JP2023500830A

JP2023500830A - 網膜色素上皮細胞を生成するための方法

Info

Publication number: JP2023500830A
Application number: JP2022525204A
Authority: JP
Inventors: 康弘高木; メン－ジャオシ; ミスクチャン; イリーナクリマンスカヤ
Original assignee: アステラスインスティテュートフォーリジェネラティブメディシン
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2023-01-11
Also published as: TW202130806A; US20230072771A1; IL292610A; WO2021086911A1; CO2022007349A2; CA3158763A1; MX2022005134A; EP4051785A1; KR20220106965A; BR112022006644A2; CN114981417A; AU2020374884A1

Abstract

本発明は、多能性幹細胞の分化によって非常に純粋な網膜色素上皮（RPE）細胞を生成する改良された方法を提供する。

Description

関連出願
本出願は、2019年10月30日に出願された米国仮出願第62/928,125号に対する優先権を主張し、その全内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。

背景
網膜色素上皮（RPE）は神経感覚網膜のすぐ外側の色素性細胞層である。細胞のこの層は網膜視細胞に栄養を与え、下にある脈絡膜（網膜の後ろの血管の層）に付着しており、網膜視細胞を覆っている。RPEは、どの栄養素が脈絡膜から網膜に到達するかを決定するためのフィルターとして働く。さらに、RPEは、網膜と脈絡膜の間に絶縁をもたらす。RPEの崩壊は、網膜の代謝を妨げ、網膜の薄化を引き起こす。網膜の薄化は、深刻な帰結をもたらし得る。例えば、網膜の薄化は、「乾性」黄斑変性を引き起こす可能性があり、「湿性」黄斑変性を引き起こす可能性がある不適切な血管形成につながる可能性もある。

視覚および網膜の健康の維持におけるRPEの重要性を考えると、RPEの研究およびインビトロでRPE細胞を生成するための方法体系の開発において著しい努力があった。インビトロで生成されたRPE細胞は、RPEの発生を研究するために、RPEを崩壊させる因子を特定するために、または内在性RPE細胞の修復を刺激するために使用することができる剤を特定するために、使用することができる。さらに、インビトロで生成されたRPE細胞は、それ自体を、患者の損傷を受けたRPE細胞のすべてまたは一部を交換するかまたは回復させるための療法としても使用することができる。このように使用される場合、RPE細胞は、黄斑変性ならびにRPEに対する損傷によって全体または部分的に引き起こされる他の疾患および状態を治療するためのアプローチを提供することができる。

培養培地において、分化誘導因子の存在下で多能性幹細胞の分化を誘導することによって網膜色素上皮（RPE）細胞を生成するためのインビトロ方法は公知である（例えば、Kuroda et al., PLoS One. 2012; 7(5): e37342（非特許文献1）を参照されたい）。しかし、これらの方法は、非常に濃縮されたRPE細胞集団を得るために、接着培養と浮遊培養を組み合わせる複数の工程を必要とする。これらの公知の方法は精製工程も必要とする。

さらに、従来の公知の方法を使用して、RPE細胞が多能性幹細胞から得られる場合、一般に、標的細胞以外の細胞が同時に得られる。その結果として、これらの方法は、培養容器中で誘導されたRPE細胞の一部しか得ることができない。さらに、得られたRPE細胞の純度は実験者の技法の影響を大きく受け、これによって、これらの方法が短期間でRPE細胞の純粋な集団を得ることに適さないものになる。

したがって、多能性幹細胞から非常に純粋なRPE細胞を生成するための単純かつ効率的な方法が当技術分野において必要である。

Kuroda et al., PLoS One. 2012; 7(5): e37342

概要
本発明は、ヒト胚性幹（hES）細胞などの多能性幹細胞から網膜色素上皮（RPE）を得るための改良された方法を提供する。特に、本発明は、細胞の最低限の手動採集で、または該採集なしで、RPE前駆体を単離し、部分的に精製し、さらに成熟したRPE細胞に分化させることができる、RPE細胞への多能性幹細胞の分化の間のステージの発見に基づく。本明細書において記載されるように、多能性細胞の分化の開始に続いて、本発明者らは、一緒にとどまるRPE前駆細胞（例えば、PAX6/MITF陽性細胞として特定される）のクラスターのパーセンテージが高い、培養プロセスの間の時点を特定した。したがって、本明細書において記載される方法は、クラスターにおいて細胞を脱離させる解離試薬、例えば、コラゲナーゼまたはディスパーゼでRPE前駆細胞のクラスターを処理する工程、続いて、クラスターをサイズ分画する工程、引き続いて、細胞を継代培養して、RPE細胞を生成する工程を含む。本発明の方法は単純かつ効率的であり、いくつかの態様では、実質的に純粋なRPE細胞の培養物をもたらす。

一局面では、本発明は、網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、(i)PAX6+/MITF+RPE前駆細胞の細胞クラスターを得て、細胞クラスターを単一細胞に解離させる工程；(ii)細胞がRPE細胞に分化するように分化培地中で単一細胞を培養する工程；および(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程を含み；それによってRPE細胞の集団を生成する方法を提供する。

別の局面では、本発明は、網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、(i)PAX6+/MITF+RPE前駆細胞の細胞クラスターを得る工程、(ii)細胞がRPE細胞に分化するように分化培地中で細胞クラスターを培養する工程；および(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程を含み、それによってRPE細胞の集団を生成する方法を提供する。本発明の態様のいずれかでは、PAX6+/MITF+RPE前駆細胞は多能性幹細胞の集団から得ることができる。

一局面では、本発明は、網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、(i)多能性幹細胞がRPE前駆細胞に分化するように第1の分化培地中で多能性幹細胞の集団を培養する工程；(ii)RPE前駆細胞を解離させ、細胞を分画してRPE前駆細胞クラスターを収集し、RPE前駆細胞クラスターを単一細胞に解離させ、単一細胞がRPE細胞に分化するように第2の分化培地中で単一細胞を継代培養する工程；および(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程を含み、それによってRPE細胞の集団を生成する方法を提供する。別の局面では、本発明は、網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、(i)多能性幹細胞がRPE前駆細胞に分化するように第1の分化培地中で多能性幹細胞の集団を培養する工程；(ii)RPE前駆細胞を解離させ、細胞を分画してRPE前駆細胞クラスターを収集し、細胞がRPE細胞に分化するように、収集したRPE前駆細胞クラスターを第2の分化培地中で継代培養する工程；および(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程を含み、それによってRPE細胞の集団を生成する方法を提供する。本発明の一態様では、RPE前駆細胞はPAX6/MITFに対して陽性である。別の態様では、工程(i)より前に、多能性幹細胞は、多能性を支持する培地中のフィーダー細胞上で培養される。さらなる態様では、工程(i)より前に、多能性幹細胞は、多能性を支持する培地中でフィーダーフリーで培養される。一態様では、多能性を支持する培地にbFGFが補充される。

方法は、RPE細胞を解離させ、RPE細胞を分画してRPE細胞クラスターを収集し、RPE細胞クラスターを単一RPE細胞に解離させ、単一RPE細胞を培養することによって、記載される方法のいずれかにおいて工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程をさらに含むことができる。別の態様では、方法は、RPE細胞を解離させ、RPE細胞クラスターを収集し、RPE細胞クラスターを選択的に採集することによって、記載される方法のいずれかにおいて工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程をさらに含むことができる。方法は、選択的に採集したRPE細胞クラスターを単一RPE細胞に解離させ、単一RPE細胞を培養する工程をさらに含むことができる。

本発明の態様のいずれかでは、方法は、RPE細胞を拡大させる工程をさらに含むことができる。FGFが補充された維持培地中でRPE細胞を培養することによって、RPE細胞を拡大させることができる。一態様では、RPE細胞を各継代でRPE増殖の最初の1、2、または3日間、FGFを含む維持培地中で培養し、続いて、FGFを欠く維持培地中でRPE細胞を培養する。一態様では、FGFはRPE細胞のコンフルエンスの前に添加される。別の態様では、RPE細胞は最大で2回まで継代される。

本発明の態様のいずれかでは、解離工程のいずれか1つは、解離試薬で細胞を処理することによって行われる。一態様では、解離試薬は、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼIまたはコラゲナーゼIV）、アクターゼ（accutase）、キレート剤（例えば、EDTAベースの解離溶液）、トリプシン、ディスパーゼ、またはそれらの任意の組み合わせの群より選択される。

態様のいずれかでは、多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である。本発明の態様のいずれかでは、多能性幹細胞の集団は胚様体である。本発明の態様のいずれかでは、細胞はフィーダー細胞上で培養される。さらに別の態様では、細胞はフィーダーフリー条件下で培養される。さらなる態様では、細胞は非接着培養で培養される。別の態様では、細胞は接着培養で培養される。

本発明の一態様では、分化培地はEBDMである。別の態様では、分化培地は、ニコチンアミド、形質転換因子-β（TGFβ）スーパーファミリー（例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB）、ノーダル（nodal）、抗ミュラー管ホルモン（AMH）、骨形成タンパク質（BMP）（例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、増殖分化因子（GDF））、WNT経路インヒビター（例えば、CKI-7、DKK1）、TGF経路インヒビター（例えば、LDN193189、ノギン）、BMP経路インヒビター（例えば、SB431542）、ソニックヘッジホッグシグナルインヒビター、bFGFインヒビター、ならびにMEKインヒビター（例えば、PD0325901）の群より選択される1つまたは複数の分化剤を含む。さらなる態様では、分化培地はニコチンアミドを含む。さらに別の態様では、分化培地はアクチビンを含む。一態様では、第1の分化培地および第2の分化培地は同じである。別の態様では、第1の分化培地および第2の分化培地は異なる。さらに別の態様では、第1の分化培地および第2の分化培地はEBDMである。一態様では、第1の分化培地は、ニコチンアミド、形質転換因子-β（TGFβ）スーパーファミリー（例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB）、ノーダル、抗ミュラー管ホルモン（AMH）、骨形成タンパク質（BMP）（例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、増殖分化因子（GDF））、WNT経路インヒビター（例えば、CKI-7、DKK1）、TGF経路インヒビター（例えば、LDN193189、ノギン）、BMP経路インヒビター（例えば、SB431542）、ソニックヘッジホッグシグナルインヒビター、bFGFインヒビター、ならびにMEKインヒビター（例えば、PD0325901）の群より選択される1つまたは複数の分化剤を含む。一態様では、第2の分化培地は、ニコチンアミド、形質転換因子-β（TGFβ）スーパーファミリー（例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB）、ノーダル、抗ミュラー管ホルモン（AMH）、骨形成タンパク質（BMP）（例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、増殖分化因子（GDF））、WNT経路インヒビター（例えば、CKI-7、DKK1）、TGF経路インヒビター（例えば、LDN193189、ノギン）、BMP経路インヒビター（例えば、SB431542）、ソニックヘッジホッグシグナルインヒビター、bFGFインヒビター、ならびにMEKインヒビター（例えば、PD0325901）の群より選択される1つまたは複数の分化剤を含む。別の態様では、第1の分化培地はニコチンアミドを含む。別の態様では、第2の分化培地はアクチビンを含む。本発明の態様のいずれかでは、分化培地はヘパリンおよび／またはROCKインヒビターをさらに含むことができる。

本発明の態様のいずれかでは、RPE前駆細胞の細胞クラスターは約40μm～約200μmの間のサイズである。別の態様では、RPE前駆細胞の細胞クラスターは約40μm～約100μmの間のサイズである。

本発明の態様のいずれかでは、工程(ii)において、細胞は、ラミニンまたはその断片、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、およびゼラチンの群より選択される細胞外マトリックス上で培養される。一態様では、細胞外マトリックスはラミニンまたはその断片である。別の態様では、ラミニンは、ラミニン-521およびラミニン-511より選択される。さらなる態様では、ラミニンはiMatrix511である。

本発明の態様のいずれかでは、第1の分化培地中で多能性幹細胞の集団を培養する工程の期間は、約1週間～約12週間である。別の態様では、第1の分化培地中で多能性幹細胞の集団を培養する工程の期間は、少なくとも約3週間である。別の態様では、第1の分化培地中で多能性幹細胞の集団を培養する工程の期間は、約6週間～約10週間である。本発明の態様のいずれかでは、工程(ii)における培養の期間は、約1週間～約8週間である。別の態様では、工程(ii)における培養の期間は、少なくとも約3週間である。さらに別の態様では、工程(ii)における培養の期間は、約6週間である。

本発明の態様のいずれかでは、RPE前駆細胞クラスターまたはRPE前駆単一細胞は、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、およびゼラチンの群より選択される細胞外マトリックス上で継代培養される。一態様では、細胞外マトリックスはラミニンまたはその断片を含む。一態様では、ラミニンまたはその断片はラミニン-521およびラミニン-511より選択される。

本発明の態様のいずれかでは、単一RPE細胞は、RPEの増殖または分化を支持する培地中で培養される。別の態様では、単一RPE細胞は、ラミニンまたはその断片、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、およびゼラチンの群より選択される細胞外マトリックス上で培養される。一態様では、細胞外マトリックスはゼラチンである。さらに別の態様では、細胞外マトリックスはラミニンまたはその断片である。

ある特定の態様では、RPE細胞の組成物は、RPE細胞の実質的に精製された集団を含む。例えば、RPE細胞の組成物は、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％未満、または1％未満のRPE細胞以外の細胞を含むことができる。いくつかの態様では、RPE細胞の実質的に精製された集団は、RPE細胞が集団中の細胞の少なくとも約75％を構成するものである。他の態様では、RPE細胞の実質的に精製された集団は、RPE細胞が集団中の細胞の少なくとも約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、99％、またはさらに99％超を構成するものである。いくつかの態様では、細胞培養におけるRPE細胞の色素沈着レベルは均一である。他の態様では、細胞培養におけるRPE細胞の色素沈着は不均一である。本発明の細胞培養は、少なくとも約10¹、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、または少なくとも約10¹⁰個のRPE細胞を含むことができる。本発明の態様のいずれかでは、RPE細胞はヒトRPE細胞である。

本発明の態様のいずれかでは、RPE細胞クラスターは約40μm～200μmの間のサイズである。別の態様では、RPE細胞クラスターは約40μm～100μmの間のサイズである。

本発明の態様のいずれかでは、RPE細胞は、以下の遺伝子の1つまたは複数（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11個）を（mRNAおよび／またはタンパク質レベルで）発現する：RPE65、CRALBP、PEDF、ベストロフィン（BEST1）、MITF、OTX2、PAX2、PAX6、プレメラノソームタンパク質（PMELまたはgp-100）、チロシナーゼ、およびZO1。一態様では、RPE細胞は、ベストロフィン、PMEL、CRALBP、MITF、PAX6、およびZO1を発現する。さらなる態様では、RPE細胞は、ベストロフィン、PAX6、MITF、およびRPE65を発現する。別の態様では、RPE細胞は、MITFならびにベストロフィンおよびPAX6より選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する。ある特定の態様では、遺伝子発現はmRNA発現によって測定される。他の態様では、遺伝子発現はタンパク質発現によって測定される。

本発明の態様のいずれかでは、RPE細胞は、1つまたは複数の幹細胞マーカーの実質的な発現を欠く。幹細胞マーカーは、OCT4、NANOG、REX1、アルカリホスファターゼ、SOX2、TDGF-1、DPPA-2、DPPA-4、ステージ特異的胚抗原（SSEA）-3およびSSEA-4、腫瘍拒絶抗原（TRA）-1-60およびTRA-1-80の群より選択することができる。一態様では、RPE細胞は、OCT4、SSEA4、TRA-1-81、およびアルカリホスファターゼの実質的な発現を欠く。別の態様では、RPE細胞は、OCT4、NANOG、およびSOX2の実質的な発現を欠く。

本発明の態様のいずれかでは、RPE細胞は回収後に凍結保存される。前述の局面のいずれかのある特定の態様では、RPE細胞は保存のために凍結される。細胞は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって凍結することができ、例えば、極低温凍結することができ、細胞の保存に適している任意の温度で凍結することができる。一態様では、凍結保存される組成物は、RPE細胞および凍結保存剤を含む。当技術分野において公知の任意の凍結保存剤を使用することができ、該凍結保存剤は、DMSO（ジメチルスルホキシド）、エチレングリコール、グリセロール、2-メチル-2-4-ペンタンジオール（MPD）、プロピレングリコール、およびショ糖の1つまたは複数を含むことができる。一態様では、凍結保存剤は、約5％～約50％のDMSOおよび約30％～約95％の血清を含み、血清は、任意でウシ胎仔血清（FBS）でもよい。特定の態様では、凍結保存剤は、約90％のFBSおよび約10％のDMSOを含む。別の態様では、凍結保存剤は、約2％～約5％のDMSOを含む。一態様では、細胞は、およそ-20℃～-196℃で、または細胞の保存に適している任意の他の温度で凍結することができる。一態様では、細胞は約-80℃で、または約-196℃で凍結される。別の態様では、細胞は約-135℃～約-196℃で凍結される。特定の態様では、細胞は約-135℃で凍結される。さらなる態様では、細胞は、自動緩慢凍結プロトコールを使用して凍結することができ、これによって、細胞は、コンピューター制御下の工程において指定の温度まで冷却される。極低温凍結された細胞は適切な容器中に保存され、細胞損傷のリスクを低減し、かつ細胞が解凍を生き延びる可能性を最大にするように、保存のために調製される。他の態様では、RPE細胞は約2℃～約37℃で維持されるかまたは輸送される。一態様では、RPE細胞は室温で、約2℃～約8℃で、約4℃で、または約37℃で維持されるかまたは輸送される。

前述のいずれかのある特定の態様では、方法は、現行適正製造基準（cGMP）に従って行われる。前述のいずれかのある特定の態様では、RPE細胞が分化する多能性幹細胞は現行適正製造基準（cGMP）に従って得られる。

本発明は、本明細書において記載される方法のうちのいずれか1つの方法によって生成されたRPE細胞の集団を含む組成物も提供する。前述のいずれかのある特定の態様では、方法は、少なくとも10個のRPE細胞、少なくとも100個のRPE細胞、少なくとも1000個のRPE細胞、少なくとも1×10⁴個のRPE細胞、少なくとも1×10⁵個のRPE細胞、少なくとも5×10⁵個のRPE細胞、少なくとも1×10⁶個のRPE細胞、少なくとも5×10⁶個のRPE細胞、少なくとも1×10⁷個のRPE細胞、少なくとも2×10⁷個のRPE細胞、少なくとも3×10⁷個のRPE細胞、少なくとも4×10⁷個のRPE細胞、少なくとも5×10⁷個のRPE細胞、少なくとも6×10⁷個のRPE細胞、少なくとも7×10⁷個のRPE細胞、少なくとも8×10⁷個のRPE細胞、少なくとも9×10⁷個のRPE細胞、少なくとも1×10⁸個のRPE細胞、少なくとも2×10⁸個のRPE細胞、少なくとも5×10⁸個のRPE細胞、少なくとも7×10⁸個のRPE細胞、少なくとも1×10⁹個のRPE細胞、少なくとも1×10¹⁰個のRPE細胞、少なくとも1×10¹¹個のRPE細胞、または少なくとも1×10¹²個のRPE細胞を含む組成物を生成するために使用される。一態様では、組成物は、約1×10⁸～1×10¹²個のRPE細胞、約1×10⁹～1×10¹¹個のRPE細胞、または約5×10⁹～1×10¹⁰個のRPE細胞を含む。ある特定の態様では、組成物中のRPE細胞の数は、異なる成熟レベルのRPE細胞を含む。他の態様では、組成物中のRPE細胞の数は成熟したRPE細胞の数を指す。

