KR102058259B1

KR102058259B1 - 인슐린 의존성 당뇨병의 치료에 유용한 줄기 세포 및 췌장 세포

Info

Publication number: KR102058259B1
Application number: KR1020157000845A
Authority: KR
Inventors: 윌리엄 엘. 러스트
Original assignee: 세라시스, 인코포레이티드
Priority date: 2012-06-26
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2019-12-23
Also published as: IL266965A; WO2014004341A1; JP2018193394A; CA2876677A1; CN113265370A; SG11201408717XA; US9968639B2; US20130344594A1; EP2864473A1; IN2015DN00281A; PT2864473T; CN104640979A; ES2745704T3; DK2864473T3; KR102174581B1; US9474772B2; US20150231181A1; KR20150036059A; EA201992135A1; JP6856586B2

Abstract

신선한 인간 췌장 조직을, 인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 사용될 수 있는 대용 췌장 세포에 대한 공급원이 될 소지가 있는 비-줄기세포 집단의 동정 및 선택을 위한 세포의 공급원으로서 사용할 수 있다. 이들 대용 췌장 세포의 선조들은 그들의 게놈내로 통합되는 재프로그램화 유전자를 갖지 않고, 오직 한정된 시약만을 사용하는 프로토콜에 따라 췌장 계통으로 분화하며, 실질적으로 중배엽 계통으로 분화할 수 없다.

Description

인슐린 의존성 당뇨병의 치료에 유용한 줄기 세포 및 췌장 세포{STEM CELLS AND PANCREATIC CELLS USEFUL FOR THE TREATMENT OF INSULIN-DEPENDENT DIABETES MELLITUS}

관련 특허 출원의 상호 참조

본 출원은 2012년 6월 26일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/664,259 호(이의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)로부터 우선권을 주장한다.

A. 췌장 내분비세포에 대한 미충족 요구

인슐린 의존성 당뇨병은 췌장의 인슐린 생산 세포의 상실을 특징으로 하는 질병이다. 상기 인슐린 생산 세포(또한 "베타" 세포라 칭한다)는 통상적으로 "랑게르한스섬"이라 칭하는 작은 구형 구조로 존재하며, 췌장 전체에 산재되어 있다. 작용성 베타세포를 함유하는 대체 랑게르한스섬의 이식물이 인슐린 의존성 당뇨병을 치유할 수 있음이 인간 및 동물에서 입증되었다. 이 과정에서, 한 명 이상의 사망한 장기 기증자의 췌장으로부터 섬을 정제하여 신체의 다양한 부위들 중 한 곳에 주사한다. 일부의 섬이 상기 과정에서 생존하고, 상기 섬이 인슐린을 만들어 분비한 신체 중에 잔류하게 된다. 이는 상기 이식된 섬의 수명이 끝날 때까지 수년간 상기 환자를 치유하기에 충분할 수 있다. 문헌[Shapiro(2011)] 및 [Robertson(2010)]을 참조하시오.

상기 과정은 당뇨병을 유효하게 치료하지만, 소수의 당뇨병 환자보다 많은 환자를 치료하기에는 기증 췌장이 불충분하다. 이러한 이유로, 베타 세포 또는 췌장섬의 대체 공급원이 필요하다.

B. 췌장세포의 대체 공급원

많은 주목을 끌어온 대체 췌장 세포의 유망한 공급원은 만능줄기세포이다. 만능줄기세포를 배로부터 수확하거나, 또는 완전히 분화된 체세포를 배상태로 향하게 함으로써; 즉 성체 세포를 배로부터 수확된 세포를 닮게 "재프로그램화"함으로써 인공적으로 생성시킬 수 있다. 수확에 의해서든 또는 재프로그램화에 의해서든, 모든 만능줄기세포는 3 개의 특징을 공유한다:

·줄기세포 유전자의 발현: 상기 세포는 초기 포유동물 배에서 전형적으로 발현되는 유전자를 발현한다.

·불멸성: 상기 세포는 이론상 무제한량으로 배양물에서 확대될 수 있다.

·포유동물 신체의 모든 계통으로의 성숙: 모든 성체 기관은 초기 배의 3 개의 조직 계통 중 하나로부터 유래한다. 이들 계통은 췌장 및 다른 장 기관이 형성되는 내배엽, 근육 및 골격이 형성되는 중배엽, 및 뇌 및 피부가 형성되는 외배엽이다.

문헌[Yamanaka (2012)], [Plath (2011)], [Lai (2011)], 및 [Stover (2011)]을 참조하시오.

만능줄기세포를 조작하여 췌장세포를 형성시키기 위한 프로토콜들이 고안되었다. 이들 프로토콜 중 일부는 만능줄기세포의 분화를 랑게르한스섬의 태아 선조세포의 형태를 닮은 형태로 구동할 수 있다. 문헌[Kroon (2008)], 및 [Rezania (2011)]을 참조하시오. 그러나, 어느 것도 상기 언급한 방식으로 치료학적으로 사용될 수 있는 작용성의 인슐린 생산 세포로 더 성숙될 수 있는 췌장 세포를 제공하지 않는다.

췌장 선조세포를 수득하기 위한 통상적인 프로토콜들은 다수의 결점 및 단점들을 갖지만, 이 중 핵심은 하기와 같다:

·췌장 선조세포의 집단은 불순물이며, 비-췌장 세포에 의해 오염된다. 만능줄기세포는 3 개의 배엽들을 모두 형성시킬 소지가 있다. 따라서, 가장 효율적인 프로토콜조차 비-췌장 세포와 섞인 췌장 세포 집단을 생성시킨다.

·췌장 선조세포의 집단은 미성숙 세포에 의해 오염된다. 상기 세포는 불멸의 성질을 유지하며 환자에게 이식후 종양을 개시시킬 수 있다.

·상기 췌장 선조세포는 충분히 작용성인 인슐린 생산 베타세포로 성숙하지 못한다.

·상기 세포의 배양 프로토콜은, 규제 당국이 인간 사용에 대해 일반적으로 승인하지 않는 시약 및 과정들을 사용한다.

문헌[Matveyenko (2010)], [Tahamtani (2013)]을 참조하시오. 또한 문헌[Title 21, U.S. Code of Federal Regulations, part 1271]을 참조하시오.

C. 성체 췌장의 세포 이질성

섬은 배발생 동안 발생하는 췌장관으로부터 갈라져 나오는 선조세포로부터 기원한다. 건강한 개인의 삶 동안, 베타 세포는 오로지 기존 베타세포의 복제를 통해서만 생산된다. 문헌[Dor(2004)]을 참조하시오. 상기 베타세포 복제 과정은 체중 증가, 임신, 및 췌장 손상에 이은 회복 기간 동안 보다 신속하게 발생한다. 지금까지 단리된 베타 세포는 그의 성숙한 성질의 상실 없이는 배양물에서 복제되지 않았다. 문헌[Pagluca(2013)]을 참조하시오.

췌장 줄기세포 또는 선조세포는 계통 추적 실험을 통해 성숙한 조직에서 동정되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 다수의 발행물들이 일부 줄기세포 특징을 나타낸다고 하는, 포유동물 췌장으로부터 단리된 세포를 개시하였다. 이들 세포는 도관 조직, 외분비 조직, 및 상기 섬 자체에서 동정되었다. 예를 들어 문헌[Gong (2012)], [Noguchi (2010)], 및 [Ciba (2009)]을 참조하시오. 이들 세포는 제한된 복제 능력을 갖고 인슐린을 발현하도록 유도되는 것으로 개시되어 있다.

