JP2024506286A - 幹細胞から網膜外層細胞の誘導生成方法及びそれによって生成された細胞を含む網膜疾患予防又は治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、神経前駆体球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｅｕｒａｌ ｍａｓｓ，ＳＮＭ）から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）への分化方法及び該分化方法で生成された網膜外層細胞を含む組成物に関する。本発明の分化方法を用いる場合に、神経前駆体球を効率的に網膜外層細胞に分化させることができ、これを関連研究開発及び製品化に有用に用いることができる。
Description
本発明は、神経前駆体球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｅｕｒａｌ ｍａｓｓ，ＳＮＭ）から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）への分化及び生成方法に関する。
本特許出願は、２０２１年０２月０２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００１５０３８号に対して優先権を主張し、当該特許出願の開示事項は本明細書に参照により組み込まれる。
失明は、医学的に光覚がないことをいい、現在、全世界人口の０．２～０．５％に至る数千万の人々が病んでいる疾患で、個人的、社会的及び経済的に大きな損失をもたらしている。全世界的に失明の最大の原因の一つとして網膜の視覚細胞（光受容体細胞、ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ）及び網膜色素上皮細胞の変性を挙げることができるが、これは先天的要因又は他の様々な原因によって発生する。網膜未形成、網膜変性（ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、加齢黄斑変性（ａｇｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、糖尿病性網膜疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、網膜色素変性（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）、先天性網膜萎縮症、レーバー先天黒内障（ｌｅｂｅｒ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ）、網膜剥離、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、視神経病症及び外傷など、多くの疾患がこの疾患に該当する。今のところ、これらの疾患に対する根本的な治療のための薬物療法はなく、それらの疾患の原因であり結果である機能不全の視覚細胞及び網膜色素上皮細胞を新しい機能性細胞に再生して移植することが、最も可能性のある治療法とされている。視覚細胞及び網膜色素上皮細胞移植法は、網膜変性を遅延又は抑制し、退化又は変性された網膜を再生後に網膜機能を向上させることによって失明を防止したり又は損傷した視力を再生させ得るものと評価されている。
骨髄幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＢＭＳ）、網膜幹細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＲＳＣ）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥＳＣ）、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳＣ）及び体細胞核置換幹細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｅｌｌ：ＳＣＮＴ）などを用いる眼球疾患の治療可能性が台頭している。しかし、幹細胞から網膜細胞への分化及びこれを用いた細胞治療に対する研究成果は僅かな現状にある。これらの幹細胞から網膜細胞への分化が可能な場合、１）効果的な細胞治療のための無限な細胞供給、２）今まで知られていない胚細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｅｌｌ）及び網膜起源細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）からの網膜細胞への分化機序の究明、３）網膜の分化関連遺伝子及び分子の発見及びそれに対する病変の究明、４）網膜変性疾患の発生機序の把握、及び５）網膜変性防止及び網膜神経保護のための薬剤開発にも利用可能であろう。
始めてヒト胚性幹細胞株が確立されて以来、ヒト胚性幹細胞は非常に様々な種類の細胞に分化できる能力を有しており、前記分化された細胞が各種臓器に発生する疾患を治療できるヒト細胞治療法に適用されることが提案されてきた。すなわち、ヒト胚性幹細胞は性状を正確に究明することができ、臨床治療時に機能不全の細胞を新しい細胞に置換するための細胞を豊富に供給できる強力な候補とされている。ヒト胚性幹細胞から誘導された各種臓器を構成する分化細胞は、正常の分化過程によって形成される当該細胞と同じ性状及び機能を有し得るものと仮定されてきた。この可能性に基づき、発達段階と類似な環境を提供する分化誘導法が膵臓ホルモン－発現内分泌細胞、神経細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞の分化などにおいて試みられている。網膜疾患においてもヒト胚性幹細胞から分化された、網膜細胞の代表的な細胞である視覚細胞及び網膜色素上皮細胞を生産するために多くの試みがあってきたが、成績は非常に低調であった。
現在までの最大の成功の一つとして報告された研究結果は、網膜起源細胞がヒト胚性幹細胞から効果的に誘導されたということであるが、誘導された網膜起源細胞から視覚細胞への分化には失敗した（分化率０．０１％未満）（Ｌａｍｂａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００６；１０３：１２７６９－７４）。
したがって、臨床的に適用可能な視覚細胞及び網膜色素上皮細胞の分化方法の開発が必要である。