本発明は、さらに、網膜疾患を有するかまたは網膜疾患のリスクを有する患者を治療する方法であって、有効量の本明細書において記載される方法のうちのいずれか1つの方法によって生成されたRPE細胞の集団を含む組成物または本明細書において記載される方法のいずれかによって生成されたRPE細胞の集団および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を投与することを含む方法を提供する。一態様では、網膜疾患は網膜変性症、コロイデレミア、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（乾性または湿性）、網膜剥離、網膜色素変性症、シュタルガルト病、網膜色素線条症、近視性黄斑変性症、および緑内障の群より選択される。ある特定の態様では、方法は、移植に適したRPE細胞の組成物を生成するために、RPE細胞を製剤化することをさらに含む。

別の局面では、本発明は、網膜変性症を特徴とする状態を治療または防止するための方法であって、RPE細胞を含む有効量の組成物をそれらを必要とする対象に投与することを含み、RPE細胞がヒト胚性幹細胞または他の多能性幹細胞に由来する方法を提供する。網膜変性症を特徴とする状態としては、例えば、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、加齢性黄斑変性症（乾性または湿性）、糖尿病性網膜症、および網膜色素変性症が挙げられる。ある特定の態様では、RPE細胞は、本明細書において記載される方法の1つまたは複数を使用して、ヒト多能性幹細胞から得られたものである。

ある特定の態様では、調製物は予め凍結保存されており、移植前に解凍される。

ある特定の態様では、治療する方法は、1つまたは複数の免疫抑制剤の投与をさらに含む。一態様では、免疫抑制剤は以下の1つまたは複数を含むことができる：抗リンパ球グロブリン（ALG）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ATG）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、BASILIXIMAB（登録商標）（抗IL-2Ra受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンA）、DACLIZUMAB（登録商標）（抗IL-2Ra受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、RITUX1MAB（登録商標）（抗CD20抗体）、シロリムス、タクロリムス、およびミコフェノール酸モフェチル（MMF）。免疫抑制剤が使用される場合、これは、全身的または局部的に投与することができ、RPE細胞の投与より前に、該投与と同時に、または該投与の後に投与することができる。ある特定の態様では、免疫抑制療法は、RPE細胞の投与に続いて、数週間、数か月間、数年間、または無期限に続く。他の態様では、治療の方法は免疫抑制剤の投与を必要としない。ある特定の態様では、治療の方法は単回用量のRPE細胞の投与を含む。他の態様では、治療の方法は、RPE細胞がある期間にわたって複数回投与される療法のコースを含む。例示的な治療のコースは、週1回、2週に1回、月1回、年4回、年2回、または年1回を含むことができる。あるいは、治療は段階的に進行してもよく、複数回投与が最初に必要とされ（例えば、第1週目の間は毎日投与）、続いて、より少なくより低頻度の投与が必要とされる。多数の治療レジメンが企図される。

ある特定の態様では、RPE細胞を含む組成物が、懸濁液、マトリックス、または基材に移植される。ある特定の態様では、組成物は注射によって眼の網膜下腔に投与される。ある特定の態様では、約10⁴～約10⁶個のRPE細胞が対象に投与される。ある特定の態様では、方法は、対象において網膜電図応答、視運動鋭敏性（optomotor acuity）閾値、または輝度閾値を測定することによって治療または防止の有効性をモニターする工程をさらに含む。方法は、細胞の免疫原性または眼における細胞の遊走をモニターすることによって治療または防止の有効性をモニターすることを含むこともできる。他の態様では、治療の効力は、以下の1つまたは複数により視覚の転帰を決定することによって、評価することができる：細隙灯生体顕微鏡撮影、眼底撮影、1VFA、およびSD-OCT、ならびに最高矯正視力（BCVA）。方法は、矯正視力（BCVA）の向上、および／または視力表、例えば早期治療糖尿病性網膜症研究（ETDRS）で読むことができる文字の増加をもたらすことができる。

ある特定の局面では、本発明は、有効量のRPE細胞を含む、網膜変性症を特徴とする状態を治療または防止するための薬学的組成物であって、RPE細胞がヒト胚性幹細胞または他の多能性幹細胞に由来する薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、投与経路に従って、薬学的に許容される担体中で製剤化することができる。例えば、調製物は、眼の網膜下腔への投与のために製剤化することができる。組成物は、少なくとも10³、10⁴、10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、または10⁷個のRPE細胞を含むことができる。ある特定の態様では、組成物は、少なくとも1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、1.5×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶個のRPE細胞を含むことができる。

ある特定の態様では、RPE細胞は、RPE細胞を含む薬学的組成物および薬学的に許容される担体または賦形剤中で製剤化される。ある特定の態様では、本発明は、ヒト胚性幹細胞または他の多能性幹細胞に由来するヒトRPE細胞を含む薬学的調製物を提供する。薬学的調製物は、少なくとも約10¹、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、1.5×10⁵、2×10⁵、5×10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、または約10¹⁰個のhRPE細胞を含むことができる。

別の局面では、本発明は、RPE細胞の生存をモジュレートする剤を特定するためのスクリーニングのための方法を提供する。例えば、ヒト胚性幹細胞から得られたRPE細胞は、RPEの生存を促進する剤をスクリーニングするために使用することができる。特定された剤は、治療レジメンの一部として、単独で、またはRPE細胞と組み合わせて使用することができる。あるいは、特定された剤は、インビトロで分化したRPE細胞の生存を向上させるために、培養方法の一部として使用することができる。

別の局面では、本発明は、RPE細胞の成熟をモジュレートする剤を特定するためのスクリーニングのための方法を提供する。例えば、ヒトES細胞から得られたRPE細胞は、RPEの成熟化を促進する剤をスクリーニングするために使用することができる。

標準化したGAPDH mRNA発現と比較した、RPE前駆細胞における、qPCRによるPAX6およびMITF mRNA発現のタイムコースを示す。 RPE細胞への分化の開始後に得られた様々な細胞画分の免疫蛍光アッセイ（IFA）による、PAX6およびMITF発現のタイムコースを示す。単一RPE前駆細胞継代培養方法の模式図を示す。 RPE前駆細胞クラスター継代培養方法の模式図を示す。単一RPE前駆細胞継代培養方法およびRPE前駆細胞クラスター継代培養方法の例示的なワークフローを示す。図4-1の続きの図である。本発明の態様による単一RPE前駆細胞継代培養およびRPE前駆細胞クラスター継代培養方法によって得られたRPE細胞の特徴を示す。

詳細な説明
本発明は、多能性幹細胞、例えば、ヒト胚性幹（hES）細胞、胚由来細胞、および人工多能性幹細胞（iPS細胞）から網膜色素上皮（RPE）細胞を得るための改良された方法を提供する。特に、本発明は、細胞の最低限の選択的採集で、または手動採集なしで、RPE前駆体を単離し、部分的に精製し、さらに成熟したRPE細胞に分化させることができる、多能性幹細胞の分化の間のステージの発見に基づく。特に、本明細書において記載されるように、多能性細胞の分化の開始に続いて、本発明者らは、解離試薬、例えば、コラゲナーゼおよびディスパーゼで培養物が解離される場合に一緒にとどまる十分な数のRPE前駆細胞（PAX6/MITF陽性細胞として特定される）のクラスターが存在する、培養プロセスの間の時点を特定した。培養物は成熟しすぎておらず、その結果、培養物中の、またはそのようなRPE前駆細胞クラスターに接着した非RPE細胞の大部分を単一細胞として排除することができる。さらに、非RPE細胞の大きなクラスター、およびRPEと非RPEの混合物を含むクラスターをサイズ分画によって排除することができ、これによって、純度を高めることが可能になる。したがって、本明細書において記載される方法は、解離試薬、例えば、コラゲナーゼまたはディスパーゼでRPE前駆細胞のクラスターを処理すること、続いて、サイズ分画して、特定のサイズのRPE前駆細胞クラスターを単離すること、およびRPE前駆細胞を単一細胞または細胞クラスターとしてとして継代培養して、RPE細胞を生成することを含む。

一態様では、本発明の方法は、約40～約200μmの間、または約40～約100μmの間のサイズであるRPE前駆細胞クラスターを単離することを含む。一態様では、RPE前駆細胞クラスターをセルストレーナーまたは一連のセルストレーナーを使用することによって収集し、望ましいサイズ要件を有する細胞クラスターを収集する。例えば、約40～約200μmの間または約40～約100μmの間の細胞クラスターを得るために、40μm、70μmm、100μm、200μmの、または望ましい細胞クラスターサイズを得ることを可能にするであろう任意の他のフィルターサイズのセルストレーナーを使用することができる。本発明の方法は単純かつ効率的である。いくつかの態様では、本発明の方法は、実質的に純粋なRPE細胞の培養物をもたらす。RPE細胞の実質的に精製された集団は、RPE細胞が集団中の細胞の少なくとも約75％を構成するものである。他の態様では、RPE細胞の実質的に精製された集団は、RPE細胞が、集団中の細胞の少なくとも約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.5、99％、またはさらに99％超を構成するものである。

本発明は、例えば、大きく増強されたRPE細胞の収率、大きく増強されたRPE細胞の純度、手動RPE細胞単離の容易さの向上、自動RPE細胞選択の能力、手動または自動選択による任意のさらなる精製が必要でないこと、および商業的な大規模製造を可能にする単純な成分の使用を含めて、RPE細胞を生成するための当技術分野において公知の方法と比べて、いくつかの利点を提供する。いくつかの態様では、本発明の方法は、手動採集をともなう従来の製造方法によって生成された細胞と比較して、例えば50～90倍超までRPEの収率を高め、98％～99％を超える純度の高い一貫性でRPE細胞を生成する。

本明細書において記載される本発明を十分に理解するために、以下の詳細な説明を提供する。本発明の様々な態様が詳細に記載されており、本明細書において提供される実施例によってさらに例示され得る。本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、別段定義しない限り、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。

定義
別段の指定がない限り、以下の用語のそれぞれは本セクションに記載される意味を有する。

不定冠詞「1つ（a）」および「1つ（an）」は、関連する名詞の少なくとも1つを指し、用語「少なくとも1つ」および「1つまたは複数」と互換的に使用される。

接続詞「または」および「および／または」は非排他的分離として互換的に使用される。

本明細書において使用する場合、用語「網膜色素上皮細胞」または「RPE細胞」は本明細書において互換的に使用されて、網膜色素上皮を構成する上皮細胞を指す。本用語は、一般的に、細胞の成熟レベルにかかわらず分化したRPE細胞を指すために使用され、したがって、様々な成熟レベルのRPE細胞を包含することができる。RPE細胞は、その玉石状形態および色素の初期出現によって、視覚的に認識することができる。RPE細胞は、OCT4およびNANOGなどの胚性幹細胞マーカーの発現の実質的な欠如に基づいて、ならびにRPE65、PEDF、CRALBP、および／またはベストロフィン（BEST1）などのRPEマーカーの発現に基づいて、分子的に特定することもできる。一態様では、RPE細胞は、限定されないが、OCT4、NANOG、REX1、アルカリホスファターゼ、SOX2、TDGF-1、DPPA-2、DPPA-4、ステージ特異的胚抗原（SSEA）-3およびSSEA-4、腫瘍拒絶抗原（TRA）-1-60および／またはTRA-1-80を含めた胚性幹細胞マーカーの1つまたは複数の実質的な発現を欠く。別の態様では、RPE細胞は、限定されないが、RPE65、CRALBP、PEDF、ベストロフィン、MITF、OTX2、PAX2、PAX6、プレメラノソームタンパク質（PMELもしくはgp-100）、および／またはチロシナーゼを含めた1つまたは複数のRPE細胞マーカーを発現する。別の態様では、RPE細胞はZO1を発現する。一態様では、RPE細胞は、MITFならびにベストロフィンおよびPAX6より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する。他のRPE様細胞が言及される場合、これらは、一般に、成人RPE、胎児RPE、成人または胎児RPEの初代培養物、および不死化RPE細胞株、例えばAPRE19細胞と称されることに留意されたい。したがって、別段の指定がない限り、本明細書において使用する場合、RPE細胞は、多能性幹細胞（PSC-RPE）から得られたRPE細胞を指し、ヒト多能性幹細胞（hRPE）から得られたRPE細胞を指してもよい。

RPE細胞の色素沈着は、培養の細胞密度およびRPE細胞の成熟度によって変動し得る。しかし、細胞が色素性と称される場合、本用語は、色素沈着のありとあらゆるレベルを指すと理解される。したがって、本発明は、様々な程度の色素沈着を有するRPE細胞を提供する。ある特定の態様では、RPEの色素沈着は他のRPE様細胞、例えば、成人RPE、胎児RPE、成人もしくは胎児RPEの初代培養物、または不死化RPE細胞株、例えばARPE19の平均的な色素沈着と同じである。ある特定の態様では、RPEの色素沈着の程度は、他のRPE様細胞、例えば、成人RPE、胎児RPE、成人もしくは胎児RPEの初代培養物、または不死化RPE細胞株、例えばARPE19の平均的な色素沈着よりも高い。ある特定の他の態様では、RPEの色素沈着の程度は、他のRPE様細胞、例えば、成人RPE、胎児RPE、成人もしくは胎児RPEの初代培養物、または不死化RPE細胞株、例えばARPE19の平均的な色素沈着よりも低い。

RPE細胞の機能的評価は、例えば、サイトカイン（VEGFまたはPEDFなど）の分泌能力、食作用能など、桿体および錐体の脱落した外節の食作用（または、ポリスチレンビーズなどの別の基材の食作用）、迷光の吸収、ビタミンAの代謝、レチノイドの再生、経上皮抵抗性、細胞極性、ならびに組織修復を使用して、確認することができる。評価は、例えば、行動試験、蛍光血管造影、組織学的検査、密着結合伝導率、または電子顕微鏡を使用する評価を使用して、適切な宿主動物（例えば、天然のまたは誘導された網膜変性症の状態を罹患するヒトまたは非ヒト動物）へのRPE細胞の埋植後に、インビボの機能を試験することによって行うこともできる。これらの機能的評価および確認作業は当業者によって行うことができる。本明細書において使用する場合、RPE細胞はヒトRPE（hRPE）細胞を含む。

本明細書において使用する場合、用語「RPE細胞の前駆細胞」または「RPE前駆細胞」は本明細書において互換的に使用されて、網膜細胞に分化するように指示される細胞を指す。一態様では、RPE前駆細胞という用語は、（例えば、本明細書において記載されるようにP0でプレーティングするために）RPE細胞を回収するまでに網膜細胞に分化するように指示される任意の細胞を指すのに使用され得る。分化の後期のステージでは、分化培養はRPE前駆細胞とRPE細胞の混合物を含む可能性があることが認識されるであろう。一態様では、前駆細胞は、（MITF（色素上皮細胞、前駆細胞）、PAX6（前駆細胞）、Rx（網膜前駆細胞）、Crx（光受容体前駆細胞）、および／またはChx10（双極細胞）など）などを発現する。一態様では、RPE前駆細胞はPAX6およびMITFを発現する。

用語「成熟したRPE細胞」および「成熟した分化したRPE細胞」は全体を通して互換的に使用されて、RPE細胞の初期の分化に続いて生じる変化を指す。特に、RPE細胞は、色素の初期出現に基づいてある程度認識することができるが、分化後は、成熟したRPE細胞は、増強された色素沈着に基づいて認識することができる。分化後の色素沈着は細胞のRPE状態の変化を示さない可能性がある（例えば、細胞は依然として分化したRPE細胞である）。分化後の色素の変化は、RPE細胞が培養され、維持される密度に対応する可能性がある。成熟したRPE細胞は、初期の分化後に蓄積する色素沈着が増加している可能性がある。成熟したRPE細胞は未成熟のRPE細胞よりも色素性である可能性があり、かつ、例えば培養皿内の高細胞密度が理由で、RPEが増殖を停止した後に出現する可能性がある。成熟したRPE細胞は、成熟したRPE細胞の増殖を可能にするように、より低密度で継代培養することができる。培養における成熟したRPEの増殖は脱分化－色素および上皮形態の消失をともなう可能性があり、色素および上皮形態の両方は、細胞が単層を形成し、静止状態になった後に回復する。これに関連して、成熟したRPE細胞を培養して、RPE細胞を生成することができる。そのようなRPE細胞は、依然として、RPEのマーカーを発現する分化したRPE細胞である。したがって、RPE細胞が出現し始めるときに生じる色素沈着の初期出現と対照的に、分化後の色素沈着の変化は現象上であり、RPEの運命から離れた細胞の脱分化を反映しない。分化後の色素沈着の変化は、PAX2、PAX6、チロシナーゼ、神経マーカー、例えば、チューブリンベータIII、ベストロフィン、RPE65、およびCRALBPの発現の1つまたは複数の変化とも相関し得る。一態様では、分化後の色素沈着の変化は、PAX6および神経マーカー（例えば、チューブリンベータIII）の1つまたは複数と逆相関を示す。別の態様では、分化後の色素沈着の変化は、RPE65およびCRALBPと直接相関を示す。

本明細書において使用する場合、用語「多能性幹細胞」、「PS細胞」、または「PSC」は、多能性幹細胞が得られる方法にかかわらず、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および胚由来多能性幹細胞を含む。多能性幹細胞は、(a)免疫不全（SCID）マウスに移植される場合に、奇形腫を誘導することができる；(b)3胚葉すべての細胞型に分化することができる（例えば、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の細胞型に分化することができる）；(c)胚性幹細胞の1つまたは複数のマーカーを発現する（例えば、OCT4、アルカリホスファターゼ、SSEA-3表面抗原、SSEA-4表面抗原、NANOG、TRA-1-60、TRA-1-81、SOX2、REX1などを発現する）；ならびにd)自己複製することができる幹細胞として機能的に定義される。用語「多能性」は、細胞が体または細胞体（すなわち、胚本体）のすべての系列を形成する能力を指す。例えば、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞は、3胚葉：外胚葉、中胚葉、および内胚葉のそれぞれから細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生じさせることができない不完全にまたは部分的に多能性の細胞から、完全な生物を生じさせることができるより原始的で、より多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）に及ぶ、一連の発生能である。例示的な多能性幹細胞は、例えば、当技術分野において公知の方法を使用して生成することができる。例示的な多能性幹細胞としては、限定されないが、胚盤胞期胚のICMに由来する胚性幹細胞、卵割期または桑実期胚の1つもしくは複数の卵割球に由来する胚性幹細胞（任意で、胚の残部の破壊なし）、多能性状態への体細胞のリプログラミングによって生成される人工多能性幹細胞、および（例えば、FGF-2、LIF、およびSCFの存在下で培養することによって）胚性生殖（EG）細胞から生成される多能性細胞が挙げられる。そのような胚性幹細胞は、受精によって、または体細胞核移植（SCNT）、単為生殖、および雄核発生を含めた無性生殖的手段によって、胚性物質から生成することができる。