또한, 다수의 공개된 특허 문헌들은 성숙한 췌장으로부터 직접 수확된다고 하는 성체 줄기세포를 개시한다. 미국 특허 제 6436704 호, 제 6815203 호, 제 7544510 호, 제 8110399 호 및 제 8377689 호, 및 또한 공개된 미국 출원 제 2004/0115805 호를 참조하시오.

이들 세포 집단은 환자를 치료하기 위해 필요한 규모로 제조되지 않았으며, 어느 것도 글루코스에 반응하여 적합하게 인슐린을 분비하는 것으로 입증되지 않았다. 이러한 이유로 인해, 이들 세포 집단은 임상적 이점을 나타내지 못했다.

예를 들어, 미국 특허 제 8377689 호는 배양물에서 복제되고 인슐린을 발현하도록 유도된다고 하는 췌장 세포에 대해 말하고 있다. 그러나, 개시된 바와 같이, 이들 세포는 제한된 복제 능력을 가졌으며 충분히 작용성인 베타 세포로 성숙하지 못하거나, 또는 적어도 설치류 모델에서 당뇨병을 역전시킬 수 없었다. 즉, 상기 실제로 획득된 결과는 "당뇨병 마우스" 모델에서, "5 주 이내에 ...고혈당증(>400 ㎎/㎗)으로부터 거의 정상(<300 ㎎/㎗)으로의 회복"을 보이는 반면, 이식되지 않은 당뇨병 마우스는 연구 기간 전체를 통해 고혈당성이었다"라고 한다. 컬럼 45, 라인 18 이하 참조(강조됨). 그러나, 당뇨병 마우스 모델에서, "정상"은 약 150 ㎎/㎗이지만, 보고된 바와 같이, 250 ㎎/㎗ 이상의 지속적인 판독을 안정한 당뇨 상태의 증거로 간주하고 있다. 예를 들어 문헌[Dang(2013)]을 참조하시오.

따라서, 대용 베타 세포 또는 랑게르한스섬의 이식에 의한 당뇨병의 치유를 위한 전략의 가능성은 약제-등급의 치료학적 췌장 세포의 확대 가능한 공급원의 요구를 충분히 실현시키지 못하고 사라졌다.

상기 연구의 본체는 포유동물 췌장으로부터 줄기세포의 단리에 관한 것이므로, 본 명세서에 개시된 발명과 다르다. 이 발명은 줄기세포 특징을 채용하기 위해 배양물 중에서 조작되는 췌장 또는 다른 공급원으로부터의 충분히 성숙한, 비-줄기세포의 단리에 관한 것이다. 이 방법은 치료학적으로 유용한 줄기세포가 되도록 조작될 수 있는 아집단을 동정하기 위해서 인간 기관내 성숙한 세포의 유전적 다양성을 이용함에 의존한다. 성숙한 인간 조직 중에 존재하는 세포의 유전적 다양성은 단지 최근에 인식되었으며, 성숙한 췌장내 세포 이질성에 관한 통상적인 이해는 불완전하다.

나타낸 바와 같이, 췌장 세포를 생성시키기 위한 현행 기법들은 유효한 대용 췌장 세포, 즉 포유동물 체내의 한 부위에 이식되고 여기에서 거주하여 고유 췌장 세포의 기능을 수행하는 세포를 제공하지 않는다. 본 발명은 약제 등급, 즉 미국 식품의약품 안전청(FDA) 및/또는 다른 상기와 같은 규제 당국이 인간 사용에 허용 가능한 것으로 간주하는 대용 췌장 세포 및 세포-함유 조성물을 제공함으로써 상기 결점 및 다른 단점들을 극복한다. 예를 들어 문헌[Title 21, U.S. Code of Federal Regulations, part 1271](이의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용됨)을 참조하시오.

인간 세포요법에 관하여 일반적으로, 세계의 규제 당국의 허용성 기준은 사용되는 세포의 안전성 및 유효성을 강조한다. 이와 관련하여 중심적인 안전성 우려는 (i) 세포가 종양을 형성하는 성향 및 (ii) 세포가 접촉할 수도 있는 동물-유래된 시약으로부터의 독성, 면역원성 또는 감염성 입자의 전이 위험성이다. 유효성 기준은 세포 집단이 주어진 세포 기능에 효능이 있고 유효 치료 기간에 걸쳐 안정성임을 포함한다.

따라서, 본 발명의 대용 췌장 세포-함유 조성물은 (1) 효능을 감소시키거나 불필요한 기능을 수행하는 비-치료 세포를 함유하지 않고, (2) 그의 구성 치료 세포가 국제적으로 승인된 표준에 따라, 한정된, 비-동물-기원 성분을 사용하여 배양되며, (3) 유전자 변형되지 않거나, 형질전환되지 않거나, 비정상 핵형이 아니거나, 또는 달리 불안정성 또는 종양발생성의 허용될 수 없게 높은 위험을 특징으로 하지 않는다.

따라서, 본 발명의 하나의 태양에 따라, 대용 췌장 세포의 비-만능 선조세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 선조세포는 (i) 그의 게놈내로 통합된 재프로그램화 유전자를 갖지 않고, (ii) 오직 한정된 시약만을 사용하는 프로토콜에 따라 췌장 계통으로 분화되며, (iii) 중배엽 계통으로 실질적으로 분화될 수 없다.

또한, 본 발명의 또 다른 태양에 따라, 인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 적합한 대용 췌장 세포의 상기와 같은 비-만능 선조세포를 포함하는 조성물을 생성시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은

a. 최소의, 한정된 배양 조건에서 생육성 인간 췌장 조직으로부터 인간 세포를 수확하는 단계;

b. 약 9일 미만의 기간 동안 1차 인간 세포를 배양하는 단계; 이어서

c. 게놈 수준으로 통합된 재프로그램화 유전자를 갖지 않고 줄기세포 형태를 갖는 재프로그램화된 세포가 수득되도록 재프로그램화 유전자를 사용하여 (b)로부터의 1차 인간 세포를 재프로그램화하는 단계;

d. 먼저 (c)에서 수득된 재프로그램화된 세포들 중에서, 최소의, 한정된 배양 조건에서 상기 줄기세포 형태의 상실없이 증식하는 능력으로 선택하여, 증식하는 재프로그램화된 세포를 수득하는 단계; 이어서

e. 둘째로, 상기 증식하는 재프로그램화된 세포들 중에서, (i) 오직 한정된 시약만을 사용하는 프로토콜의 과정 동안 생존하여 췌장 계통으로 분화하는 능력, 및 (ii) 실질적으로 중배엽 계통으로 분화할 수 없음을 특징으로 하는 세포 집단을 선택하여,

상기 언급한 비-만능 선조세포를 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 태양은 인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 적합한 대용 췌장 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 이때 (A) 상기 대용 췌장 세포는 상술한 비-만능 선조세포로부터 유래되고, (B) 상기 조성물을 포함하는 세포 중 약 90% 이상이 마커 Pdx1, Nkx6.1, 및 NeuroD1을 발현한다. 본 발명은 또한 상기와 같은 대용 췌장 세포의 생성 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은

a. 내배엽 계통으로의 분화를 구동하는 성분들의 제1 조합에 상기 비-만능 선조세포를 노출시켜 내배엽 세포를 수득하는 단계 (상기 제1 조합은 혈청 및 임의의 wnt 과 구성원을 배제함); 이어서

b. 상기 내배엽 세포를, 췌장 내분비 계통으로의 분화를 구동하는 성분들의 조합에 노출시켜,

관심 대용 췌장 세포를 수득하는 단계를 포함한다.

