ES2874953T3 - Métodos para la detección de subpoblaciones raras de células y composiciones muy purificadas de células - Google Patents

Métodos para la detección de subpoblaciones raras de células y composiciones muy purificadas de células Download PDF

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Abstract

Un método in vitro de detección de la presencia de o de confirmación de la ausencia de células madre pluripotentes residuales en una población de células diferenciadas de dichas células madre pluripotentes, que comprende: (a) proporcionar una población de células diferenciadas en condiciones que favorezcan el crecimiento o el mantenimiento de dichas células madre pluripotentes; (b) aplicar un primer colorante y un segundo colorante a dicha población de células, en donde dicho primer colorante detecta un primer marcador y dicho primer marcador comprende fosfatasa alcalina expresada por dichas células madre pluripotentes; y dicho segundo colorante detecta un segundo marcador cuya expresión es indicativa de la presencia de dichas células madre pluripotentes, y (i) en donde dicho primer colorante es detectable bajo luz visible y dicho segundo colorante es detectable bajo luz ultravioleta, o (ii) en donde dicho primer colorante es detectable bajo luz visible y dicho segundo colorante es detectable bajo luz visible, y en donde dicho primer colorante y dicho segundo colorante son distinguibles visualmente; o (iii) en donde dicho primer colorante es observable bajo luz visible y bajo luz ultravioleta y dicho segundo colorante es detectable bajo luz ultravioleta, o (iv) en donde dicho primer colorante es observable bajo luz visible y bajo luz ultravioleta y dicho segundo colorante es detectable bajo luz visible; (c) observar al microscopio las células de dicha población de células bajo visible o luz ultravioleta para detectar células que sean positivas para dicho primer marcador; (d) observar al microscopio las células que son positivas para dicho primer marcador bajo visible o luz ultravioleta y determinar si cualquiera de dichas células es positiva para dicho primer marcador y dicho segundo marcador; y (e) identificar una célula que es positiva para dicho primer marcador y dicho segundo marcador como una célula madre pluripotente, o confirmar la ausencia de células madre pluripotentes si no se identifican células positivas para dicho primer marcador y dicho segundo marcador.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para la detección de subpoblaciones raras de células y composiciones muy purificadas de células
Antecedentes
El uso terapéutico de células madre tiene un profundo potencial para revolucionar el tratamiento médico. Los investigadores llevan mucho tiempo esperando usar células madre embrionarias y otros tipos de células pluripotentes como fuente de células para trasplante terapéutico. Por ejemplo, las células madre embrionarias se pueden diferenciar en células del epitelio pigmentario de la retina y trasplantarse en pacientes para la prevención o el tratamiento de enfermedad retiniana, como se desvela en las patentes de EE. UU. 7.795.025, 7.794.704 y 7.736.896, documento de patente de EE. UU. N° de serie 12/682.712, solicitudes provisionales de EE. u U. 60/998.668, 60/998.766, 61/009.911, 61/009.908, 61/262.002, documentos de patente WO/2009/051671 y WO 2011/063005.
Sin embargo, la capacidad de autorrenovación y la plasticidad de las células madre - los mismos atributos que dicha promesa terapéutica - también conducen a problemas de seguridad. Una clara ilustración de los posibles peligros del uso de células madre sin pruebas de seguridad suficientes fue el caso reciente de un "turista de células madre" que supuestamente recibió inyecciones de células madre en sus riñones en una clínica privada en Tailandia (un tratamiento que aparentemente no había sido probado y que no había sido autorizado por ninguna agencia reguladora). La paciente no tuvo ningún beneficio terapéutico evidente del tratamiento, pero en su lugar desarrolló masas en los sitios de inyección, necesitando la extirpación del riñón (Thirabanjasak et al., "Angiomyeloproliferative Lesions Following Autologous Stem Cell Therapy", J Am Soc Nephrol.17 de junio de 2010). Los autores de este estudio llegaron a la conclusión de que las masas surgieron de las células madre trasplantadas. Este incidente fue ampliamente informado en la prensa general como un recordatorio aleccionador de que "las personas enfermas no deberían jugar con su seguridad, ni con su dinero, recurriendo al turismo de células madre vendido por operadores sin escrúpulos " (Coghlan, "Death revives warnings about rogue stem cell clinics", The New Scientist, 17 de junio de 2010).
Incluso en una pauta de tratamiento usando tipos de células diferenciadas derivadas de células ES, existe la preocupación de que la presencia de algunas células ES residual pudieran dar lugar a un tumor o teratoma. Cierta garantía de seguridad puede proceder de la administración de la preparación de células a un animal (por ejemplo, un animal inmunodeprimido). Sin embargo, las pruebas en animales solo se pueden considerar insuficientes debido a que una célula ES humana puede ser más propensa a producir un teratoma en un hospedador humano que en el modelo animal.
Un enfoque complementario para tratar estas posibles cuestiones de seguridad es la manipulación genética de células madre para expresar un "gen suicida" inducible. La esperanza de estos métodos es que las células madre y su descendencia puedan ser selectivamente destruidos en caso de crecimiento no regulado (véase, por ejemplo, Schuldinar et al., "Selective ablation of human embryonic stem cells expressing a 'suicide' gene", Stem Cells, 2003;21(3):257-65). Sin embargo, dependiendo de la enfermedad implicada y la localización y la cantidad de tejido derivado de células madre, la inducción de muerte de las células trasplantadas podría causar un gran daño al paciente. Además, en el caso de terapias con células específicas de paciente, el uso de este tipo de mecanismo de seguridad requeriría posiblemente ingeniería genética muy laboriosa de células específicas de paciente, junto con la prueba de cada estirpe de células específicas de paciente para seguridad, eficacia y ausencia de modificaciones genéticas no deseadas. Aún cuando los genes suicidas inducibles pudieran proporcionar opciones de tratamiento una vez un tumor o teratoma empieza a aparecer, es evidentemente preferible evitar por completo la formación de tumores o teratomas. Además, las células podrían llegar a ser resistentes a la inducción del gen suicida, por ejemplo, por mutación o pérdida del gen suicida, haciendo ineficaz al gen suicida y permitiendo que las células sigan siendo posiblemente perjudiciales. Así, también se desean métodos de detección directa de células madre en una población de células para proporcionar garantía de que las células madre indiferenciadas están como máximo presentes a una concentración muy baja o preferentemente ausentes por completo.
Los métodos convencionales de detección de células madre han limitado la sensibilidad que podría no proporcionar garantía suficiente de la ausencia de células madre. Para los métodos que utilizan extractos de células a granel (tales como RT-PCR y transferencia Western), la sensibilidad puede estar limitada inherentemente por la expresión de fondo de genes de células madre en células no madre. Por ejemplo, si un gen de célula madre se expresa a concentraciones 1000 veces más bajas en células no madre, un extracto de células a granel que tienen una concentración de células madre inferior a 1 por cada 1000 células tendrá un aumento inferior al doble en ese producto génico, que está por debajo del umbral de ruido para muchos métodos de detección convencionales. Si una pauta terapéutica implica administrar 500.000 células, dicho método sería incapaz de detectar hasta 500 células madre residuales en la preparación de células. Probablemente se consideraría que este número de células madre es poco seguro debido a las posibilidades de formación de teratomas. Así, estos métodos son útiles cuando la sensibilidad de detección deseada no es mayor que la diferencia en veces en la expresión génica de células madre entre células madre y otras células en la población. Debido a esta falta de sensibilidad, dichos métodos serían considerados probablemente como inadecuados para garantizar la seguridad del paciente.
Otro método tradicional de detección de células madre, la citometría de flujo, puede tener algo más de sensibilidad que la RT-PCR para la detección de células madre debido a que se consideran células individuales en vez de extractos a granel. Sin embargo, la preparación de células para la citometría de flujo implica etapas que dan como resultado la pérdida de células, tales como la permeabilización de células, el lavado y el tamizado de células para garantizar una suspensión de células individuales. Debido a esta pérdida de células, existe la preocupación de si la subpoblación de células que llegan al citómetro de flujo es ciertamente representativa de la población inicial de células. Por ejemplo, debido a que las células madre pueden tener una tendencia a estar relativamente "adheridas" en comparación con otros tipos de células, se pueden perder preferentemente en la etapa de tamizado de células. Además, debido a su pequeño tamaño, grupos pequeños de células madre pueden pasar a través de un tamiz juntos y ser contados erróneamente como un único acontecimiento en el flujo citómetro, que conduce a un recuento a la baja de las células madre en la preparación. Además, con los ensayos de citometría de flujo, se requiere normalmente la activación de la población de células para excluir residuo celular, agregados de células y "ruido" de fondo no específico. Aunque se evalúan células no activadas, la interpretación de los resultados (en cuanto a dónde "trazar una línea" para positivas/negativas) se puede basar en la opinión subjetiva de un operario y, aunque se pueden detectar fácilmente grandes cantidades de células contaminantes en una población por citometría de flujo, pequeños números de células se clasificarán casi con seguridad en la categoría de "ruido" aún cuando puedan ser suficientemente numerosas como para plantear posibles cuestiones de seguridad. Así, debido a la posible pérdida o fracaso en contar completamente las células madre, los métodos de citometría de flujo también pueden tener sensibilidad insuficiente para garantizar la seguridad del paciente.
Así, existe una necesidad en la técnica de métodos altamente sensibles de detección de la presencia de células indiferenciadas en una composición de células y de composiciones derivadas de células madre que se ha comprobado que están libres de células madre indiferenciadas. Los métodos preferidos son suficientemente sensibles como para detectar células madre incluso en concentraciones de tan solo 1 por cada 100.000 células o menos, y además permiten probar cada célula en una población sin pérdida de una fracción considerable de células durante la preparación del ensayo.
Sumario
La presente invención proporciona un método in vitro según la reivindicación 1. La presente divulgación proporciona métodos de ensayo para la detección sensible de células de un tipo diana dentro de una población más grande de células de otros tipos. En una realización preferida, las células diana comprenderán células raras, es decir, células que están presentes en cantidades muy pequeñas en una población de células, preferentemente esa población de células se va a usar para terapia de células. En una realización particularmente preferida, estas células raras comprenderán células que si se administran a un sujeto podrían causar una reacción adversa o enfermedad. Los ejemplos específicos incluyen células infectadas por virus (por ejemplo, VIH, hepatitis, etc.), otras enfermedades o células aberrantes (tales como células cancerosas, precancerosas y madre cancerosas), ciertas células inmunitarias, tales como linfocitos T, y similares que si se administran a un receptor podrían dar como resultado infección, enfermedad u otra reacción adversa, tal como una reacción inmunitaria adversa (por ejemplo, GVHD), o dar como resultado la proliferación de células no deseadas. Por ejemplo, los métodos objeto se pueden usar para confirmar que una población que contiene células de donante, tal como células de médula ósea o pancreáticas derivadas de un donante autólogo o heterólogo, que se va a usar en terapia de células o trasplante, carece de células que podrían causar cáncer, infección viral, o una reacción inmunitaria adversa. Según las reivindicaciones, estos métodos se usan para probar la presencia de células madre pluripotentes residuales en una población de células que se puede usar para terapia de trasplante. Los experimentos en los que números definidos de células ES se añadieron a la población de células muestran sensibilidad suficiente para detectar tan solo 5 células ES de la población de 600.000 células, así que muestran la capacidad de detectar células diana tan raras como el 0,0008 % de la población total de células. Usando una realización a modo de ejemplo de estos métodos, un operario cualificado puede examinar en el orden de entre uno y diez millones de células por hora. Debido a que se pueden examinar números arbitrariamente grandes de células, el método tiene la posibilidad de tener sensibilidad ilimitada.
