养基(Essential 6，0.5％的青霉素、链霉素(penicillin,streptomycin))中在皮氏培养皿培养分离的细胞5天。

在第五天，为了只制备神经细胞，将胚状体(EB)移到包被CELLstart的培养皿(dish)在作为神经选择培养基的DMEM/F12培养基(包含0.5％的N2底物(N2substrate)、2mM的L-谷氨酸(L-glutamin)、1％的非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)、0.5％的青霉素/链霉素(penicillinstreptomycin)、0.1mM的β-巯基乙醇(beta-mercaptoethanol))中培养5天。追加地，为了神经玫瑰花结和神经管样结构的形成及增殖，在作为增殖培养基的DMEM/F12培养基(包含0.5％的N2底物、2mM的L-谷氨酸、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、1％的非必需氨基酸、0.5％的青霉素/链霉素、0.1mM的β-巯基乙醇)中培养4天-7天来增殖。

然后，为了神经玫瑰花结和神经管样结构的形成及增殖，在N2bF培养基(DMEM/F12培养基中包含1％的N2底物、2mM的L-谷氨酸、20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、1％的非必需氨基酸、0.5％的青霉素/链霉素、0.1mM的β-巯基乙醇)中培养10天～14天。

在培养期间，若观察到神经玫瑰花结及神经管样结构，则使用玻璃巴斯德吸管拉细的工具从底面摘出切断，然后移到皮氏培养皿(petri-dish)中，在N2bF培养基中培养来形成球状神经团(spherical neural mass，SNM)。

球状神经团传代培养在直径到达500μm左右时使用0.1mm钨线(wire)通过机械性切割的方法来进行，最大可以传代到第10代而不改变特性。

在用于分化为视网膜外层细胞的分离培养的一天前，在包被CELLstart的6孔培养皿中附着培养球状神经团来源囊状结构物，在包被CELLstart的插入式细胞培养器中附着培养从球状神经团非囊状结构物单一化的细胞(球状神经团单一细胞)。球状神经团单一细胞化是在包被CELLstart的培养皿中附着培养切片化的球状神经团1天后，通过处理Accutase来单一细胞化的。在用于分离培养的细胞培养中使用N2B27细胞培养基。

向培养着囊状结构物切片的6孔培养皿中放入培养着单一细胞化的球状神经团单一细胞的插入视细胞培养器来进行分离培养，在细胞培养中使用N2B27细胞培养基，在直至分化结束的3周的分离培养期间，每两天更换一次培养基。

图1a及图1b为示出将上述过程依次简单模式化及不同步骤的细胞形态的图。

【视网膜外层细胞分化最佳化】

为了寻找使直至球状神经团的分化结束的细胞在视网膜外层细胞分化中最佳化的培养条件，进行如下条件的培养。

(a)只培养球状神经团细胞；

(b)将球状神经团细胞与囊性切片混合培养；

(c)在插入式细胞培养器中培养囊性切片1天，在6孔细胞培养皿中培养球状神经团单一细胞1天后，分离培养；

(d)在插入式细胞培养器中培养球状神经团单一细胞1天，在6孔细胞培养皿中培养囊性切片1天后，分离培养；

(e)在插入式细胞培养器底面培养球状神经团单一细胞1天，在6孔细胞培养皿中培养囊性切片1天后，分离培养。

上述条件在包被CELLstart的培养皿中进行，细胞培养基使用N2B27培养基来培养。

【逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)】

为了确认是否随着时间分化为视网膜外层细胞，以如下方式进行有关视网膜外层细胞中作为视细胞中表达的标记物的视紫红质的转录水平中的表达的逆转录聚合酶链式反应分析。

使用TRIzol试剂(Reagent)(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州(CA)，美国(USA))获得从球状神经团分化的视细胞的核糖核酸(RNA)，使用AMV逆转录酶(reverse transcriptase，RT)根据生产公司的指导方法(AccuPower RT PreMix；Bioneer公司，大田(Taejeon)，韩国(Korea))使用oligo-dT作为引物进行互补脱氧核糖核酸(cDNA)的合成。

聚合酶链式反应(PCR)扩增使用Taq聚合酶(Polymerase)(HiPi Plus 5x PCRPremix；Elpis biotech公司，大田，韩国)来进行，使用标准方式。聚合酶链式反应条件为在94℃的温度下变性5分钟后，重复30次在94℃的温度下30秒钟，在55℃的温度下30秒钟，在72℃的温度下10秒钟的过程。为了分析相对于其他信使核糖核酸(mRNA)的表达，基于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)信使核糖核酸的信号来使互补脱氧核糖核酸的量标准化。