도 1은 인간의 기관으로부터 세포를 수확함을 묘사한다. 즉, 생육성 인간 췌장을 단편(A)로 다지고, 이어서 세정하고 원뿔 튜브(B)에서 침전시킨다. 부착 세포(C)를 72 시간 배양후에 수득한다. 상기 제공된 한정된 배양 조건에서, 상기 세포 배양물들은 각각 세포들의 혼합된 집단을 포함하였으며, 이들 세포는 상피 및 섬유아세포 형태를 나타낸다. 줄기세포 또는 중간엽 세포 형태의 증거는 없었다.
도 2는 재프로그램화 에피솜유사 플라스미드상의 유전자 기구를 도식적으로 예시한다. 약어 -- CMV: 거대세포바이러스 프로모터, 2A: 자기절단 펩티드 서열, WPRE: 우드척 간염 바이러스 전사후 반응 요소, SV40 Poly A: 폴리아데닐화 신호, OriP: 복제 기원, EBNA1: 엡스타인 바 핵 항원 1, p53shRNA: p53을 표적화하는 작은 헤어핀 RNA.
도 3은 재프로그램화된 세포의 현미경사진을 나타낸다. 위상 콘트라스트 상은 상기 세포가 재프로그램화후 20일까지 줄기세포 형태를 나타내었음을 보인다.
도 4는 줄기세포 형태를 나타내어 선택된 세포 콜로니 배양물에서의 증식을 예시하는 막대 그래프이다. 도 3에 도시된 줄기세포를 닮은 세포의 10 개의 콜로니를 개별적인 배양 용기로 손으로 옮겼다. 생육면이 줄기세포의 세포밀집층에 의해 덮이게 되었을 때, 상기 세포를 새로운 배양 용기로 계대배양하였다. 상기 이동된 세포의 증식을 3 회 연속 계대배양의 시작 및 끝에서 존재하는 세포의 수를 카운트함으로써 시간에 걸쳐 추적하였다. 세포수를, 혈구계수기를 사용하여 수동으로 카운트하고, 각 클론에 대한 배가 시간을 계산하였다. 상기 10 개의 선택된 클론 중 6 개가 최소 한정 배지에서 증식할 수 있는 것으로 나타났다.
도 5는 최소 한정 배지에서 증식된 상기 언급된 6 개의 클론에 적용된 선택 결과를 묘사하는 현미경사진 A 내지 D를 나타낸다. 상기 6 개의 클론 중 2 개는, 최소의, 한정된 시약을 사용하는 분화 과정에서 생존하였다. 클론 9의 세포 중 단지 일부(<50%)만이 상기 분화에서 생존하였으며, 달리 빈 조직 배양 디쉬(A,C) 중에는 작은 세포 부유물들이 생성되었다. 면역세포형광은 Pdx1이 상기 세포 중 일부의 핵(A)에서 발현되었지만, 다른 경우에서는 세포질(C)에서 나타났음을 밝혀냈다. Nkx6.1은 마찬가지로 핵(C)에서 발현되는 것으로 나타났다. 클론 10의 세포 중 적어도 80%가 상기 분화 과정에서 생존하였으며, 상기 배양 디쉬에서 세포의 세포밀집 단층(B,D)이 생성되었다. Pdx1(B,D) 및 Nkx6.1(D)은 상기 세포의 >90%의 핵에서 발현되었다. 따라서, 오직 클론 9 및 10만이 상기 분화 과정에서 생존하였다. 클론 9는 불충분하게 생존하였으며, 상기 세포는 췌장 유전자를 적합하게 발현하지 못했다. 이 클론은 거부되었다. 클론 10의 세포 중 80%를 초과하는 세포가 상기 분화 과정에서 생존하였으며, 상기 세포 중 90%를 초과하는 세포가 췌장 유전자를 적합하게 발현하였다. 이 클론이 선택되었다.
도 6은 유전자 발현의 RT-qPCR 분석으로부터의 결과를 묘사하는 막대 그래프를 포함한다. 클론 5 내지 9로부터의 배상체는 분화 3일 및 10일째의 내배엽, 중배엽 및 외배엽을 나타내는 유전자를 발현하였다. 그러나, 클론 10은 중배엽을 나타내는 유전자를 발현하지 않았다. 분화와 동시에, 모든 배상체들은 3일 및 10일째에 다능성-관련 유전자의 발현을 하향 조절하였다. 결과를 베타-액틴에 대해 표준화하고 0일째 배양물(분화되지 않은)에 비교하여 나타낸다. 오차 막대는 3 회 중복시행의 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 클론 10이 중배엽 계통을 향해 분화할 수 없음을 입증하는 실험 결과를 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. 클론 5 및 10은 만능줄기세포로부터 고도로 순수한 심근세포 집단을 생성시키는 프로토콜에 따라, 중배엽 심근세포 계통을 향한 분화가 지시되었다. 문헌[Xu(2009)]을 참조하시오. 15일째에, 심장 특이성 성장 인자(Gata4, Nkx2.5) 및 구조 단백질(알파 MHC)의 유전자 발현을 RT-qPCR에 의해 정량분석하였다. 클론 5는 심장 유전자의 발현을 상향조절한 반면, 클론 10은 심장 유전자 발현 수준을 미분화된 세포와 유사하게 유지시켰다. 결과를 도 6에서와 같이 나타낸다(상기 관련 해설 참조).

A. 약제 등급 대용 췌장 세포를 공급하기 위한 진보적인 접근법

성체 췌장 내에 존재하는 다양한 세포 중에서, 상술한 바와 같이 치료 세포의 유도를 활용할 수 있는 세포의 아집단을 발견하였다. 이들 세포는 췌장 줄기세포 또는 선조세포가 아니라, 오히려 하기에 상세히 개시하는 조작을 용이하게 하는 특정한 유전학적 특성을 갖는 다양한 유전자 조성물의 성숙한 세포 집단의 구성원들이다. 따라서, 본 발명의 핵심 태양은 본 발명자에 의해 동정된 아집단을 포함하여, 다양한 집단을 유지하도록 성체 기관으로부터 세포를 수확하는 것이다. 하기 실시예 1을 참조하시오.

본 발명의 또 다른 중요한 태양은 상기 언급한 다양한 집단의 줄기세포 상태로의 재프로그램화이며, 상기 집단의 각 세포를 분석 및 선택을 위해 확대시킬 수 있다(실시예 2 및 3을 참조하시오). 상기 재프로그램화는 상기 세포의 게놈내로 임의의 재프로그램화 유전자가 통합되지 않게 하거나 또는 인간 치료용도를 위한 상기 세포의 규제 승인을 달리 제한하는 방식으로 수행되어야 한다.