一態様では、多能性幹細胞は、例えば、寿命、有効性、ホーミングを高めるように
、免疫応答を防止するかもしく低減させるように、またはそのような多能性細胞（例えば、RPE）から得られる望ましい因子を細胞に送達するように、遺伝子操作またはそうでなければ改変され得る。例えば、多能性幹細胞、したがって、結果として生じた分化細胞は、ベータ2ミクログロブリン、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP1、TAP2、タパシン、CTIIA、RFX5、TRAC、またはTRAB遺伝子の発現を欠くかまたは該発現が低減しているように、操作またはそうでなければ改変され得る。多能性幹細胞および結果として生じた分化細胞は、遺伝子の発現を増大させるように操作またはそうでなければ改変され得る。AAVベクターなどのウイルスベクターの使用、ゲノム工学のためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、およびCRISPR/Casベースの方法、ならびに転写および翻訳インヒビター、例えば、アンチセンスおよびRNA干渉（これらは、安定して組み込まれるベクターおよびエピソームベクターを使用して達成され得る）の使用を含めて、1種または複数種の遺伝子（または、タンパク質）の発現をモジュレートするように操作するための様々な技法が存在する。

用語「胚」または「胚性」は、母体宿主の子宮膜に着床していない発生中の細胞塊を意味する。「胚性細胞」は、胚から単離されるかまたは胚に含まれる細胞である。これは、2細胞期ほどの早期に得られた卵割球または抽出後の凝集した卵割球も含む。

本明細書において使用する場合、用語「胚由来細胞」（EDC）は、桑実胚由来細胞、内部細胞塊、胚盾、もしくはエピブラストのものを含めた胚盤胞由来細胞、または原始内胚葉、外胚葉、および中胚葉含めた初期胚の他の多能性幹細胞、ならびにこれらの誘導体を広く指す。「EDC」は、卵割球および凝集した単一卵割球からの細胞塊または発生の様々なステージからの胚も含むが、細胞株として継代されているヒト胚性幹細胞を除外する。

本明細書において使用する場合、用語「胚性幹細胞」、「ES細胞」、または「ESC」は、胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊から単離され、細胞株として連続的に継代されている細胞を広く指す。本用語は、好ましくは胚の残部の破壊なしで胚の1つまたは複数の卵割球から単離される細胞も含む（例えば、Chung et al., Cell Stem Cell. 2008 Feb 7;2(2): 113-7；米国特許出願第20060206953号；米国特許出願第2008/0057041号を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ES細胞は、精子もしくはDNAとの卵細胞の受精、核移植、単為生殖から、またはHLA領域にホモ接合性を有するES細胞を作製するための任意の手段によって、得ることができる。ES細胞は、精子と卵細胞の融合により生成された接合体、卵割球、もしくは胚盤胞期の哺乳動物胚、核移植、単為生殖、またはクロマチンのリプログラミングおよび引き続くリプログラムされたクロマチンの原形質膜への組み込みによる細胞の生成から得られる細胞を指すこともできる。一態様では、胚性幹細胞はヒト胚性幹細胞（または、「hES細胞」）でもよい。一態様では、ヒト胚性幹細胞は受精から14日を超えた胚に由来しない。別の態様では、ヒト胚性幹細胞はインビボで発生した胚に由来しない。別の態様では、ヒト胚性幹細胞はインビトロ受精によって生成された着床前の胚に由来する。

本明細書において使用する場合、「人工多能性幹細胞」または「iPS細胞」は、一般に、体細胞をリプログラミングさせることによって得られる多能性幹細胞を指す。iPS細胞は、体細胞において、因子（「リプログラミング因子」）、例えば、OCT4（OCT3/4と称されることもある）、SOX2、MYC（例えば、c-MYCまたは任意のMYC変異体）、NANOG、LIN28、およびKLF4の組み合わせを発現させるかまたは該組み合わせの発現を誘導することによって、生成することができる。一態様では、リプログラミング因子はOCT4、SOX2、c-MYC、およびKLF4を含む。別の態様では、リプログラミング因子はOCT4、SOX2、NANOG、およびLIN28を含む。ある特定の態様では、体細胞を首尾よくリプログラムするために、少なくとも2つのリプログラミング因子が体細胞で発現される。他の態様では、体細胞を首尾よくリプログラムするために、少なくとも3つのリプログラミング因子が体細胞で発現される。他の態様では、体細胞を首尾よくリプログラムするために、少なくとも4つのリプログラミング因子が体細胞で発現される。別の態様では、体細胞を首尾よくリプログラムするために、少なくとも5つのリプログラミング因子が体細胞で発現される。さらに別の態様では、少なくとも6つのリプログラミング因子、例えば、OCT4、SOX2、c-MYC、NANOG、LIN28、およびKLF4が体細胞で発現される。他の態様では、さらなるリプログラミング因子が特定され、体細胞を多能性幹細胞にリプログラムするために、単独で、または1つまたは複数の公知のリプログラミング因子と組み合わせて使用される。

iPS細胞は、胎児、出生後、新生児、若年、または成人の体細胞を使用して生成することができる。体細胞としては、限定されないが、線維芽細胞、角化細胞、脂肪細胞、筋細胞、器官および組織の細胞、ならびに限定されないが、造血細胞（例えば、造血幹細胞）を含めた様々な血液細胞を挙げることができる。一態様では、体細胞は、線維芽細胞、例えば、真皮線維芽細胞、滑膜線維芽細胞、もしくは肺線維芽細胞、または非線維芽体細胞である。

iPS細胞は細胞バンクから得ることができる。あるいは、iPS細胞は、当技術分野において公知の方法によって新しく生成することができるiPS細胞は、組織適合細胞を生成することを目的に、特定の患者または適合ドナーからの材料を使用して特に生成することができる。一態様では、iPS細胞は実質的に免疫原性でない普遍的ドナー細胞でもよい。

人工多能性幹細胞は、体細胞において、1つまたは複数のリプログラミング因子を発現させるか、または該リプログラミング因子の発現を誘導することによって、生成することができる。レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター感染を使用した感染、またはCRISPR、Talen、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）などの他の遺伝子編集技術によって、リプログラミング因子を体細胞で発現させることができる。また、非組み込み型ベクター、例えばエピソームプラスミド、もしくはRNA、例えば合成mRNAを使用して、またはRNAウイルス、例えばセンダイウイルスを介して、リプログラミング因子を体細胞で発現させることができる。非組み込み型ベクターを使用してリプログラミング因子を発現させる場合、ベクターを用いた体細胞のエレクトロポレーション、トランスフェクション、または形質転換を使用して、該因子を細胞中で発現させることができる。例えば、マウス細胞において、組み込み型ウイルスベクターを使用した4つの因子（OCT3/4、SOX2、c-MYC、およびKLF4）の発現は、体細胞をリプログラムするのに十分である。ヒト細胞において、組み込み型ウイルスベクターを使用した4つの因子（OCT3/4、SOX2、NANOG、およびLIN28）の発現は、体細胞をリプログラムするのに十分である。

リプログラミング因子の発現は、リプログラミング因子の発現を誘導する少なくとも1つの剤、例えば有機小分子剤と体細胞を接触させることによって誘導することができる。

（例えば、ウイルスベクター、プラスミドなどを使用して）リプログラミング因子が発現され、（例えば、有機小分子を使用して）リプログラミング因子の発現が誘導されるコンビナトリアルアプローチを使用して、体細胞をリプログラムすることもできる。

一旦リプログラミング因子が細胞で発現されるかまたは誘導されれば、細胞を培養することができる。時間とともに、ES特性を有する細胞が培養皿中に出現する。例えばES細胞の形態に基づいて、または選択可能もしくは検出可能なマーカーの発現に基づいて、細胞を選択し、継代培養することができる。該細胞を培養して、ES細胞に似ている細胞の培養物をもたらすことができる。

iPS細胞の多能性を確認するために、多能性の1つまたは複数のアッセイで細胞を試験することができる。例えば、ES細胞マーカーの発現について細胞を試験することができ；SCIDマウスに移植された場合に奇形腫を生成する能力について細胞を評価することができ；3胚葉すべての細胞型を生成することができる能力について細胞を評価することができる。

iPS細胞は任意の種からのものであり得る。これらのiPS細胞は、マウスおよびヒト細胞を使用して首尾よく生成されている。さらに、iPS細胞は、胚性、胎児、新生児、および成人の組織を使用して首尾よく生成されている。したがって、任意の種からのドナー細胞を使用して、iPS細胞を容易に生成することができる。したがって、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄動物（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（家イヌおよび野生のイヌ）、ネコ（家ネコおよび野生のネコ、例えば、ライオン、トラ、チーター）、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含める）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳動物（イルカ、クジラなど）などを含めて、任意の種からiPS細胞を生成することができる。

本明細書において使用する場合、用語「分化」は、特殊化していない（「拘束されていない（uncommitted）」）かまたはあまり特殊化していない細胞が、例えばRPE細胞などの特殊化した細胞の特色を獲得するプロセスである。分化細胞は、細胞の系列内のより特殊化した位置についているものである。例えば、hES細胞は、RPE細胞を含めて、様々なより分化した細胞型に分化することができる。

本明細書において使用する場合、用語「培養される」または「培養する」は、数ある中でも、培養細胞の生存を持続するのに必要とされる栄養素、任意の特定の添加物質を含む培地中に細胞を入れることを指す。細胞は、そのような細胞が維持される培地がそのような特定の物質を含む場合、特定の物質「の存在下で」培養される。培養は、非限定的に、ペトリ皿、培養皿、採血バッグ、ローラボトル、フラスコ、試験管、マイクロタイターウェル、中空繊維カートリッジ、または当技術分野において公知の任意の他の装置を含めて、細胞を培地に曝露された状態で維持することができる任意の容器または装置中で行うことができる。

本明細書において使用する場合、用語「継代培養する」または「継代する」は、一部またはすべて細胞を前の培養から新鮮な増殖培地に移し、および／または新しい培養皿上にプレーティングし、さらに細胞を培養することを指す。継代培養は、例えば、培養において、生存を延ばす、望ましい細胞集団を豊富にする、および／または細胞数を拡大するために行われる。例えば、本用語は、細胞の増殖を可能にするために、一部またはすべての細胞をより低い細胞密度で新しい培養容器に移すこと、培養すること、またはプレーティングすることを含む。

本明細書において使用する場合、用語「選択的に採集する」または「選択的採集」は、外観または他の表現型特性に基づいて、より大きな集団から細胞のサブセットを機械的に採集または分離することを指す。選択的採集は、手動で、または自動システムによって行うことができ、顕微鏡、コンピューターイメージングシステム、または、採集する細胞を特定するための他の手段を用いて行うことができる。

本明細書において使用する場合、用語「解離試薬」は、細胞凝集体または単一細胞への細胞の解離または脱離を促進する酵素的または非酵素的試薬を指す。解離試薬の例としては、限定されないが、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼIもしくはコラゲナーゼIV）、アクターゼ、キレート剤（例えば、EDTAベースの解離溶液）、トリプシン、ディスパーゼ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

本明細書において使用する場合、用語「細胞外マトリックス」は、細胞が培養で接着することができ、典型的には、細胞が付着することができる細胞外成分を含み、それにより、適切な培養基材を提供する任意の物質を指す。本発明での使用に適したものは、基底膜に由来する細胞外マトリックス成分、または接着分子受容体－リガンドカップリングの一部を形成する細胞外マトリックス成分である。細胞外マトリックスの例としては、限定されないが、単独、または様々な組み合わせで、ラミニンまたはその断片、例えば、ラミニン521、ラミニン511、またはiMatrix511、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパリン硫酸などが挙げられる。

本明細書において使用する場合、用語「ラミニン」は、異なるサブユニット鎖組成物を有するアイソフォームを含む細胞外マトリックスタンパク質である、α、β、γ鎖、またはこれらの断片からなるヘテロ三量体分子を指す。特に、ラミニンは、5種類のα鎖、4種類のβ鎖、および3種類のγ鎖の組み合わせのヘテロ三量体を含めた約15種類のアイソフォームを有する。ラミニンの名前を決定するために、α鎖（α1～α5）、β鎖（β1～β4）、およびγ鎖（γ1～γ3）のそれぞれの数が組み合わされる。例えば、α1鎖、β1鎖、γ1鎖の組み合わせからなるラミニンはラミニン-111と命名され、α5鎖、β1鎖、γ1鎖の組み合わせからなるラミニンはラミニン-511と命名され、α5鎖、β2鎖、γ1鎖の組み合わせからなるラミニンはラミニン-521と命名される。哺乳動物に由来するラミニンを本発明の方法で使用することができる。哺乳動物の例としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、およびヒトが挙げられる。RPE細胞が生成される場合、ヒトラミニンが好ましくは使用される場合。一態様では、ラミニンは組換えラミニンである。現在、ヒトラミニンは15種類のアイソフォームを含むことが公知である。

任意のラミニン断片を、それぞれ対応するラミニンの機能を保持する限り、本発明で使用することができる。すなわち、本発明で使用される「ラミニン断片」は、これが、ヘテロ三量体を構成するラミニンα鎖、β鎖およびγ鎖を有し、インテグリンへの結合活性を保持し、かつ細胞接着活性を維持する分子である限り、各鎖の長さに関して制限されない。ラミニン断片は、元のラミニンアイソフォームによって異なるインテグリン結合特異性を示し、対応するインテグリンを発現する細胞への接着活性を発揮することができる。一態様では、ラミニンは組換えラミニン-511 E8断片（例えば、iMatrix-511（Takara Bio））である。

本明細書において使用する場合、「投与」、「投与する」、およびこれらの変異形は、組成物または剤を対象に導入することを指し、組成物または剤の同時および連続的導入を含む。「投与」は、例えば、治療的、薬物動態学的、診断的、研究、プラセボ、および実験的方法を指すことができる。「投与」は、インビトロおよびエクスビボ治療も包含する。投与には、自己投与および他人による投与が含まれる。投与は、任意の適切な経路によって行うことができる。適切な投与経路は、組成物または剤がその意図された機能を果たすことを可能にする。例えば、適切な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または剤を対象の静脈に導入することによって投与される。

本明細書において使用する場合、用語「対象」、「個体」、「宿主」、および「患者」は本明細書において互換的に使用され、診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書において記載される方法は、ヒト療法と獣医学的適用の両方に適用可能である。いくつかの態様では、対象は哺乳動物であり、特定の態様では、対象はヒトである。

本明細書において使用する場合、活性剤（例えば、RPE細胞）の「治療量」、「治療的有効量」、「有効な量」、または「薬学的有効量」という用語は互換的に使用されて、治療の意図された恩恵を提供するのに十分である量を指す。しかし、投薬量レベルは、傷害のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、予測される細胞生着、長期生存、および／または用いられる特定の活性剤を含めて、様々な因子に基づく。したがって、投薬レジメンは広く変動し得るが、標準的な方法を使用して、医師が日常的に決定することができる。さらに、用語「治療量」、「治療的有効量」、および「薬学的有効量」は、記載される本発明の組成物の予防的または防止的量を含む。記載される本発明の予防的または防止的適用では、薬学的組成物または医薬は、疾患、障害、または状態の発生の間に呈する、疾患、障害、または状態の生化学的、組織学的および／または行動学的な症状、その合併症、ならびに中間の病理学的表現型を含めて、疾患、障害、または状態のリスクを排除するかもしくは低減させる、該疾患、障害、または状態の重症度を軽減する、または該疾患、障害、または状態の発症を遅らせるのに十分である量で、疾患、障害、もしくは状態に罹りやすいか、またはそうでなければ疾患、障害、もしくは状態のリスクを有する患者に投与される。一般に、最大用量、すなわち、ある種の医学的判断による最も安全な用量が使用されることが好ましい。用語「用量」および「投薬量」は本明細書において互換的に使用される。

本明細書において使用する場合、用語「治療効果」は治療の帰結を指し、その結果は望ましくかつ有益であると判断される。治療効果は、疾患発現の抑止、低減、または排除を直接的または間接的に含むことができる。治療効果は、疾患発現の進行の抑止、低減、または排除を直接的または間接的に含むこともできる。

本明細書において記載される治療剤（例えば、RPE細胞）については、治療的有効量は予備的なインビトロ研究および／または動物モデルから最初に決定することができる。治療有効量は、ヒトのデータから決定することもできる。投与量は、投与される化合物の相対的バイオアベイラビリティおよび有効性に基づいて調整することができる。上記の方法および他の周知の方法に基づいて最大の有効性を達成するために用量を調整することは、当業者の能力内である。

薬物動態原理は、許容できない有害作用を最低限に抑えて望ましい程度の治療有効性を得るために投薬レジメンを修正するための根拠を提供する。剤の血漿濃度を測定することができ、これを治療濃度域と関連付けることができる状況では、投薬量の修正のためのさらなるガイダンス得ることができる。

本明細書において使用する場合、用語「治療する」、「治療すること」、および／または「治療」は、状態の進行を妨げる、実質的に阻害する、緩徐化する、もしくは逆行させること、状態の臨床症状を実質的に改善させること、または状態の臨床症状の出現を実質的に防止すること、有益なまたは望ましい臨床結果を得ることを含む。治療することは、以下の1つまたは複数を成し遂げることをさらに指す：(a)障害の重症度を低減させること；(b)治療される障害に特徴的である症状の発生を制限すること；(c)治療される障害に特徴的である症状の悪化を制限すること；(d)以前に障害を有していた患者において障害の再発を制限すること；および(e)以前に障害について無症候であった患者において症状の再発を制限すること。

有益なまたは望ましい臨床結果、例えば、薬理的および／または生理的効果としては、限定されないが、疾患、疾患、障害、または状態になりやすい可能性があるが、疾患の症状をまだ経験もしておらず、示してもいない対象において、障害、または状態が生じないように防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害、または状態の症状の緩和、疾患、障害、または状態の程度の減少、疾患、障害、または状態の安定化（すなわち、悪化させないこと）、疾患、障害、または状態の広がりを防止すること、疾患、障害、または状態の進行を遅らせるかまたは緩徐化すること、疾患、障害、または状態の改善または寛解、およびこれらの組み合わせ、ならびに治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延ばすことが挙げられる。