La presente invención proporciona un método in vitro de detección de la presencia o confirmación de la ausencia de células madre pluripotentes residuales en una población de células diferenciadas de dichas células madre pluripotentes, que comprende:
(a) proporcionar una población de células diferenciadas en condiciones que favorezcan el crecimiento o el mantenimiento de dichas células madre pluripotentes;
(b) aplicar un primer colorante y un segundo colorante a dicha población de células,
en donde dicho primer colorante detecta un primer marcador y dicho primer marcador comprende fosfatasa alcalina expresada por dichas células madre pluripotentes; y dicho segundo colorante detecta un segundo marcador cuya expresión es indicativa de la presencia de dichas células madre pluripotentes, y
(i) en donde dicho primer colorante es detectable bajo luz visible y dicho segundo colorante es detectable bajo luz ultravioleta, o
(ii) en donde dicho primer colorante es detectable bajo luz visible y dicho segundo colorante es detectable bajo luz visible, y en donde dicho primer colorante y dicho segundo colorante son distinguibles visualmente; o
(iii) en donde dicho primer colorante es observable bajo luz visible y bajo luz ultravioleta y dicho segundo colorante es detectable bajo luz ultravioleta, o
(iv) en donde dicho primer colorante es observable bajo luz visible y bajo luz ultravioleta y dicho segundo colorante es detectable bajo luz visible;
(c) observar al microscopio las células de dicha población de células bajo visible o luz ultravioleta para detectar células que sean positivas para dicho primer marcador;
(d) observar al microscopio las células que son positivas para dicho primer marcador bajo visible o luz ultravioleta y determinar si cualquiera de dichas células es positiva para dicho primer marcador y dicho segundo marcador; y
(e) identificar una célula que es positiva para dicho primer marcador y dicho segundo marcador como una célula madre pluripotente, o confirmar la ausencia de células madre pluripotentes si no se identifican células positivas para dicho primer marcador y dicho segundo marcador.
El primer colorante puede ser observable bajo luz visible y bajo luz ultravioleta.
El primer marcador comprende fosfatasa alcalina.
El primer colorante puede comprender un anticuerpo directamente o indirectamente acoplado a un reactivo coloreado o una enzima capaz de producir un reactivo coloreado.
El reactivo coloreado puede comprender partículas de oro, partículas de plata o partículas de látex.
El primer colorante puede comprender un anticuerpo directamente o indirectamente acoplado a partículas de oro y dicho método puede comprender además formar un precipitado de plata sobre dichas partículas de oro.
El primer colorante puede comprender además un sustrato de fosfatasa alcalina seleccionado del grupo que consiste en: naftol AS-BI fosfato; fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) y nitroazul de tetrazolio (NBT); reactivo BCIP y reactivo INTX; naftol AS-BI y Fast Red Violet LB, sales de tetrazolio; compuestos diazo; VECTOR® Red; VECTOR® Blue; VECTOR® Black; y p-nitrofenilfosfato (pNPP).
Dicho segundo marcador se puede seleccionar del grupo que consiste en: Oct-4, Nanog, antígeno embrionario específico de estadio 3 (SSEA-3), antígeno embrionario específico de estadio 4 (SSEA-4), TRA-1 -60, TRA-1 -81, TRA-2-49/6E, Sox2, factor de crecimiento y de diferenciación 3 (GDF3), expresión reducida 1 (REX1), factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4), gen específico de células embrionarias 1 (ESG1), 2 asociado a la pluripotencia del desarrollo (DPPA2), DPPA4, transcriptasa inversa de la telomerasa (hTERT), SALL4, E-CADHERINA, grupo de diferenciación 30 (CD30), Cripto (TDGF-1), GCTM-2, Genesis, factor nuclear de células germinativas y factor de células madre (SCF o el ligando c-Kit).
El segundo colorante puede comprender un anticuerpo primario, que puede comprender una marca fluorescente.
El segundo colorante puede comprender además un anticuerpo secundario, que puede comprender una marca fluorescente.
La marca fluorescente se puede seleccionar del grupo que consiste en: Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750 y Alexa Fluor 790, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Texas Red, SYBR Green, Dy Light Fluors, proteína verde fluorescente (GFP), TRIT (tetrametilrrodaminaisotiol), NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), colorante Texas Red, ácido ftálico, ácido tereftálico, ácido isoftálico, violeta de cresilo rápido, azul-violeta de cresilo, azul de cresilo brillante, ácido para-aminobenzoico, eritrosina, biotina, digoxigenina, 5-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, t Et (6-carboxi-2',4,7,7'-tetraclorofluoresceína), HEX (6-carboxi-2',4,4',5',7,7,'-hexaclorofluoresceína), Joe (6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína), 5-carboxi-2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína, 5-carboxifluroresceína, 5-carboxirrodamina, Tamra (tetrametilrrodamina), 6-carboxirrodamina, Rox (carboxi-X-rodamina), R6G (rodamina 6G), ftalocianinas, azometinas, cianinas (por ejemplo Cy3, Cy3.5, Cy5), xantinas, succinilfluoresceínas, N, N-dietil-4-(5'-azobenzotriazolil)-fenilamina, aminoacridina y puntos cuánticos.
La población de células puede comprender células de una especie seleccionada del grupo que consiste en: antílopes, bovinos, camellos, gatos, tragúlidos (ratón ciervo), chimpancé, vaca, ciervo, perro, jirafas, cabra, cobaya, hámster, hipopótamos, caballo, humano, ratón, primate no humano, ovino, pecaríes, cerdo, antílope americano, conejo, rata, macaco Rhesus, rinocerontes, ovejas, tapires y ungulados.
El método puede comprender además determinar el número aproximado de células en la población de células.
Al menos el 90 % de las células en dicha población de células se puede examinar bajo luz visible para detectar células que son positivas para dicho primer marcador, y cada célula que es positiva para dicho primer marcador se puede examinar bajo luz ultravioleta para determinar si esa célula es positiva para dicho segundo marcador.
La población de células puede contener cualquier número de células, dependiendo del uso previsto. Por ejemplo, una población de células puede contener al menos 105 células, al menos 106 células, al menos 107 células, al menos 108 células, al menos 109 células, al menos 1010 células, o entre 105 y 1010 células.
El primer marcador y el segundo marcador pueden ser marcadores de células madre embrionarias.
La población de células se puede producir por diferenciación in vitro de células madre embrionarias.
La célula diana puede ser una célula madre embrionaria o célula pluripotente inducida (iPS).
La población de células puede comprender además células diferenciadas de una célula madre embrionaria o célula iPS.
Las células diferenciadas de una célula madre embrionaria o célula iPS pueden ser células RPE. Por ejemplo, las células RPE se pueden producir por cualquiera de los métodos desvelados en las patentes de EE. UU. 7.795.025, 7.794.704 y 7.736.896, N2 de serie de EE. UU. 12/682.712, documentos de patente WO/2009/051671 y WO 2011/063005.
La célula diana es una célula madre pluripotente residual según las reivindicaciones. El segundo marcador es un marcador asociado a dicha célula madre pluripotente como se enumera en la Tabla 1.
El método puede comprender además antes de la etapa (a) cultivar la población de células en condiciones que favorezcan el mantenimiento de células del tipo de célula diana, y la célula diana puede ser una célula madre embrionaria o una célula pluripotente inducida (iPS), y las condiciones de cultivo pueden comprender medios de células madre embrionarias y/o la presencia de células nodrizas de fibroblastos embrionarios de ratón.
El método puede comprender además sembrar una segunda población de células que comprende el tipo de células diana y analizar dicha segunda población de células por los mismos métodos que dicha población de células de la etapa (a), estableciendo así el límite de detección de dicho método. Solo las células de dicho tipo de células diana se añaden a dicha segunda población, o la segunda población de células puede comprender una mezcla de un primer grupo de células y un segundo grupo células, en donde el primer grupo de células es del mismo tipo que el tipo de células diana. El segundo grupo de células puede tener esencialmente la misma constitución que dicha población de células de la etapa (a). La relación entre el número de células en dicho primer grupo de células y dicho segundo grupo de células se puede seleccionar del grupo que consiste en: 1:10; 1:100, 1:1.000; 1:10.000; 1:100.000; 1:1.000.000; 1:10.000.000; 1:100.000.000; 1:1.000.000.000; entre 1:10 y 1:100; entre 1:10 y 1:1.000; entre 1:10 y 10.000; entre 1:10 y 1:100.000; entre 1:10 y 1:1.000.000; entre 1:10 y 1:10.000.000; entre 1:10 y 1:100.000.000; entre 1:10 y 1:1.000.000.000; entre 1:100 y 1:1.000; entre 1:100 y 1:10.000; entre 1:100 y 1:100.000; entre 1:100 y 1:1.000.000; entre 1:100 y 1:10.000.000; entre 1:100 y 1:100.000.000; entre 1:100 y 1:1.000.000.000; entre 1:1.000 y 1:10.000 ; entre 1:1.000 y 1:100.000; entre 1:1.000 y 1:1.000.000; entre 1:,1000 y 1:10.000.000; entre 1:1.000 y 1:100.000.000; entre 1:1.000 y 1:1.000.000.000 entre 1:10.000 y 1:100.000; entre 1:10.000 y 1:1.000.000; entre 1:10.000 y 1:10.000.000; entre 1:10.000 y 1:100.000.000; entre 1:10.000 y 1:1.000.000.000; entre 1:100.000 y 1:1.000.000; entre 1:100.000 y 1:10.000.000; entre 1:100.000 y 1:100.000.000; entre 1:100.000 y 1:1.000.000.000; entre 1:1.000.000; y 1:10.000.000; entre 1:1.000.000 y 1:100.000.000; entre 1:1.000.000 y 1:1.000.000.000; entre 1:10.000.000 y 1:100.000.000; entre 1:10.000.000 y 1:1.000.000.000; y entre 1:100.000.000 y 1:1.000.000.000.
La población de células que contiene supuestamente la célula diana puede comprender médula ósea, glóbulos sanguíneos o células pancreáticas.
La población de células que contiene supuestamente la célula diana puede haber sido tratada previamente por clasificación de células, irradiación, quimioterapia u otro medio para retirar la célula diana.
También se describe en el presente documento una composición que comprende células somáticas derivadas de células madre que pueden estar esencialmente libres de dichas células madre.
También se describe en el presente documento una composición que comprende células y un indicador que indica el número o la fracción de células diana (tal como células madre) presentes, en donde el valor de dicho indicador se puede determinar aplicando los métodos descritos en el presente documento a una población de células representativas de las células en dicha composición. La composición puede comprender células RPE, que se pueden diferenciar de células madre pluripotentes, tales como células madre embrionarias, células iPS, blastómeros, células de masa interna, u ovocitos que se pueden activar de forma partenogenética. Estas células madre pluripotentes pueden ser recombinantes o genéticamente manipuladas (por ejemplo, manipuladas para expresar una proteína terapéutica deseada o para eliminar la expresión de un gen implicado en una deficiencia genética, tal como degeneración macular). Las células RPE se pueden formular y usar para tratar enfermedades degenerativas de la retina. Además, las células RPE derivadas de células madre pluripotentes se pueden usar en ensayos de cribado para identificar agentes que modulan la supervivencia de células RPE (in vitro y/o in vivo), para estudiar la maduración de células RPE, o para identificar agentes que modulan la maduración de células RPE. Los agentes identificados usando dichos ensayos de cribado se pueden usar in vitro o in vivo y pueden proporcionar terapéuticos adicionales que se pueden usar solos o en combinación con células RPE para tratar enfermedades degenerativas de la retina. La composición puede comprender una preparación sustancialmente purificada de células RPE humanas diferenciadas de células madre pluripotentes humanas, en donde las células RPE expresan, al nivel de ARNm y de proteína, RPE-65, bestrofina, PEDF, CRALBP, Otx2 y MITF, y en donde las células carecen sustancialmente de expresión de Oct-4, NANOG y Rex-1. Las células RPE pueden comprender células RPE diferenciadas y células RPE diferenciadas maduras, y al menos las células RPE diferenciadas maduras pueden expresar, además, a los niveles de ARNm y de proteína, PAX2, pax-6 y tirosinasa. Las células RPE se pueden diferenciar de células ES humanas o células iPS humanas.
La composición puede comprender al menos 105 células, al menos 106 células, al menos 107 células, al menos 108 células, al menos 109 células, al menos 1010 células, o entre 105 y 1010 células.
La composición puede comprender células crioconservadas. La composición puede comprender una preparación crioconservada que comprende al menos aproximadamente 104 células RPE humanas, en donde la preparación es una preparación sustancialmente purificada de células RPE humanas derivadas de células madre pluripotentes humanas, y en donde las células RPE expresan RPE-65, bestrofina, PEDF, CRALBP, Otx2 y MITF. Al menos aproximadamente el 85 % de las células RPE pueden retener viabilidad después de la descongelación. Por ejemplo, las células RPE se pueden crioconservar por un método que comprende: (a) cultivar células RPE, (b) recoger dichas células RPE, (c) centrifugar dichas células RPE, (d) resuspender dichas células RPE en disolución de 10 % de DMSO/90 % de FBS; y (e) congelar dichas células RPe .