본 발명의 추가의 중요한 태양은 상기 재프로그램화된 세포의 집단 중에서, 약제 등급 대용 췌장 세포에 대한 공급원이 되는 독특한 성질(본 발명자에 의해 최초로 밝혀진)을 갖는 줄기세포를 선택하는 것이다. 상기 선택 기준은 통상적인 방법학의 목표인 다능성에 대한 기준과 상이하다. 결과적으로, 만능은 아니나 개선된 임상적 유용성을 갖는, 본 발명에 따른 세포가 수득된다(실시예 4를 참조하시오).

만능줄기세포를 유도하는 재프로그램화 유전자의 사용은, 상기 다능성의 기준을 충족하는 세포의 단지 0.01 내지 0.0001%만을 재프로그램화하는 비효율적인 과정이다. 과학 문헌에서, 이러한 세포를 "유도만능줄기세포" 또는 iPS 세포라 칭한다. 통상적인 접근법에서, 다능성에 대한 기준을 충족하지 못하는 세포는 거부되며; 이들 세포를 통상적으로 "불완전하게 재프로그램화된" 또는 "부분적으로 재프로그램화된"으로 나타낸다.

iPS 세포의 콜로니의 유전자형은 단지 매우 낮은 빈도로 모세포 집단 중에 존재하는 특정한 유전 변이를 함유할 수 있다. 따라서, 상기 재프로그램화 과정은 출발 세포 집단의 단지 소수에 의해서만 나타나는 유전자형을 식별하고 선택할 수 있다.

(i) 재프로그램화는 비효율적인 과정이며 (ii) iPS 세포 유전자형은 흔히 출발 집단의 전형적인 세포와 상이하다는 사실로부터, 본 발명자는 특정한 유전적 변경이 세포가 쉽게 iPS 세포로 성공적으로 재프로그램화되게 할 수 있을 것으로 추정한다. 따라서, 발명자는 앞서 불완전하게 프로그램화되어서 거부된 세포가, 상기 세포를 쉽게 비-iPS 세포 표현형으로 되게 하는 드문 유전적 변경(이는 지금까지 그 자체가 인식되지 못하였으며, 그럼에도 불구하고 본 발명의 치료 목적에 가치를 가짐)을 가질 수 있음을 인식하였다.

인간 기관으로부터 새롭게 수확된 세포 집단은 연장된 기간 동안 배양된 세포의 집단보다 훨씬 더 큰 범위의 세포 다양성을 갖는다. 발명자는 상기 언급한 바와 같이, 특정한 임상적 유용성을 갖는 세포를 동정하고 선택하기 위해서, 재프로그램화 유전자를 새로 수확된 세포 집단에 적용하였다. 이렇게 하여 동정된 세포는, 상기 동정된 세포가 (1) 복제성이 아니고 대신에 장기간 배양물에서 사라지며, (2) 줄기세포 형태를 나타내지 않고, (3) 추정적인 췌장 줄기세포를 함유하지 않는 조직으로부터 단리될 수 있다는 사실에 의해 입증된 바와 같이, 췌장 줄기세포가 아니다. (추정적인 췌장 줄기세포는 췌장관 중에 존재하는 것으로 가정됨). 하기 실시예 1을 참조하시오.

성체 췌장으로부터 수확된 본 발명의 세포는 그의 단리를 위해 혈청을 필요로 하지 않으며, 줄기세포 형태를 나타내지 않고, 정제된 췌장세포 아집단의 특정한 분획으로부터 단리시킬 필요가 없다. 이들 모두는 예를 들어 미국 특허 제 8377689 호가 개시하는 것들과 뚜렷이 대비된다.

따라서, 본 발명에 따라, 신선한 인간 췌장 조직을, 인슐린-의존성 당뇨병을 치료할 수 있는 대용 췌장 세포에 대한 공급원이 될 소지가 있는 비-줄기세포 집단을 동정하고 선택하기 위한 세포의 공급원으로서 사용할 수 있다. 특히, 하기에 상세히 개시하는 바와 같이, 세포를 줄기세포 상태를 채용하기 위해 상기 기관으로부터 수확 1주일 이내에 재프로그램화할 수 있다.

상기 생성되는 줄기세포를 (1) 췌장 내분비 선조세포로 효율적으로 분화시켜, 상기 세포자체를 상술한 바와 같이 인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 가능하게 하고, (2) 규모 확대 가능하고, 규제 당국에 의해 일반적으로 승인될 수 있는 최소 배양 조건에서 생존 및 분화하는 능력을 근거로 선택하였다. 이와 관련하여 "효율적으로"는 분화 과정의 끝에서 적어도 약 80%의 내분비 선조세포; 보다 바람직하게는 적어도 약 90%의 내분비 선조세포를 포함하는 세포 집단을 생성시킴을 내포한다. "내분비 선조세포"는 랑게르한스섬의 호르몬-생산세포로 성숙하게 되는 세포이다. 상기 세포는 예를 들어 유전자 Pdx1, Nkx6.1 및 NeuroD1의 동시 발현을 특징으로 한다. 이와 관련하여 "생존하는"은 분화 과정의 끝에서 출발 생육성 세포 집단의 적어도 약 80% 및 바람직하게는 적어도 약 90%가 생육성임을 나타낸다.

보다 구체적으로, 내배엽 계통으로의 분화를 구동하는 화합물은 만능줄기세포에 독성이다. 따라서 통상적인 프로토콜은 혈청을 사용하여 세포 생존을 증대시키며; 혈청에 의해 세포 생존은 50%를 초과할 수 있다. 그러나, 혈청은 확실하지 않은 시약이며, 이는 인간 치료 세포의 배양에 대해서 규제 당국에게 일반적으로 바람직하지 않은 것이다.

통상적인 프로토콜과 대조적으로, 본 발명의 접근법은 혈청을 배제하며, 이에 의해 생성 세포는 인간 세포 요법에 적합한 것으로 간주될 수 있다. 또한, 통상적인 프로토콜은, 값비싸고 대단히 불안정한 성장 인자인 wnt를 사용한다. 본 발명은 wnt의 사용을 배제하며, 이에 의해 일관되고 규모확대 가능한 방법을 제공한다.

혈청 및 wtn의 사용을 모두 피함으로써, 본 발명의 방법은 만능줄기세포의 효율적인 분화의 구동에 효과가 없다. 다른 한편으로, 본 발명에 따른 조성의 세포는 상기 신규의 접근법에 반응하고 생존하도록 선택된다. 따라서, 본 발명에 따라 선택된 세포의 약 80% 이상, 바람직하게는 세포의 약 90% 이상이 상기 분화 과정에서 생존한다. 더욱이, 상기 생존 세포 중 약 80% 이상, 및 바람직하게는 약 90% 이상이 췌장 내분비 계통의 마커들인 Pdx1, Nkx6.1 및 NeuroD1을 동시에 발현한다(실시예 3, 마지막 단락을 참조하시오).

본 발명의 동정 및 선택 과정 동안, 만능줄기세포에 대한 선택 기준은 무시되며, 실제로 본 발명에 따라 생성된 세포는 만능이 아니다; 즉 상기 세포는 실질적으로 비-췌장 계통으로 분화하는 능력이 없다. 이와 관련해서, "실질적으로"는 분화된 세포 집단의 적어도 약 5%, 바람직하게는 적어도 약 10%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 20%가 비-췌장 계통에 특이적인 특징을 나타냄을 의미한다.