以多种条件的退火温度和循环次数来重复试验的结果，成正比扩增的区间确定了各个引物对并使聚合酶链反应条件最佳化。

下述表2中示出基因表达分析中使用的引物的序列。

【表2】

【光传导路径代谢物质浓度测定法】

为了使用cGMP酶联免疫分析试剂盒(Enzyme immunoassay kit)(GE Healthcare公司)在分离培养第七天的视网膜外层细胞中测定光传导路径代谢物质浓度，根据生产公司的说明书来使用。在cGMP测定48小时前处理磷酸二酯酶抑制剂(IBMX，50mM)。

【在视网膜退化啮齿类模型中移植球状神经团来源的视网膜外层细胞】

向6周龄的SD大鼠静脉注射灭菌的1％的碘酸钠(NaIO₃)生理盐水溶液1次(70mg/kg)。静脉注射4天后，通过肌肉注射替来他明/唑拉西泮(tiletamine/zolazepam(舒泰(Zoletil))和甲苯噻嗪(xylazine)来对动物进行麻醉处理。

通过0.5％的托吡卡胺(tropicamide)和2.5％的盐酸苯肾上腺素(phenylephrineHCl)滴眼液(eye drops)(Mydrin-P)扩张瞳孔，处理0.5％的盐酸丙美卡因(proparacineHCl)(爱尔卡因)局部眼药麻醉剂。

在移植前，将球状神经团来源视网膜外层细胞与4',6-二脒基-2-苯基吲哚(10μg/ml)一同培养30分钟。为了从培养机中去除4',6-二脒基-2-苯基吲哚，进行多次洗涤过程后，在37℃、0.05％的胰蛋白酶(trypsin)/0.1％的乙二胺四乙酸的条件下培养5分钟来分离。

通过手术显微镜可视化后，利用附着在Hamilton注射器(syringe)的26-gauge的针头将分离的各视网膜外层细胞(1×10⁵cells/2μl)注入视网膜下空间或玻璃体腔。

在移植的前一天，直至脱核过程前，向饮水中给药环孢霉素A(Cyclosporine A)(210mg/l，Cipol-N，钟根堂公司(Chong Kun Dang)，首尔(Seoul)，韩国)。移植1周后，将眼球脱核后使用包埋化合物(embedding compound)(FSC 徕卡显微系统公司(Leicamicrosystems)，IL)进行急速冷冻处理。

使用磷酸盐缓冲溶液洗涤冷却片后，在包含0.1％的Triton X100的磷酸盐缓冲溶液的3％的牛血清白蛋白溶液(bovine serum albumin solution)中封闭。封闭后，与一抗反应1天，为了免疫组织化学检查，抗体使用抗微管蛋白βIII(Anti-bШ-tub)抗体以及混合人类抗体、RPE65及ZO-1抗体。

使用视网膜电图在细胞移植后的第4、第12、第24周测定b波(b-wave)。

【结果】

【从人多能干细胞分化视网膜外层细胞】

图1a及图1b将本发明一连的过程模式化并示出各不同步骤的细胞形态。

为了将多能干细胞(包括胚胎干细胞及诱导性多能干细胞)分化为视网膜外层细胞，应诱导向神经系统细胞的分化。从初期开始，利用培养结构及细胞培养基经过神经祖细胞筛选培养、增殖培养、神经特异性结构物诱导、球状神经团形成步骤来诱导向神经祖细胞的有效分化，可知球状神经团若不给予单独的分化信号，则在初期或反复的传代后也保持神经祖细胞的性质(图2)。

最终，确认到通过只分离培养球状神经团的两种类型的结构物就有效分化本发明所目标的视细胞和视网膜上皮细胞。

本发明确认到，即使通过在利用多能干细胞的视细胞及视网膜上皮细胞的分化中不使用细胞传递信号活性剂及抑制剂等培养及补充物质的培养方法也能够显著增加分化效率。

【视网膜外层细胞分化最佳化】

在上述上“视网膜外层细胞分化最佳化”项目的分化条件为a)的情况下，几乎未示出作为视细胞标记物的视紫红质的表达(图3a)，在b)培养条件的情况下，确认到只有囊状结构物来源细胞存活，而球状神经团单一细胞几乎未存活的现象(图3b)，在c)培养条件下，在球状神经团单一细胞中示出视紫红质的表达(图3c)，但示出比d)培养条件下更低的倾向，在d)培养条件下，确认到视紫红质的表达最高(图3d)。e)培养条件在球状神经团单一细胞中的视紫红质的表达示出与d)培养条件相似的倾向(图3e)，但由于在插入式细胞培养器底面附着球状神经团单一细胞，无法完全排除囊状结构物来源的混合，给各个回收带来不便，因此可知，d)培养条件最适合视网膜外层细胞(视细胞)分化。