本発明者らは、臨床的に適用が可能な網膜外層細胞、すなわち、視覚細胞及び網膜色素上皮細胞の分化方法を開発しようと鋭意研究努力した。その結果、神経前駆体球単一細胞及び神経前駆体球の嚢様構造物を単一培地内で共に培養する場合に、視覚細胞及び網膜色素上皮細胞への分化効率が高い点を突き止め、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、次の段階を含む、神経前駆体球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｅｕｒａｌ ｍａｓｓ，ＳＮＭ）から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）への分化方法を提供することである。
神経前駆体球単一細胞及び神経前駆体球の嚢様構造物を単一培地内で共に培養する段階；及び
神経前駆体球から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）に分化させる段階。
神経前駆体球から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）に分化させる段階。
本発明のさらに他の目的は、前記分化方法で生成された網膜外層細胞を含む網膜疾患予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記分化方法で生成された網膜外層細胞を個体に投与する段階を含む網膜疾患治療方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記分化方法で生成された網膜外層細胞の網膜疾患治療用途を提供することである。
本発明の一態様によれば、本発明は、次の段階を含む、神経前駆体球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｅｕｒａｌ ｍａｓｓ，ＳＮＭ）から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）への分化方法を提供する：
神経前駆体球単一細胞及び神経前駆体球の嚢様構造物を単一培地内で共に培養する段階；及び
神経前駆体球から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）に分化させる段階。
神経前駆体球単一細胞及び神経前駆体球の嚢様構造物を単一培地内で共に培養する段階；及び
神経前駆体球から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）に分化させる段階。
本明細書における用語「網膜外層細胞」は、多層構成された網膜を構成する細胞のうち、外層に存在する視覚細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ）及び網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃｅｌｌ）を意味する。
本明細書における用語「視覚細胞」は、網膜の外層に存在する桿体細胞（ｒｏｄ ｃｅｌｌ）及び錐体細胞（ｃｏｎｅ ｃｅｌｌ）を意味する。視覚細胞は、光受容器細胞、光受容体細胞などと呼ぶことができる。
本明細書における用語「網膜色素上皮細胞」は、網膜の最外層に位置し、脈絡膜（ｃｈｏｒｏｉｄ）と接している網膜色素上皮を構成している細胞を意味する。
本明細書における用語「神経前駆体球」は、ヒト胚性幹細胞又は誘導万能幹細胞のような全分化能幹細胞から作られた神経前駆細胞又は神経組織から分離された神経前駆細胞が球状に凝集したものを意味する。
本発明で用いられる神経前駆体球は、３００～７００μｍのサイズを有してよい。本発明の実施例によれば、前記神経前駆体球は４５０～５５０μｍのサイズを有してよい。
神経前駆体球単一細胞は、神経前駆体球を単一細胞化する段階によって分離されてよい。前記単一細胞化は、微細切片ツールを用いて神経前駆体球を切片化することを含んでよい。このとき、細胞分離酵素を用いて切片化する場合には細胞の損傷が多くて回収率が少ないため、物理的な方法を用いることができる。切片化のためのツールは、解剖顕微鏡下で直径５００μｍ以下の凝集物を切断できるいかなるツールも使用可能であり、具体的には、ガラスパスツールピペットを細く引き伸ばしたもの、直径１００μｍ以下の金属線及びマイクロメートル（μｍ）サイズの穴を有する金属網などを用いることができる。本発明の実施例によれば、前記切片化はタングステンワイヤーを用いて行った。
また、前記切片化された神経前駆体球は、細胞分離用酵素として、トリプシン－ＥＤＴＡ、ディスパーゼ、アクターゼ及びコラゲナーゼなどのように通常の技術分野によく知られた酵素を用いて単一化することができる。本発明の実施例によれば、細胞の単一化はアクターゼを用いて行った。
本発明の実施例によれば、切片化された神経前駆体球は、セルスタート（ＣｅｌｌＳｔａｒｔ）でコートされた直径６０ｍｍ培養皿においてｂＦＧＦとＮ２添加剤が添加された培養培地で１２～２４時間付着培養した後に培地を除去し、アクターゼ３～５ｍｌを入れて３７℃培養器で１～３時間処理して単一細胞化することができる。
神経前駆体球の嚢様構造物は、神経前駆体球に存在する水疱形態の透明嚢を意味し、これらは神経前駆体球から水疱形態の透明嚢として突出したり又は全体的に透明嚢に囲まれた形態で存在してよい。前記神経前駆体球の嚢様構造物は、金属線及びマイクロメートル（μｍ）サイズの穴を有する金属網などを用いて分離することができる。本発明の実施例によれば、前記神経前駆体球の嚢様構造物はタングステンワイヤーを用いて分離した。
前記神経前駆体球の嚢様構造物は切片化されてよい。
神経前駆体球単一細胞及び神経前駆体球の嚢様構造物を単一培地内で共に培養する段階
この段階は、神経前駆体球単一細胞と神経前駆体球の嚢様構造物を単一培地内で共に培養する段階である。
この段階は、神経前駆体球単一細胞と神経前駆体球の嚢様構造物を単一培地内で共に培養する段階である。
本発明の一具現例において、前記培養する段階は、孔隙性構造物で上下離隔した空間のうち、上段部上に神経前駆体球単一細胞を位置させ、下段部上に神経前駆体球の嚢様構造物を位置させて培養する段階である。
本発明の一具現例において、前記孔隙性構造物は多孔性メッシュ（ｍｅｓｈ）である。
本発明の一具現例において、前記神経前駆体球単一細胞は、神経前駆体球の非嚢様構造物から分離されるものである。
本発明の一具現例において、前記神経前駆体球嚢様構造物は、神経前駆体球由来透明嚢から分離されるものである。
前記神経前駆体球の嚢様構造物は切片化して培養できる。前記神経前駆体球の嚢様構造物の切片サイズに制限はない。