예를 들어, 본 발명에 따라 생성된 세포에, 3 개의 계통, 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 혼합물을 유도하기 위해 통상적으로 사용되는 프로토콜을 수행하였다. 상기 3 개 계통의 혼합물로 분화하는 능력을 입증하기 위해서, 자발적인 성장 및 분화가 가능한 줄기세포 클러스터의 현탁액에, 하나의 계통이 또 다른 것, 예를 들어 혈청에 유리한 분화를 유발하지 않는 배지를 제공하는 것을 통상적으로 수행한다. 상기와 같은 배양 조건 하에서 상기 줄기세포 클러스터는 그의 유전적 프로그램화에 따라(제공된 배양 조건에 의해 특이적으로 유도되지 않고) 분화할 것이다. 상기와 같이 형성된 클러스터를 초기 포유동물 배를 닮아 "배상체"라 칭한다. 문헌[Rust(2006)]을 참조하시오. 만능세포는 포유동물 배의 방식에 따라, 3 개의 배엽: 외배엽, 내배엽 및 중배엽을 모두 함유하는 배상체를 생성시킬 것이다. 그러나, 만능줄기세포와 달리, 본 발명의 세포로부터 생성된 혼합물은 중배엽 계통의 세포를 포함하지 않았다(실시예 4, 예를 들어 다섯 번째 단락을 참조하시오).

본 발명의 세포에 또한, 만능줄기세포를 심근세포(중배엽 계통의 세포임)로 분화시키기 위해 통상적으로 사용되는 프로토콜을 수행하였다. 다시, 만능줄기세포와 대조적으로, 본 발명의 세포는 상기 분화 프로토콜에 반응하여 심근세포-관련 유전자를 발현하지 못했다. 외관 검사는 본 발명에 의해 개시된 세포들 중 어느 것도 심근세포의 전형적인 박동 형태를 나타내지 않음을 밝혔다. 따라서, 세포의 약 5% 미만이, 만능줄기세포로부터 심근세포를 유도하기 위해 당해 분야에 사용되는 프로토콜에 반응하였다(실시예 4, 예를 들어 그의 여섯 번째 및 일곱 번째 단락을 참조하시오).

본 발명에 따라 생성된 줄기세포는 이전에 개시되지 않은, 하기의 성질들을 갖는다:

·신선한 인간 췌장으로부터 유래하는 재생 줄기세포 집단을 구성하고;

·인슐린-의존성 당뇨병을 치료할 수 있는, 실질적으로 순수한 대용 췌장 세포 집단으로 효율적으로 분화(즉 ≥80% 또는 ≥90%)할 소지가 있고;

·외인성 유전자의 게놈 통합이 없고;

·규제 당국에 의해 인간 사용에 허용성인 것으로 일반적으로 간주되는 시약 및 과정을 사용하여 유도되고, 재프로그램화되고, 배양된다.

본 발명에 따라 수득된 대용 췌장 세포는 또한 이전에 개시되지 않았던 성질들을 갖는다. 이들 성질은 하기와 같다:

·종양발생 가능성이 있는 줄기세포에 의해 오염되지 않은, 실질적으로 순수한 치료 세포의 집단(즉 ≥80% 또는 ≥90%)을 구성하고;

·규제 당국에 의해 인간 사용에 허용성인 것으로 일반적으로 간주되고 규모 확대 가능한 시약 또는 과정을 사용하여 분화되었고;

·외인성 유전자의 게놈 통합이 없다.

B. 진보적인 접근법의 실행에 대한 지침

1. 다양성의 희생 없이 고유 췌장 세포의 수득

기관으로부터 세포를 수확하는 현행 방법은 상기 세포를 시간에 따라 배양되게 한다. 그 결과, 상기 배양 조건에 적합한 증식 세포의 아집단이 유리하며, 이는 동종 세포 배양물을 생성시키는 집단을 압도한다. 이러한 현상(종종 "배양물 표류"로 나타냄)은 10 배 정도로 적은 집단 배가로 발생한다.

대조적으로, 본 발명은 성숙한 기관으로부터 수확된 세포가 장기간에 걸쳐, 바람직하게는 1주일 이하에 걸쳐 배양될 수 없음(5 배 미만으로 집단 배가됨)을 명시한다. 이는 상기 세포 집단이 상기 배양 조건에 적합하게 되는 것을 방지하며, 빠르게 성장하는 세포가 상기 집단을 압도하여 전체 집단 다양성을 감소시킬 기회를 최소화한다.

2. 재프로그램화 유전자의 통합 또는 장기간 발현 없이 세포의 재프로그램화

4 개의 유전자, Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc는 성숙한 세포가 줄기세포의 성질을 채용하게 할 것이다. 이들 "재프로그램화 유전자"는 재프로그램화되는 동일한 세포에서 발현되어야 하며, 이들 유전자가 발현될 수 있는 숙주 게놈내로 상기 유전자를 삽입하는 바이러스를 통해 통상적으로 전달된다.

게놈내로 무작위 삽입되는 유전자를 갖는 세포는 인간에의 이식에 대해 규제 당국에 의해 일반적으로 승인되지 않는다. 이는 상기와 같이 변형된 세포가 조작되지 않은 세포보다 더 높은 종양발생 위험성을 나타내기 때문에 그렇다.

본 발명은 재프로그램화 유전자를, 상기 유전자를 게놈내로 통합시키지 않고 따라서 그의 발현을 오직 일시적으로만 수행하는 플라스미드 중에서 전달함을 수반한다. 핵에 있는 동안 플라스미드에 의해 운반된 유전자는 숙주 핵 전사 복합체에 의해 전사될 수 있다. 문헌[Takacs(2010)]을 참조하시오.

바람직한 실시태양에서, 상기 유전자는 에피솜유사 플라스미드 중에서 전달된다. "에포솜유사"는 플라스미드를 세포의 핵 중에서 존속될 수 있으나 상기 세포의 어떠한 염색체 내로도 통합되지 않게 제한한다(상기 문헌[Takacs]). 시간이 지남에 따라 에피솜유사 플라스미드는, 유사분열 동안 복제되지 않고 분리되기 때문에, 상기 세포 집단으로부터 희석된다. 또한, 에피솜유사 플라스미드를 상기 핵으로부터 삭제하거나 또는 퇴화시킬 수 있다.

재프로그램화에 통상적으로 사용되는 myc 과 구성원인 C-myc는 공지된 종양형성유전자이다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 C-myc 대신에, 종양형성유전자가 아닌 L-myc를 사용한다. 문헌[Nakagawa(2010)]을 참조하시오.

3. 치료학적 유용성을 갖는 세포의 선택

재프로그램화된 세포는 전형적인 줄기세포 형태를 나타냄으로써 재프로그램화되지 않은 세포와 구분될 수 있다. 전형적인 줄기세포는 작고 둥글며, 현저한 핵과 작은 세포질을 갖고, 단단한 클러스터로 성장한다.

상기 재프로그램화된 세포의 비교적 작지만 식별 가능한 분획은 본 발명에 따른 약제-등급 대용 췌장 세포에 대한 공급원이다. 상기 분획은 하기 상세히 나타낸 기준의 충족에 의해 확인된다.