【分析多能干细胞来源视网膜外层细胞的功能特性】

利用免疫细胞化学方法确认与成熟视细胞的细胞功能相关的特定分子标记物。如图4a及4b所示，可以确认从胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化完毕的细胞不仅表达蓝视蛋白(blueopsin)、红视蛋白(redopsin)、PDE6b、恢复蛋白(recoverin)、视紫红质，还一同表达作为神经细胞标记物的微管蛋白βIII。

可以在生物体外进行视细胞的功能评估的方法为通过测定光传导路径代谢物质浓度在明处与暗处的差异来评估。在具有起作用的光传导路径情况下，会在环鸟苷酸的浓度上产生差异，分别将分化的视细胞在明处和暗处培养相同的时间时，在明处培养的细胞的环鸟苷酸的浓度比在暗处培养的减少，在处理磷酸二酯酶抑制剂(IBMX)时也确认到相同的状态。这表示通过本发明分化的视细胞内存在光传导路径，也就是意味着分化为视细胞(图4c)。

在分离培养期间通过逆转录聚合酶链式反应确认作为视细胞的特异蛋白的视紫红质的表达的结果，确认到分离培养第七天的视紫红质的信使核糖核酸的表达最高。这样的结果表示分离培养第七天的视细胞的分化已处于高水平，从第二十一天几乎不表达作为神经祖细胞标记物的巢蛋白的情况来看，确认大部分细胞已经分化完毕(图4d)。

利用特定分子标记物的免疫细胞化学方法确认视网膜色素上皮细胞的分化与否。如图4e及图4f所示，可以确认从胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化完毕的视网膜色素上皮细胞表达ZO-1、RPE65、斑萎蛋白。

【在视网膜退化啮齿类模型中移植球状神经团来源视网膜外层细胞的功效】

将基于本发明分化的视细胞及视网膜色素上皮细胞移植到视网膜退化大鼠并在12周后确认移植存活能力的结果，确认到在表达4',6-二脒基-2-苯基吲哚的同时还表达人类抗体及作为神经细胞标记物的微管蛋白βIII。并且，确认到作为视网膜上皮细胞标记物的RPE65和斑萎蛋白与作为上皮细胞标记物的ZO-1同时表达(图5a)。进而，由于在所有视网膜外层中都观察到了移植的细胞，因此可知移植细胞具有高的移植存活能力。

视网膜电图测定结果，在所有移植组中都确认到b波振幅(b-wave amplitude)的保持(图5b)，虽然在移植后经过时间表现出视功能的些许减少，但与对照组相比，确认到显著增加。同时，视细胞移植表现出比RPE移植更高的视功能改善(图5c)。

【产业上的可利用性】

本发明涉及从球状神经团向视网膜外层细胞的分化及生产方法。

序列表

<110> S生物医药公司

<120> 从干细胞诱导生成视网膜外层细胞的方法及包含通过该方法生成的细胞的用于预防或治疗视网膜疾病的组合物

<130> PP220001

<150> KR 10-2021-0015038

<151> 2021-02-02

<160> 8

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 视紫红质 F 引物

<400> 1

cacaggatgc aatttggagg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 视紫红质 R 引物

<400> 2

ccttctgtgt ggtggctgac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 微管蛋白βIII F 引物

<400> 3

caacagcacg gccatccagg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 微管蛋白βIII R 引物

<400> 4

cttggggccc tgggcctccg a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 巢蛋白 F 引物

<400> 5

cagctggcgc acctcaagat g 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 巢蛋白 R 引物

<400> 6

agggaagttg ggctcaggac tgg 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH F 引物

<400> 7

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH R 引物

<400> 8

tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims

1.从球状神经团向视网膜外层细胞的分化方法，其包括：

从球状神经团向视网膜外层细胞分化的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述培养步骤中，在以多孔结构物上下隔开的空间中，使球状神经团单一细胞位于上端部上，使球状神经团的囊状结构物位于下端部上来培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述多孔结构物为多孔网状物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述球状神经团单一细胞从球状神经团来源非囊状结构物中分离而来。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述球状神经团囊状结构物从球状神经团来源透明囊中分离而来。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述球状神经团从干细胞分化而来。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述干细胞选自由胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞、体细胞核移植胚胎干细胞及通过基因直接重组法生成的干细胞组成的组中。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述球状神经团通过如下步骤从干细胞分化而来：

从干细胞形成胚状体的步骤；

从所述胚状体形成神经玫瑰花结及神经管样结构的步骤；以及

从所述神经玫瑰花结及神经管样结构形成球状神经团的步骤。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述视网膜外层细胞的视紫红质及微管蛋白βIII的表达增加，或者RPE65及斑萎蛋白的表达增加。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述视网膜外层细胞为视细胞、视网膜色素上皮细胞或者视细胞及视网膜色素上皮细胞。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述视网膜外层细胞改善或预防失明。

12.用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含通过权利要求1所述的分化方法生成的视网膜外层细胞。