前記神経前駆体球の嚢様構造物は、セルスタート（ＣｅｌｌＳｔａｒｔ）がコートされた培養皿に、培養皿当たり１５～２０個の嚢様構造物切片を入れ、Ｎ２、Ｂ２７添加剤が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地で付着培養できるが、これに限定されるものではない。前記神経前駆体球の嚢様構造物は、孔隙性構造物で上下離隔された空間のうち下段部上に位置する。
神経前駆体球単一細胞は、セルスタートがコートされた培養皿に載せ、細胞を０．５×１０５～１．５×１０５個入れた後、神経前駆体球の嚢様構造物と共に１～３週間培養できるが、これに限定されるものではない。前記神経前駆体球単一細胞は、孔隙性構造物で上下離隔された空間のうち上段部上に位置する。
前記各段階で使用されるコーティング物質はセルスタートであるが、これに限定されず、細胞付着のための細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）をさらに含んでよい。これは、未分化幹細胞及び神経細胞は自力で培養皿に付着して成長できず、細胞外基質又は他の支持細胞の助けによって維持培養が可能なためである。
細胞外基質は、セルスタート以外にも、他の物質を単独又は混合して使用可能である。
本発明の一具現例において、前記神経前駆体球は幹細胞から分化されるものである。
本発明の一具現例において、前記幹細胞は全分化能幹細胞である。
本発明の一具現例において、前記幹細胞は、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｉＰＳＣｓ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、核置換胚性幹細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）及び直接分化法（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）によって生成される幹細胞からなる群から選ばれるものである。本発明の実施例によれば、前記幹細胞は胚性幹細胞又は誘導万能幹細胞である。
本発明の一具現例において、前記神経前駆体球は次の段階によって幹細胞から分化されるものである：
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成する段階；
前記胚様体から神経ロゼット（ｎｅｕｒａｌ ｒｏｓｅｔｔｅ）及び神経管様構造（ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ－ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成する段階；及び
前記神経ロゼット及び神経管様構造から神経前駆体球を形成する段階。
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成する段階；
前記胚様体から神経ロゼット（ｎｅｕｒａｌ ｒｏｓｅｔｔｅ）及び神経管様構造（ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ－ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成する段階；及び
前記神経ロゼット及び神経管様構造から神経前駆体球を形成する段階。
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成する段階は４～６日間行われてよいが、これに限定されるものではない。
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成する段階は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６細胞培養培地を用いて行われてよいが、これに限定されるものではない。
本明細書における用語「胚様体」は、胚性幹細胞に代表される全分化能幹細胞の３次元集合体を意味し、全分化能幹細胞は胚様体によって初期胚芽発生段階の分化過程を再現することができ、内胚葉、中胚葉、外胚葉の全ての三胚葉体細胞に分化可能である。
前記胚様体から神経ロゼット（ｎｅｕｒａｌ ｒｏｓｅｔｔｅ）及び神経管様構造を形成する段階は４～６日間行われてよいが、これに限定されるものではない。
前記胚様体から神経ロゼット（ｎｅｕｒａｌ ｒｏｓｅｔｔｅ）及び神経管様構造を形成する段階は、セルスタートがコートされている培養皿を用いて行われてよいが、これに限定されるものではない。
前記胚様体から神経ロゼット（ｎｅｕｒａｌ ｒｏｓｅｔｔｅ）及び神経管様構造を形成する段階は、前記胚様体形成過程で形成された胚様体を、セルスタートがコートされている培養皿において１／２含有量のＮ２添加剤のみが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２最小培養培地で４～６日間培養してなり、その後、１／２ Ｎ２添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２最小培養培地をｂＦＧＦとＮ２が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地に交換して５～１０日間培養して増殖させることによって行われてよいが、これに限定されるものではない。
この段階で使用される培養培地は、ｂＦＧＦとＮ２添加剤が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培養培地であってよいが、神経ロゼットが形成／維持可能な培養液は選択的に制限なく使用可能である。
神経前駆体球から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）に分化させる段階
この段階は、神経前駆体球単一細胞と神経前駆体球の嚢様構造物を単一培地内で共に培養した後、神経前駆体球単一細胞と嚢様構造物が網膜外層細胞に分化される段階である。
この段階は、神経前駆体球単一細胞と神経前駆体球の嚢様構造物を単一培地内で共に培養した後、神経前駆体球単一細胞と嚢様構造物が網膜外層細胞に分化される段階である。
本発明の一具現例において、前記神経前駆体球は、神経前駆体球単一細胞、神経前駆体球の嚢様構造物、又は神経前駆体球単一細胞及び神経前駆体球の嚢様構造物である。