La población de células puede comprender células RPE diferenciadas de células pluripotentes por los métodos descritos en las patentes de EE. UU. 7.795.025, 7.794.704 y 7.736.896, serie de EE. UU. N° 12/682.712, solicitudes provisionales de EE. UU. 60/998.668, 60/998.766, 61/009.911,61/009.908 y 61/262.002, documentos de patente WO/ 2009/051671 y WO 2011/063005.
En una realización, las células diana son células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas (iPS), células madre adultas, células hematopoyéticas, células madre fetales, células madre mesenquimatosas, células madre posparto, células madre multipotentes o células germinativas embrionarias. En otra realización, las células madre pluripotentes pueden ser células madre pluripotentes de mamífero. En otra realización adicional, las células madre pluripotentes pueden ser células madre pluripotentes humanas que incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias humanas (hES), células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas, células madre adultas humanas, células madre hematopoyéticas humanas, células madre fetales humanas, células madre mesenquimatosas humanas, células madre posparto humanas, células madre multipotentes humanas o células germinativas embrionarias humanas. En otra realización, las células madre pluripotentes pueden ser una estirpe de células hES enumerada en el Registro europeo de células madre embrionarias humanas - hESCreg. En otra realización, la estirpe de células hES puede ser una estirpe de células hES derivadas de blastómero, tal como MA09 u otra estirpe celular obtenida por los métodos descritos en las patentes de EE. UU. 7.893.315 o 7.838.727.
También se describe en el presente documento el uso de una preparación farmacéutica de células RPE en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de degeneración retiniana.
También se describe en el presente documento un método de tratamiento de degeneración retiniana que comprende administrar una cantidad eficaz de las células RPE descritas en el presente documento. La degeneración retiniana es debida a coroideremia, retinopatía diabética, degeneración macular senil, desprendimiento de retina, retinitis pigmentosa o enfermedad de Stargardt.
La preparación se puede trasplantar en una suspensión, matriz, coloide de gel, armazón o sustrato. La preparación se puede administrar por inyección en el espacio subrretiniano del ojo.
La cantidad eficaz puede ser al menos aproximadamente 20.000-200.000 células RPE. La cantidad eficaz puede ser al menos aproximadamente 20.000, 50.000, 75.000, 100.000, 125.000, 150.000, 175.000, 180.000, 185.000, 190.000 o 200.000 células RPE.
El método puede comprender además monitorizar la eficacia del método midiendo respuestas del electrorretinograma, umbral de agudeza optomotora o umbral de luminancia en el sujeto.
La preparación puede estar sustancialmente libre de célula ES, contaminación viral, bacteriana o fúngica. Las células RPE pueden ser células RPE funcionales capaces de ser integradas en la retina tras el trasplante. Las células RPE pueden mejorar la agudeza visual tras el trasplante.
En el presente documento también se describen métodos para el tratamiento de trastornos oculares. En particular, estos métodos implican el uso de células RPE para tratar o mejorar los síntomas de trastornos oculares, particularmente trastornos oculares causaos o agravados, por completo o en parte, por daño o rotura de la capa endógena de RPE (por ejemplo, degeneración retiniana).
Las células RPE descritas en el presente documento pueden estar sustancialmente libres de mutaciones genéticas que pueden conducir a degeneración retiniana.
Las células RPE se pueden trasplantar con un polímero biocompatible, tal como ácido poliláctico, ácido poli(lácticoco-glicólico), 50:50 de PDLGA, 85:15 de PDl Ga y membrana biodegradable INION Gt R® (mezcla de polímeros biocompatibles).
Las células RPE se pueden adherir a la membrana de Bruch después del trasplante, establecer polaridad e integrarse en el tejido del receptor.
Las células RPE pueden mejorar la agudeza visual después del trasplante. Las células RPE pueden mejorar sustancialmente la agudeza visual después del trasplante.
Las células RPE pueden carecer de expresión apreciable de marcadores de células madre embrionarias que incluyen, pero no se limitan a, Oct-4, NANOG, Rex-1, fosfatasa alcalina, Sox2, TDGF-1, DPPA-2 y DPPA-4. Las células Rp E pueden expresar marcadores de células RPE que incluyen, pero no se limitan a, RPE65, CRALBP, PEDF, bestrofina, MITF, Otx2, PAX2, Pax-6 y tirosinasa. Las células RPE pueden expresar al menos un gen, en donde la expresión del al menos un gene es elevada en las células RPE con respecto a la expresión en células ES humanas. Las células RPE pueden mostrar elevada expresión de la subunidad alfa de la integrina. La subunidad alfa de la integrina puede ser alfa 1,2, 3, 4, 5, 6 o 9. La expresión puede ser expresión de ARNm, expresión de proteínas, o tanto expresión de ARNm como de proteínas.
También se describe en el presente documento un método para proporcionar una preparación de RPE a un sitio clínico que comprende (a) descongelar viales de células crioconservadas RPE, (b) resuspender las células RPE en medios, (c) centrifugar las células RPE, (d) resuspender las células RPE en medios, (e) separar en alícuotas las células RPE en viales, y (f) transferir al sitio clínico. Las etapas de resuspensión y de centrifugación se pueden repetir al menos 1, 2, 3, 4 o 5 veces. El producto de RPE se puede transportar al sitio clínico en al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 horas desde la finalización de la etapa (e). Los viales se pueden etiquetar.
También se describe en el presente documento un método para proporcionar una preparación de células RPE para su venta que comprende (a) producir células RPE y (b) preparar dichas preparaciones de células RPE para la transferencia a un cliente. El método puede comprender crioconservar las células RPE. El método puede comprender ofrecer dichas preparaciones de células RPE para su venta. El método puede comprender publicitar las preparaciones de células RPE.
La invención contempla cualquier combinación de los aspectos y las realizaciones descritos anteriormente o más adelante. Por ejemplo, se pueden usar preparaciones de células RPE que comprenden cualquier combinación de células RPE diferenciadas y células RPE maduras en el tratamiento de cualquiera de las afecciones descritas en el presente documento. Similarmente, los métodos descritos en el presente documento para producir células RPE usando células madre embrionarias humanas como material de partida se pueden realizar similarmente usando cualquier célula madre pluripotente humana como material de partida.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una micrografía representativa que muestra la detección de células hES (positivas para Oct-4 y positivas para fosfatasa alcalina) entre células diferenciadas. La expresión de GFP confirma la identidad de células hES.
FIG. 2A-C Se extrajo ARN de poblaciones mixtas de células RPE y células hES (que contienen 0 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 10 % o 100 % de células hES como se indica). Entonces se sintetizó ADNc y se ensayó la expresión génica relativa en repeticiones por triplicado normalizada a la señal de beta-actina presente en cada muestra. La pauta de expresión génica se realizó por RT-qPCR usando StepOne Plus de Applied Biosystems con la versión 2.1 de software y ensayos de expresión génica TaqMan de Life Technologies siguiendo las condiciones de ciclos recomendadas por el fabricante para la cuantificación relativa comparativa. Los datos se expresan como la media /- desviación estándar para tres repeticiones con valores de p determinados por la prueba de la t. Los resultados se presentan para la expresión de (A) OCT4, (B) Nanog y (C) SOX2.
Descripción detallada
Los métodos convencionales de detección de células madre han limitado la sensibilidad debido a la expresión de fondo de genes de células madre en células no madre y debido a la pérdida de células durante la preparación de muestras. La presente divulgación proporciona métodos que pueden vencer estas limitaciones y proporcionar un método de detección altamente sensible de tipos raros de células en una población de células. Usando estos métodos, un operario puede examinar en el orden de entre uno y diez millones de células teñidas por hora y detectar células individuales del tipo de célula diana en la población de células. Las realizaciones a modo de ejemplo se pueden realizar en un modo automático o semiautomático que puede además mejorar el rendimiento. Por ejemplo, cuando se producen células diferenciadas a partir de células ES, es conveniente determinar si quedan células ES residuales en la población de células, y se puede desechar un lote dado de células si la proporción de células ES supera un cierto umbral prefijado. Se pueden examinar varios millones de células representativas de cada lote de células diferenciadas con gasto de solo algunas horas de trabajo, proporcionando una garantía enormemente elevada de la ausencia de células ES residuales.
Debido a que se pueden examinar números arbitrariamente grandes de células, las realizaciones de los presentes métodos tienen posiblemente sensibilidad ilimitada.
En una realización a modo de ejemplo, se siembran células a alta densidad, pero lo más preferentemente a densidad no superior a una monocapa (para simplificar la observación microscópica de las células), que pueden estar encima de una monocapa de células nodriza, y luego se tiñen para la presencia de dos o más marcadores característicos del tipo de célula diana, que incluyen un primer marcador que es detectable bajo luz visible y un segundo marcador que es detectable bajo luz ultravioleta. Entonces se observan al microscopio bajo luz visible las células sembradas para detectar células que expresan el primer marcador. A partir de una esquina de las células sembradas, el operario (o un sistema automático) barre toda la placa y de vuelta en pistas superpuestas, lo que asegura que se examina cada célula. Debido a que se usa luz visible, las células no teñidas son visibles y el plano focal se puede ajustar según se necesite para garantizar que las células siguen en el foco a medida que las células sembradas se mueven a través del campo de vista. El uso de luz visible también previene el fotoblanqueo que puede ocurrir bajo luz ultravioleta. El barrido bajo luz visible se puede realizar con un aumento relativamente pequeño, que aumenta el número de células que se observan en cada campo microscópico y aumenta el rendimiento. Las células que son positivas para el primer marcador se examinan entonces bajo luz ultravioleta para determinar si las células también expresan el segundo marcador. La selección de marcadores se puede basar en su expresión conocida en células pluripotentes: por ejemplo, se sabe que la fosfatasa alcalina (que se puede usar con células ES como el marcador usado para "barrer" toda la placa en luz visible) permanece en las células hES durante más tiempo que el otro marcador cuando se empiezan a diferenciar. Así, si una célula es positiva para la fosfatasa alcalina, puede ser o positiva o negativa para el segundo marcador y, por lo tanto, las células positivas para el primer y segundo marcador se consideran una célula hES. Preferentemente (al igual que con AP y Oct-4 para las células hES), el primer marcador tiñe las células diana de forma consistente (aún cuando también pueda teñir otras células) para evitar perder la oportunidad de observar células que pueden ser positivas para el segundo marcador, pero tienen una expresión baja o indetectable del primer marcador. Normalmente, las células positivas se fotografían de manera que la comparación de fotografías pueda evitar contar dos veces las células que se observan en campos que se solapan. El número total de células sembradas se determina contando todas las células en cada uno de uno o más campos microscópicos representativos y dividiendo el número de células encontradas entre la fracción del área sembrada total que se contó. Finalmente, el número de células diana detectado se expresa como una proporción del número total de células examinadas.
Estos marcadores se eligen para distinguir células diana de los otros tipos de células en la población. Por ejemplo, si las células diana son células hES y el otro tipo de célula en la población es células RPE humanas, entonces el primer marcador puede ser fosfatasa alcalina y el segundo marcador puede ser Oct-4. Otros marcadores de células ' hES a modo de ejemplo que se pueden usar con estos métodos incluyen: Nanog, antígeno embrionario específico de estadio 3 (SSEA-3), antígeno embrionario específico de estadio 4 (SSEA-4), TRA-1 -60, TRA-1 -81, TRA-2-49/6E, Sox2, factor de crecimiento y de diferenciación 3 (GDF3), expresión reducida 1 (REX1), factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4), gen específico de células embrionarias 1 (ESG1), 2 asociado a la pluripotencia del desarrollo (DPPA2), DPPA4, transcriptasa inversa de la telomerasa (hTERT), s A l L4, E-CADHERINA, grupo de diferenciación 30 (CD30), Cripto (TDGF-1), GCTM-2, Genesis, factor nuclear de células germinativas y factor de células madre (SCF o el ligando c-Kit). Los presentes métodos utilizan al menos dos marcadores y pueden utilizar tres, cuatro, cinco, seis, etc., marcadores que pueden proporcionar confirmación adicional de si una célula es de un tipo diana.
En un ejemplo, la célula diana es una célula madre de cáncer y se detecta por tinción con uno o más de los marcadores desvelados en una de las siguientes solicitudes de patente publicadas de EE. UU.: 20100169990, 20090004205, 20080194022, 20080178305, 20080175870, 20080064049, 20070297983, 20070259969, 20070231325, 20070212737,20070190647,20060073125,20060051325,20040037815 y 20020119565.