I.本発明の方法
本発明は、最低限のRPE細胞の手動採集で、または該採集なしで、RPE前駆細胞を単離することができ、部分的に精製することができ、さらに成熟したRPE細胞に分化させることができる、RPE細胞への多能性幹細胞の分化の間のステージの発見に基づく。多能性細胞をRPE細胞に分化させるための任意の方法を使用することができる。例えば、RPE細胞は、本明細書において記載され、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWO 2005/070011にも記載されている単層方法を通じて多能性幹細胞を分化させることによって得ることができる。他の方法は、多能性幹細胞から胚様体を得ること、および胚様体をRPE細胞に分化させることを含み、参照によりその全体が組み入れられる、WO 2005/070011およびWO 2014/121077にも記載されている。別の例では、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWO 2019130061に記載されているように、第1の分化剤を使用して多能性幹細胞をRPE細胞系列に向けて分化させることができ、次いで、形質転換因子-β（TGFβ）スーパーファミリーのメンバー、ならびにアクチビン（例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB）、ノーダル、抗ミュラー管ホルモン（AMH）、骨形成タンパク質（BMP）（例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、ならびに増殖分化因子（GDF））を含めた相同リガンドを使用して、RPE細胞に向けてさらに分化させることができる。一態様では、RPE細胞は、WO 2019130061に記載されているように、(a)第1の分化剤（例えば、ニコチンアミド）を含む培地中で多能性幹細胞を培養すること、ならびに(b)TGFβスーパーファミリーのメンバー（例えば、アクチビンA）および第1の分化剤（例えば、ニコチンアミド）を含む培地中で工程(a)で得た細胞を培養することによって、得ることができる。さらに別の例では、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWO 2017/044488に記載されているように、多能性幹細胞の単一細胞懸濁液を使用して、RPEに分化させることができる。したがって、RPEは、多能性幹細胞から得ることができ、多能性幹細胞は、分化因子、例えば、WNT経路インヒビター（例えば、CKI-7、DKK1）、TGF経路インヒビター（例えば、LDN193189）、BMP経路インヒビター（例えば、SB431542）、MEKインヒビター（例えば、PD0325901）、形質転換因子-β（TGFβ）スーパーファミリーのメンバーおよび相同なリガンド、例えばアクチビンの1つまたは複数を含むことができる1種または複数種の分化培地中において、1つまたは複数の工程で分化する。さらに、RPE細胞は、非接着または接着培養から、およびフィーダーまたはフィーダーフリー培養から得ることができる。

一緒にとどまる十分な数のRPE前駆細胞（例えば、PAX6/MITF陽性細胞として特定される）のクラスターが存在する分化プロセスの間、RPE前駆細胞のクラスターを解離試薬で処理し、続いて、クラスターをサイズ分画し、引き続いて、RPE前駆細胞を単一細胞または細胞クラスターとして継代培養して、RPE細胞を生成することができる。本発明の方法は単純かつ効率的であり、いくつかの態様では、実質的に純粋なRPE細胞の培養物をもたらす。

一局面では、本発明は、網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、(i)PAX6+/MITF+RPE前駆細胞の細胞クラスターを得て、細胞クラスターを単一細胞に解離させる工程；(ii)細胞がRPE細胞に分化するように分化培地中で単一細胞を培養する工程；および(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程を含み；それによってRPE細胞の集団を生成する方法を提供する。別の局面では、本発明は、網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、(i)PAX6+/MITF+RPE前駆細胞の細胞クラスターを得る工程、(ii)細胞がRPE細胞に分化するように分化培地中で細胞クラスターを培養する工程；および(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程を含み；それによってRPE細胞の集団を生成する方法を提供する。本発明の態様のいずれかでは、PAX6+/MITF+RPE前駆細胞は多能性幹細胞の集団から得ることができる。

一局面では、本発明は、網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、(i)多能性幹細胞がRPE前駆細胞に分化するように第1の分化培地中で多能性幹細胞の集団を培養する工程；(ii)RPE前駆細胞を解離させ、細胞を分画してRPE前駆細胞クラスターを収集し、RPE前駆細胞クラスターを単一細胞に解離させ、単一細胞がRPE細胞に分化するように第2の分化培地中で単一細胞を継代培養する工程；および(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程を含み；それによってRPE細胞の集団を生成する方法を提供する。別の局面では、本発明は、網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、(i)多能性幹細胞がRPE前駆細胞に分化するように第1の分化培地中で多能性幹細胞の集団を培養する工程；(ii)RPE前駆細胞を解離させ、細胞を分画してRPE前駆細胞クラスターを収集し、細胞がRPE細胞に分化するように、収集したRPE前駆細胞クラスターを第2の分化培地中で継代培養する工程；および(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程を含み、それによってRPE細胞の集団を生成する方法を提供する。本発明の一態様では、RPE前駆細胞はPAX6/MITFに対して陽性である。別の態様では、工程(i)より前に、多能性幹細胞は、多能性を支持する培地中のフィーダー細胞上で培養される。さらなる態様では、工程(i)より前に、多能性幹細胞は、多能性を支持する培地中でフィーダーフリーで培養される。一態様では、多能性を支持する培地にbFGFが補充される。

方法は、RPE細胞を解離させ、RPE細胞を分画してRPE細胞クラスターを収集し、RPE細胞クラスターを単一RPE細胞に解離させ、単一RPE細胞を培養することによって、工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収することをさらに含むことができる。別の態様では、方法は、RPE細胞を解離させ、RPE細胞クラスターを収集し、RPE細胞クラスターを選択的に採集することによって、工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収することをさらに含むことができる。方法は、選択的に採集したRPE細胞クラスターを単一RPE細胞に解離させ、単一RPE細胞を培養することをさらに含むことができる。

一態様では、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞であり、RPE細胞はヒトRPE細胞である。これらの工程のいずれも、非接着または接着培養において、フィーダーまたはフィーダーフリー条件下で行うことができる。

一態様では、RPE前駆細胞クラスターおよび／またはRPE細胞クラスターは、約40～約200μm、約40～約100μm、約40μm～約70μm、約70μm～約100μm、約70μm～約200μm、または約100μm～約200μmの間のサイズを有する。

いくつかの態様では、多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞である。他の態様では、多能性幹細胞はヒトiPS細胞である。いくつかの態様では、RPE細胞は回収後にさらに拡大される。いくつかの態様では、本発明の方法は、実質的に純粋なRPE細胞の培養物をもたらす。RPE細胞の実質的に精製された集団は、RPE細胞が集団中の細胞の少なくとも約75％を構成するものである。他の態様では、RPE細胞の実質的に精製された集団は、RPE細胞が、集団中の細胞の少なくとも約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、99％、またはさらに99％超を構成するものである。態様のいずれかでは、RPE細胞はヒトRPE細胞である。

本発明の態様のいずれかでは、RPE細胞は、RPE65、CRALBP、PEDF、ベストロフィン（BEST1）、MITF、OTX2、PAX2、PAX6、プレメラノソームタンパク質（PMELまたはgp-100）、チロシナーゼ、およびZO1の群より選択されるマーカーの1つまたは複数を発現する。一態様では、RPE細胞は、ベストロフィン、PMEL、CRALBP、MITF、PAX6、およびZO1を発現する。さらなる態様では、RPE細胞は、ベストロフィン、PAX6、MITF、およびRPE65を発現する。一態様では、RPE細胞は、MITFならびにベストロフィンおよびPAX6より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する。

本発明の態様のいずれかでは、RPE細胞は、OCT4、NANOG、REX1、アルカリホスファターゼ、SOX2、TDGF-1、DPPA-2、DPPA-4、ステージ特異的胚抗原（SSEA）-3およびSSEA-4、腫瘍拒絶抗原（TRA）-1-60およびTRA-1-80の群より選択される1つまたは複数の幹細胞マーカーの実質的な発現を欠く。一態様では、RPE細胞は、OCT4、SSEA4、TRA-1-81、およびアルカリホスファターゼの実質的な発現を欠く。別の態様では、RPE細胞は、OCT4、NANOG、およびSOX2の実質的な発現を欠く。

多能性幹細胞の培養
多能性幹細胞、例えば、胚性幹（ES）細胞またはiPS細胞は開示される方法の出発材料であり得る。本明細書の態様のいずれかでは、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞（hPSC）であり得る。多能性幹細胞（PSC）は、当技術分野において公知の任意の方法で、例えば、フィーダー細胞の存在または非存在下で培養することができる。さらに、任意の方法を使用して生成されたPSCを、RPE細胞を生成するための出発材料として使用することができる。例えば、hES細胞は、卵子と精子のインビトロ受精の生成物であった胚盤胞期胚に由来し得る。あるいは、hES細胞は、任意で胚の残部の破壊なしで、初期卵割期胚から取り出された、1つまたは複数の卵割球に由来し得る。さらに別の態様では、hES細胞は、核移植を使用して生成することができる。さらなる態様では、iPSCを使用することができる。出発材料として、予め凍結保存されたPSCを使用することができる。別の態様では、凍結保存されたことがないPSCを使用することができる。

本発明の一局面では、PSCは、フィーダーまたはフィーダーフリー条件化で細胞外マトリックス上にプレーティングされる。いくつかの態様では、細胞外マトリックスは、e-カドヘリンを有するかまたは有さないラミニンである。いくつかの態様では、ラミニンは、ラミニン521、ラミニン511、またはiMatrix511を含む群より選択することができる。いくつかの態様では、フィーダー細胞はヒト真皮線維芽細胞（HDF）である。他の態様では、フィーダー細胞はマウス胚線維芽細胞（MEF）である。

ある特定の態様では、PSCを培養する場合に使用される培地は、PSCを培養するのに適している任意の培地より選択することができる。いくつかの態様では、PSC培養を支持することができる任意の培地を使用することができる。例えば、当業者は、市販のまたは専売の培地の中から選択することができる。さらなる態様では、PSCは、多能性を支持する培地において、限定されないが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、またはゼラチンを含めた細胞外マトリックス上で培養することができる。

多能性を支持する培地は、当技術分野において公知の任意のそのよう培地であり得る。いくつかの態様では、多能性を支持する培地はNutristem^（商標）である。いくつかの態様では、多能性を支持する培地はTeSR^（商標）である。いくつかの態様では、多能性を支持する培地はStemFit^（商標）である。他の態様では、多能性を支持する培地はKnockout^（商標）DMEM（Gibco）であり、これは、Knockout^（商標）Serum Replacement（Gibco）、LIF、bFGF、または任意の他の因子で補充されてもよい。これらの例示的な培地のそれぞれは当技術分野において公知であり、市販されている。さらなる態様では、多能性を支持する培地は、bFGFまたは任意の他の因子で補充されてもよい。一態様では、bFGFは低濃度（例えば、4ng/mL）で補充されてもよい。別の態様では、bFGFはより高濃度（例えば、100ng/mL）で補充されてもよく、これは、PSCを分化のために刺激することができる。

本発明の生成方法で使用されるPSCの濃度は特に制限されない。例えば、10cm皿が使用される場合、皿あたり1×10⁴～1×10⁸細胞、好ましくは、皿あたり5×10⁴～5×10⁶細胞、より好ましくは、皿あたり1×10⁵～1×10⁷細胞が使用される。

いくつかの態様では、PSCは、約1,000～100,000細胞／cm²の細胞密度でプレーティングされる。いくつかの態様では、PSCは、約5000～100,000細胞／cm²、約5000～50,000細胞／cm²、または約5000～15,000細胞／cm²の細胞密度でプレーティングされる。他の態様では、PSCは、約10,000細胞／cm²の密度でプレーティングされる。

いくつかの態様では、多能性を支持する培地、例えば、StemFit^（商標）または他の同様の培地は、細胞をRPE細胞に分化させるために、分化培地（例えば、bFGFなどの多能性支持因子を含まない培地）と交換される。一態様では、胚様体（EB）はPSCから形成され、EBはRPE細胞にさらに分化させられる。

いくつかの態様では、多能性を支持する培地から分化培地への培地の交換は、PSCの細胞培養の間の異なる時点で行うことができ、PSCの初期のプレーティング密度にも依存し得る。いくつかの態様では、培地の交換は、多能性培地で3～14日間PSCを培養した後に行うことができる。いくつかの態様では、培地の交換は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14日目に行うことができる。

多能性幹細胞の分化
RPE細胞への多能性幹細胞の分化は、多能性を支持する培地を1種または複数種の分化培地、例えばEBDMと交換した後に開始される。いくつかの態様では、多能性幹細胞は、分化誘導因子の非存在下でRPE細胞に自発的に分化する。他の態様では、多能性幹細胞をRPE細胞に分化させるために、分化誘導因子、例えば、アクチビン、ノーダルシグナルインヒビター、Wntシグナルインヒビター、またはソニックヘッジホッグシグナルインヒビターを使用することができる。

いくつかの態様では、分化培地はEB分化培地（EBDM）である。EBDMは、Xeno-free Knockout^（商標）Serum Replacement（XF-KSR）（Gibco）を含むKnockout^（商標）DMEM（Gibco）、ベータ－メルカプトエタノール、NEAA、およびグルタミンを含む。当技術分野において公知の任意の他の分化培地を使用することができる。別の態様では、分化培地は、1つまたは複数の分化剤、例えば、ニコチンアミド、形質転換因子-β（TGFβ）スーパーファミリーのメンバー（例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB）、ノーダル、抗ミュラー管ホルモン（AMH）、骨形成タンパク質（BMP）（例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、増殖分化因子（GDF））、WNT経路インヒビター（例えば、CKI-7、DKK1）、TGF経路インヒビター（例えば、LDN193189、ノギン）、BMP経路インヒビター（例えば、SB431542）、ソニックヘッジホッグシグナルインヒビター、bFGFインヒビター、ならびに／またはMEKインヒビター（例えば、PD0325901）を含むことができる。一態様では、第1の分化剤を含む第1の分化培地中で多能性幹細胞をRPE細胞系列に向けて分化させることができ、次いで、第2の分化剤を含む第2の分化培地中でRPE細胞に向けてさらに分化させることができる。一態様では、第1の分化培地はニコチンアミドを含み、第2の分化培地はアクチビン（例えば、アクチビンA）を含む。さらに、RPE細胞は、非接着または接着培養から、フィーダーまたはフィーダーフリー条件下で得ることができる。

一態様では、分化培地は分化の間毎日変えることができる。いくつかの態様では、分化培地は、その後、分化の間2～3日ごとに変えられる。いくつかの態様では、細胞は、約3～12週間、例えば、6～10週間、2～8週間、または3～6週間、分化培地で培養される。

一態様では、多能性を支持する培地を分化培地と交換した後に、培養において多能性細胞の分化を決定し、RPE前駆細胞を特定するために、分子マーカーおよび形態的特徴を検出することができる。細胞がRPE細胞であるかまたはRPE前駆体であるかどうかは、光学顕微鏡または電子顕微鏡を使用して、指標としての細胞形態（例えば、細胞内メラニン色素沈着、多角形および平らな細胞形態、多角形アクチン束の形成など）の変化によって、判断することができる。RPEの分子的特色、形態的特色、および他の特色の検出は、例えば、米国特許第7,794,704号；米国特許第7,736,896号；WO 2009/051671；WO 2012/012803；WO 2013/074681；WO 2011/063005；およびWO 2016/154357に記載されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。したがって、いくつかの態様では、多能性を支持する培地が分化培地と交換された後に、多能性細胞の分化は、培養におけるRPE前駆細胞の形態的特徴の特定によって観察される。

さらなる態様では、多能性を支持する培地が分化培地と交換された後に、多能性細胞の分化は、分化細胞の分子マーカーの遺伝子発現の変化を観察することによって特定される。いくつかの態様では、分化細胞の分子マーカーはアップレギュレートされる。さらなる態様では、多能性の分子マーカーはダウンレギュレートされる。いくつかの態様では、分化細胞の分子マーカーの遺伝子発現の変化は、qPCR／スコアカードによって、および／または免疫染色によって確認することができる。いくつかの態様では、分化細胞の分子マーカーの遺伝子発現の変化は約3週間の分化後に観察される。

いくつかの態様では、網膜系列の分子マーカーはPAX6であり、色素性細胞のマーカーはMITFである。したがって、PAX6および／またはMITFを発現する細胞の集団は、網膜系列／RPEの前駆体が存在し、これを培養から単離することができることを示す。

他の態様では、培養条件が、RPE前駆細胞を生成することが公知である限り、多能性細胞の分化を決定し、RPE前駆体を特定することが必要ではない可能性がある。したがって、PAX6/MITFについて試験する必要なしに、PAX6およびMITFに陽性のクラスターを単離することができる。

RPE前駆細胞の単離および継代培養
上皮形態の細胞は、密着結合の形成によって、培養中に一緒に保持されており、分化の間に同様のタイプの細胞のクラスターを生成する。したがって、いくつかの態様では、望ましいRPE前駆体細胞集団の単離のために、分化している培養物を、例えば、酵素的または非酵素的解離試薬、例えば、コラゲナーゼまたはディスパーゼで、消化したかまたは解離させた、RPE前駆細胞および単一細胞を含む細胞クラスターを含む懸濁液を形成する。以下に記載のように、単一細胞および非上皮細胞を分離し、捨てることができる。さらに、以下に記載のように、非RPE細胞の大きなクラスターおよびRPEと非RPEの混合物を含むクラスターをサイズ分画によって排除することができ、これによって、純度を高めることが可能になる。

いくつかの態様では、望ましいRPE前駆体細胞集団を単離するために、分化中の培養物を解離試薬で消化することができ、これにより、細胞の遊離浮遊クラスターの単離が可能になる。いくつかの態様では、解離試薬はコラゲナーゼである。他の態様では、解離試薬はディスパーゼである。いくつかの態様では、解離試薬による解離は一晩行われる。いくつかの態様では、解離試薬による解離は約2～30時間行われる。一態様では、解離試薬による解離は、約3～10時間または約3～6時間行われる。一態様では、解離試薬による解離は、約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18時間行われる。

いくつかの態様では、解離は分化の開始後約2～12週で行われる。いくつかの態様では、解離は分化の開始後約2週、約3週、4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約11週または約12週目に行われる。さらなる態様では、解離はPAX6およびMITFに対して陽性の上皮形態のクラスターに対して行われる。

本明細書において開示される方法の別の局面では、RPE前駆細胞クラスターを単離するために、細胞クラスターおよび単一細胞を含む懸濁液が分画される。望ましいRPE前駆細胞クラスターを収集するための任意の方法を使用することができる。一態様では、単一細胞および他の望ましくない細をセルストレーナーまたは一連のセルストレーナーを通過させることができ、セルストレーナー上に残存している細胞を回収することによって、望ましい細胞クラスター集団を収集することができる。いくつかの態様では、さらなる処理のために収集された細胞クラスターは、約40μm～約100μmの間のサイズの細胞クラスターを含む。他の態様では、収集された細胞クラスターは、約40μm～約200μmの間のサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約40μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約50μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約60μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約70μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約80μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約90μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約100μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約110μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約120μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約130μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約140μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約150μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約160μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約170μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約180μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約190μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集された細胞クラスターは、約200μmのサイズの細胞クラスターを含む。

いくつかの態様では、望ましいサイズ要件を満たさない単一細胞および細胞培養物は捨てられる。いくつかの態様では、一連のセルストレーナーを使用して、望ましいサイズ要件を有する細胞クラスターを収集することができる。例えば、第1のセルストレーナーは小さなメッシュサイズ（例えば、40μm）を有することができ、第1のセルストレーナー上に残存する細胞クラスター集団が収集される。次いで、収集された細胞クラスター集団をより大きなメッシュサイズ（例えば、200μm、100μm）を有する第2のセルストレーナー上に設置することができ、第2のセルストレーナーを通過する細胞クラスター集団を収集して、望ましいサイズ要件（例えば、40μm～200μm、または40μm～100μm）を得ることができる。あるいは、第1のセルストレーナーは、より大きなメッシュサイズ（例えば、200μm、100μm）を有する第1のセルストレーナーでもよく、その結果、セルストレーナーを通過する細胞クラスター集団が収集され、第1のセルストレーナー上に残存しているより大きな細胞クラスターが捨てられる。次いで、通過細胞をより小さなメッシュサイズ（例えば、40μm）を有する第2のセルストレーナー上に設置することができ、その結果、第2のセルストレーナー上に残存している細胞クラスターが収集され、これは、望ましいサイズ要件（例えば、40μm～200μm、または40μm～100μm）を有する。