本発明の一具現例において、前記網膜外層細胞は、視覚細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）、網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、又は視覚細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）及び網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）である。
本発明の一具現例において、前記網膜外層細胞は、ロドプシン（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）及びβＩＩＩ－チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）発現が増加するものであるか、ＲＰＥ６５及びベストロフィン（Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）の発現が増加するものである。
本発明の一具現例において、前記網膜外層細胞は、失明を改善又は予防するものである。
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記分化方法で生成された網膜外層細胞を含む網膜疾患予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。
本発明の一具現例において、前記網膜疾患は、網膜未形成、網膜変性（ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、加齢黄斑変性（ａｇｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、糖尿病性網膜疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、網膜色素変性（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）、緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）、視神経病症、外傷、網膜剥離、レーバー先天黒内障及び先天性網膜萎縮症からなる群から選ばれるものである。
前記網膜外層細胞は、前記分化方法に記載された網膜外層細胞と同じ細胞であるので、網膜外層細胞に関する記載は、明細書の過度な複雑性を避けるために省略する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記分化方法で生成された網膜外層細胞を個体に投与する段階を含む網膜疾患治療方法に関する。
前記「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなどの哺乳類を意味する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記分化方法で生成された網膜外層細胞の網膜疾患治療用途に関する。
前記網膜外層細胞は、上述した分化方法に記載された網膜外層細胞と同じ細胞であるので、網膜外層細胞に関する記載は、明細書の過度な複雑性を避けるために省略する。
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
本発明は、神経前駆体球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｅｕｒａｌ ｍａｓｓ，ＳＮＭ）から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）への分化方法及び前記分化方法で生成された網膜外層細胞を含む組成物を提供する。
本発明は、神経前駆体球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｅｕｒａｌ ｍａｓｓ，ＳＮＭ）から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）への分化方法及び前記分化方法で生成された網膜外層細胞を含む組成物を提供する。
本発明の分化方法を用いる場合に、培養培地及び基本培養添加剤以外には他の化学的構成物又は他の支持細胞無しで神経前駆体球のみで効率的に神経前駆細胞を網膜外層細胞に分化させることができ、これを関連研究開発及び製品化に有用に用いることができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
本明細書全体を通じて、特定物質の濃度を示すために使われる「％」は、特記しない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、及び液体／液体は（体積／体積）％である。
ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＥＳＣ）培養
網膜外層細胞分化のための未分化されたｈＥＳＣｓ（ＳＮＵｈＥＳ３２）は、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＧＩＢＣＯ，Ａ２７９４０）コーティング培養皿でＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（ＧＩＢＣＯ，Ａ１５１６９－０１）培養液を用いて培養した。
網膜外層細胞分化のための未分化されたｈＥＳＣｓ（ＳＮＵｈＥＳ３２）は、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＧＩＢＣＯ，Ａ２７９４０）コーティング培養皿でＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（ＧＩＢＣＯ，Ａ１５１６９－０１）培養液を用いて培養した。
この時、未分化幹細胞はコロニー（Ｃｏｌｏｎｙ）形態で培養した。７日間培養を原則とするが、コロニー中央部分が分化に誘導されようとすれば、ガラスピペット先端部分を鉤の形態にしたツールを用いて、２０～３０個程度の格子状に切り、１００個の切片を、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎがコートされた新しい培養皿に移して継代培養し、３日目から７日目まで毎日２４時間経過前に培養液を交換して維持した。
誘導万能幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｉＰＳＣｓ）培養
前記ｈＥＳＣ培養方法と同じ方法により、視覚細胞分化のための未分化されたｉＰＳＣｓ（ｈＦＳｉＰＳ１）を培養した。
前記ｈＥＳＣ培養方法と同じ方法により、視覚細胞分化のための未分化されたｉＰＳＣｓ（ｈＦＳｉＰＳ１）を培養した。