Preferentemente, las células se siembran en condiciones que favorezcan el mantenimiento del tipo de célula diana. Sembrando en dichas condiciones, es más probable que el tipo de células diana sea retenido en el cultivo y se deba mejorar la sensibilidad del método. Por ejemplo, si las células diana son células hES, las células se pueden sembrar en condiciones que se conocen que mantienen la célula hES en el estado pluripotente. Las condiciones de cultivo a modo de ejemplo incluyen sembrar en células nodriza, que pueden ser inactivadas por la mitosis pretratando con irradiación o mitomicina C u otros métodos conocidos en la técnica, o en medios acondicionados por células nodriza. Se conocen en la técnica numerosos tipos de células nodrizas adecuadas que incluyen cultivos de fibroblastos primarios, tales como fibroblasto embrionario murino (MEF), fibroblastos dérmicos humanos adultos, células STO y otros. Las condiciones de cultivo para el mantenimiento sin nodrizas de células ES también se conocen en la técnica y puede incluir matrigel, laminina, hormona adrenocorticotrópica, medio acondicionado, o cualquier combinación de los mismos. Los medios de cultivos de células ES a modo de ejemplo, que incluye medios de cultivo sin nodrizas, se describen en Carpenter et al., Dev Dyn. 2004 feb; 229(2):243-58; Xu et al., Nat Biotechnol. 2001 oct;19(10):971-4; Rosler et al., Dev Dyn. 2004 feb;229(2):259-74; y Amit et al., Biol Reprod. 2004 Mar; 70(3):837-45; documento de patente WO01/51616; patente de EE. UU. N° 6.800.480; publicación de EE. UU. preconcedida N° 2009/0275128; publicación de EE. UU. preconcedida N° 2008/0064099; y publicación de EE. UU. preconcedida N° 2007/0160974.
Preferentemente, el método está validado para determinar su sensibilidad, por ejemplo, por "experimentos de enriquecimiento" en los que números definidos de células de un tipo de células diana se añaden a una población, que luego se ensaya usando los métodos objeto para detectar células del tipo de célula diana. El uso de poblaciones que contienen números definidos de células diana permite la determinación del número mínimo de células diana que debe estar presente o el límite de detección del ensayo, por ejemplo, el porcentaje mínimo de la población que debe ser, en promedio, del tipo de célula diana antes de que las células diana se detecten por el ensayo. El límite de detección se puede expresar como una relación o fracción que indica la proporción mínima de células del tipo de célula diana que se puede detectar en el ensayo (por ejemplo, 5 en 600.000 células o el 0,0008 %).
El método puede incluir una etapa de determinación de un factor de corrección que se puede usar para corregir la sensibilidad o límite de detección del ensayo. Por ejemplo, las células diana se pueden perder durante el cultivo antes de realizar el ensayo (por ejemplo, las células diana se pueden diferenciar en otros tipos de células). Se pueden sembrar números definidos de células del tipo diana en las mismas condiciones que en los experimentos de enriquecimiento, pero en ausencia del otro tipo de células en la población (aunque si las células nodriza son parte de las condiciones de cultivo, entonces pueden estar presentes). Por ejemplo, si están presentes células nodriza de una especie diferente de las células diana, las células se pueden teñir con un anticuerpo específico de especie que específicamente identifica células de la especie de las células diana, que detectarían células que han perdido los marcadores específicos de células diana. Después de este cultivo, el cultivo se puede examinar para determinar la fracción de células diana que retuvieron la expresión de los marcadores de célula diana usados en el ensayo, determinando así un "factor de corrección" que establece la relación entre el número de células sembradas y el número que retienen los fenotipos usados para la detección. Por ejemplo, si se determina que el 50 % de las células diana pierden expresión de los marcadores de células diana ensayados en estas condiciones, entonces el número de células diana eficaz (por ejemplo, usado en el cálculo del límite de detección en experimentos de enriquecimiento) se reduce en consecuencia. Así, si se muestra en experimentos "de enriquecimiento" que el ensayo puede detectar tan solo diez células diana añadidas por millones de células en la población, pero ese 50 % de células diana pierde el fenotipo detectado durante el cultivo, entonces se puede calcular que el límite de detección corregido del ensayo es cinco células en diez millones para reflejar el número de células diana que en realidad siguen presentes en la población.
Además, el método emplea preferentemente preparaciones de muestras que hacen que sea máximo el número de células diana que siguen presentes en la población y retienen la expresión de los marcadores de células diana usados para su detección. Una realización adicional a modo de ejemplo proporciona un método de identificación de una condición de cultivo que conserva la expresión de un marcador seleccionado por células diana, que comprende sembrar células diana en condiciones de cultivo variables, identificar la fracción de células diana que retienen la expresión de uno o más marcadores característicos de células diana en cada condición de cultivo, e identificar las condiciones de cultivo que retienen una mayor fracción como una condición de cultivo que conserva la expresión de un marcador seleccionado por células diana. Por ejemplo, la presente divulgación demuestra que para detectar células hES, la retención de marcadores de células hES (y, por lo tanto, la sensibilidad del ensayo) mejora enormemente usando condiciones de cultivos de células hES (cultivo en MEF en medios de cultivo de células hES) en vez de condiciones de cultivo de células RPE (ausencia de MEF y un medio en el que se diferencian las células hES).
Los marcadores se pueden detectar usando al menos una tinción que es detectable bajo luz visible y otro marcador que es detectable bajo luz ultravioleta. Los marcadores detectables bajo luz visible pueden ser detectables basándose en una actividad enzimática. Las enzimas a modo de ejemplo que puede producir productos coloreados detectables bajo la luz visible incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasas (incluyendo peroxidasa de rábano picante) y pgalactosidasas. Estas enzimas se pueden expresar por células diana, o se pueden acoplar a una molécula que se une a una célula diana (tal como un anticuerpo primario o secundario).
Un marcador que es detectable bajo luz visible que se puede usar en las realizaciones de la presente divulgación es fosfatasa alcalina, que se puede teñir basándose en su actividad enzimática. La fosfatasa alcalina se puede expresar endógenamente, acoplar a un anticuerpo, o ambos. Se pueden usar numerosos sustratos para la tinción de fosfatasa alcalina para producir un producto detectable bajo la luz visible, que incluye: naftol AS-BI fosfato como sustrato y colorante Fast Red Violet como lectura colorimétrica (por ejemplo, usando el kit II de tinción de fosfatasa alcalina (AP) Stemgent®); bromo-cloro-indolilfosfato (BCIP) y nitroazul de tetrazolio (NBT/azul de tiazolilo/Nitro BT) (por ejemplo, sustrato para micropocillos azul de fosfatasa alcalina (SIGMA-ALDRIc H®)); reactivo BCIP y reactivo INTX (Sig Ma -ALDRIc H®); naftol AS-BI y Fast Red Violet LB (por ejemplo, kit de fosfatasa alcalina de leucocitos (SIGMA-ALDRICH®); los sustratos que forman precipitados se basan en o la reducción de sales de tetrazolio o la producción de compuestos diazo coloreados (por ejemplo, VECTOR® Red, VECTOR® Blue, Vector® Black, p-nitrofenilfosfato, kit de sustrato BCIP/NBT AP y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/nitroazul de tetrazolio). Opcionalmente, se puede usar un inhibidor de fosfatasa alcalina, tal como Levamisol ((S)-6-fenil-2,3,5,6-tetrahidroimidazo[2,1-b][1,3]tiazol) o un tratamiento térmico para inhibir la actividad de fondo de la fosfatasa alcalina no deseada.
Otro marcador que es detectable bajo luz visible que se puede usar en las realizaciones de la presente divulgación es la peroxidasa, tal como la peroxidasa de rábano picante (HRP), que se puede teñir basándose en su actividad enzimática. La peroxidasa se puede expresar endógenamente, acoplar a un anticuerpo, o ambos. La peroxidasa puede catalizar la conversión de sustratos cromogénicos en moléculas coloreadas. Los sustrato de peroxidasa a modo de ejemplo incluyen 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB); 3,3'-diaminobencidina (DAB); 3-amino-9-etilcarbazol (AEC); ácido 4-cloro-1-naftol; 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS); cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio; 2-cloro-5,5-dimetil-1,3-ciclohexanodiona; 3,3',5,5'-tetrametilbencidina; tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina; cloruro de azul de 3-nitrotetrazolio; 4-aminoftalhidrazida; 4-cloro-1-naftol; 4-cloro-7-nitrobenzofurazano; ácido 5-aminosalicílico; diclorhidrato de dicarboxidina; guaiacol; aducto de peróxido de hidrógeno-urea; cloruro de yodonitrotetrazolio; Luminol; MTT formazano; N-(4-aminobutil)-N-etilisoluminol; N-(6-aminohexil)-N-etilisoluminol; cloruro de azul de nitrotetrazolio; pirogalol; cloruro de tetranitroazul de tetrazolio; indicador de cloruro de azul de tetrazolio; violeta de tetrazolio; odianisidina; diclorhidrato de o-dianisidina; diclorhidrato de o-fenilendiamina; base libre de o-fenilendiamina; e hidroperóxido de trans-5-fenil-4-pentenilo.
Otro marcador que es detectable bajo luz visible que se puede usar en las realizaciones de la presente divulgación es p-galactosidasa, que se puede teñir basándose en su actividad enzimática. La p-galactosidasa se puede expresar endógenamente, acoplar a un anticuerpo, o ambos. La p-galactosidasa puede catalizar la conversión de sustratos cromogénicos en moléculas coloreadas. Los sustratos de p-galactosidasa a modo de ejemplo incluyen: 1 -metil-3-indolil-p-d-galactopiranósido; 2-nitrofenil-p-d-galactopiranósido; 4-metilumbeliferil p-d-galactopiranósido; 4-nitrofenil-pd-galactopiranósido; 5-bromo-3-indolil-p-d-galactopiranósido; 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-d-galactopiranósido; 5-bromo-6-cloro-3-indolil-p-d-galactopiranósido; 6-bromo-2-naftil p-d-galactopiranósido; 6-cloro-3-indolil-p-dgalactopiranósido; di(p-d-galactopiranósido) de fluoresceína; y p-d-galactopiranósido de resorufina.
Cuando los anticuerpos se usan como un componente de una tinción, un marcador se puede acoplar directa o indirectamente al anticuerpo. Los ejemplos de acoplamiento indirecto incluyen acoplamiento de avidina/biotina, acoplamiento por un anticuerpo secundario, y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, las células se pueden teñir con un anticuerpo primario que se une a antígeno específico de diana, y un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario o una molécula acoplada al anticuerpo primario se pueden acoplar a un marcador detectable. El uso de acoplamiento indirecto puede mejorar la relación entre señal y ruido, por ejemplo, reduciendo la unión de fondo y/o proporcionando amplificación de señal.
Otras tinciones detectables bajo luz visible incluyen partículas que incluyen oro, plata o látex. Por ejemplo, las partículas se pueden acoplar directa o indirectamente a anticuerpos primarios o secundarios o unir de otro modo a células diana. Opcionalmente, la tinción se puede potenciar aún más usando tinción con inmuno-oro-plata, en la que las células se tiñen con un anticuerpo acoplado a oro coloidal, y las partículas de oro se revelan usando un método de reacción por precipitación de plata (Holgate et al., J Histochem Cytochem. 1983 jul;31 (7):938-44).