収集されたRPE前駆細胞は、クラスターとして、または単一細胞として継代培養して、以下に記載の方法に従って増殖性の成熟したRPE細胞を得ることができる。

RPE細胞得るための単一RPE前駆細胞継代培養方法
単一RPE前駆細胞継代培養方法では、上記のように得られたRPE前駆細胞クラスターを解離試薬で解離させて単一細胞を得ることができ、RPE前駆単一細胞の集団は、RPE細胞が得られるまで分化培地中で継代培養される。一態様では、細胞は、ラミニン、例えば、ラミニン521、ラミニン511、もしくはiMatrix511、または他の細胞外マトリックス、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、もしくはゼラチン上で継代培養される。いくつかの態様では、細胞は、約1～8週間継代培養される。いくつかの態様では、細胞は、約2、3、4、5、6、7、または8週間継代培養される。他の態様では、細胞は、少なくとも8週間継代培養される。一態様では、細胞は、接着培養皿などの接着条件下で継代培養することができる。別の態様では、細胞は、非接着条件下、およびフィーダーまたはフィーダーフリー条件下で継代培養することができる。

次いで、例えば解離試薬を用いてRPE細胞を回収し、RPE細胞クラスターを得ることができる。RPE細胞クラスターは、当技術分野において公知の任意の方法によって、RPE細胞を回収し、単一細胞を除去することによって、得ることができる。一態様では、上記のように、RPE細胞を回収し、ストレーナーまたは一連のストレーナーを通過させて、RPE細胞クラスターを得ることができる。任意のセルストレーナーサイズ、例えば、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、もしくは200μmのサイズ、またはこれらの組み合わせを使用することができる。得られたRPE細胞クラスターは、少なくとも40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、または200μmのサイズであり得る。いくつかの態様では、さらなる処理のために収集されたRPE細胞クラスターは、約40μm～約100μmのサイズの細胞クラスターを含む。他の態様では、収集されたRPE細胞クラスターは、約40μm～約200μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集されたRPE細胞クラスターは、約40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、または200μmのサイズの細胞クラスターを含む。

一態様では、得られたRPE細胞クラスターを酵素的または非酵素的解離試薬で単一細胞に解離させ、培養して、RPE細胞を拡大させることができ、以下にさらに記載される。

代替の態様では、色素性細胞の島を得られたRPE細胞クラスターから選択的に採集することができる。この選択的な／最低限の採集プロセスは、前の継代培養工程で望ましい細胞集団が濃縮されているので、実質的により簡単であり、高純度のRPEをもたらす。RPEは、手動で、例えば、ガラス毛細管を使用して機械的に、光学顕微鏡を使用することによってなど、または他のタイプの細胞からRPE細胞を識別することができる自動システムによって、選択的に採集することができる。次いで、選択されたRPEクラスターを解離させて、単一RPE細胞を生成することができる。単一RPE細胞を培養して、以下にさらに記載するようにRPE細胞を拡大させることができる。

本発明の態様のいずれかでは、RPE細胞は、RPE65、CRALBP、PEDF、ベストロフィン、MITF、OTX2、PAX2、PAX6、プレメラノソームタンパク質（PMELまたはgp-100）、チロシナーゼ、およびZO1の群より選択されるマーカーの1つまたは複数を発現する。一態様では、RPE細胞は、ベストロフィン、PMEL、CRALBP、MITF、PAX6、およびZO1を発現する。さらなる態様では、RPE細胞は、ベストロフィン、PAX6、MITF、およびRPE65を発現する。一態様では、RPE細胞は、MITFならびにベストロフィンおよびPAX6より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する。本発明の態様のいずれかでは、RPE細胞は、OCT4、NANOG、REX1、アルカリホスファターゼ、SOX2、TDGF-1、DPPA-2、DPPA-4、ステージ特異的胚抗原（SSEA）-3およびSSEA-4、腫瘍拒絶抗原（TRA）-1-60およびTRA-1-80の群より選択される1つまたは複数の幹細胞マーカーの実質的な発現を欠く。一態様では、RPE細胞は、OCT4、SSEA4、TRA-1-81、およびアルカリホスファターゼの実質的な発現を欠く。別の態様では、RPE細胞は、OCT4、NANOG、およびSOX2の実質的な発現を欠く。

いくつかの態様では、生成されたRPE細胞の試料を望ましい分子マーカープロファイルについて試験し、次いで、回収することができる。他の態様では、培養条件が、RPE細胞を生成することが公知である限り、回収する前に分子マーカーについてRPE細胞を試験する必要がない可能性がある。したがって、分子マーカーについて試験する必要なしに、RPE細胞を回収することができる。

RPE細胞を得るためのRPE前駆細胞クラスター継代培養方法
RPE前駆細胞クラスター継代培養方法では、上記のサイズ分画の後に得られたRPE前駆細胞クラスターは、RPE細胞が得られるまで細胞クラスターとして分化培地中で継代培養される。一態様では、RPE前駆細胞クラスターは、ラミニン、例えば、ラミニン521、ラミニン511、もしくはiMatrix511、または他の細胞外マトリックス、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、もしくはゼラチン上で継代培養される。いくつかの態様では、細胞クラスターは約1～8週間継代培養される。いくつかの態様では、細胞クラスターは約2、3、4、5、6、7、または8週間継代培養される。他の態様では、細胞クラスターは少なくとも8週間継代培養される。一態様では、細胞クラスターは非接着条件下で継代培養することができる。別の態様では、細胞クラスターは接着条件下で継代培養することができる。別の態様では、細胞クラスターはフィーダーまたはフィーダーフリー条件下で培養することができる。

次いで、例えば解離試薬を用いてRPE細胞を回収して、RPE細胞クラスターを得ることができる。RPE細胞クラスターは、当技術分野において公知の任意の方法によって、RPE細胞を回収し、単一細胞を除去することによって、得ることができる。一態様では、上記のように、RPE細胞を回収し、ストレーナーまたは一連のストレーナーを通過させて、RPE細胞クラスターを得ることができる。任意のセルストレーナーサイズ、例えば、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、もしくは200μmのサイズ、またはこれらの組み合わせを使用することができる。得られたRPE細胞クラスターは、少なくとも40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、または200μmのサイズであり得る。いくつかの態様では、さらなる処理のために収集されたRPE細胞クラスターは、約40μmから約100μmのサイズの細胞クラスターを含む。他の態様では、収集されたRPE細胞クラスターは、約40μmから約200μmのサイズの細胞クラスターを含む。いくつかの態様では、収集されたRPE細胞クラスターは、約40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、または200μmのサイズの細胞クラスターを含む。

代替の態様では、次いで、色素性細胞の島を得られたRPE細胞クラスターから選択的に採集することができる。この選択的な／最低限の採集プロセスは、前の継代培養工程で望ましい細胞集団が濃縮されているので、実質的により簡単であり、高純度のRPEをもたらす。RPEは、手動で、例えば、ガラス毛細管を使用して機械的に、光学顕微鏡を使用することによってなど、または他のタイプの細胞からRPE細胞を識別することができる自動システムによって、選択的に採集することができる。次いで、選択されたRPEクラスターを解離させて、単一RPE細胞を生成することができる。単一RPE細胞を培養して、以下にさらに記載するようにRPE細胞を拡大させることができる。

RPE細胞の拡大
いくつかの態様では、単一RPE前駆細胞継代培養またはRPE前駆細胞クラスター継代培養方法から得られたRPE細胞は、RPE細胞集団を拡大させるために、RPEの成長または増殖を支持する培地において、細胞外マトリックス、例えば、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、またはゼラチン上で培養することができる。

本工程で最初に培養されるRPE細胞集団は、本明細書において「P0」と称される。一態様では、細胞外マトリックスは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、およびゼラチンからなる群より選択される。いくつかの態様では、細胞外マトリックスはラミニンである。一態様では、ラミニンは、ラミニン521、ラミニン511、またはiMatrix511より選択される。さらなる態様では、ラミニンはe-カドヘリンを含む。別の態様では、細胞外マトリックスはゼラチンである。いくつかの態様では、培地は、RPE-MM（RPEGMMM、MM、または維持培地とも称され、KSRおよびFBSを含むDMEM/KO-DMEM、ベータ－メルカプトエタノール、NEAA、ならびにグルタミンを含む）、StemFit、EGM2、またはEBDMである。いくつかの態様では、RPE-MMは、FGF（MM/FGF）が補充される。他の態様では、RPEの増殖および拡大を支持する当技術分野において公知の他の培地を使用することができる。任意のそのような培地は、FBSおよび／またはbFGF、または任意の他の因子、例えば、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、血管内皮増殖因子、組換えインスリン様増殖因子、アスコルビン酸、またはヒト上皮増殖因子で補充されてもよいし、補充されなくてもよい。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWO2013074681Aを参照されたい。

一態様では、十分な数のRPE細胞が得られるまで、RPE細胞を継代および培養することができる。一態様では、RPE細胞は無期限に継代される。別の態様では、RPE細胞は少なくとも1回（「P1」）から最大20回（「P20」）まで継代される。一態様では、RPE細胞は少なくとも2回（「P2」）から最大8回（「P8」）まで継代される。さらなる態様では、RPE細胞は2回（「P2」）、3回（「P3」）、4回（「P4」）、5回（「P5」）、6回（「P6」）、7回（「P7」）、または8回（「P8」）継代される。RPE細胞は、さらに使用するまで凍結保存することができる。一態様では、各拡大フェーズの期間は、数日、数週から数か月まで変動し得る。一態様では、拡大フェーズの期間は約2～90日の間である。別の態様では、拡大フェーズの期間は、約2～60日、3～50日、3～40日、3～30日、3～25日、8～25日、10～25日、または2～14日、または2～10日の間である。拡大フェーズの間、1～2日ごとなどの間隔で新鮮な培地を添加することができる。一態様では、bFGFは、各継代（例えば、P0、P1、P2）のRPE拡大の最初の1～5日、1～4日、1～3日、1～2日、1日、2日、3日、4日、または5日の間、約1～100ng/mlの濃度でRPE細胞培養培地に加えられ、次いで、さらに継代されるまで除去される。一態様では、bFGFの濃度は、約1～50ng/ml、約2～40ng/ml、約3～30ng/ml、約4～20ng/ml、または約4～10ng/mlである。特定の態様では、bFGFの濃度は、約4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、または10ng/mlである。

フィーダーおよびフィーダーフリーベースの培養
マウスフィーダー層
本明細書において開示されるように、PSCは、フィーダー細胞としてのマウス胚線維芽細胞（MEF）上で培養することができる（例えば、Thomson J A, Itskovitz-Eldor J, Shapiro S Xenon, Waknitz M A, Swiergiel J Siegel, Marshall V S, Jones J M. (1998)；Science 282: 1145-7；Reubinoff B E, Pera M F, Fong C, Trounson A, Bongso A. (2000)；Reubinoff et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18: 399-404を参照されたい）。MEF細胞は、ウシ胎仔血清が補充された培地中の12～13日目のマウス胚に由来し得る。

PSCは、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）が補充された血清代替品を使用して、血清フリー条件化で、MEF上で培養することができる（例えば、Amit M, Carpenter M K, Inokuma M S, Chiu C P, Harris C P, Waknitz M A, Itskovitz-Eldor J, Thomson J A. (2000)を参照されたい）。クローンに由来するヒト胚性幹細胞株は、長期間の培養にわたって多能性および増殖能を維持する（例えば、Dev. Biol. 227: 271-8を参照されたい）。さらに、多能性状態の維持を促進する条件下で培養した場合、血清代替品下での6か月の培養後、PSCは、その多能性を依然として維持することができる。PSCの多能性は、3つの胚性胚葉すべてを含む奇形腫を形成する能力によって示され得る。さらに、RPEへのPSCの分化は、マウスフィーダー細胞の存在下で行うことができる。したがって、本明細書において記載される方法で使用されるPSCをマウスフィーダー細胞上で培養することができる。

ヒトフィーダー細胞
PSCは、例えば、PCT公開第WO2009048675号に記載されているように、ヒトフィーダー細胞上で培養すること、維持すること、または分化させることができる。PSCは、ヒトフィーダー細胞上でのPSCの複数の連続的継代によって、未分化状態で維持することができる（例えば、Richards et al., 2002, Nat. Biotechnol. 20: 933-6を参照されたい）。PSCは、ヒトフィーダー細胞の存在下でRPEに分化させることもできる。したがって、本明細書において記載される方法で使用されるPSCは、ヒトフィーダー細胞上で培養することができる。

フィーダーフリー培養
PSCは、培養培地の存在下で、細胞外マトリックス（例えば、Matrigel（登録商標）またはラミニン）などの固体表面上で、フィーダーフリーシステムで培養することができる。参照により本明細書に組み入れられるRowland et al., Journal Cell Physiology, 227:457-466, 2012に概説されているように、エクスビボでPSCをRPE細胞に分化させるための様々な方法が当技術分野において公知である。したがって、本明細書において記載される方法で使用されるPSCは、フィーダーフリー培養で培養することができる。

FGF/bFGFおよびROCKインヒビターの使用
哺乳動物の発生において、RPEは、神経網膜、すなわち眼胞の神経上皮と同じ前駆体を共有する。ある特定の条件下で、RPEは、ニューロン前駆体（Opas and Dziak, 1994, Dev Biol. 161(2):440-54）、ニューロン（Chen et al., 2003, J Neurochem. 84(5):972-81；Vinores et al., 1995, Exp Eye Res. 60(6):607-19）、およびレンズ上皮（Eguchi, 1986）に分化転換することができる。ニューロンへのRPEの変化を刺激することができる因子のうちの1つは、bFGF（Opas and Dziak, 1994, Dev Biol. 161(2):440-54）であり、すなわち、眼の発生に通常必要とされる転写活性化因子、例えば、rx/rax、chx10/vsx-2/alx、ots-1、otx-2、six3/optx、six6/optx2、mitf、およびPAX6/pax2の発現と関連するプロセス（Fischer and Reh, 2001, Dev Neurosci. 23(4-5):268-76；Baumer et al., 2003, Development;130(13):2903-15）である。ひな鳥の網膜の縁が神経幹細胞を含むこと（Fischer and Reh, 2000; Dev Biol. 15;220(2):197-210）、およびPAX6/mitfを発現するその領域の色素性細胞が、FGFに応答して神経細胞を形成することができること（Fischer and Reh, 2001, Dev Neurosci. 23(4-5):268-76）が示された。

いくつかの態様では、本発明のPSCは、1～200ng/ml bFGFを含む培養培地において、多能性状態で維持することができる。一態様では、bFGFの濃度は、約1～100ng/ml、約2～100ng/ml、約3～100ng/ml、または約4～100ng/mlである。特定の態様では、bFGFの濃度は、約100ng/mlである。いくつかの態様では、bFGFの存在下で、PSCをRPE細胞に分化させることができる。他の態様では、上記および本明細書で説明されるように、bFGFの存在下で、RPE細胞を拡大させることができる。

RPE形成の間、rho結合プロテインキナーゼ（ROCK）のインヒビターの存在下で多能性細胞を培養することができる。ROCKインヒビターは、細胞においてRho結合キナーゼまたはそのシグナリング経路の機能を阻害するかまたは低減させる任意の物質、例えば、小分子、siRNA、miRNA、アンチセンスRNAなどを指す。本明細書において使用する場合、「ROCKシグナリング経路」は、細胞におけるRho-ROCK-ミオシンIIシグナリング経路、その上流のシグナリング経路、またはその下流のシグナリング経路などのROCK関連シグナリング経路に関与する任意のシグナルプロセッサーを含むことができる。使用することができる例示的なROCKインヒビターは、StemgentのStemolecule Y-27632である（Watanabe et al., Nat Biotechnol. 2007 Jun;25(6):68 1-6を参照されたい）。他のROCKインヒビターとしては、例えば、H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、ヒドロキシル-HA-1077、GSK269962A、およびSB-772077-Bが挙げられる。それぞれが、あたかもその全体が記載されるかのように参照により本明細書に組み入れられる、Doe et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 32:89-98, 2007；Ishizaki, et al, Mol. Pharmacol., 57:976-983, 2000；Nakajima et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 52:3 1 9-324, 2003；およびSasaki et al., Pharmacol. Ther., 93 :225-232, 2002。ROCKインヒビターは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2012/0276063号に記載されているような、当技術分野において公知の濃度および／または培養条件で利用することができる。例えば、ROCKインヒビターは、その中から導き出せる任意の範囲を含めて、約0.05～約50マイクロM、例えば、少なくともまたは約0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50マイクロMの濃度、または細胞の増殖または生存の促進に有効な任意の濃度を有し得る。さらなる態様では、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるPCT公開第WO2013074681A1号によって記載されているように、RPEの拡大培養は、ROCKインヒビターおよび／またはbFGFでさらに補充されてもよい。

接着および非接着培養
本開示で使用される「接着培養」は、関心対象の細胞が細胞培養基材、例えばラミニンを介して組織培養容器に接着している状態での培養を意味する。細胞は、いかなるさらなる基材コーティングもなしで細胞接着のために処理された（「組織培養処理された」）プラスチックにも接着することができる。

いくつかの態様では、多能性幹細胞からRPE細胞への分化は接着培養によって行われる。接着培養は、細胞接着性培養容器を使用することによって行うことができる。細胞接着性培養容器は、細胞への接着性を向上させるように培養容器の表面が処理されている限り、特に制限されないが、例えば、細胞外マトリックス、合成ポリマーなどを含むコーティングされた層を有する培養容器を使用することができる。コーティングされた層は、1種または複数種の成分で構成されてもよく、または単層もしくは多層によって形成されてもよい。細胞外マトリックスは、多能性幹細胞に接着性を示すコーティングされた層を形成することができる限り、特に制限されないが、例えば、単独で、または組み合わせて使用することができる、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチンなどである。複数種の細胞外マトリックスを含む市販製品として、Matrigel（BD）、CellStart（Invitrogen）などが入手可能である。合成ポリマーとして、生物学的または化学的に生成されたポリマーを使用することができる。例えば、陽イオン性ポリマー、例えば、ポリリジン（ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン）、ポリオルニチンポリエチレンイミン（PEI）、ポリ-N-プロピルアクリルアミド（PIPAAm）などが好ましくは使用される。細胞外マトリックスまたは合成ポリマーは、細菌、細胞などを使用し、必要に応じて遺伝子改変を導入することによって、生物学的に生成することができ、または化学的に合成することができる。他の態様では、細胞は、細胞外マトリックスに見られるインテグリン接着受容体が結合するRGDペプチドを介して細胞外マトリックスに結合することができる。

いくつかの態様では、接着培養は、いかなる細胞培養基材でも処理されておらず、細胞接着のためにも処理されていない組織培養容器で行うことができる。例えば、FBS、フィブロネクチン、またはビトロネクチンなどの培地成分は、組織培養容器に吸収され、細胞接着基材として働くことができる。他の態様では、組織培養容器中の細胞は、細胞接着基材としても働くことができる細胞外マトリックスを分泌し得る。