免疫細胞化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）分析
細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液に１０分間固定させた。
細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液に１０分間固定させた。
それぞれの抗体が細胞質内によく透過されるように、０．１％トリプンＸ－１００（ｉｎ ＰＢＳ）溶液で１５分間反応させ、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，ｉｎ ＰＢＳ）溶液で室温で１時間反応させた。
その後、一次抗体と４℃で細胞を結合させた。前記一次抗体が結合した細胞を確認するために、それぞれの一次抗体由来種に合う二次抗体を使用した（下記表１参照）。
最後に、細胞核を確認するために、４‘，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）が含まれたＰＢＳに１０分間反応させて核染色を完了した後、蛍光顕微鏡を用いてイメージを得、重要マーカーを確認及び分析した。
ヒト全分化能幹細胞から網膜外層細胞への分化
全分化能幹細胞株である未分化されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又は誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）を解凍時点から２回継代培養を行って安定化させ、３回目の継代培養後に７日間培養を維持した。
全分化能幹細胞株である未分化されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又は誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）を解凍時点から２回継代培養を行って安定化させ、３回目の継代培養後に７日間培養を維持した。
７日培養されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又は誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）（全分化能幹細胞）の培養液を除去し、ＤＰＢＳ（－）で１回水洗した後、ディスパーゼ１ｍｌを入れ、３７℃培養器で３分間反応させて細胞を分離した。分離された細胞は、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ，ＥＢ）の形成のためにペトリ培養皿にＥＢ培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６、０．５％ペニシリンストレプトマイシン）で５日間培養した。
ＥＢ ５日目に神経性細胞のみ育ち得るようにＥＢをセルスタートコーティング皿に移し、神経選択培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（０．５％ Ｎ２基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、０．５％ペニシリンストレプトマイシン、０．１ｍＭベータ－メルカプトエタノールを含む。）で５日間培養した。さらに、神経ロゼット（Ｎｅｕｒａｌ ｒｏｓｅｔｔｅ）と神経管様構造（Ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の形成及び増殖のために、増殖培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（０．５％ Ｎ２基材、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、０．５％ペニシリンストレプトマイシン、０．１ｍＭ ベータ－メルカプトエタノールを含む。）で４～７日間培養して増殖した。
その後、神経ロゼット（Ｎｅｕｒａｌ ｒｏｓｅｔｔｅ）と神経管様構造（Ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の形成及び増殖のためにＮ２ｂＦ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％ Ｎ２基材、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、１％必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、０．５％ペニシリンストレプトマイシン、０．１ｍＭベータ－メルカプトエタノールを含む。）で１０～１４日間培養した。
培養期間中に神経ロゼット及び神経管様構造が観察されると、ガラスパスツールピペットを細く引き伸ばしたツールを用いて底から離して切断し、その後、ペトリ皿に移してＮ２ｂＦ培地で培養して神経前駆体球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｅｕｒａｌ ｍａｓｓ，ＳＮＭ）として形成させた。
ＳＮＭ継代培養は、直径が５００μｍ程度になると、０．１ｍｍタングステンワイヤを用いて機械的に切断する方法で行ったし、最大１０回まで特性が変わることなく継代可能であった。
網膜外層細胞への分化のための分離培養１日前に、セルスタートコーティング６ウェル培養皿に神経前駆体球由来嚢様構造物を付着培養し、また、セルスタートコーティング細胞培養インサートに神経前駆体球非嚢様構造物から単一化した細胞（神経前駆体球単一細胞）を付着培養した。ＳＮＭ単一細胞化は、切片化したＳＮＭをセルスタートコーティング培養皿に付着培養し、１日後にアクターゼを処理して単一細胞化した。分離培養のための細胞培養にはＮ２Ｂ２７細胞培養培地を用いた。
分離培養は、嚢様構造物切片が培養されている６ウェル培養皿に、単一細胞化した神経前駆体球単一細胞が培養されている細胞培養インサートを入れて行ったし、細胞培養にはＮ２Ｂ２７細胞培養培地を使用し、分離培養３週間に、分化が終了するまで２日に１回ずつ培地を交換した。
図１Ａ及び図１Ｂは、上記の過程を日別に簡単に模式化し及び段階別細胞形態で示す図である。
網膜外層細胞分化最適化
ＳＮＭまで分化が完了した細胞を用いて、網膜外層細胞分化に最適化された培養条件を探すために次のような条件の培養を行った。
ＳＮＭまで分化が完了した細胞を用いて、網膜外層細胞分化に最適化された培養条件を探すために次のような条件の培養を行った。
ａ）ＳＮＭ細胞のみ培養、
ｂ）ＳＮＭ細胞と嚢様切片の混合培養、
ｃ）細胞培養インサートに嚢様切片、６ウェル細胞培養皿にＳＮＭ単一細胞１日培養後に分離培養、