Las realizaciones a modo de ejemplo del presente método utilizan anticuerpos acoplados a una molécula fluorescente, tal como bromuro de etidio, SYBR Green, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Dy Light Fluors, proteína verde fluorescente (GFP), TRIT (tetrametilrrodaminaisotiol), NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), colorante Texas Red, ácido ftálico, ácido tereftálico, ácido isoftálico, violeta de cresilo rápido, azul-violeta de cresilo, azul de cresilo brillante, ácido para-aminobenzoico, eritrosina, biotina, digoxigenina, 5-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, TET (6-carboxi-2',4,7,7'-tetraclorofluoresceína), HEX (6-carboxi-2',4,4',5',7,7'- hexaclorofluoresceína), Joe (6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína) 5-carboxi-2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína, 5-carboxifluoresceína, 5-carboxirrodamina, Tamra (tetrametilrrodamina), 6-carboxirrodamina, Rox (carboxi-X-rodamina), R6G (rodamina 6G), ftalocianinas, azometinas, cianinas (por ejemplo Cy3, Cy3.5, Cy5), xantinas, succinilfluoresceínas, N,N-dietil-4-(5'-azobenzotriazolil)-fenilamina y aminoacridina. Otras moléculas fluorescentes a modo de ejemplo incluyen puntos cuánticos, que se describen en la bibliografía de patentes [véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 6.207.299, 6.322.901,6.576.291,6.649.138 (métodos de modificación superficial en los que los agentes de transferencia mixtos de polímero h id rófobo/h id róf i lo se unen a la superficie de los puntos cuánticos), las patentes de EE. UU. N° 6.682.596, 6.815.064 (para cortezas aleadas o mixtas)], y en la bibliografía técnica [tal como "Alternative Routes toward High Quality CdSe Nanocrystals", (Qu et al., Nano Lett., 1(6):333-337 (2001)]. Los puntos cuánticos que tienen diversas químicas superficiales y características de fluorescencia están comercialmente disponibles de Invitrogen Corporation, Eugene, Oreg., Evident Technologies (Troy, N.Y.), y Quantum Dot Corporation (Hayward, Calif.), entre otros. Punto cuántico" también incluye puntos cuánticos aleados, tales como ZnSSe, ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe, ZnCdS, ZnCdSe, ZnCdTe, ZnHgS, ZnHgSe, ZnHgTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, ZnCdSSe, ZnHgSSe, ZnCdSeTe, ZnHgSeTe, CdHgSSe, CdHgSeTe, InGaAs, GaAlAs y InGaN. Los puntos cuánticos aleados y los métodos de preparación de los mismos se desvelan, por ejemplo, en la publicación de solicitud de EE. UU. N° 2005/0012182 y la publicación PCT WO 2005/001889.
La presente divulgación proporciona realizaciones a modo de ejemplo que ilustran la detección altamente sensible de células madre embrionarias humanas en una población de células RPE diferenciadas, pero se pueden adaptar fácilmente para detectar otros tipos de células o con otras especies distintas de la humana. Por ejemplo, estos métodos se pueden usar con otros tipos de células que incluyen otros tipos de células madre, células cancerosas, células nodriza, células xenógenas, u cualquier otro tipo de célula que expresa marcadores característicos. Similarmente, estos métodos se pueden usar con primates humanos, no humanos, antílopes, bovinos, camellos, gatos, tragúlidos (ratón ciervo), chimpancé, vaca, ciervo, perro, jirafas, cabra, cobaya, hámster, hipopótamos, caballo, humano, ratón, primate no humano, ovino, pecaríes, cerdo, antílope americano, conejo, rata, macaco Rhesus, rinocerontes, ovejas, tapires y ungulados, o cualquiera otro tipo de célula de mamífero o no de mamífero.
Las células diana (tales como las células madre) se pueden identificar por expresión de uno o más marcadores de células madre. Se puede desear probar la expresión de uno o más marcadores de células diana (por ejemplo, dos marcadores, tres marcadores, cuatro marcadores, etc.) para proporcionar garantía adicional de que una célula que expresa un marcador de célula diana es de hecho una célula diana. Por ejemplo, se puede acoplar (tanto directa como indirectamente) cada uno de una "mezcla" de anticuerpos contra diferentes marcadores a la misma marca o a marcas diferentes. Como un ejemplo, una mezcla de anticuerpos contra diferentes marcadores puede contener cada uno un motivo de unión que se une a la misma marca (por ejemplo, cada uno puede contener un Fc de la misma especie que es reconocido por el mismo anticuerpo secundario, o cada uno se puede biotinilar y específicamente unir por la misma marca acoplada con avidina). Opcionalmente, se pueden utilizar dos o más anticuerpos diferentes o mezclas de anticuerpos. Preferentemente, las células se tiñen usando al menos dos marcas que se pueden distinguir entre así, que permite así la identificación de células que expresan al menos dos marcadores diferentes del tipo de célula diana. Las células también se pueden teñir usando al menos tres, cuatro, cinco o más marcas diferentes que se pueden distinguir entre sí, permitiendo así la detección de células que expresan mayores números de marcadores del tipo de célula diana. Opcionalmente, una célula se puede identificar como una célula del tipo diana si expresa un número preseleccionado de marcadores o ciertas combinaciones preseleccionadas de marcadores.
Además, no es necesario que el (los) marcador(es) del tipo de célula diana sean únicos para las células diana, en tanto que permitan la distinción de las células diana de otras células en la población. Por ejemplo, se puede usar fosfatasa alcalina como marcador adecuado para detectar células hES dentro de una población de RPE, aún cuando otros tipos de células también expresen fosfatasa alcalina, debido a que la fosfatasa alcalina no es expresada normalmente por RPE.
Los marcadores de células madre embrionarias a modo de ejemplo incluyen fosfatasa alcalina, Oct-4, Nanog, antígeno embrionario específico de estadio 3 (SSEA-3), antígeno embrionario específico de estadio 4 (SSEA-4), TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, Sox2, factor de crecimiento y de diferenciación 3 (GDF3), expresión reducida 1 (REX1), factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4), gen específico de células embrionarias 1 (ESG1), 2 asociado a la pluripotencia del desarrollo (DPPA2), DPPA4, transcriptasa inversa de la telomerasa (hTERT), SALL4, E-CADHERiNa , grupo de diferenciación 30 (CD30), Cripto (TDGF-1), GCTM-2, Genesis, factor nuclear de células germinativas y factor de células madre (SCF o el ligando c-Kit).
Para algunos tipos de células a modo de ejemplo, las células solo se pueden considerar positivas para un marcador dado si ese marcador presenta una localización característica o patrón dentro de la célula. Por ejemplo, una célula se puede considerar "positiva" si está presente un marcador citoesquelético en el citoesqueleto y "negativa" si existe cierta tinción citoplásmica difusa. En dicho caso, las células se pueden cultivar en condiciones adecuadas (por ejemplo, como cultivos adheridos) para establecer la localización característica o patrón dentro de la célula. Los expertos habituales en la técnica determinan fácilmente el tiempo y las condiciones de cultivo adecuadas para el ensamblaje del citoesqueleto (u otros procesos para establecer la organización subcelular) que pueden ser necesarios para la consistente detección de un marcador dado. Además, se pueden elegir fácilmente marcadores que disminuyen o eliminan la necesidad de cultivo adherido como una condición previa para la consistente tinción. Por ejemplo, se pueden teñir poblaciones de células no adheridas después del procedimiento de tipo CytoSpin (en el que las células pueden perder su morfología normal mientras que son "aplastadas" sobre portaobjetos por fuerza centrífuga); se conocen bien o se identifican fácilmente marcadores adecuados para su uso en dichas circunstancias.
Además de los marcadores de células madre anteriores, los métodos actualmente desvelados se pueden usar con otros tipos de células. Los marcadores para otras poblaciones de células o tipos de célula diana a modo de ejemplo que se pueden usar según las realizaciones del método actualmente desvelado se enumeran en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1. Tipos de células a modo de ejemplo y marcadores indicativos de los tipos de células.
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Las células RPE pueden expresar marcadores de células RPE. Por ejemplo, el nivel de expresión de los genes de células RPE RPE65, PAX2, Pa X6 y tirosinasa, bestrofina, PEDF, CRALBP, Otx2 y MITF puede ser equivalente a aquél en células RPE que existen de forma natural. El nivel de madurez de las células RPE se puede evaluar por expresión de al menos uno de PAX2, PAX6 y tirosinasa, o sus niveles de expresión respectivos.
A diferencia, las células RPE pueden no expresar marcadores de células ES. Por ejemplo, los niveles de expresión de los genes de células ES Oct-4, NANOG y/o Rex-1 pueden ser aproximadamente 100-1000 veces más bajos en células RPE que en células ES. Por ejemplo, las células RPE pueden carecer sustancialmente de expresión de marcadores de células ES que incluyen, pero no se limitan a, factor de transcripción 4 que se une a octámero (Oct-4, también conocido como POU5F1), antígenos embrionarios específicos de estadio (SSEA)-3 y SSEA-4, antígeno de rechazo de tumor (TRA)-1 -60, TRA-1 -80, fosfatasa alcalina, NANOG y Rex-1. Así, en comparación con las células ES, las células RPE carecen sustancialmente de expresión de Oct-4, NANOG y/o Rex-1.
Preparaciones de células RPE
En el presente documento también se describen preparaciones de células RPE y un indicador que indica el número o la fracción de células pluripotentes presentes, en donde el valor de dicho indicador se puede determinar aplicando los métodos descritos en el presente documento a una población de células representativa de las células en dicha preparación. En el presente documento se describen células RPE, poblaciones sustancialmente purificadas de células RPE, preparaciones farmacéuticas que comprenden células RPE y preparaciones crioconservadas de las células RPE. Las células RPE descritas en el presente documento pueden estar sustancialmente libres de al menos una proteína, molécula, u otra impureza que se encuentre en su entorno natural (por ejemplo, "aislada".) Las células RPE pueden ser de mamífero, que incluyen, células RPE humanas. También se describen células RPE humanas, una población sustancialmente purificada de células RPE humanas, preparaciones farmacéuticas que comprenden células RPE humanas y preparaciones crioconservadas de las células RPE humanas. La preparación puede ser una preparación que comprende células RPE derivadas de células madre embrionarias humanas, células RPE derivadas de células iPS humanas y preparaciones sustancialmente purificadas (con respecto a células distintas de RPE) que comprenden células RPE derivadas de ES diferenciadas.
Las poblaciones de células RPE pueden incluir células RPE diferenciadas de niveles variables de madurez, o pueden ser sustancialmente puras con respecto a células RPE diferenciadas de un nivel particular de madurez. Las células RPE pueden ser una preparación sustancialmente purificada que comprende células RPE de niveles variables de madurez/pigmentación. Por ejemplo, el cultivo de células RPE sustancialmente purificado puede contener tanto células RPE diferenciadas como células RPE diferenciadas maduras. Entre las células RPE maduras, puede variar el nivel de pigmento. Sin embargo, las células RPE maduras se pueden distinguir visualmente de las células RPE basándose en el aumento del nivel de pigmentación y la forma más columnar. La preparación sustancialmente purificada de células RPE comprende células RPE de diferentes niveles de madurez (por ejemplo, células RPE diferenciadas y células RPE diferenciadas maduras). En dichos casos, puede haber variabilidad en la preparación con respecto a la expresión de marcadores indicativos de pigmentación. La pigmentación de las células RPE en el cultivo celular puede ser homogénea. Además, la pigmentación de las células RPE en el cultivo celular puede ser heterogénea, y el cultivo de células RPE puede comprender tanto células RPE diferenciadas como células RPE maduras. Las preparaciones que comprenden células RPE incluyen preparaciones que son sustancialmente puras, con respecto a tipos de células distintas de RPE, pero que contienen una mezcla de células RPE diferenciadas y células RPE diferenciadas maduras. Las preparaciones que comprenden células RPE también incluyen preparaciones que son sustancialmente puras tanto con respecto a tipos de células distintas de RPE como con respecto a células RPE de otros niveles de madurez.
El porcentaje de células RPE diferenciadas maduras en el cultivo se puede reducir disminuyendo la densidad del cultivo. Así, los métodos descritos en el presente documento pueden comprender además subcultivar una población de células RPE maduras para producir un cultivo que contiene un porcentaje más pequeño de células RPE maduras. El número de células RPE en la preparación incluye células RPE diferenciadas, independientemente del nivel de madurez e independientemente de los porcentajes relativos de células RPE diferenciadas y células RPE diferenciadas maduras. El número de células RPE en la preparación se refiere al número de células RPE diferenciadas o células RPE maduras. La preparación puede comprender al menos aproximadamente el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de células RPE diferenciadas. La preparación puede comprender al menos aproximadamente el 75 %, 80 %. 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de células RPE maduras. La preparación de células RPE puede comprender una población mixta de células RPE diferenciadas y células RPE maduras.
También se describe en el presente documento un cultivo celular que comprende células RPE humanas que están pigmentadas y expresan al menos un gen que no se expresa en una célula que no es una célula RPE humana. Por ejemplo, aunque dichas células RPE puedan tener sustancialmente la misma expresión de RPE65, PEDF, CRALBP, y bestrofina que una célula RPE humana natural, las células RPE pueden variar, dependiendo del nivel de madurez, con respecto a la expresión de uno o más de PAX2, Pax-6, MITF y/o tirosinasa. Obsérvese que cambios en la pigmentación post-diferenciación también se correlacionan con cambios en la expresión de PAX2. Se pueden distinguir células RPE maduras de células RPE por el nivel de pigmentación, nivel de expresión de PAX2, Pax-6 y/o tirosinasa. Por ejemplo, las células RPE maduras podrían tener un mayor nivel de pigmentación o un mayor nivel de expresión de PAX2, Pax-6 y/o tirosinasa en comparación con las células RPE.