·한정된, 비-동물-기원 성분으로 구성된 배양 조건에서 증식하는 능력

·실질적으로 순수한 췌장 세포 집단, 즉 췌장 내분비 선조세포의 유전자 특징을 발현하고 랑게르한스섬의 호르몬-생산 세포로 성숙할 수 있는 세포의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%로 구성된 집단으로 분화함으로써 최소 분화 프로토콜에 응답하는 능력

본 발명의 프로토콜은 인체의 줄기세포가 상기 췌장의 발생에서 따르는 경로를 요약하는 분화 경로에 따라 병든 세포를 구동하도록 설계된다. 따라서, 상기 프로토콜은 발생하는 인간 태아 또는 신생아로부터 단리될 수 있는 췌장세포로부터 식별이 불가능한 췌장세포를 생산하기에 충분히 충실하게 인간 발생을 모방한다. 통상적인 기법과 대조적으로, 본 발명에 따른 프로토콜은 또한, 규모 확대 가능한 약제-등급 제조 공정의 부분일 수 있는 단지 한정된, 비-동물 기원 성분만을 사용한다. 즉, 본 발명의 프로토콜은 세포 생존의 증대를 위해 지금까지 사용된 혈청도, 대단히 불안정하고 값비싼 성장 인자인 wnt과 구성원도 사용하지 않는다.

·큰 췌장 세포 집단을 효율적으로 생산할 수 있는 분화 과정에서 생존하는 상기 집단의 능력.

나타낸 바와 같이, "생존하다"는 출발 생육성 세포 집단의 적어도 약 80%, 및 바람직하게는 적어도 약 90%가 상기 분화 과정의 끝에서 생육성인 능력을 나타낸다.

본 발명에 따라, 췌장세포를 형성할 소지가 있는 세포에 대한 선택은 인체의 3 개 계통 모두로의 효율적인 성숙의 다능성 특징을 갖는 세포에 대한 선택이다. 특히, 이들 기준을 충족하는 상기 언급한 분획을 구성하는 세포는 중배엽 계통의 세포로 실질적으로 분화할 수 없기 때문에 만능이 아니다, 즉 상기 분화된 세포 집단의 적어도 약 5%, 바람직하게는 적어도 약 10% 및 보다 바람직하게는 적어도 약 20%가 중배엽 계통에 특이적인 특징을 나타낸다.

C. 실시예

1. 오직 비-동물 기원의 한정된 시약만을 사용하는 1차 췌장세포의 수확

인간 췌장을 5X 항생제/항진균제(페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies))가 보충된 DMEM 배지에서 철저히 세정하였다. 상기 조직의 작은 일부를 2 ㎜ 이하 직경의 단편으로 다졌다. 상기 다진 조직을 50 ㎖ 원뿔 튜브로 옮기고 중력 침전되게 하였다(도 1 A,B). 배지를 5X 항생제/항진균제가 보충된 새로운 DMEM으로 교체하고 실온에서 5 분간 배양하였다. 이어서 배지를 DMEM/F12, L-아스코르브산-2-포스페이트(64 ㎎/L), Na 셀레늄(14 ㎍/L), 인슐린(19.4 ㎎/L), NaHCO₃(543 ㎎/L), 트랜스페린(10.7 ㎎/L), TGF 베타1(2 ㎍/L), bFGF(10 ㎍/L), 헤파린(50 ㎍/L) 및 하이드로코르티손(100 nM)으로 구성된 1차 배양 배지로 교체하였다. 배지를 pH 7.4 및 340 mOSM으로 조절하였다.

상기 프로토콜의 변형은 EGF(100 ㎍/L), 트롬빈(1 U/㎖) 및 하이드로코르티손(100 nM)이 보충된 필수 8 배지(라이프 테크놀로지스)를 사용하였다. 또 다른 변형에서, 프로도 랩스(Prodo Labs)(미국 캘리포니아주 얼바인 소재)로부터 구입한 단편화된 췌장 조직을 완전 인간 췌장 대신에 사용하였다; 즉 상기 췌장 조직을 섬 제제 및 도관 제제로 단편화하였다. 더욱 또 다른 변형에서, 피부 천공 생검을 사용하였다. 이들 변형은 결과에 어떠한 실질적인 변화도 초래하지 않았다.

50 ㎎/㎖ 량의 동물 기원없는 콜라게나제, AFA 등급(월딩톤 바이오케미칼(Worthington Biochemical)을 상기 배지에 가하고, 배양 플라스크를 밤새 37 ℃ 가습 배양기에 두었다. 다음날 남아있는 세포 덩어리를 분쇄에 의해 부수었다. 상기 용액을 원뿔 튜브로 옮기고 200XG에서 4분간 원심분리시켰다. 상기 배지를 흡출하고 세포 펠릿을 1차 배양 배지에 재현탁시켰다. 이어서 상기 세포를 CELLstart(인비트로젠)로 사전-코팅한 세포 배양 플라스크로 옮기고 상기 배양기로 복귀시켰다. 24 시간 후에, 세포가 상기 디쉬에 부착되었으며 증식하기 시작하였다(도 1, 상 C 참조).

상기 프로토콜의 변형에서, 콜라게나제를 1X TrypLE 셀렉트(라이프 테크놀로지스)로 교체하였다. 추가의 변형에서, CELLstart를 1X 비트로넥틴(Vitronectin)XF(스템 셀 테크놀로지스(Stem Cell Technologies)로 코팅한 디쉬로 교체하였다. 어느 변형에서도 실질적인 변화는 발생하지 않았다.

상기 세포 배양물이 성장면상에서 거의 세포밀집으로 성장했을 때, 상기 배양물을 TrypLE 셀렉트(라이프 테크놀로지스)의 첨가에 의해 용해시키고 재프로그램화를 위해 수확하였다. 췌장의 수령으로 시작된 상기 과정을 9일을 초과하여 지속시키지 않았다. 과잉의 세포를 Synth-a-freeze CTS(라이프 테크놀로지스)에서 제조사의 사용설명서에 따라 냉동보존하였다. 실질적인 변화가 수행되지 않은 하나의 변형에서, 과잉의 세포를 10% DMSO가 보충된 1차 배양 배지에서 냉동보존하였다.

2. 오직 비-통합 유전자 벡터 및 한정된 비-동물 기원 시약만을 사용하는 췌장 세포의 재프로그램화

세포 배양물을 TrypLE 셀렉트를 사용하여 단세포로 용해시켰다. 상기 단세포 현탁액을 혈구계수기를 사용하여 카운트하였다. 1.5E6 세포를 새로운 원뿔 튜브로 옮기고 200XG에서 4 분 동안 원심분리시켰다. 상기 펠릿을 7.5 ㎍의 재프로그램화 플라스미드 1 및 12.5 ㎍의 재프로그램화 플라스미드 2가 보충된 용액 V(론자(Lonza))에 재현탁시키고(도 2), 일렉트로포레이션 큐벳에 가하였다. 재프로그램화 플라스미드 1 및 2는 에피솜유사, 비-통합 플라스미드이다. 상기 재프로그램화 플라스미드에 사용된 유전자는 예를 들어 문헌[Takahashi(2006)]에 개시되었다. L-myc를 공지된 종양형성유전자인 C-myc 대신에 사용하였다. 문헌[Nakagawa(2010)]을 참조하시오. 상기 큐벳을 신속히 론자 뉴클레오펙터(Lonza Nucleofector)에 삽입하고 프로그램 T-024를 사용하여 일렉트로포레이션시켰다.