ｄ）細胞培養インサートにＳＮＭ単一細胞、６ウェル細胞培養皿に嚢様切片１日培養後に分離培養、
ｅ）細胞培養インサートの下面にＳＮＭ単一細胞、６ウェル細胞培養皿に嚢様切片１日培養後に分離培養。
ｂ）ＳＮＭ細胞と嚢様切片の混合培養、
ｃ）細胞培養インサートに嚢様切片、６ウェル細胞培養皿にＳＮＭ単一細胞１日培養後に分離培養、
ｄ）細胞培養インサートにＳＮＭ単一細胞、６ウェル細胞培養皿に嚢様切片１日培養後に分離培養、
ｅ）細胞培養インサートの下面にＳＮＭ単一細胞、６ウェル細胞培養皿に嚢様切片１日培養後に分離培養。
上記の条件は、セルスタートコートされた培養皿で行われたし、細胞培養培地は、Ｎ２Ｂ２７培地を用いて培養した。
逆転写重合酵素増幅反応（ＲＴ－ＰＣＲ）
分離培養時間によって網膜外層細胞への分化有無を確認するために、網膜外層細胞のうち視覚細胞で発現するマーカーであるロドプシンの転写レベルにおける発現に対するＲＴ－ＰＣＲ分析を次のように行った。
分離培養時間によって網膜外層細胞への分化有無を確認するために、網膜外層細胞のうち視覚細胞で発現するマーカーであるロドプシンの転写レベルにおける発現に対するＲＴ－ＰＣＲ分析を次のように行った。
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＳＮＭから分化された視覚細胞のＲＮＡを得たし、ＡＭＶ ＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いるメーカーの指示方法（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ；Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｔａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）によってｏｌｉｇｏ－ｄＴをプライマーとして用いてｃＤＮＡ合成を行った。
ＰＣＲ増幅は、Ｔａｑポリメラーゼ（ＨｉＰｉ Ｐｌｕｓ ５ｘ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ；Ｅｌｐｉｓ ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｔａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を用いて行ったし、標準方式を用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性後に９４℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・１０秒を３０回反復した。他のｍＲＮＡとの相対的な発現を分析するためにＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）ｍＲＮＡの信号に基づいてｃＤＮＡの量を標準化した。
様々な条件のアニーリング温度とサイクル回数を反復実験した結果、比例的に増幅される区間がそれぞれのプライマー対に対して決定され、ＰＣＲ条件は最適化された。
遺伝子発現分析に用いらたプライマーの配列を、下記表２に示す。
光伝達経路代謝物質濃度測定法
ｃＧＭＰ酵素免疫測定キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、分離培養７日目の網膜外層細胞から光伝達経路代謝物質濃度を測定するために、メーカーのプロトコルにしたがって使用した。ホスホディエステラーゼ抑制剤（ＩＢＭＸ，５０ｍＭ）はｃＧＭＰ測定４８時間前に処理した。
ｃＧＭＰ酵素免疫測定キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、分離培養７日目の網膜外層細胞から光伝達経路代謝物質濃度を測定するために、メーカーのプロトコルにしたがって使用した。ホスホディエステラーゼ抑制剤（ＩＢＭＸ，５０ｍＭ）はｃＧＭＰ測定４８時間前に処理した。
網膜退化齧歯類モデルでのＳＮＭ由来網膜外層細胞移植
６週齢のＳＤラットに滅菌された１％ ＮａＩＯ３サリン溶液を１回静脈注射した（７０ｍｇ／ｋｇ）。静脈注射４日後に動物は、チレタミン／ゾラゼパム（ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ／ｚｏｌａｚｅｐａｍ）（Ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標））とキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）の筋肉注射で麻酔処理した。
６週齢のＳＤラットに滅菌された１％ ＮａＩＯ３サリン溶液を１回静脈注射した（７０ｍｇ／ｋｇ）。静脈注射４日後に動物は、チレタミン／ゾラゼパム（ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ／ｚｏｌａｚｅｐａｍ）（Ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標））とキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）の筋肉注射で麻酔処理した。
瞳孔は、トロピカミド（ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ）０．５％とフェニレフリン（ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ）ＨＣｌ ２．５％目薬（Ｍｙｄｒｉｎ－Ｐ（登録商標））によって拡張され、ｐｒｏｐａｒａｃｉｎｅ ＨＣｌ ０．５％（Ａｌｃａｉｎｅ（登録商標））局部目薬痲酔剤を処理した。
移植前に、ＳＮＭ由来網膜外層細胞は、ＤＡＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）と共に３０分間培養された。培地でＤＡＰＩを除去するために数回洗浄過程を行ったし、３７℃、０．０５％トリプシン／０．１％ ＥＤＴＡ下で５分間培養することによって分離した。
手術顕微鏡を用いて視覚化し分離されたそれぞれの網膜外層細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／２μｌ）を、ハミルトン注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｓｙｒｉｎｇｅ）に付いた２６ゲージの針を用いて網膜下空間又は硝子体腔に注入した。
サイクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ）（２１０ｍｇ／ｌ，Ｃｉｐｏｌ－Ｎ（登録商標），Ｃｈｏｎｇ Ｋｕｎ Ｄａｎｇ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）は、移植１日前に、脱核過程前まで飲料水に投与した。移植１週後に、眼球を脱核化し、包埋化合物（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＦＳＣ ２２（登録商標），Ｌｅｉｃａ ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＩＬ）を用いて急速凍結処理した。
冷却片をＰＢＳで洗浄し、０．１％トリプンＸ１００を含むＰＢＳ溶液の３％ウシ血清アルブミン溶液でブロッキングした。ブロッキング後には１次抗体と共に１日間反応したし、免疫組織化学的検査のために、抗体はＡｎｔｉ－ｂШ－ｔｕｂ抗体及び混合ヒト抗体、ＲＰＥ６５及びＺＯ－１抗体を使用した。
網膜電位図は、細胞移植後４、１２、２４週目にｂ波（ｂ－ｗａｖｅ）を測定した。
結果
ヒト全分化能幹細胞から網膜外層細胞分化
図１Ａ及び図１Ｂには、本発明の一連の過程を模式化し、段階別細胞形態を示す。
ヒト全分化能幹細胞から網膜外層細胞分化
図１Ａ及び図１Ｂには、本発明の一連の過程を模式化し、段階別細胞形態を示す。
全分化能幹細胞（胚性幹細胞及び誘導万能幹細胞を含む。）を網膜外層細胞に分化させるためには神経系細胞に分化を誘導しなければならない。初期から培養構造及び細胞培養培地を用いて神経前駆細胞選別培養、増殖培養、神経特異的構造物誘導、神経前駆体球形成段階を経て神経前駆細胞への効率的な分化を誘導したし、神経前駆体球は、別の分化信号を与えないと、初期や反復的な継代後にも神経前駆細胞の性質を維持することが分かった（図２）。
最終的には、神経前駆体球の２タイプの構造物のみを分離培養し、本発明の目的である視覚細胞と網膜上皮細胞が効率的に分化されることを確認した。
本発明は、全分化能幹細胞を用いた視覚細胞及び網膜上皮細胞分化に外部の細胞伝達信号活性剤及び抑制剤のような培地補充物無しに培養方法によっても分化効率を画期的に増加させることができることを確認した。
網膜外層細胞分化最適化
上記の「網膜外層細胞分化最適化」の欄における分化条件ａ）の場合には、視覚細胞のマーカーであるロドプシンの発現がほとんど見られず（図３Ａ）、ｂ）培養条件の場合には、嚢様構造物由来細胞のみが生き残り、神経前駆体球単一細胞はほとんど生き残らない現象を確認した（図３Ｂ）。ｃ）培養条件は、神経前駆体球単一細胞においてロドプシンの発現が見られたが（図３Ｃ）、ｄ）培養条件に比べては低い傾向を示したし、ｄ）培養条件でロドプシンの発現が最も高いことを確認した（図３Ｄ）。ｅ）培養条件は、神経前駆体球単一細胞でロドプシンの発現がｄ）培養条件と類似の傾向を示したが（図３Ｅ）、細胞培養インサートの下面に神経前駆体球単一細胞を付着させたため、嚢様構造物由来の混合を完全に排除することはできず、それぞれの回収が容易でないため、ｄ）培養条件が網膜外層細胞（視覚細胞）分化に最適であることが分かった。
上記の「網膜外層細胞分化最適化」の欄における分化条件ａ）の場合には、視覚細胞のマーカーであるロドプシンの発現がほとんど見られず（図３Ａ）、ｂ）培養条件の場合には、嚢様構造物由来細胞のみが生き残り、神経前駆体球単一細胞はほとんど生き残らない現象を確認した（図３Ｂ）。ｃ）培養条件は、神経前駆体球単一細胞においてロドプシンの発現が見られたが（図３Ｃ）、ｄ）培養条件に比べては低い傾向を示したし、ｄ）培養条件でロドプシンの発現が最も高いことを確認した（図３Ｄ）。ｅ）培養条件は、神経前駆体球単一細胞でロドプシンの発現がｄ）培養条件と類似の傾向を示したが（図３Ｅ）、細胞培養インサートの下面に神経前駆体球単一細胞を付着させたため、嚢様構造物由来の混合を完全に排除することはできず、それぞれの回収が容易でないため、ｄ）培養条件が網膜外層細胞（視覚細胞）分化に最適であることが分かった。
全分化能幹細胞由来網膜外層細胞の機能的な特性分析
成熟した視覚細胞の細胞性機能と関連した特定分子マーカーの免疫細胞化学法を用いて確認した。図４Ａ及び図４Ｂから確認できるように、胚性幹細胞又は誘導万能幹細胞から分化が完了した細胞は、ｂｌｕｅｏｐｓｉｎ、ｒｅｄｏｐｓｉｎ、ＰＤＥ６ｂ、ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ、ｒｈｏｄｏｐｓｉｎを発現し、神経細胞のマーカーであるβＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎも共に発現することを確認した。
成熟した視覚細胞の細胞性機能と関連した特定分子マーカーの免疫細胞化学法を用いて確認した。図４Ａ及び図４Ｂから確認できるように、胚性幹細胞又は誘導万能幹細胞から分化が完了した細胞は、ｂｌｕｅｏｐｓｉｎ、ｒｅｄｏｐｓｉｎ、ＰＤＥ６ｂ、ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ、ｒｈｏｄｏｐｓｉｎを発現し、神経細胞のマーカーであるβＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎも共に発現することを確認した。
視覚細胞の機能評価をｉｎ ｖｉｔｒｏで行い得る方法は、光伝達経路代謝物質濃度が、明所及び暗所での差を測定することによって分かる。機能する光伝達経路がある場合に、ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰの濃度に差が出るが、分化された視覚細胞を明所と暗所で同一期間培養したとき、暗所に比べて明所で培養した細胞のｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰの濃度が減少したし、ホスホディエステラーゼ抑制剤（ＩＢＭＸ）を処理した時にも同じ様相を確認した。これは、本発明によって分化された視覚細胞が光伝達経路を内在するということであり、よって、視覚細胞に分化されたことを意味する（図４Ｃ）。
分離培養期間中に視覚細胞の特異タンパク質であるロドプシンの発現をＲＴ－ＰＣＲで確認した結果、分離培養７日目にロドプシンのｍＲＮＡ発現が最も高いことが確認された。このような結果は、分離培養７日目に視覚細胞の分化が既に高いレベルで起きることを示し、２１日目には神経前駆細胞マーカーであるネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）がほとんど発現していない点から、大部分の細胞が分化完了したことが確認される（図４Ｄ）。