La preparación puede estar sustancialmente purificada, con respecto a las células distintas de RPE, que comprende al menos aproximadamente el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de células RPE. La preparación de células RPE puede estar esencialmente libre de células distintas de RPE o consistir en células RPE. Por ejemplo, la preparación sustancialmente purificada de células RPE puede comprender menos de aproximadamente 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de tipo de célula no RPE. Por ejemplo, la preparación de células RPE puede comprender menos de 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,09 %, 0,08 %, 0,07 %, 0,06 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 %, 0,01 %, 0,009 %, 0,008 %, 0,007 %, 0,006 %, 0,005 %, 0,004 %, 0,003 %, 0,002 %, 0,001 %, 0,0009 %, 0,0008 %, 0,0007 %, 0,0006 %, 0,0005 %, 0,0004 %, 0,0003 %, 0,0002 % o 0,0001 % de células distintas de RPE.
Las preparaciones de células RPE pueden ser sustancialmente puras, tanto con respecto a células distintas de RPE como con respecto a células RPE de otros niveles de madurez. Las preparaciones pueden estar sustancialmente purificadas, con respecto a células distintas de RPE, y enriquecidas en células RPE maduras. Por ejemplo, en preparaciones de células RPE enriquecidas en células RPE maduras, al menos aproximadamente el 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de las células RPE son células RPE maduras. Las preparaciones pueden estar sustancialmente purificadas, con respecto a células distintas de RPE, y enriquecidas en células RPE diferenciadas en vez de células RPE maduras. Por ejemplo, al menos aproximadamente el 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de las células RPE pueden ser células RPE diferenciadas en vez de células RPE maduras.
Las preparaciones de células RPE pueden comprender al menos aproximadamente 1 x103, 2x103, 3x103, 4x103, 5x103, 6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1 x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1 x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1 x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1 x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x1077x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1 x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010 o 9x1010 células RPE. Las preparaciones de células RPE pueden comprender al menos aproximadamente 5.000-10.000, 50.000-100.000, 100.000-200.000, 200.000-500.000, 300.000-500.000 o 400.000-500.000 células RPE. La preparación de células RPE puede comprender al menos aproximadamente 20.000-50.000 células RPE. Por tanto, la preparación de células RPE puede comprender al menos aproximadamente 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 75.000, 80.000, 100.000 o 500.000 células RPE.
Las preparaciones de células RPE pueden comprender al menos aproximadamente 1 x 103, 2x 103, 3x103, 4xl03,5xl03,6x103, 8x103, 9x103, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1 x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1 x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x1077x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010 o 9x1010 células RPE/mL. Las preparaciones de células RPE pueden comprender al menos aproximadamente 5.00010.000, 50.000-100.000, 100.000-200.000, 200.000-500.000, 300.000-500.000 o 400.000-500.000 células RPE/mL.
La preparación de células RPE puede comprender al menos aproximadamente 20.000-50.000 células RPE/mL. Por
tanto, la preparación de células RPE puede comprender al menos aproximadamente 5.000, 10.000, 20.000, 30.000,
40.000, 50.000, 60.000, 75.000, 80.000, 100.000 o 500.000 células RPE/mL.
Las preparaciones descritas en el presente documento pueden estar sustancialmente libres de contaminación o
infección bacteriana, viral o fúngica, que incluye, pero no se limita a, la presencia de VIH-1, VIH-2, VHB, VHC, CMV,
HTLV-1, HTLV-2, parvovirus B19, virus de Epstein-Barr, o virus del herpes 6. Las preparaciones descritas en el
presente documento pueden estar sustancialmente libres de contaminación o infección por micoplasma.
Las células RPE descritas en el presente documento también pueden actuar de células RPE funcionales después del
trasplante donde las células RPE forman una monocapa entre la retina neurosensorial y la coroides en el paciente que
recibe las células trasplantadas. Las células RPE también pueden suministrar nutrientes a los fotorreceptores
adyacentes y eliminar los segmentos externos de fotorreceptores desprendidos por fagocitosis. Además, las células
RPE descritas en el presente documento pueden haber experimentado menos senescencia que las células derivadas
de donantes de ojo (por ejemplo, las células RPE son "más jóvenes" que las de donante de ojo). Esto permite que la
célula RPE descrita en el presente documento tenga una mayor vida útil que las células derivadas de donantes de ojo.
Las preparaciones que comprenden células RPE se pueden preparar según prácticas correctas de fabricación (GMP)
(por ejemplo, las preparaciones son conforme a GMP) y/o las actuales buenas prácticas en materia de tejidos (GTP)
(por ejemplo, las preparaciones pueden ser conforme a GTP).
Cultivos de células RPE
En el presente documento también se describen cultivos sustancialmente purificados de células RPE, que incluyen células
RPE humanas y un indicador que indica el número o la fracción de células pluripotentes presentes, en donde el valor de
dicho indicador se puede determinar aplicando el método descrito en el presente documento a una población de células
representativa de la célula en dichos cultivos. Los cultivos de RPE descritos en el presente documento pueden comprender
al menos aproximadamente 1.000; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; o 9.000 células RPE. El cultivo puede
comprender al menos aproximadamente 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105,
3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x10 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x1077x107, 8x107, 9x107, 1 x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1 x109,
2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x10 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010 células RPE.
Las células RPE se pueden cultivar aún más para producir un cultivo de células RPE maduras. Las células RPE
pueden ser maduradas, y las células RPE se pueden cultivar aún más en, por ejemplo, medio MDBK-MM hasta que
se obtenga el nivel deseado de maduración. Esto se puede determinar monitorizando el aumento en el nivel de
pigmentación durante la maduración. Como una alternativa al medio MDBK-MM, se puede usar un medio
funcionalmente equivalente o similar. Independientemente del medio particular usado para madurar las células RPE,
el medio se puede complementar opcionalmente con un factor de crecimiento o agente. Tanto las células RPE como
las células RPE maduras son células RPE diferenciadas. Sin embargo, las células RPE maduras se caracterizan por
un elevado nivel de pigmento en comparación con las células RPE diferenciadas. El nivel de madurez y la pigmentación
se pueden modular aumentando o disminuyendo la densidad de cultivo de células RPE diferenciadas. Así, un cultivo
de células RPE se puede cultivar aún más para producir células RPE maduras. Alternativamente, se puede disminuir
la densidad de un cultivo que contiene células RPE maduras para reducir el porcentaje de células RPE diferenciadas
maduras y aumentar el porcentaje de células RPE diferenciadas.
Las células RPE se pueden identificar comparando el ARN mensajero transcrito de dichas células con células
derivadas in vivo. Se toma una alícuota de células a diversos intervalos durante la diferenciación de células madre
embrionarias en células RPE y se ensaya para la expresión de cualquiera de los marcadores descritos anteriormente.
Estas características distinguen a las células RPE diferenciadas.
El cultivo de células RPE puede ser un cultivo sustancialmente purificado que comprende al menos aproximadamente
el 30 %, 35 %, 40 %, o 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de células RPE diferenciadas. El cultivo sustancialmente purificado puede
comprender al menos aproximadamente el 30 %, 35 %, 40 %, o 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %,
85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de células RPE diferenciadas
maduras.
Los cultivos de células RPE se pueden preparar según prácticas correctas de fabricación (GMP) (por ejemplo, los
cultivos son conforme a GMP) y/o las actuales buenas prácticas en materia de tejidos (GTP) (por ejemplo, los cultivos
pueden conforme a GTP).
Preparaciones crioconservadas de células RPE
Las células RPE se pueden congelar para el almacenamiento. Por ejemplo, se puede analizar la porción de una
población de células de RPE usando los métodos descritos en el presente documento para detectar la presencia de cualquier célula hES residual en la población, y el resto de la población se congela para su almacenamiento, lo que permite así la determinación de la concentración aproximada de células hES en la población de células. Las células
RPE congeladas se pueden asociar a un indicador que indica el número o la concentración de células hES detectadas en la población o indica de otro modo el resultado del ensayo, por ejemplo, un indicador que indica que las células han "pasado" la prueba de contaminación de células hES debido a que el número detectado o la concentración de células hES está por debajo de un umbral de liberación establecido, que indica que las células se consideran adecuadas para su uso.
Las células RPE se pueden almacenar por cualquier método apropiado conocido en la técnica (por ejemplo, congelar criogénicamente) y se pueden congelar a cualquier temperatura apropiada para el almacenamiento de las células. Por ejemplo, las células se pueden congelar a aproximadamente -20 °C, -80 °C, -120 °C, -130 °C, -135 °C, -140 °C, -150 °C, -160 °C, -170 °C, -180 °C, -190 °C, -196 °C, a cualquier otra temperatura apropiada para el almacenamiento de células. Las células criogénicamente congeladas se pueden almacenar en envases apropiados y preparar para el almacenamiento para reducir el riesgo de daño a las células y maximizar la probabilidad de que las células sobrevivan a la descongelación. Las células RPE se pueden crioconservar inmediatamente tras la diferenciación, tras la maduración in vitro, o después de algún periodo de tiempo en cultivo. Las células RPE también se pueden mantener a temperatura ambiente, o refrigeradas, por ejemplo, a aproximadamente 4 °C.
Se describen similarmente métodos de crioconservación de células RPE. Las células RPE se pueden recoger, lavar en tampón o medio, contar, concentrar (por centrifugación), formular en medio de congelación (por ejemplo, 90 % de FBS/10 % de DMSO), o cualquier combinación de estas etapas. Por ejemplo, las células RPE se pueden sembrar en varios recipientes de cultivo y expandir en serie. Las células RPE se recogen y se mantienen en FBS a aproximadamente 4 °C, mientras que varios matraces de células RPE se combinan en un único lote. Las células RPE también se pueden lavar en solución salina (por ejemplo, DPBS) al menos 1, 2, 3, 4 o 5 veces. Además, las células
RPE se pueden crioconservar después de que la distrofina se organice en la membrana celular y la expresión de PAX6 sea baja. Además, los viales se pueden etiquetar, con una etiqueta primaria y/o secundaria. La información en la etiqueta puede incluir el tipo de célula (por ejemplo, células hRPE), el número y la fecha del lote, el número de células
(por ejemplo, 1 x106 células/mL), la fecha de caducidad (por ejemplo, la fecha recomendada en la que el vial se debe usar), información de fabricación (por ejemplo, nombre y dirección), advertencias y el medio de almacenamiento (por ejemplo, almacenamiento en nitrógeno líquido).
Las preparaciones crioconservadas de células RPE descritas en el presente documento pueden comprender al menos aproximadamente 50.000-100.000 células RPE. Las preparaciones crioconservadas de células RPE también pueden comprenden al menos aproximadamente 20.000-50.000 células RPE. Por tanto, las preparaciones crioconservadas de células RPE pueden comprender al menos aproximadamente 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 75.000, 80.000 o 100.000 células RPE. Las preparaciones crioconservadas de células RPE puede comprender al menos aproximadamente 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 1 x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1 x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1 x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x1077x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1 x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109 células
RPE. Las células RPE de las preparaciones crioconservadas de células RPE pueden ser células RPE de mamífero, que incluyen células RPE humanas.
Además, las preparaciones crioconservadas de células RPE descritas en el presente documento pueden comprender al menos aproximadamente 50,00-100.000 células RPE/mL. Las preparaciones crioconservadas de células RPE también pueden comprenden al menos aproximadamente 20.000-500.000 células RPE/mL. Por tanto, las preparaciones crioconservadas de células RPE puede comprender al menos aproximadamente 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 75.000, 80.000 y 100.000 células RPE/mL. Las preparaciones crioconservadas de células RPE pueden comprender al menos aproximadamente 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x1077x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010 célula RPE/mL. Las células RPE de las preparaciones crioconservadas de células RPE pueden ser células RPE de mamífero, que incluyen células RPE humanas.
Las células RPE se pueden recuperar del almacenamiento tras la crioconservación. Las células RPE recuperadas de la crioconservación también mantienen su estado de viabilidad y diferenciación. Por ejemplo, al menos aproximadamente el
65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de las células RPE pueden retener la viabilidad y diferenciación tras la crioconservación.
Además, las células RPE se pueden crioconservar y mantener su viabilidad después de ser almacenadas durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días. Las células RPE también se pueden crioconservar y mantener su viabilidad después de ser almacenadas durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. Las células
RPE se pueden crioconservar y mantener su viabilidad después de ser conservadas durante al menos aproximadamente
1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 años. Por ejemplo, las células RPE se pueden crioconservar durante al menos aproximadamente 4 años y mostrar al menos aproximadamente el 80 % de viabilidad. La preparación de crioconservación que comprende células
RPE puede estar sustancialmente libre de DMSO.