本開示で使用される「非接着培養」は、関心対象の細胞が組織培養容器に接着しないかまたは実質的に接着しない状態での培養を意味する。したがって、非接着培養における単一細胞または細胞のクラスターは、培養で浮遊することができ、懸濁状態であり得る。非接着培養の単一細胞は、適切な条件下でクラスターまたは凝集体を形成することができる。一態様では、ポリスチレン容器の表面に共有結合している親水性で中性に荷電したコーティング、例えば、Corning（登録商標）Ultra-Low Attachment Surfaceで培養容器の表面をコーティングすることができる。非結合表面は、特異的および非特異的固定化を阻害し、細胞を懸濁状態にする。懸濁状態で細胞を培養するために、スピナーフラスコ（Corning）中で細胞を培養することもできる。非接着培養で細胞を培養する他の方法は当業者に公知であり、本発明の方法で使用することができる。

II.網膜色素上皮細胞の使用方法
本明細書において記載される方法によって生成されるRPE細胞およびRPE細胞を含む薬学的組成物は、RPE細胞が必要とされるかまたは治療を向上させるであろう細胞ベースの治療に使用することができる。RPE細胞ベースの療法から恩恵を受ける可能性がある様々な状態を治療するための、本発明によって提供されるRPE細胞を使用する方法は、本明細書において、および例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第10,077,424号において記載される。特定の治療レジメン、投与経路、および任意の補助療法は、特定の状態、状態の重症度、および患者の全体的な健康状態に基づいて、適合させられるであろう。さらに、ある特定の態様では、RPE細胞の投与は、任意の視力喪失または他の症状を十分に回復させるのに有効であり得る。他の態様では、RPE細胞の投与は、症状の重症度を低減させるのに、および／または患者の状態のさらなる変性を防止するのに有効であり得る。本発明は、本明細書において記載される状態のいずれかを治療する（全体または部分的に症状の重症度を低減させることを含める）ために、RPE細胞を含む組成物の投与を使用できることを企図する。さらに、RPE細胞の投与は、内在性RPE層への任意の傷害の症状を治療するのを助長するために使用することができる。

本発明は、RPE細胞を含む組成物を含めて、本明細書において記載される方法のいずれかを使用して得られたRPE細胞を、本明細書において記載される適応症のいずれかの治療で使用できることを企図する。さらに、本発明は、本明細書において記載されるRPE細胞を含む組成物のいずれかを、本明細書において記載される適応症のいずれかの治療で使用できることを企図する。別の態様では、本発明のRPE細胞は、他の治療的細胞または剤とともに投与することができる。RPE細胞は、組み合わされたかもしくは別々の製剤で同時に、または連続して投与することができる。

一態様では、本発明は、網膜の疾患または障害を治療する方法を提供する。一態様では、網膜の疾患または障害としては、例えば、網膜変性症、例えば、コロイデレミア、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（乾性もしくは湿性）、網膜剥離、網膜色素変性症、シュタルガルト病、網膜色素線条症、もしくは近視性黄斑変性症）、または緑内障が挙げられる。ある特定の態様では、本発明のRPE細胞は、中枢神経系の障害、例えばパーキンソン病を治療するために使用することができる。

網膜色素変性症は、視覚受容体が異常な遺伝的プログラミングを通じて徐々に破壊される遺伝性の状態である。比較的若い年齢で全盲を引き起こす形態もあれば、視覚破壊がほとんどない特徴的な「骨小体（bone spicule）」網膜変化を示す形態もある。この疾患は、世界中で約150万人に影響を及ぼす。常染色体劣性網膜色素変性症を引き起こすいくつかの遺伝子欠陥が、RPEだけで発現する遺伝子で見つかっている。1つは、ビタミンA代謝に関与するRPEタンパク質（シスレチナールデヒド結合タンパク質（CRLBP））による。もう1つは、RPEに特有のタンパク質、RPE65に関係する。MER癌原遺伝子、すなわち、チロシンキナーゼ（MERTK）遺伝子の突然変異もRPE食作用経路の破壊および常染色体劣性網膜色素変性症の発症と関連していた。他の遺伝子欠陥およびRPE関連網膜色素変性症の形態は公知である。例えば、Verbakel et al., Progress in Retinal and Eye Research 66:157-186 (2018)を参照されたい。本発明は、RPE細胞の投与によって任意のまたはすべての形態のRPE関連網膜色素変性症を治療するための方法および組成物を提供する。

治療することができる、または本明細書において記載される方法を使用して生成されるRPE細胞の有効性を試験するために使用することができる網膜色素変性症の動物モデルとしては、げっ歯類（rdマウス、RPE-65ノックアウトマウス、タビー（tubby）様マウス、LRATマウス、RCSラット）、ネコ（アビシニアンネコ）、ならびにイヌ（錐体変性「cd」イヌ、進行性桿体－錐体変性「prcd」イヌ、初期網膜変性症「erd」イヌ、桿体－錐体異形成1、2 & 3「rcd1、rcd2 & rcd3」イヌ、光受容体異形成「pd」イヌ、およびブリアード「RPE-65」（イヌ））が挙げられる。

別の態様では、本発明は、黄斑変性を含めた網膜変性症と関連する障害を治療するための方法および組成物を提供する。

本発明のさらなる局面は、遺伝性および後天性眼疾患を含めた眼疾患の療法のための、RPE細胞の使用である。後天性または遺伝性眼疾患の例は、加齢性黄斑変性症、緑内障、および糖尿病性網膜症である。

加齢性黄斑変性症（AMD）は、西洋諸国において法的盲の最も一般的な理由である。黄斑下の網膜色素上皮の萎縮および脈絡膜血管新生（CNV）の発生は、中心視力の喪失を二次的にもたらす。中心窩下CNVおよび地図状萎縮を有する患者の大部分にとって、中心視力の喪失を防止するために利用可能な治療は現在存在しない。AMDの初期徴候は、網膜色素上皮とブルッフ膜の間の沈着物（ドルーゼン）である。疾患の間に、黄班の網膜下腔への脈絡膜血管の発芽がある。これは、中心視野および読字力の喪失につながる。

緑内障は、眼内の圧力が異常に高まる一群の疾患に与えられた名前である。これは、視野の制限および見る能力の全体的な低下につながる。最も一般的な形態は原発性緑内障であり；これの2つの型：慢性開放隅角（obtuse-angle）緑内障および急性閉塞隅角緑内障（acute angle closure）が区別される。続発性緑内障は、感染、腫瘍、または傷害によって引き起こされ得る。第3のタイプ、すなわち遺伝性緑内障は、通常、妊娠中の発育障害に由来する。眼球中の房水は、眼の光学特性に必要である、ある特定の圧力下にある。この眼内圧は通常は15～20水銀柱ミリメートルであり、房水産生と房水流出の間の平衡状態によって制御される。緑内障では、前眼房の隅角における房水の流出は遮断され、その結果、眼内部の圧力が上昇する。緑内障は、通常、中年または高齢で発生するが、遺伝性の形態および疾患は、子供および青年で珍しいことではない。眼内圧がわずかにしか上昇しておらず、さらに明らかな症状がないが、ゆっくりした損傷、特に視野の制限が起こる。対照的に、急性閉塞隅角緑内障は、疼痛、発赤、瞳孔の散大、および視覚の重度の障害を引き起こす。角膜が濁り、眼内圧が大きく高まる。疾患が進行するにつれて、視野がますます狭くなり、これは、眼科機器である視野計を使用して容易に検出することができる。慢性緑内障は、一般に、房水流出を増強する局部的に投与される医薬によく応答する。房水産生を低減させるために、全身性活性物質が与えられることもある。しかし、薬物による治療は必ずしも成功するとは限らない。薬物による療法が失敗した場合、房水の新しい流出を作り出すために、レーザー療法または従来の手術が使用される。急性緑内障は医学的緊急事態である。24時間以内に眼内圧が低減しない場合、永続的損傷が起こる。

糖尿病性網膜症は真性糖尿病の場合に生じる。これは、タンパク質のグリコシル化の結果として、血管内皮細胞の基底膜の肥厚につながり得る。これは、初期の血管硬化および毛細血管瘤の形成の原因である。これらの血管の変化は、数年の間に糖尿病性網膜症につながる。血管の変化は、毛細血管領域の低灌流を引き起こす。これは、脂質沈着物（硬性白斑）および血管増殖につながる。臨床経過は、真性糖尿病を有する患者において一様でない。加齢性糖尿病（II型糖尿病）では、毛細血管瘤が最初に出現する。その後、障害を受けた毛細血管灌流が理由で、網膜実質中に硬性および軟性白斑ならびにドット状出血が出現する。糖尿病性網膜症の後期では、脂肪沈着物が黄班の周囲に冠状に並ぶ（輪状網膜炎）。これらの変化は、眼の後極に浮腫をともなうことが多い。浮腫が黄班を含む場合、急性の深刻な視覚の悪化がある。I型糖尿病の主な問題は、眼底領域における血管増殖である。標準療法は、眼底の罹患領域のレーザー凝固である。レーザー凝固は、最初に、網膜の罹患領域で限局的に行われる。白斑が存続する場合、レーザー凝固の領域が広げられる。最も鮮明な視覚部位を有する網膜の中心、すなわち黄班および乳頭黄斑束を凝固させることができず、なぜならば、手順が、視覚に最も重要な網膜の一部の破壊をもたらすと考えられるからである。増殖が既に起きている場合、増殖に基づいて、病巣を非常に密に押圧することが必要であることが多い。これは、網膜の領域の破壊を必然的にともなう。結果は、対応する視野の喪失である。I型糖尿病では、適時のレーザー凝固が失明から患者を救う唯一の機会であることが多い。

本発明の別の態様は、血管新生を防止する能力が増大したRPE細胞またはRPE細胞への前駆体を誘導するための方法である。別の方法では、そのような細胞は、血管新生を阻害する外来性遺伝子で遺伝子改変され得る。

本発明は、前述の疾患または状態いずれか、および内在性RPE層の傷害を治療するために、ヒト多能性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞または他の多能性幹細胞）から得られたRPE細胞の組成物を使用できることを企図する。これらの疾患は、様々な成熟レベルのRPE細胞を含むRPE細胞の組成物で、および成熟したRPE細胞が豊富なRPE細胞の組成物で治療することができる。

III.網膜色素上皮細胞の投与方法
本発明のRPE細胞は、治療される疾患または障害に適している任意の投与経路によって投与することができる。一態様では、本発明のRPE細胞は、例えば、注射（例えば、網膜下注射）によって、またはデバイスもしくは埋植体（例えば、徐放性埋植体）の一部として、局所的に、全身的に、または局部的に投与することができる。例えば、本発明のRPE細胞は、網膜の障害または疾患、例えば、黄斑変性症、シュタルガルト病、および網膜色素変性症を有する患者を治療する場合、硝子体切除手術を使用することによって網膜下腔中に移植することができる。別の例では、本発明のRPE細胞は、CNS障害、例えばパーキンソン病を有する患者を治療する場合、全身的または局部的に移植することができる。当業者は、治療される疾患または障害に対する投与経路を決定することができるであろう。

本発明のRPE細胞は眼内注射によって、より具体的には網膜下に、薬学的に許容される眼用製剤中で送達することができる。注射のための濃度は、本明細書において記載される因子に応じて、有効かつ無毒であるいかなる量でもよい。いくつかの態様では、患者の治療ためのRPE細胞は、約5細胞／150μl～1×10⁷細胞／150μl、50細胞／150μl～1×10⁶細胞／150μl、または50細胞／150μl～5×10⁵細胞／150μlの用量で製剤化される。他の態様では、患者の治療のためのRPE細胞は、約10、50、100、500、5000、1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、または1×10⁶細胞／150μlの用量で製剤化される。一態様では、約50,000～500,000細胞を患者に投与することができる。特定の態様では、約50,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、または500,000 RPE細胞を患者に投与することができる。

RPE細胞は、細胞が眼の罹患領域、例として、前眼房、後眼房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、レンズ、脈絡膜、網膜、強膜、上脈絡膜腔、結膜、結膜下腔、強膜外隙、角膜内隙（intracorneal space）、角膜外隙（epicorneal space）、毛様体扁平部、手術誘導性無血管領域、または黄班に侵入することを可能にするのに十分な期間にわたって組成物が眼の表面と接触して維持されるように、薬学的に許容される眼用ビヒクル中での送達のために製剤化することができる。本発明の剤を含む生成物およびシステム、例えば送達ビヒクル、特に、薬学的組成物として製剤化されたもの、ならびにそのような送達ビヒクルおよび／またはシステムを含むキットも本発明の一部であることが想定される。

ある特定の態様では、本発明の治療方法は、埋植体またはデバイスで本発明のRPE細胞を投与する工程を含む。ある特定の態様では、デバイスは、眼の医学的状態を治療するための生体侵食性埋植体であり、これは、生分解性ポリマーマトリックス内に分散した活性剤を含み、活性剤の粒子の少なくとも約75％は、約10um未満の直径を有する。生体侵食性埋植体は眼領域中の埋植のためにサイズ調整される。眼領域は、前眼房、後眼房、硝子体腔、脈絡膜、上脈絡膜腔、結膜、結膜下腔、強膜外隙、角膜内隙、角膜外隙、強膜、毛様体扁平部、手術誘導性無血管領域、黄班、および網膜のいずれか1つまたは複数であり得る。生分解性ポリマーは、例えば、ポリ（乳酸-co-グリコール）酸（PLGA）コポリマーであり得る。ある特定の態様では、ポリマー中の乳酸対グリコール酸モノマーの比は、約25/75、40/60、50/50、60/40、75/25重量パーセンテージ、より好ましくは約50/50である。さらに、PLGAコポリマーは、生体侵食性埋植体の約20、30、40、50、60、70、80～約90重量パーセントであり得る。ある特定の好ましい態様では、PLGAコポリマーは、生体侵食性埋植体の約30～約50重量パーセント、好ましくは約40重量パーセントであり得る。

本明細書において記載される方法に従って投与される組成物の体積も、投与様式、RPE細胞の数、患者の年齢、ならびに治療される疾患のタイプおよび重症度などの因子に依存する。注射によって投与される場合、本発明の組成物を含む液体体積は、約5.0マイクロリットル～約50マイクロリットル、約50マイクロリットル～約250マイクロリットル、約250マイクロリットル～約1ミリリットルであり得る。一態様では、注射のための体積は約150マイクロリットルであり得る。

眼内注射によって投与される場合、患者の人生の全体を通して1回または複数回定期的にRPE細胞を送達することができる。例えば、1年に1回、6～12か月に1回、3～6か月に1回、1～3か月に1回、または1～4週に1回RPE細胞を送達することができる。あるいは、ある特定の条件または障害について、より頻繁な投与が望ましい場合もある。埋植またはデバイスによって投与される場合、治療される特定の患者および障害もしくは状態の必要に応じて、患者の生涯全体を通して1回、1回もしくは複数回定期的にRPE細胞を投与することができる。同様に、経時的に変化する治療レジメンが企図される。ある特定の態様では、患者は、RPE細胞の投与の前、該投与と同時に、または該投与の後のいずれかで、免疫抑制療法も施される。免疫抑制療法は、患者の人生の全体を通して、またはより短い期間にわたって必要であり得る。免疫抑制療法の例としては、限定されないが、以下の1つまたは複数が挙げられる：抗リンパ球グロブリン（ALG）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ATG）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、BASILIXIMAB（登録商標）（抗IL-2Ra受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンA）、DACLIZUMAB（登録商標）（抗IL-2Ra受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、RITUX1MAB（登録商標）（抗CD20抗体）、シロリムス、タクロリムス（Prograf^（商標））、およびミコフェノール酸モフェチル（MMF）。

ある特定の態様では、本発明のRPE細胞は、薬学的に許容される担体とともに製剤化される。例えば、RPE細胞は、単独で、または薬学的製剤の成分として、投与することができる。主題の化合物は、ヒト医薬における使用のための任意の好都合な方法で投与するために製剤化することができる。ある特定の態様では、非経口投与に適した薬学的組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される滅菌した等張の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液、もしくは乳濁液、または滅菌した注射可能な溶液もしくは分散液に使用直前に再構成することができる滅菌した粉末と組み合わせて、RPE細胞を含むことができ、これらは、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、意図されたレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、または懸濁もしくは増粘剤を含むことができる。本発明の薬学的組成物で用いることができる適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料、例えばレシチンの使用の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。

一態様では、本発明のRPE細胞はGS2中に製剤化され、これはWO 2017/031312に記載され、これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

特許および特許出願を含めて、本明細書で引用される任意の刊行物で開示される内容は、それらが本明細書において開示されている範囲で、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

以下の実施例は単に例示であり、本開示の範囲または内容を限定することを決して意図しない。

実施例1：RPE前駆細胞におけるPAX6/MITF発現のタイムコース
EBDMにおいて、マイトマイシンC不活性化HDFを含むラミニン521/e-カドヘリンコーティングプレートにJ1 hES細胞をプレーティングして、J1細胞の分化を開始させた。EBDMで培養を開始してからおよそ1、2、3、4、6、および8週後に培養中の細胞を回収し、これをqPCRによってPAX6およびMITF発現について評価した。図1に示すように、PAX6+/MITF+RPE前駆細胞は、培養の約3～4週目に出現し始め、培養におけるPAX6およびMITFのmRNA発現は経時的に増加した（例えば、6～8週目を参照されたい）。

別の実験では、4日間のNutristem（Stemgent）、続いて、8日間のTeSR2（STEMCELL Technologies）において、マイトマイシンC不活性化HDFを含むラミニン521/e-カドヘリンコーティングプレートにJ1 hES細胞をプレーティングした。次いで、培地をEBDMに切り換えて、J1細胞の分化を開始させた。EBDMで培養を開始してからおよそ5.5週、9週、および10週後に、細胞をコラゲナーゼで処理し、遊離し消化された材料を、収集チューブ上に置かれた40ミクロンストレーナーの頂部に載っている100ミクロンストレーナーからなるストレーナーのカラムを通過させた。40ミクロンストレーナー（＜40μmの細胞）を通過した細胞、100ミクロンストレーナー上に保持された細胞（＞100μmの細胞）、および40ミクロンストレーナー上に保持されたクラスター（約40～100μmの細胞）を回収し、EBDM中のLN521コーティングウェルに各画分を3日間プレーティングし、細胞を固定し、PAX6/MITFについて染色した。図2に示すように、＜40μmの細胞は、分化の開始から5.5、9、および10週後でさえもPAX6/MITF染色をほとんどまたは全く示さなかった。分化の開始から9～10週までに、40～100μm画分から得られた細胞は、＞100μm画分と比較して強いPAX6/MITF染色を示した。

これらの結果に基づいて、継代培養のためにPAX6+/MITF+RPE前駆細胞を回収するタイミングを特定した。本発明のいくつかの態様による、RPE細胞の生成のための例示的なプロセスを図3に概説する。これらの例示的な方法の態様の詳細な工程を以下のように記載する。