網膜色素上皮細胞の分化有無を特定分子マーカーの免疫細胞化学法を用いて確認した。図４Ｅ及び図４Ｆから確認できるように、胚性幹細胞又は誘導万能幹細胞から分化完了した網膜色素上皮細胞がＺＯ－１、ＲＰＥ６５、ベストロフィン（Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）を発現させることを確認した。
網膜退化齧歯類モデルでのＳＮＭ由来網膜外層細胞移植による効能
本発明に基づいて分化された視覚細胞及び網膜色素上皮細胞を、網膜退化ラットに移植し、１２週後に生着能を確認した結果、ＤＡＰＩと共にヒト抗体及び神経細胞マーカーであるβＩＩＩ－チューブリンが発現することを確認した。また、網膜上皮細胞マーカーであるＲＰＥ６５とベストロフィンが上皮細胞マーカーであるＺＯ－１と共に発現することを確認した（図５Ａ）。なお、移植した細胞はいずれも網膜外層から観察されたため、移植細胞が高い生着能を有することが分かった。
本発明に基づいて分化された視覚細胞及び網膜色素上皮細胞を、網膜退化ラットに移植し、１２週後に生着能を確認した結果、ＤＡＰＩと共にヒト抗体及び神経細胞マーカーであるβＩＩＩ－チューブリンが発現することを確認した。また、網膜上皮細胞マーカーであるＲＰＥ６５とベストロフィンが上皮細胞マーカーであるＺＯ－１と共に発現することを確認した（図５Ａ）。なお、移植した細胞はいずれも網膜外層から観察されたため、移植細胞が高い生着能を有することが分かった。
網膜電位図測定結果は、いかなる移植群からもｂ波振幅（ｂ－ｗａｖｅ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）が維持されることを確認したし（図５Ｂ）、移植後、時間の経過につれて視機能が若干の減少を示すが、対照群に比べて有意に増加していることを確認した。なお、視覚細胞の移植はＲＰＥ移植に比べて高い視機能改善を示した（図５Ｃ）。
本発明は、神経前駆体球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｅｕｒａｌ ｍａｓｓ，ＳＮＭ）から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）への分化及び生成方法に関する。
Claims (12)
- 次の段階を含む神経前駆体球（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｎｅｕｒａｌ ｍａｓｓ，ＳＮＭ）から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）への分化方法：
神経前駆体球単一細胞及び神経前駆体球の嚢様構造物を単一培地内で共に培養する段階；及び
神経前駆体球から網膜外層細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｏｕｔｅｒ ｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ）に分化させる段階。 - 前記培養する段階は、孔隙性構造物で上下離隔された空間のうち、上段部上に神経前駆体球単一細胞を位置させ、下段部上に神経前駆体球の嚢様構造物を位置させて培養する段階である、請求項１に記載の方法。
- 前記孔隙性構造物は多孔性メッシュ（ｍｅｓｈ）である、請求項２に記載の方法。
- 前記神経前駆体球単一細胞は、神経前駆体球由来非嚢様構造物から分離される、請求項１に記載の方法。
- 前記神経前駆体球嚢様構造物は、神経前駆体球由来透明嚢から分離される、請求項１に記載の方法。
- 前記神経前駆体球は、幹細胞から分化される、請求項１に記載の方法。
- 前記幹細胞は、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＥＳＣｓ）、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｉＰＳＣｓ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、核置換胚性幹細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）及び直接分化法（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）によって生成される幹細胞からなる群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
- 前記神経前駆体球は、次の段階によって幹細胞から分化される、請求項１に記載の方法：
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）から胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成する段階；
前記胚様体から神経ロゼット（ｎｅｕｒａｌ ｒｏｓｅｔｔｅ）及び神経管様構造（ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ－ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成する段階；及び
前記神経ロゼット及び神経管様構造から神経前駆体球を形成する段階。 - 前記網膜外層細胞は、ロドプシン（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）及びβＩＩＩ－チューブリンの発現が増加するか、又はＲＰＥ６５及びベストロフィン（Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）の発現が増加する、請求項１に記載の方法。
- 前記網膜外層細胞は、視覚細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ）、網膜色素上皮細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃｅｌｌ）、又は視覚細胞及び網膜色素上皮細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記網膜外層細胞は、失明を改善又は予防する、請求項１に記載の方法。
- 請求項１による分化方法で生成された網膜外層細胞を含む網膜疾患予防又は治療用薬剤学的組成物。
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