Métodos de producción células RPE
Se pueden producir poblaciones de células analizadas por los métodos objeto a partir de células madre pluripotentes. Los tipos de células que se pueden producir incluyen, pero no se limitan a, células RPE, células RPE progenitoras, células epiteliales pigmentadas del iris (IPE) y otras células neurales asociadas a la visión, tales como neuronas internunciales (por ejemplo, neuronas de "retraso" de la capa nuclear interna (INL)) y células amacrinas. Además, se pueden producir células retinianas, bastones, conos y células de la córnea. Las células que proporcionan la vasculatura del ojo también se puede producir por los métodos descritos en el presente documento.
Sin desear quedar ligado a una teoría particular, los inventores encontraron que los métodos descritos en el presente documento pueden actuar mediante FGF, EGF, WNT4, TGF-beta y/o estrés oxidativo para señalizar MAP-cinasa y posibles vías de la cinasa terminal C-Jun para inducir la expresión del factor de transcripción Paired-box 6 (PAX6). PAX6 actúa sinérgicamente con PAX2 para diferenciar terminalmente RPE madura por la coordinación de MITF y Otx2 para transcribir genes específicos de RPE, tales como tirosinasa (Tyr), y dianas en la dirección 3', tales como RPE-65, bestrofina, CRALBP y PEDF. Véase el documento de patente W o 2009/051671, Figura 1.
Las células RPE descritas en el presente documento se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes, tales como las células madre embrionarias humanas, y pueden ser molecularmente distintas de las células madre embrionarias, células RPE derivadas de adulto y células RPE derivadas de feto. Por ejemplo, las etapas del proceso de fabricación descritas en el presente documento pueden conferir características estructurales y funcionales distintivas al producto de células RPE final de forma que estas células se parezcan mucho a las células RPE nativas y sean distintas de las células RPE derivadas de feto o estirpes de células RPE (por ejemplo, APRE19).
Un método a modo de ejemplo de producción de una célula RPE comprende: (a) proporcionar células madre pluripotentes; (b) cultivar las células madre pluripotentes como cuerpos embrioides en medio rico en nutrientes y bajo en proteínas, en donde el medio comprende opcionalmente complemento B-27 sin suero; (c) cultivar los cuerpos embrioides como un cultivo adherido en medio rico en nutrientes y bajo en proteínas, en donde el medio comprende opcionalmente complemento B-27 sin suero; (d) cultivar el cultivo adherido de células de (c) en medio rico en nutrientes y bajo en proteínas, en donde el medio no comprende complemento B-27 sin suero; (e) cultivar las células de (d) en medio capaz de soportar el crecimiento de cultivo celular somático de alta densidad, por el cual las células RPE aparecen en el cultivo de células; (f) disociar las células o grupos de células del cultivo de (e), preferentemente mecánicamente o químicamente (por ejemplo, usando una proteasa u otra enzima, u otro medio de disociación); (g) seleccionar las células RPE del cultivo y transferir las células RPE a un cultivo separado que contiene medio complementado con un factor de crecimiento para producir un cultivo enriquecido de células RPE; y (g) propagar el cultivo enriquecido de células RPE para producir una célula RPE. Estas etapas de método se pueden realizar al menos una vez para producir un cultivo sustancialmente purificado de células RPE. Además, estas etapas de método se pueden repetir al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces para producir más células RPE.
Además, en el presente documento se describe un método de producción de un célula de epitelio pigmentario de la retina (RPE) madura que comprende: (a) proporcionar células madre pluripotentes; (b) cultivar las células madre pluripotentes como cuerpos embrioides en medio rico en nutrientes y bajo en proteínas, en donde el medio comprende opcionalmente complemento B-27 sin suero; (c) cultivar los cuerpos embrioides como un cultivo adherido en medio rico en nutrientes y bajo en proteínas, en donde el medio comprende opcionalmente complemento B-27 con suero; (d) cultivar el cultivo adherido de células de la etapa (c) en medio rico en nutrientes y bajo en proteínas, en donde el medio no comprende complemento B-27 sin suero; (e) cultivar las células de (d) en medio capaz de soportar el crecimiento de cultivo celular somático de alta densidad, por el cual células RPE aparecen en el cultivo de células; (f) disociar las células o grupos de células del cultivo de (e), preferentemente mecánicamente o químicamente (por ejemplo, usando una proteasa u otra enzima, u otro medio de disociación); (g) seleccionar las células RPE del cultivo y transferir las células RPE a un cultivo separado que contiene medio complementado con un factor de crecimiento para producir un cultivo enriquecido de células RPE; (h) propagar el cultivo enriquecido de células RPE; y (i) cultivar el cultivo enriquecido de células RPE para producir una célula RPE madura. Estas etapas de método se pueden realizar al menos una vez para producir un cultivo sustancialmente purificado de células RPE maduras. Además, estas etapas de método se pueden repetir al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces para producir más células RPE maduras.
Para cualquiera de las etapas articuladas, las células se pueden cultivar durante al menos aproximadamente 1-10 semanas. Por ejemplo, las células se pueden cultivar durante al menos aproximadamente 3-6 semanas. Para cualquiera de las etapas articuladas, las células se pueden cultivar durante entre aproximadamente 1 días y 50 días, por ejemplo, durante al menos aproximadamente 1 -3, 3-4, 7, 4-9, 7-10, 7-12, 8-11,9-12, 7-14, 14-21 y 3-45 días. Las células se pueden cultivar aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 487, 48, 49 o 50 días. Las células se pueden cultivar durante aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, ,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 horas. Por ejemplo, las células se pueden cultivar durante 2-4 y 3-6 horas. Para cada una de las etapas de método de anteriormente articuladas, las células se pueden cultivar durante el mismo periodo de tiempo en cada etapa o durante periodos de tiempo diferentes en una o más de las etapas. Además, se puede repetir cualquiera de las etapas de método anteriormente articuladas para producir más células RPE (por ejemplo, aumento para producir grandes números de células RPE).
En los métodos descritos en el presente documento, las células RPE se pueden empezar a diferenciar de entre las células en el cultivo adherido de EB. Las células RPE pueden ser visualmente reconocidas basándose en su morfología en adoquín y el aspecto inicial de la pigmentación. A medida que las células RPE continúan diferenciándose, se pueden observar grupos de células RPE.
Se pueden usar métodos mecánicos o enzimáticos para seleccionar células RPE de entre los grupos de células distintas de RPE en un cultivo de cuerpo embrioide, o para facilitar el subcultivo de células adheridas. Los métodos mecánicos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, valoración con una pipeta o corte con una aguja de tracción. Los métodos enzimáticos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, cualquier enzima apropiada para disociar células (por ejemplo, tripsina (por ejemplo, tripsina/EDTA), colagenasa (por ejemplo, colagenasa B, colagenasa IV), dispasa, papaína, mezcla de colagenasa y dispasa, una mezcla de colagenasa y tripsina). Se puede usar una disolución no enzimática para disociar las células, tales como una disolución con alto contenido de EDTA, por ejemplo, tampón de disociación de células basado en Hanks.
Las células RPE se pueden diferenciar de los cuerpos embrioides. El aislamiento de células RPE de EB permite la expansión de las células RPE en un cultivo enriquecido in vitro. Para células humanas, las células RPE se pueden obtener de EB cultivados durante menos de 90 días. Además, las células RPE pueden surgir en EB humanos cultivados durante al menos aproximadamente 7-14 días, 14-28 días, 28-45 días o 45-90 días. Se puede retirar el medio usado para el cultivo de células madre pluripotentes, cuerpos embrioides y células RPE y/o sustituir con los mismos medios o diferentes en cualquier intervalo. Por ejemplo, el medio se puede retirar y/o sustituir después de al menos aproximadamente 0-7 días, 7-10 días, 10-14 días, 14-28 días o 28-90 días. Además, el medio se puede sustituir al menos diariamente, cada dos días, o al menos cada 3 días.
Para enriquecer en células RPE y para establecer cultivos sustancialmente purificados de células RPE, las células RPE se pueden disociar entre sí y de células distintas de RPE usando métodos mecánicos y/o químicos (incluyendo enzimáticos). Entonces se puede transferir una suspensión de células RPE a medio nuevo y a un recipiente de cultivo nuevo para proporcionar una población enriquecida de células RPE.
Las células RPE se pueden seleccionar de las células disociadas y cultivar por separado para producir un cultivo sustancialmente purificado de células RPE. Las células RPE se seleccionan basándose en las características asociados a células RPE. Por ejemplo, las células RPE se pueden reconocer por la morfología celular en adoquín y la pigmentación. Además, se conocen varios marcadores de RPE, que incluye proteína celular de unión a retinaldehído (CRALBP), una proteína citoplásmica que también se encuentra en microvellosidades apicales; RPE65, una proteína citoplásmica que participa en el metabolismo retinoide; bestrofina, el producto el gen de la distrofia macular viteliforme de Best (VMD2) y factor derivado de epitelio del pigmento (PEDF), una proteína de 48 kD secretada con propiedades angiostáticas. Se pueden ensayar los transcritos de ARN mensajero de estos marcadores usando PCR (por ejemplo, RT-PCR) o transferencias Northern. Por tanto, se pueden ensayar los niveles de proteína de estos marcadores usando tecnología de inmunotransferencia o transferencias Western.
Las células RPE también se pueden seleccionar basándose en la función celular, tal como por fagocitosis de segmentos externos de bastones y conos desprendidos (o fagocitosis de otro sustrato, tal como perlas de poliestireno), absorción de luz parásita, metabolismo de la vitamina A, regeneración de retinoides y reparación de tejido. La evaluación también se puede realizar probando in vivo la función después de la implantación de células RPE en un animal hospedador adecuado (tal como un animal humano o no humano que padece una afección que existe de forma natural o inducida de degeneración retiniana), por ejemplo, usando pruebas de comportamiento, angiografía fluorescente, histología, conductividad de zonas de oclusión, o evaluación usando microscopía electrónica.
Los cultivos enriquecidos de células RPE se pueden cultivar en medio apropiado, por ejemplo, medio EGM-2. Este, o un medio funcionalmente equivalente o similar, se puede complementar con un factor de crecimiento o agente (por ejemplo, bFGF, heparina, hidrocortisona, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento recombinante similar a la insulina, ácido ascórbico, o factor de crecimiento epidérmico humano). Las células RPE pueden ser fenotípicamente estables durante un largo periodo de tiempo en cultivo (por ejemplo, >6 semanas).
Células madre pluripotentes
Los métodos descritos en el presente documento pueden usar células diferenciadas (tales como células RPE) producidas a partir de células madre pluripotentes. Las células madre pluripotentes adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias, células madre derivadas de embrión y células madre pluripotentes inducidas, independientemente del método por el que se obtengan las células madre pluripotentes. Las células madre pluripotentes se pueden generar usando, por ejemplo, métodos conocidos en la técnica. Las células madre pluripotentes a modo de ejemplo incluyen células madre embrionarias derivadas de la masa celular interna (ICM) de embriones en estadio de blastocisto, así como células madre embrionarias derivadas de uno o más blastómeros de un embrión en estadio de escisión o en estadio de mórula (opcionalmente sin destruir el resto del embrión). Dichas células madre embrionarias se pueden generar a partir de material embrionario producido por fecundación o por medios asexuales, que incluye transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), partenogénesis, reprogramación celular y androgénesis. Además, las células madre pluripotentes adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas humanas.
Las células madre pluripotentes (por ejemplo, células hES) se pueden cultivar como un cultivo en suspensión para producir cuerpos embrioides (EB). Los cuerpos embrioides se pueden cultivar en suspensión durante aproximadamente 7-14 días. Sin embargo, en ciertas realizaciones, los EB se pueden cultivar en suspensión durante menos de 7 días (menos de 7, 6, 5, 4, 3, 2, o menos de 1 día) o más de 14 días. Los EB se pueden cultivar en medio complementado con el complemento B-27.