実施例2：単一RPE前駆細胞継代培養方法による網膜色素上皮（RPE）細胞の生成
第1の実験では、マイトマイシン-C処理したHDF細胞をラミニン521/E-カドヘリンコーティングウェルにプレーティングした。J1 hESCをウェルに播種し、Nutristem（Stemgent）でおよそ4日間、続いて、TeSR2（STEMCELL Technologies）で4日間培養した。次いで、培地をEBDMに切り換えて、RPE生成を促進し、EBDMを7日間毎日変え、次いで、2～3日ごとに変えた。

EBDMで83日（およそ12週）後に、細胞をコラゲナーゼで一晩処理した。遊離し消化された材料を収集チューブ上に置かれた40ミクロンストレーナーの頂部に載っている100ミクロンストレーナーからなるストレーナーのカラムを通過させた。40ミクロンストレーナー上に保持されたクラスターを回収し、15分間のトリプシン処理によって単一細胞に解離させた。EBDM中のLN521コーティングウェルに単一細胞をプレーティングし、EBDMを2～3日ごとに変えた。プレーティングしてからEBDMで30日（およそ4週）後、細胞をコラゲナーゼで約6時間処理した。遊離し消化された材料を収集チューブ上に置かれた40ミクロンストレーナーの頂部に載っている100ミクロンストレーナーからなるストレーナーのカラムを通過させた。40ミクロンストレーナー上に保持されたクラスターを回収し、15分間の10×TrypLE（Thermo Fisher）処理によって単一細胞に解離させた。MM/FGF培地（DMEM；GlutaMAX^（商標）-Iサプリメント（100×）、液体、200mM；FBS；KnockOut DMEM；非必須アミノ酸；2-メルカプトエタノール；Knockout Serum Replacement［KSR］＋bFGF）中のゼラチンコーティングウェルに単一細胞を継代0 RPE細胞（「P0」）としてプレーティングした。MM/FGF培地は、約＞90％コンフルエントまで毎日変え、次いで、MM培地［bFGFを含まない上記のMM/FGF培地］に変え、回収するまで2日ごとに供給した。P0 RPE細胞を16日間培養した。15分間の10×TrypLE処理によってP0細胞を回収し、MM/FGF培地中のゼラチンコーティングウェルに単一細胞を継代1 RPE細胞（「P1」）として再度プレーティングした。最初にMM/FGF中で培養し、次いで、MM培地に切り換えることによって、P0 RPE細胞について上で記載されるように培養方法を反復した。P1 RPE細胞を14日間培養した。P1 RPE細胞を回収し、最初にMM/FGF中で培養し、次いで、MM培地に切り換えることによって、上記のように継代2 RPE細胞（「P2」）として再プレーティングした。P2 RPE細胞を14日間培養し、15分間の10×TrypLE処理によって回収し、次いで、凍結保存した。次いで、細胞を解凍し、GS2中に製剤化し、品質試験にかけた。結果を表1に示す。

第2の実験では、マイトマイシン-C不活性化HDF細胞をiMatrix511（Takara Bio）コーティングウェルにプレーティングした。次いで、J1 hES細胞をiMatrix511-HDFウェルにプレーティングし、StemFit培地（Ajinomoto）中で8日間培養した。次いで、培地をEBDMに切り換えて、RPE生成を促進した。EBDMを7日間毎日変え、次いで、2～3日ごとに変えた。

EBDMで47日（およそ7週）後に、細胞をコラゲナーゼで6時間処理した。遊離し消化された材料を収集チューブ上に置かれた40ミクロンストレーナーの頂部に載っている100ミクロンストレーナーからなるストレーナーのカラムを通過させた。40ミクロンストレーナー上に保持されたクラスターを回収し、15分間の10×TrypLE処理によって単一細胞に解離させた。EBDM中のiMatrix511コーティングウェルに単一細胞をプレーティングし、EBDMを2～3日ごとに変えた。プレーティングしてからEBDMで39日（およそ5週）後に、細胞をコラゲナーゼで一晩処理した。遊離し消化された材料を収集チューブ上に置かれた40ミクロンストレーナーの頂部に載っている100ミクロンストレーナーからなるストレーナーのカラムを通過させた。40ミクロンストレーナー上に保持されたクラスターを回収し、15分間の10×TrypLE（Thermo Fisher）処理によって、単一細胞に解離させた。MM/FGF培地中のゼラチンコーティングウェルに単一細胞を継代0 RPE細胞（「P0」）としてプレーティングした。MM/FGF培地は、約＞90％コンフルエントまで毎日変え、次いで、回収するまで2日ごとにMM培地に変えた。P0 RPE細胞を16日間培養した。15分間の10×TrypLE処理によってP0細胞を回収し、MM/FGF培地中のゼラチンコーティングウェルに単一細胞を継代1 RPE細胞（「P1」）として再度プレーティングした。最初にMM/FGF中で培養し、次いで、MM培地に切り換えることによって、P0 RPE細胞について上で記載されるように培養方法を反復した。P1 RPE細胞を14日間培養した。P1 RPE細胞を回収し、最初にMM/FGF中で培養し、次いで、MM培地に切り換えることによって、上記のように継代2 RPE細胞（「P2」）として再プレーティングした。P2 RPE細胞を14日間培養し、15分間の10×TrypLE処理によって回収し、次いで、凍結保存した。次いで、細胞を解凍し、GS2中に製剤化し、ゼラチン（ある特定の試験用）上で培養し、品質試験にかけた。表2に結果を示す。

品質試験は、一般に、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2015/0366915号に記載されるように行った。例えば、純度（MITF/PAX6）、ベストロフィン、およびZO1レベルを免疫蛍光アッセイ（IFA）によって決定した。食作用／有効性アッセイは、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 2016/154357に記載されるように行う。

（表１）

（表２）

実施例3：単一RPE前駆細胞継代培養方法およびRPE前駆細胞クラスター継代培養方法によって生成されるRPE細胞
第1の実験では、図4に示すように、単一RPE前駆細胞継代培養方法およびRPE前駆細胞クラスター継代培養方法によって、RPE細胞を生成した。手短に言えば、マイトマイシンC不活性化HDF細胞をiMatrix511コーティングウェルにプレーティングした。次いで、J1 hESCをiMatrix511-HDFウェルにプレーティングし、StemFit培地中で8日間培養した。次いで、培地をEBDMに変えて、RPE生成を促進した。EBDMで69日（およそ10週）後に、細胞をコラゲナーゼで一晩処理した。遊離し消化された材料を収集チューブ上に置かれた40ミクロンストレーナーの頂部に載っている100ミクロンストレーナーからなるストレーナーのカラムを通過させた。40ミクロンストレーナー上に保持されたクラスターを回収した。単一RPE前駆細胞継代培養手順については、10×TrypLEでクラスターを単一細胞に解離し、iMatrix511上のEBDM中で培養した。RPE前駆細胞クラスター継代培養手順については、コラゲナーゼおよびストレーナー分画後に得られたクラスターをiMatrix511上のEBDM中にインタクトで播種した。すべての播種したウェルは、1日おきまたは2日おきにEBDM培地を変えた。

再プレーティングからEBDMでおよそ24日（およそ4週）後に、単一RPE前駆細胞継代培養プロセスのウェルを上記と同じコラゲナーゼ処理およびストレーナー分画にかけ、クラスターを単一RPE細胞に解離させた。RPE前駆細胞クラスター継代培養プロセスのウェルをコラゲナーゼで処理し、濾して単一細胞を除去し、検査および手動操作によって負および正の選択にかけた。単離されたパッチを10×TrypLEで単一RPE細胞に解離させた。単一RPE前駆細胞継代培養およびRPE前駆細胞クラスタープロセスから得られた単一RPE細胞をMM/FGF中のゼラチンまたはiMatrix511コーティングウェルにP0 RPE細胞として別々に播種した。MM/FGF培地は、約＞90％コンフルエントまで（約3日間）毎日変え、次いで、回収するまで2日ごとにMM培地に変えた。P2 RPE細胞を得て、凍結保存するまで本プロセスを反復した。次いで、細胞を解凍し、GS2中に製剤化し、（必要であれば）ゼラチン上で培養し、品質試験にかけた。品質試験は、一般に、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2015/0366915号に記載されるように行った。例えば、純度（MITF/PAX6）、ベストロフィン、およびZO1レベルを免疫蛍光アッセイ（IFA）によって決定した。食作用／有効性アッセイは、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 2016/154357に記載されるように行う。図5に結果を示す。

実施例4：RPE細胞の網膜下移植後の移植片拒絶予防法としての2つの免疫抑制療法レジメンの評価および中度から重度の視力障害を有する患者における加齢性黄斑変性症に続発する萎縮に対する治療としてのRPE細胞についての概念実証の決定
本開示のヒト多能性幹細胞由来の網膜色素上皮（hPSC RPE）細胞は、中度から重度の視力障害を有する患者における加齢性黄斑変性症に続発する萎縮に対する治療として、網膜下移植に使用することができる。本研究は、hPSC RPE細胞の投与後の移植片拒絶予防法としての短期間、低用量、全身性の免疫抑制療法（IMT）の2つのレジメンの効力、安全性、および忍容性を評価する（パート1）。本研究は、中度から重度の視力障害を有する患者における加齢性黄斑変性症に続発する萎縮に対するhPSC RPE細胞の有効性も実証する（パート2）。

研究のパート1では、各レジメンについて最大15対象において2つの免疫抑制療法レジメンのうちの1つを用いた、hPSC RPE細胞の連続的評価がある。パート1における移植失敗または拒絶の発生によって、研究のパート2で治療される次の対象に使用される免疫抑制療法レジメンが決定される。研究のパート2は概念実証試験であり、これは、選択された免疫抑制療法またはパート1由来のより長い免疫抑制療法レジメンで治療される対象を含む。

用量および投与
hPSC RPE細胞およびGS希釈剤（任意）の単回用量は、網膜下注射によって研究対象眼（study eye）に投与する。hPSC RPE細胞の用量は、50,000；150,000；および500,000個のhPSC RPE細胞で対象を治療する別の用量漸増研究の結果に基づいて、本研究の第1の対象の治療より前に決定する。

免疫抑制療法の処方はPrograf（登録商標）0.5mgカプセル、Prograf（登録商標）1mgカプセル、およびミコフェノール酸モフェチル（MMF）500mg錠剤を含み、これらのすべては経口的に投与する。Prograf（登録商標）は、1日2回用量に分けられた1日あたり0.05mg/kgの初回用量で投与し、3～5ng/mLの標的トラフレベルを達成するように調整する。CYP3A4インヒビター（プロテアーゼ阻害剤、直接的第Xa因子インヒビター、直接的トロンビンインヒビター、またはエリスロマイシン以外）、例えば、アゾール系抗真菌薬（例えば、ボリコナゾール、ケトコナゾール）、または抗生物質（例えば、クラリスロマイシン、クロラムフェニコール）を服用している対象について、Prograf（登録商標）の初回用量を調整する必要があり得る。MMFは、1.0gの用量で経口的に1日2回投与する。2つのIMTレジメンがある；レジメン1の間、Prograf（登録商標）およびMMFは、hPSC RPE細胞移植の日より1週間前に開始される。両方のIMT薬物を移植後6週間続ける。レジメン2の間、Prograf（登録商標）およびMMFを移植日より1週間前に服用し、次いで、中断する。

標準的な3ポート経毛様体扁平部硝子体切除術後に、網膜下注射によってhPSC RPE細胞を研究対象眼に投与する。対象は、移植後少なくとも6時間は仰向けのままである。SSCは、細胞移植注射の位置を推奨する。hPSC RPE細胞の用量は、50,000；150,000；および500,000個のhPSC RPE細胞で対象を治療する別の用量漸増研究によって決定する。

移植後、hPSC RPE細胞で治療したすべての対象を、1日目、1～4週目まで週1回（1週間の免疫抑制療法レジメンでは3週目の来院はない）、6～14週目まで2週間ごと、20、26、52、および78週目、ならびに5年目の終わりまでその後年1回で、研究対象眼における安全性および有効性について評価する。未治療の対照を、研究開始基準0日目、ならびに4、8、12、20、26、および52週目で、研究対象眼における有効性について評価する。52週目は、対照群に対する研究の終わり（EoS）である。

すべての有害事象（AE）をスクリーニング来院から52週目まで取得する。その後、眼に関するおよび免疫介在性のすべての事象を含めて、特に関心があるAEのみを取得する。

画像読み取りセンターは、眼底撮影、眼底自発蛍光、スペクトラルドメイン－光干渉断層撮影（SD OCT）、光干渉断層撮影－血管造影（OCT-A）、補償光学（AO）、およびフルオレセイン血管造影（FA）の結果を評価する。中央マイクロペリメトリーデータ収集センターおよび中央検査室も利用される。可能な限り、視覚機能試験者および読み取りセンターは治療群に対してマスクされる。

免疫抑制療法の評価
最初に研究に参加し、hPSC RPE細胞治療アームに無作為化された対象を、以下の低用量の組み合わせ免疫抑制療法（Prograf（登録商標）およびミコフェノール酸モフェチル）ならびに感染予防法の2つのレジメンのうちの1つに順次割り当てる：

コホート1／免疫抑制療法レジメン1：移植日より1週間前に開始する7週間の免疫抑制療法および予防薬物適用。

コホート2／免疫抑制療法レジメン2：移植日より1週間前に開始する1週間の免疫抑制療法および予防薬物適用。

対象が免疫抑制療法を受けている間に、免疫抑制療法の医師が安全性について対象をモニターする。

各コホートは、hPSC RPE細胞で治療される最大15対象からなる。コホート1において移植失敗または拒絶の発生が1回であるかまたはない場合、一旦コホート1が完全に登録され、最後に治療された対象が14週目の来院を完了すれば、コホート2の治療アームへの無作為化を開始する。

1つのコホートまたはコホート全体で1対象より多くが移植失敗または拒絶の証拠を有する場合、治療されている対象およびまだ治療されていない対象の免疫抑制療法レジメンが変更される。

別の原因への帰属がない限り、移植失敗または拒絶は、以下からなる：
・予測されない、持続性または増大する非感染性眼炎症（例えば、血管炎、網膜炎、脈絡膜炎、硝子体炎、毛様体扁平部炎、または前眼部炎症／ブドウ膜炎）の証拠。
・眼底写真での色素性斑またはSD-OCTでのブルッフ膜上の超反映性物質の移植後の出現およびその後の消失。
・研究の最初の52週以内に、反復測定によって、または次の予定された来院で≧10文字の獲得が確認される場合、別の原因に帰属することができないその後の確認された≧10文字の喪失は、移植失敗または拒絶の証拠とみなすことができる。
・治験責任医師および／またはデータ安全性モニタリング委員会（DSMB）の見解によれば、移植失敗または拒絶が理由であり得る他の眼の徴候または症状。「他の眼の徴候または症状」に関する報告が移植失敗または移植片拒絶を構成するかどうかの最終的な決定は、DSMBからのガイダンスに基づいて、治験依頼者によって行われる。

有効性
一次分析セットは、完全な分析セットであり、これは、hPSC RPE群からの、選択されたIMTレジメンまたはより長いIMTレジメンを受けたすべての無作為化された治療対象、および未治療の対照群からの（研究の両方のパートから）、0日目に達する無作為化された対象を含む。両側5％有意性レベルをすべての分析について統計的有意性を評価するために使用する。

主要エンドポイントは、52週目における萎縮の全領域のベースラインからの変化である。主要エンドポイントの分析は、ベースラインから各週（4、8、12、20、26、および52週目）までの変化についての混合モデル反復測定（MMRM）分析から推定される。該モデルは、以下の固定効果を含む：研究群（hPSC RPEまたは未治療）、DDAFのベースライン領域（2レベル）および研究対象眼におけるDDAFの領域の周囲の超AF（hyperAF）（2レベル）の層別化群、部位（必要に応じてプールされる）、時間（研究週）、ならびに治療×時間の交互作用、ならびにベースラインの共変数。パラメーターは制限付き最尤法を使用して推定され、自由度はKenward-Roger近似を使用して推定される。モデルの対象内誤差を推定するために、非構造化（unstructured）分散－共分散構造が使用される。非構造化共分散構造の適合度が収束しない場合、収束まで他の分散－共分散構造が使用される。欠測データはこの分析に帰属させられない。

両方の研究群に対する最小二乗平均（標準誤差をともなう）およびhPSC RPE対未治療の対照の研究群の差（95％信頼区間もともなう）は、4、8、12、20、26、および52週目について示される。

副次的エンドポイント「研究対象眼において確認された≧15文字の向上（来院許容期間内）と定義される、対象の視覚機能応答」（ベースラインから52週目までの変化）の分析は、研究群の比較のためにカイ二乗検定を使用する。2×2表の任意のセルに5人未満の対象しか存在しない場合、代わりにフィッシャーの正確確率検定が使用される。研究群および研究群の差（95％信頼区間をともなう）について、研究対象眼において≧15文字が向上した対象の割合が示される。観察されたデータ分析に加えて、欠測値がある対象は、欠測データについて無回答を使用して評価される。

副次的エンドポイント「指標4分円における萎縮の領域のベースラインからの変化」、「52週目における病変周囲試験箇所の平均マイクロペリメトリー感度のベースラインからの変化」、「52週目におけるログコントラスト感度のベースラインからの変化」、および「52週目におけるBCVAのベースラインからの変化」の分析は、主要エンドポイントについて記載れるものと同じMMRMモデルを使用して分析される。萎縮の領域について含まれる時点は4、8、12、20、26、および52週目であり、BCVAについて、4、8、12、20、26、および52週目（RPE細胞群と未治療群の両方に共通している時点）、マイクロペリメトリー感度について、4、12、20、26、および52週目であり、コントラスト感度について、4、12、26、および52週目である。

52週目における視覚機能障害の影響の質問票（Impact of Vision Impairment questionnaire）（IVI）のすべての項目を表すサマリースコアの「ベースラインからの変化」の分析は、共分散分析（ANCOVA）モデルを使用し、これは、研究群（ASP7317または未治療）、DDAFのベースライン領域（2レベル）および研究対象眼におけるDDAFの領域の周囲の超AF（2レベル）の層別化群、ならびに部位（必要に応じてプールされる）に関する用語を含む。

主要および副次的エンドポイントはまた、重度（ベースラインBCVA 20/320～＜20/200）および中度（ベースラインBCVA 20/200～20/80）の視力障害群について別々に分析される（各亜群分析で十分な数の対象を条件とする）。

52週目／ET時点は、上記のようにカイ二乗検定を使用する「研究対象眼において確認された≧15文字の向上と定義される、対象応答」を除いて、上記のようにANCOVAを使用して上記のすべてのエンドポイントについて分析される。

実施例5：継代培養を用いない従来の選択的採集方法、選択的採集を用いるRPE前駆細胞クラスター継代培養方法、および選択的採集を用いない単一RPE前駆細胞継代培養方法からのRPE細胞生成の比較
RPE細胞生成の比較は、1)継代培養を用いない大きな労働力を要する選択的採集を含む従来のRPE細胞生成方法、2)本明細書において記載される選択的採集を用いるRPE前駆細胞クラスター継代培養方法、および3)本明細書において記載される選択的採集を用いない単一RPE前駆細胞継代培養方法の間で行った。従来のRPE細胞生成方法は、接着性hES単層方法によって、一般にWO 2005/070011に記載されているように行った。手短に言えば、多角形の玉石状形態および細胞質に茶色の色素を有する色素性斑が形成されるまで、EBDM中のHDF上で90～100日間J1 hES細胞を分化させた。これらの色素性多角形細胞を消化し、色素性の島を手動で選択的に採集した。採集した色素性クラスターを単一細胞に解離させ、数え、P0 RPE細胞として播種した。選択的採集を用いるRPE前駆細胞クラスター継代培養方法および選択的採集を用いない単一RPE前駆細胞継代培養方法から得られたRPE細胞を同様に数えてから、P0 RPE細胞として播種した。