상기 일렉트로포레이션된 세포를 재프로그램화 배양 배지에서 희석하고 CELLstart로 사전-코팅한 디쉬로 옮겼다. 재프로그램화 배양 배지는 DMEM/F12, L-아스코르브산-2-포스페이트(64 ㎎/L), Na 셀레늄(14 ㎍/L), 인슐린(19.4 ㎎/L), NaHCO₃(543 ㎎/L), 트랜스페린(10.7 ㎎/L), TGF 베타1(2 ㎍/L), bFGF(10 ㎍/L), 및 헤파린(50 ㎍/L)으로 구성되었다. 배지를 pH 7.4 및 340 mOSM으로 조절하였다. 한편으로, 상기 일렉트로포레이션된 세포를 100 ng/㎖ bFGF(시그마), 100 μM 나트륨 부티레이트(시그마) 및 100 nM 하이드로코르티손(시그마)이 보충된 필수 6 배지(라이프 테크놀로지스)에서 희석하였다.

상기 배지를 매 2일마다 새로이 하였다. 임의로, 상기 배지에 4 내지 10일 동안 2 mM 발프로산(시그마)을 보충하였다. 세포가 세포밀집도에 도달했을 때, 상기 세포를 TrypLE를 사용하여 계대배양하였다. 20일까지 줄기세포 형태를 갖는 세포의 20 개 콜로니가 나타났다(도 3).

3. 인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 유용한 세포의 동정 및 선택

줄기세포 형태를 갖는 세포의 10 개 콜로니를 상기 기질로부터 손으로 작은 세포 덩어리로 용해시키고 CELLstart로 사전-코팅한 새로운 조직 배양 디쉬로 옮기고, 재프로그램화 배양 배지와 함께 배양하였다. 상기 프로토콜의 변형으로, 줄기세포 형태를 갖는 콜로니를 비트로넥틴 XF(스템 셀 테크놀로지스)로 사전-코팅한 조직 배양 디쉬로 옮겼다.

상기와 같이 수득된 10 개의 콜로니 중, 6 개는 그의 형태 변화 없이 계속 증식하였다. 상기 세포 집단의 배가 시간을 계대배양 1 내지 3에 대해서 계산하였다(도 4).

이어서 증식하는 세포의 콜로니를 CELLstart로 사전-코팅한 6-웰 조직 배양 디쉬의 웰로 옮기고, 거의 세포밀집도로 성장시켰다. 거의-세포밀집도에서, 상기 세포에 대해, 췌장 계통으로의 분화를 지시하는 프로토콜을 수행하였다. 한편으로, 세포를 비트로넥틴 XF(스템 셀 테크놀로지스)로 사전-코팅한 6-웰 조직 배양 디쉬의 웰로 옮겼다.

췌장 계통으로 줄기세포의 분화를 구동하는 신규의 프로토콜:

상기 배지를 0.2% 인간 혈청 알부민(HSA), 0.5XN2(라이프 테크놀로지스), 0.5XB27(라이프 테크놀로지스), 100 ng/㎖ 액티빈 A 및 1 μM 보르트만닌(시그마)이 보충된 DMEM/F-12로 교체하였다. 상기 배지를 2일 후에 새로이 하였다. 4일까지 상기 세포는 내배엽 계통의 특징 유전자인 Sox17, HNF3β 및 HNF4α를 발현하였다. 5일째에, 상기 배지를 0.5% HSA, 2 μM 레티노산(시그마), 50 ng/㎖ 노긴, 10 ng/㎖ FGF7/KGF 및 0.5% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(BD 바이오사이언시즈)이 보충된 IMDM/F-12로 교체하였다. 상기 배지를 7일째에 새로이 하였다. 9일째에, 상기 배지를 1% ITS, 1XN2, 및 50 ng/㎖ EGF가 보충된 DMEM으로 교체하였다. 상기 배지를 11일 및 13일째에 새로이 하였다. 15일까지, 상기 세포는 내분비 췌장이 유래되는 췌장 세포의 특징 유전자인 Pdx1, Nkx6.1, 및 NeuroD를 동시에 발현하였다.

상기 6 개의 콜로니 중 단지 2개만이 상기 분화 과정에서 생존할 수 있었다. 생존은 상기 분화 과정이 가해진 세포의 적어도 80%가 분화후 남아있는 것으로서 정의된다. 15일째에 2 개의 생존 배양물을 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 고정시키고 면역세포형광을 위해 준비하였다. 단백질 Pdx1 및 Nkx6.1의 발현을, 항-Pdx1 및 항-Nkx6.1 항체와의 1차 배양, 및 형광-결합된 2차 항체와의 2차 배양에 의해 가시화하였다. 상기 두 배양물 중 오직 하나만이, 거의 독점적으로 Pdx1 및 Nkx6.1 이중-양성 세포로 구성된 거의 세포밀집성 배양물을 유지하였다(도 5). 클론 10의 다수의 형광 상들 중 핵의 카운팅은 세포의 >95%가 Pdx1 및 Nkx6.1을 발현함을 밝혔다.

4. 다능성에 대한 시험

클론 5 내지 10을 3 개의 1차 배엽들로 분화시켜 상기 줄기세포들이 만능인지를 측정하였다. 당해 분야의 숙련가들에 의해 통상적으로 사용되는 분화 프로토콜은 줄기세포의 "배상체"로의 분화를 가능하게 한다. 문헌[Rust 2006]을 참조하시오. 분화를 유전자 발현의 RT-qPCR 분석에 의해 평가하였다.

클론 5 내지 10을 각각 함유하는 6-웰 디쉬의 2 개 웰을 디스파제(스템 셀 테크놀로지스) 중에서 5 분 동안 배양하고 피펫 팁으로 긁어냄으로써 손으로 용해시켰다. 세포 덩어리를 함유하는 배지를 원뿔 튜브로 옮기고 90XG에서 5 분간 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 DMEM(깁코(Gibco))에서 세정하고 20% 혈청 대체물(인비트로젠) 및 0.5% vol/vol 페니실린/스트렙토마이신(깁코)이 보충된 RPMI 중에 재현탁시켰다.

세포 펠릿을 6 웰 저-부착 디쉬의 웰로 옮기고 15일 동안 배양하였다. 배지를 매 2 내지 3일마다 교환하였다. 2일 이내에, 배상체가 형성되기 시작하였다. 배상체의 분액들을 0, 3 및 10일째에 수확하고 RT-PCR에 의해 분석하였다. 전체 RNA를 RNeasy 키트(퀴아겐(Qiagen))를 사용하여 단리하고, 온-필터 DNase로 처리하고 UV 흡수에 의해 정량분석하였다. 제조사의 사용설명서에 따라, 총 1 ㎍의 RNA를, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(M-MuLV) 역전사효소(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 무작위 6량체 프라이머를 사용하여 cDNA로 전환시켰다.