表3は、選択的採集を含む方法：継代培養を用いない従来の選択的採集方法および本発明の選択的採集を用いるRPE前駆細胞クラスター継代培養方法から生成されたRPE細胞を示す。表3は、選択的採集を用いるRPE前駆細胞クラスター継代培養方法は、従来の方法と比較して、ロットあたりより多くの細胞数を生成することができることを示すが、さらに重要なことは、選択的採集を用いるRPE前駆細胞クラスター継代培養方法は、従来の方法と比較して、RPE細胞を選択的に採集するのに必要とされる手作業の時間あたり、より多くの平均細胞数を生成したことを示す。さらに、従来の方法は、RPE前駆体が濃縮される継代培養工程を含んでいなかったので、従来の方法の純度が低い集団からの選択的採集は、得られる細胞がより少なくなり、形態の変動性がより大きくなり、かつRPEを選択的に採集するための作業時間がより長くなった。

表4は、RPE細胞の手動の選択的採集を含まない単一RPE前駆細胞継代培養方法から生成されたRPE細胞を示す。単一RPE前駆細胞継代培養方法は、従来の方法または選択的採集を用いるRPE前駆細胞クラスター継代培養方法よりも有意に多いRPE細胞を生成した。さらに、P0 RPE細胞を単離するためにかかった時間あたりの得られた細胞の総数も有意に多かった。

本発明の方法は、純度が低い集団からのRPE細胞の手動の選択的採集を必要とする従来の方法と比べて、著しい向上を提供する。手動採集は身体的および精神的に過酷であり、きちんとサイズ調整された1つのロットを作製するために、数日間にわたって、非常に高精度で集中した数時間の連続的な作業を必要とする。従来の方法についての新しい操作者の訓練も困難であり、なぜならば、少数の汚染細胞が、誤って受け入れられた場合、RPEを過剰増殖させ、ロットの失敗をもたらす可能性があるため、両方顕微鏡下での正確な機械的操作と細胞形態学の経験を必要とするからである。それぞれの採集したクラスターを、それが受け入れられるかまたは退けられる前に、操作者が形態について評価する必要がある。一部のクラスターは理想的なRPE形態以外を有する可能性があり、操作者は、クラスターを受け入れるかまたは退けるかどうかを主観的に決定する必要がある。一旦各クラスターが評価されれば、それをすばやく移動させる必要がある。この手順を2～3回反復して、単一細胞を排除し、採集したクラスターの品質を確実なものにする。操作者のスピードが遅いことによって、非常に低い収率がもたらされる可能性があり、意思決定の誤りによって低い純度およびロットの失敗がもたらされる可能性がある。したがって、熟練の操作者は、無菌手順の経験、滅菌環境における顕微鏡下での顕微操作の技能、選択されたおよび退かれたクラスターの比較的速い移動を可能にする経験、評価される各クラスターについて速い意思決定を可能にする細胞形態学の経験を有する必要がある。本発明の方法は、最低限の細胞培養の経験がある作業員が使用することができる標準的な細胞培養方法の使用を可能にし、細胞収率は著しく高い。

（表３）

（表４）

*P0 RPE細胞に対してIFAを行わなかった。しかし、4ロットすべてが、P1で＞95％の純度でQC試験に合格した。

Claims

網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、
(i)PAX6+/MITF+RPE前駆細胞の細胞クラスターを得て、該細胞クラスターを単一細胞に解離させる工程；
(ii)細胞がRPE細胞に分化するように分化培地中で該単一細胞を培養する工程；および
(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程
を含み、
それによってRPE細胞の集団を生成する、前記方法。
網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、
(i)PAX6+/MITF+RPE前駆細胞の細胞クラスターを得る工程、
(ii)細胞がRPE細胞に分化するように分化培地中で該細胞クラスターを培養する工程；および
(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程
を含み、
それによってRPE細胞の集団を生成する、前記方法。
前記RPE細胞を解離させ、該RPE細胞を分画し、RPE細胞クラスターを収集し、該RPE細胞クラスターを単一RPE細胞に解離させ、該単一RPE細胞を培養することによって、工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程
をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
前記RPE細胞を解離させ、RPE細胞クラスターを収集し、該RPE細胞クラスターを選択的に採集することによって、工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程
をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
前記選択的に採集したRPE細胞クラスターを単一RPE細胞に解離させ、該単一RPE細胞を培養する工程
をさらに含む、請求項4記載の方法。
前記PAX6+/MITF+RPE前駆細胞が、多能性幹細胞の集団から得られたものである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である、請求項6記載の方法。
前記RPE細胞を拡大させる工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、FGFが補充された維持培地中で該細胞を培養することによって拡大される、請求項8記載の方法。
前記維持培地が、各継代でRPE増殖の最初の1日間、2日間または3日間FGFを含み、続いて、FGFを欠く維持培地中でRPE細胞を培養する、請求項9記載の方法。
FGFがコンフルエンスの前に添加される、請求項9または10記載の方法。
前記分化培地が、ヘパリンおよび／またはROCKインヒビターをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、最大で2回まで継代される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記解離工程のいずれか1つが、解離試薬で細胞を処理することによって行われる、請求項1および3～13のいずれか一項記載の方法。
前記解離試薬が、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼIもしくはコラゲナーゼIV）、アクターゼ（accutase）、キレート剤（例えば、EDTAベースの解離溶液）、トリプシン、ディスパーゼ、またはそれらの任意の組み合わせの群より選択される、請求項14記載の方法。
前記RPE細胞が、回収後に凍結保存される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記細胞が、DMSO（ジメチルスルホキシド）、エチレングリコール、グリセロール、2-メチル-2-4-ペンタンジオール（MPD）、プロピレングリコール、およびショ糖の群より選択される1つまたは複数の凍結保存剤を含む培地中で凍結保存される、請求項16記載の方法。
前記多能性幹細胞の集団が胚様体である、請求項6～17のいずれか一項記載の方法。
前記細胞が、フィーダー細胞上で培養される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記細胞が、フィーダーフリー条件下で培養される、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
前記細胞が非接着培養で培養される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記細胞が接着培養で培養される、請求項1～20のいずれか一項記載の方法。
前記分化培地がEBDMである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記分化培地が、ニコチンアミド、形質転換因子-β（TGFβ）スーパーファミリー（例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB）、ノーダル（nodal）、抗ミュラー管ホルモン（AMH）、骨形成タンパク質（BMP）（例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、増殖分化因子（GDF））、WNT経路インヒビター（例えば、CKI-7、DKK1）、TGF経路インヒビター（例えば、LDN193189、ノギン）、BMP経路インヒビター（例えば、SB431542）、ソニックヘッジホッグシグナルインヒビター、bFGFインヒビター、ならびにMEKインヒビター（例えば、PD0325901）の群より選択される1つまたは複数の分化剤を含む、請求項1～22のいずれか一項記載の方法。
前記分化培地がニコチンアミドを含む、請求項24記載の方法。
前記分化培地がアクチビンを含む、請求項24または25記載の方法。
前記PAX6+/MITF+RPE前駆細胞の細胞クラスターが、約40μm～約200μmの間のサイズである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記PAX6+/MITF+RPE前駆細胞の細胞クラスターが、約40μm～約100μmの間のサイズである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記工程(ii)において、前記細胞が、ラミニンまたはその断片、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、およびゼラチンの群より選択される細胞外マトリックス上で培養される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記細胞外マトリックスが、ラミニンまたはその断片である、請求項29記載の方法。
前記ラミニンが、ラミニン-521およびラミニン-511より選択される、請求項30記載の方法。
前記ラミニンがiMatrix511である、請求項31記載の方法。
前記工程(ii)における培養の期間が、約1週間～約8週間である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記工程(ii)における培養の期間が、少なくとも約3週間である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記工程(ii)における培養の期間が、約6週間である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞クラスターが、約40μm～200μmの間のサイズである、請求項3～35のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞クラスターが、約40μm～100μmの間のサイズである、請求項36記載の方法。
前記単一RPE細胞が、RPEの増殖または分化を支持する培地中で培養される、請求項3～37のいずれか一項記載の方法。
前記単一RPE細胞が、ラミニンまたはその断片、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、およびゼラチンの群より選択される細胞外マトリックス上で培養される、請求項38記載の方法。
前記細胞外マトリックスがゼラチンである、請求項39記載の方法。
前記細胞外マトリックスが、ラミニンまたはその断片である、請求項39記載の方法。
前記RPE細胞の集団が、少なくとも75％純粋、少なくとも80％純粋、少なくとも90％純粋、少なくとも95％純粋、少なくとも96％純粋、少なくとも97％純粋、少なくとも98％純粋、または少なくとも99％純粋である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞がヒトRPE細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、
(i)多能性幹細胞がRPE前駆細胞に分化するように第1の分化培地中で該多能性幹細胞の集団を培養する工程；
(ii)該RPE前駆細胞を解離させ、該細胞を分画して細胞クラスターを収集し、該細胞クラスターを単一細胞に解離させ、単一細胞がRPE細胞に分化するように第2の分化培地中で該単一細胞を継代培養する工程；および
(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程
を含み、
それによってRPE細胞の集団を生成する、前記方法。
網膜上皮（RPE）細胞の集団を生成するための方法であって、
(i)多能性幹細胞がRPE前駆細胞に分化するように第1の分化培地中で該多能性幹細胞の集団を培養する工程；
(ii)該RPE前駆細胞を解離させ、該細胞を分画して細胞クラスターを収集し、細胞がRPE細胞に分化するように該収集された細胞クラスターを第2の分化培地中で継代培養する工程；および
(iii)工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程
を含み、
それによってRPE細胞の集団を生成する、前記方法。
前記RPE細胞を解離させ、該RPE細胞を分画してRPE細胞クラスターを収集し、該RPE細胞クラスターを単一RPE細胞に解離させ、該単一RPE細胞を培養することによって、工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程
をさらに含む、請求項44または45記載の方法。
前記RPE細胞を解離させ、RPE細胞クラスターを収集し、該RPE細胞クラスターを選択的に採集することによって、工程(ii)で生成されたRPE細胞を回収する工程
をさらに含む、請求項44または45記載の方法。
前記選択的に採集したRPE細胞クラスターを単一RPE細胞に解離させ、該単一RPE細胞を培養する工程をさらに含む、請求項47記載の方法。
前記RPE前駆細胞が、PAX6/MITFに対して陽性である、請求項44～48のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞を拡大させる工程をさらに含む、請求項44～49のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、FGFが補充された維持培地中で該細胞を培養することによって拡大される、請求項50記載の方法。
前記維持培地が、各継代でRPE増殖の最初の1日間、2日間または3日間FGFを含み、続いて、FGFを欠く維持培地中でRPE細胞を培養する、請求項51記載の方法。
FGFがコンフルエンスの前に添加される、請求項51または52記載の方法。
前記第1の分化培地および／または第2の分化培地が、ヘパリンおよび／またはROCKインヒビターをさらに含む、請求項44～53のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、最大で2回まで継代される、請求項44～54のいずれか一項記載の方法。
前記解離工程のいずれか1つが、解離試薬で細胞を処理することによって行われる、請求項44～55のいずれか一項記載の方法。
前記解離試薬が、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼIもしくはコラゲナーゼIV）、アクターゼ、キレート剤（例えば、EDTAベースの解離溶液）、トリプシン、ディスパーゼ、またはそれらの任意の組み合わせの群より選択される、請求項56記載の方法。
前記RPE細胞が、回収後に凍結保存される、請求項44～57のいずれか一項記載の方法。
前記細胞が、DMSO（ジメチルスルホキシド）、エチレングリコール、グリセロール、2-メチル-2-4-ペンタンジオール（MPD）、プロピレングリコール、およびショ糖の群より選択される1つまたは複数の凍結保存剤を含む培地中で凍結保存される、請求項58記載の方法。
前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項44～59のいずれか一項記載の方法。
前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項44～59のいずれか一項記載の方法。
前記多能性幹細胞の集団が胚様体である、請求項44～61のいずれか一項記載の方法。
前記工程(i)より前に、前記多能性幹細胞が、多能性を支持する培地中のフィーダー細胞上で培養される、請求項44～62のいずれか一項記載の方法。
前記工程(i)より前に、前記多能性幹細胞が、多能性を支持する培地中でフィーダーフリーで培養される、請求項44～62のいずれか一項記載の方法。
前記多能性を支持する培地にbFGFが補充される、請求項63または64記載の方法。
前記工程(i)、(ii)、および／または(iii)が非接着培養で行われる、請求項44～65のいずれか一項記載の方法。
前記工程(i)、(ii)、および／または(iii)が接着培養で行われる、請求項44～65のいずれか一項記載の方法。
前記第1の分化培地および前記第2の分化培地が同じである、請求項44～67のいずれか一項記載の方法。
前記第1の分化培地および前記第2の分化培地が異なる、請求項44～67のいずれか一項記載の方法。
前記第1の分化培地および前記第2の分化培地がEBDMである、請求項44～68のいずれか一項記載の方法。
前記第1の分化培地が、ニコチンアミド、形質転換因子-β（TGFβ）スーパーファミリー（例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB）、ノーダル、抗ミュラー管ホルモン（AMH）、骨形成タンパク質（BMP）（例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、増殖分化因子（GDF））、WNT経路インヒビター（例えば、CKI-7、DKK1）、TGF経路インヒビター（例えば、LDN193189、ノギン）、BMP経路インヒビター（例えば、SB431542）、ソニックヘッジホッグシグナルインヒビター、bFGFインヒビター、ならびにMEKインヒビター（例えば、PD0325901）の群より選択される1つまたは複数の分化剤を含む、請求項44～69のいずれか一項記載の方法。
前記第2の分化培地が、ニコチンアミド、形質転換因子-β（TGFβ）スーパーファミリー（例えば、アクチビンA、アクチビンB、およびアクチビンAB）、ノーダル、抗ミュラー管ホルモン（AMH）、骨形成タンパク質（BMP）（例えば、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、およびBMP7、増殖分化因子（GDF））、WNT経路インヒビター（例えば、CKI-7、DKK1）、TGF経路インヒビター（例えば、LDN193189、ノギン）、BMP経路インヒビター（例えば、SB431542）、ソニックヘッジホッグシグナルインヒビター、bFGFインヒビター、ならびにMEKインヒビター（例えば、PD0325901）の群より選択される1つまたは複数の分化剤を含む、請求項44～69のいずれか一項記載の方法。
前記第1の分化培地がニコチンアミドを含む、請求項71または72記載の方法。
前記第2の分化培地がアクチビンを含む、請求項71～73のいずれか一項記載の方法。
前記工程(i)における培養の期間が、約1週間～約12週間である、請求項44～74のいずれか一項記載の方法。
前記工程(i)における培養の期間が、少なくとも約3週間である、請求項44～75のいずれか一項記載の方法。
前記工程(i)における培養の期間が、約6週間～約10週間である、請求項44～76のいずれか一項記載の方法。
前記工程(ii)で収集される細胞クラスターが、約40μm～約200μmの間のサイズである、請求項44～77のいずれか一項記載の方法。
前記工程(ii)で収集される細胞クラスターが、約40μm～約100μmの間のサイズである、請求項44～78のいずれか一項記載の方法。
前記工程(ii)において、前記細胞が、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、およびゼラチンの群より選択される細胞外マトリックス上で継代培養される、請求項44～79のいずれか一項記載の方法。
前記細胞外マトリックスが、ラミニンまたはその断片を含む、請求項80記載の方法。
前記ラミニンまたはその断片が、ラミニン-521およびラミニン-511より選択される、請求項81記載の方法。
前記工程(ii)における継代培養の期間が、約1週間～約8週間である、請求項44～82のいずれか一項記載の方法。
前記工程(ii)における継代培養の期間が、少なくとも約3週間である、請求項44～83のいずれか一項記載の方法。
前記工程(ii)における継代培養の期間が、約6週間である、請求項44～84のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞クラスターが、約40μm～200μmの間のサイズである、請求項46および48～85のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞クラスターが、約40μm～100μmの間のサイズである、請求項86記載の方法。
前記単一RPE細胞が、RPEの増殖または分化を支持する培地中で培養される、請求項46および48～87のいずれか一項記載の方法。
前記単一RPE細胞が、ラミニンまたはその断片、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Matrigel、CellStart、コラーゲン、およびゼラチンの群より選択される細胞外マトリックス上で培養される、請求項88記載の方法。
前記細胞外マトリックスがゼラチンである、請求項89記載の方法。
前記細胞外マトリックスが、ラミニンまたはその断片である、請求項89記載の方法。
前記RPE細胞の集団が、少なくとも75％純粋、少なくとも80％純粋、少なくとも90％純粋、少なくとも95％純粋、少なくとも96％純粋、少なくとも97％純粋、少なくとも98％純粋、または少なくとも99％純粋である、請求項44～91のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞がヒトRPE細胞である、請求項44～92のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、RPE65、CRALBP、PEDF、ベストロフィン、MITF、OTX2、PAX2、PAX6、プレメラノソームタンパク質（PMELまたはgp-100）、チロシナーゼ、およびZO1の群より選択されるマーカーの1つまたは複数を発現する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、ベストロフィン、PMEL、CRALBP、MITF、PAX6、およびZO1を発現する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、ベストロフィン、PAX6、MITF、およびRPE65を発現する、請求項1～94のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、MITFならびにベストロフィンと、PAX6より選択される少なくとも1つのマーカーとを発現する、請求項1～94のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、OCT4、NANOG、Rex-1、アルカリホスファターゼ、SOX2、TDGF-1、DPPA-2、DPPA-4、ステージ特異的胚抗原（SSEA）-3およびSSEA-4、腫瘍拒絶抗原（TRA）-1-60およびTRA-1-80の群より選択される1つまたは複数の幹細胞マーカーの実質的な発現を欠いている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、OCT4、SSEA4、TRA-1-81、およびアルカリホスファターゼの実質的な発現を欠いている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記RPE細胞が、OCT4、NANOG、およびSOX2の実質的な発現を欠いている、請求項1～98のいずれか一項記載の方法。
前記請求項のいずれか一項記載の方法によって生成されるRPE細胞の集団を含む、組成物。
請求項1～100のいずれか一項記載の方法によって生成されるRPE細胞の集団および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
網膜疾患を有するかまたは網膜疾患のリスクを有する患者を治療する方法であって、有効量の請求項101記載の組成物または請求項102記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
前記網膜疾患が、網膜変性症、コロイデレミア、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症（乾性または湿性）、網膜剥離、網膜色素変性症、シュタルガルト病、網膜色素線条症、近視性黄斑変性症、および緑内障の群より選択される、請求項103記載の方法。