정량적인 PCR을 50 ng의 각 역전사효소 반응, 250 nM의 각각의 프라이머, 및 1XSYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Bio-RAD)를 사용하여 수행하고 iCycler 유전자증폭기(Bio-RAD)를 사용하여 분석하였다. 프라이머 쌍들을 하기 표 1에 나열한다. 발현을, 베타-액틴에 대해 표준화되고 0일째(분화되지 않은 세포)와 비교하여 작성된 표준 곡선을 기준으로 계산하였다.

[표 1]

RT-qPCR에 사용된 프라이머들

췌장 계통으로의 높은 분화 효율과 중배엽 계통 세포로의 낮은 분화 효율간에는 명백한 상관성이 있었다(도 6). 분화가 진행됨에 따라, 모든 클론들은 다능성-관련 유전자의 감소된 발현 및 내배엽- 및 외배엽-관련 유전자의 증가된 발현을 나타내었다. 클론 5 내지 9는 중배엽 관련 유전자의 증가를 나타내었다. 클론 10은 중배엽 관련 유전자의 현저한 발현을 나타내지 못하였다.

상기 마지막 결과를 입증하기 위해서, 클론 5 및 10에, 중배엽 심근세포로의 만능세포의 분화를 구동하도록 설계된 프로토콜을 수행하였다(Xu 2009). 간단히, 클론을 상술한 바와 같이, 단 재프로그램화 배양 배지를 사용하여, 저-부착 플레이트상에서 계대배양하여 세포 클러스터를 형성시켰다. 밤새 배양후, 배지를 DMEM, 1X 불필수 아미노산(깁코), 2 mM L-글루타민(깁코), 5.5 ㎍/㎖ 트랜스페린(시그마), 5 gn/㎖ 나트륨 셀레나이트(시그마), 0.1 mM 베타 머캅토에탄올(깁코) 및 1X 페니실린/스트렙토마이신(깁코)으로 구성된 배지로 교체하였다. 배지를 매 3 내지 4일마다 교환하였다.

중배엽 심근세포를 함유하는 자발적으로 박동하는 세포 클러스터는 클론 5의 배양물에서 대략 12일째에 나타났다. 15일까지, 상기 세포 클러스터의 적어도 50%는 적어도 한 부위에서 자발적으로 줄어들었다. 배상체를 15일째에 수확하고, RT-PCR 분석을 심근세포의 전형적인 유전자들 상에서 수행하였다. 심근세포 유전자는 클론 5에 의해 확고하게, 즉 미분화 세포에 비해 적어도 5배 발현되었다(도 7). 대조적으로, 자발적으로 박동하는 세포 클러스터는 12일 또는 15일의 분화시에 클론 10의 배양물에서 존재하지 않았다. 세포 클러스터의 유전자 발현에 대한 RT-PCR 분석은 심근세포 유전자가 미분화 줄기세포의 수준 이상에서는 발현되지 않음을 밝혀냈다.

따라서 클론 10은 중배엽 심장 계통의 세포로 실질적으로 분화할 수 없었다. 자발적으로 박동하는 세포 클러스터가 확인되지 않았고 심근세포 유전자가 미분화 세포 집단 이상의 수준에서 발현되지 않았기 때문에, 세포의 약 5% 미만이, 만능줄기세포를 심근세포로 분화시키는데 통상적으로 사용되는 프로토콜에 응답한다는 결론이 내려졌다.

본 발명의 특정한 실시태양들을 상기에 논의하였지만, 이들 실시태양은 단지 본 발명을 예시할 뿐이며 제한하지 않는다. 본 명세서의 검토는 본 발명의 다수의 변화를 본 발명의 분야의 숙련가들에게 자명하게 할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 등가의 전체 범위와 함께 하기 특허청구범위 및 상기 명세서 모두를 참고로, 상기와 같은 변화와 함께 결정되어야 한다.

인용된 공보들

6,436,704 B1 8/2002 Roberts 및 Mather

6,815,203 B1 11/2004 Bonner-Weir 및 Taneja

7,544,510 B2 6/2009 Habener 등

7,604,991 B2 10/2009 Bouwens 및 Baeyens

8,110,399 B2 2/2012 Habener 등

2004/0115805 A1 6/2004 Tsang 등

8,377,689 B2 2/2013 Tsang 등

다른 발행물들

Shapiro, A.M. 2011 Curr Opin Organ Transplant 16(6), 627-31

Robertson, R.P. 2010 Endocrinol Metab Clin N Am 39, 655-67

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Claims

인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 적합한 대용 췌장 세포의 비-만능 선조세포를 포함하는 조성물로, 상기 선조세포가 (i) 줄기세포 형태를 가지고, 상기 형태의 변화 없이, 배양액 내에서 증식할 수 있고, (ii) 재프로그램화 되었으나, 그의 게놈내로 통합된 재프로그램화 유전자를 갖지 않고, (iii) 비-동물 기원 시약만을 사용하는 프로토콜에 따라 췌장 계통으로 분화될 수 있으며, (iv) 중배엽 계통으로 실질적으로 분화될 수 없는 조성물.
인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 적합한 대용 췌장 세포의 비-만능 선조세포를 포함하는 조성물의 생성 방법으로,
(a) 비-동물 기원 시약만을 사용하는 배양 조건에서 생육성 인간 췌장 조직으로부터 수확된 1차 인간 세포를 약 9일 미만의 기간 동안 배양하는 단계; 이어서
(b) 게놈 수준으로 통합된 재프로그램화 유전자를 갖지 않고 줄기세포 형태를 갖는 재프로그램화된 세포가 수득되도록 재프로그램화 유전자를 사용하여 (b)로부터의 1차 인간 세포를 재프로그램화하는 단계;
(c) (b)에서 수득된 재프로그램화된 세포들 중에서, 비-동물 기원 시약만을 사용하는 배양 조건에서 상기 줄기세포 형태의 상실없이 증식하는 능력으로 선택하여, 증식하는 재프로그램화된 세포를 수득하는 단계; 이어서
(d) 상기 (c)에서 증식하는 재프로그램화된 세포들 중에서, (i) 비-동물 기원 시약만을 사용하는 프로토콜에 적용되는 경우 생존하여 췌장 계통으로 분화하는 능력, 및 (ii) 실질적으로 중배엽 계통으로 분화할 수 없음을 특징으로 하는 세포 집단을 선택하는 단계를 포함하고,
인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 적합한 대용 췌장 세포의 상기 비-만능 선조세포를 상기 단계 (a) 내지 (d)를 수행함으로써 수득하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 전구체가 생육성 인간 췌장 조직으로부터 수확되었던 것인, 조성물.
인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 적합한 대용 췌장 세포의 생성 방법으로,
(a) 내배엽 계통으로의 분화를 구동하는 성분들의 제1 조합에 제1 항의 비-만능 선조세포를 노출시켜 내배엽 세포를 수득하는 단계 (상기 제1 조합은 혈청 및 임의의 wnt 과 구성원을 배제함); 이어서
(b) 상기 내배엽 세포를, 췌장 내분비 계통으로의 분화를 구동하는 성분들의 조합에 노출시키는 단계를 포함하고,
상기 대용 췌장 세포를 상기 단계 (a) 및 (b)를 수행함으로써 수득하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 선조 세포가 Oct4 및 Nanog의 발현을 나타내는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 재프로그램화 유전자가 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 전구세포가 재프로그램화 유전자를 적어도 하나의 에피솜유사 플라스미드에 전달함으로써 재프로그램화 되었던 것인, 조성물.