Después de cultivar los EB en cultivo en suspensión, los EB se pueden transferir para producir un cultivo adhesivo. Por ejemplo, los EB se pueden sembrar en placas recubiertas de gelatina en medio. Cuando se cultivan como un cultivo adhesivo, los EB se pueden cultivar en el mismo tipo de medio que cuando se cultivan en suspensión. Los medios pueden no estar complementados con el complemento B-27 cuando las células se cultivan como un cultivo adherido. Por tanto, el medio se complementa con B-27 inicialmente (por ejemplo, durante menos de o igual a aproximadamente 7 días), pero luego se cultivan posteriormente en ausencia de B-27 durante el resto del periodo como un cultivo adhesivo. Los EB se pueden cultivar como un cultivo adherido durante al menos aproximadamente 14-28. Sin embargo, en ciertas realizaciones, los EB se pueden cultivar como un cultivo adherido durante menos de aproximadamente 14 días (menos de 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o menos de 1 día) o más de aproximadamente 28 días.
Células madre embrionarias humanas
Se pueden usar células madre embrionarias humanas (hES) como una célula madre pluripotente en los métodos descritos en el presente documento. Las células madre embrionarias humanas (hES) incluyen la descendencia de la masa celular interna (ICM) de un blastocisto o células derivadas de otra fuente, y pueden seguir siendo pluripotentes prácticamente indefinidamente. Las células hES también se pueden inducir células pluripotentes (células iPS) que se describen con más detalle más adelante. Por tanto, se pueden usar células hES crioconservadas. Las células hES se pueden cultivar de cualquier forma conocida en la técnica, tal como en presencia o ausencia de células nodriza. Por ejemplo, las células hES se pueden cultivar en MDBK-GM, medio hESC, medios de células madre de INVITROGEN®, OptiPro SFM, VP-SFM, EGM-2 o MDBK-MM. Véase Stem Cell Information (Culture of Human Embryonic Stem Cells (hESC)) [sitio web de NIH, 2010]. Las células hES se pueden usar y mantener según normas GMP.
Cuando se cultivan en cultivo en una capa nodriza en condiciones definidas, las células hES mantienen una morfología específica, formando colonias planas que comprenden células pequeñas muy compactadas con una alta relación entre núcleo y citoplasma, claros límites entre las células y bordes de colonias nítidos y refractivos. Las células hES expresan un conjunto de marcadores moleculares, tales como la proteína 4 de unión a octámero (Oct-4, también conocido como Pou5f1), antígenos embrionarios específicos de estadio (SSEA)-3 y SSEA-4, antígeno de rechazo de tumor (TRA)-1-60, TRA-1-80, fosfatasa alcalina, NANOG y Rex-1. Similar a las células de ICM que se diferencian en linajes predeterminados, se pueden inducir las células hES en cultivo para que se diferencien. Por ejemplo, se pueden diferenciar células hES en RPE humana en las condiciones definidas descritas en el presente documento.
Las células madre embrionarias humanas que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, MA01, MA04, MA09, ACT-4, MA03, H1, H7, H9 y H14. Las estirpes celulares adicionales a modo de ejemplo incluyen NED1, NED2, NED3, NED4 y NED5. Véase también el Registro de células madre embrionarias humanas de NIH. Una estirpe de células madre embrionarias humanas a modo de ejemplo que se puede usar es células MA09. El aislamiento y la preparación de células MA09 se describió previamente en Klimanskaya, et al. (2006) "Human Embryonic Stem Cell lines Derived from Single Bastomeres". Nature 444: 481-485.
Las células hES se pueden cultivar inicialmente conjuntamente con células nodriza embrionarias murinas (MEF). Las células MEF pueden ser inactivadas de forma mitótica por exposición a mitomicina C antes de la siembra de las células hES en cocultivo, y así las MEF no se propagan en cultivo. Además, se pueden examinar con microscopio los cultivos de células MEF y se pueden coger y desechar las colonias que contienen morfología no de célula hES, por ejemplo, usando una herramienta de corte de células madre, por ablación con láser, u otros medios. Normalmente, después del momento de la recogida de las células hES para la formación de cuerpos embrioides no se usan células MEF adicionales en el proceso. El tiempo entre la retirada de MEF y la recogida de células RPE descrita en el presente documento pueden ser un mínimo de al menos uno, dos, tres, cuatro, o cinco pases y al menos aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 días en cultivo celular sin MEF. El tiempo entre la retirada de MEF y la recogida de las células RPE también puede ser un mínimo de al menos aproximadamente 3 pases y al menos aproximadamente 80-90 días en cultivo celular sin MEF. Debido a los métodos de producción descritos en el presente documento, los cultivos de células RPE y las preparaciones descritas en el presente documento pueden estar sustancialmente libres de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y células madre embrionarias humanas (hES).
Células madre pluripotentes inducidas (células iPS)
Células madre pluripotentes adicionales a modo de ejemplo incluyen células madre pluripotentes inducidas (células iPS) generadas por reprogramación de una célula somática expresando o induciendo la expresión de una combinación de factores ("factores de reprogramación"). Las células iPS se pueden generar usando células somáticas fetal, postnatales, de recién nacido, juveniles o adultas. Las células iPS se pueden obtener de un banco de células. Alternativamente, las células iPS pueden ser recién generadas por métodos conocidos en la técnica antes de comenzar la diferenciación en células RPE u otro tipo de célula. La preparación de células iPS puede ser una etapa inicial en la producción de células diferenciadas. Las células iPS se pueden generar específicamente usando material de un paciente particular o donante compatible con el objetivo de generar células RPE compatibles con el tejido. Las células iPS se pueden producir a partir de células que no son sustancialmente inmunogénicas en un receptor previsto, por ejemplo, producidas a partir de células autólogas o de células histocompatibles con un receptor previsto.
La célula madre pluripotente inducida se puede producir expresando o induciendo la expresión de uno o más factores de reprogramación en una célula somática. La célula somática es un fibroblasto, tal como un fibroblasto dérmico, fibroblasto sinovial o fibroblasto de pulmón, o una célula somática no fibroblástica. La célula somática se reprograma expresando al menos 1,2, 3, 4, 5. Los factores de reprogramación se pueden seleccionar de Oct 3/4, Sox2, NANOG, Lin28, c-Myc y Klf4. La expresión de los factores de reprogramación se puede inducir poniendo en contacto las células somáticas con al menos un agente, tal como agentes de molécula orgánica pequeña, que inducen la expresión de factores de reprogramación.
La célula somática también puede ser reprogramada usando un enfoque combinatorio, en donde se expresa el factor de reprogramación (por ejemplo, usando un vector viral, plásmido y similares) y se induce la expresión del factor de reprogramación (por ejemplo, usando una molécula orgánica pequeña.) Por ejemplo, los factores de reprogramación se pueden expresar en la célula somática por infección usando un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral. Por tanto, los factores de reprogramación se pueden expresar en la célula somática usando un vector no integrativo, tal como un plásmido episómico. Cuando los factores de reprogramación se expresan usando vectores no integrativos, los factores se pueden expresar en las células usando electroporación, transfección o transformación de las células somáticas con los vectores. Por ejemplo, en células de ratón, la expresión de cuatro factores (Oct3/4, Sox2, c-myc y Klf4) usando vectores virales integrativos es suficiente para reprogramar una célula somática. En células humanas, la expresión de cuatro factores (Oct3/4, Sox2, NANOG y Lin28) usando vectores virales integrativos es suficiente para reprogramar una célula somática.
Una vez se expresan los factores de reprogramación en las células, las células se pueden cultivar. Con el tiempo, en la placa de cultivo aparecen células con características de ES. Las células se pueden elegir y subcultivar basándose en, por ejemplo, la morfología de ES, o basándose en la expresión de un marcador de selección o detectable. Las células se pueden cultivar para producir un cultivo de células que se parecen a células ES - estas son supuestas células iPS.
Para confirmar la pluripotencia de las células iPS, las células se pueden probar en uno o más ensayos de pluripotencia. Por ejemplo, las células se pueden probar para la expresión de marcadores de células ES; las células se pueden evaluar para su capacidad para producir teratomas cuando se trasplantan en ratones SCID; las células se pueden evaluar para su capacidad para diferenciarse para producir tipos de células de las tres capas germinales. Una vez se obtiene una célula iPS pluripotente, se puede usar para producir células RPE.
Manipulación de genes MHC en células madre embrionarias humanas para obtener células diferenciadas de complejidad reducida
Se pueden obtener células madre embrionarias humanas (hES) de una biblioteca de células madre embrionarias humanas. La biblioteca de células madre embrionarias humanas puede comprender células madre, cada uno de las cuales es hemicigótica, homocigótica o nulicigótica para al menos un alelo de MHC presente en una población humana, en donde cada miembro de dicha biblioteca de células madre es hemicigótico, homocigótico o nulicigótico para un conjunto diferente de alelos de MHC con respecto a los restantes miembros de la biblioteca. La biblioteca de células madre embrionarias humanas puede comprender células madre que son hemicigóticas, homocigóticas o nulicigóticas para todos los alelos de MHC presentes en una población humana. En el contexto de la presente invención, las células madre que son homocigóticas para uno o más genes del antígeno de histocompatibilidad incluyen células que son nulicigóticas para uno o más (y en algunas realizaciones, todos) de dichos genes. Nulicigótico para un locus genético significa que el gen es nulo en ese locus (es decir, ambos alelos de ese gen están delecionados o son inactivos).
Una célula hES puede comprender modificaciones en uno de los alelos de cromosomas hermanos en el complejo MHC de la célula. Se puede usar una variedad de métodos para generar modificaciones génicas, tales como manipulaciones genéticas dirigidas, para modificar los genes en el complejo MHC. Además, los alelos modificados del complejo MHC en las células pueden ser posteriormente manipulados para ser homocigóticos, de manera que estén presentes alelos idénticos en cromosomas hermanos. Se pueden utilizar métodos tales como pérdida de heterocigosidad (LOH) para manipular las células para que tengan alelos homocigóticos en el complejo MHC. Por ejemplo, se pueden inactivar uno o más genes en un conjunto de genes de MHC de un alelo parental para generar células hemicigóticas. El otro conjunto de genes de MHC se puede retirar por manipulaciones genéticas dirigidas de LOH para producir una estirpe nula. Esta estirpe nula se puede usar además como la estirpe celular embrionaria en la que añadir gota a gota matrices de los genes de HLA, o genes individuales, para producir un banco hemicigótico o homocigótico con un acervo genético por lo demás uniforme. Las células madre que son nulicigóticas para todos los genes de MHC se pueden producir por métodos convencionales conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, manipulaciones genéticas dirigidas y/o pérdida de heterocigosidad (LOH). Véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos 2004/0091936, 2003/0217374 y 2003/0232430 y la solicitud de patente provisional de EE. UU. número 60/729.173.
Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a métodos de obtención de células diferenciadas (tales como células RPE), que incluyen una biblioteca de células diferenciadas que tienen complejidad de MHC reducida. Las células diferenciadas con complejidad de MHC reducida se pueden usar para aumentar el suministro de células disponibles para aplicaciones terapéuticas ya que podría eliminar las dificultades asociadas a la compatibilidad de pacientes. Dichas células se pueden obtener de células madre que se manipulan para ser hemicigóticas o homocigóticas para los genes del complejo MHC.
También se describe en el presente documento una biblioteca de células diferenciadas (tales como células RPE y/o células de linaje RPE), en donde se seleccionan varias estirpes de células ES y se diferencian en las células diferenciadas. Estas células diferenciadas se pueden usar para un paciente en necesidad de una terapia basada en células. También se describe una biblioteca de células diferenciadas, cada una de las cuales de hemicigótica, homocigótica o nulicigótica para al menos un alelo de MHC presente en una población humana, en donde cada miembro de dicha biblioteca de células diferenciadas es hemicigótico, homocigótico o nulicigótico para un conjunto diferente de alelos de MHC con respecto a los restantes miembros de la biblioteca. También se describe una biblioteca de células diferenciadas humanas que son hemicigóticas, homocigóticas o nulicigóticas para todos los alelos de MHC presentes en una población humana.
Medio de cultivo
En los métodos descritos en el presente documento se puede usar cualquier medio que sea capaz de soportar los cultivos de alta densidad, tales como medio para cultivo celular viral, bacteriano o eucariota. Por ejemplo, el medio puede ser medio rico en nutrientes y sin proteína o medio rico en nutrientes y bajo en proteínas. Además, el medio también puede incluir componentes nutrientes tales como albúmina, complemento B-27, etanolamina, fetuína, glutamina, insulina, peptona, material purificado de lipoproteínas, selenito de sodio, transferrina, vitamina A, vitamina C o vitamina E. Por ejemplo, el medio rico en nutrientes y bajo en proteínas puede ser cualquier medio que soporte el crecimiento de células en cultivo y tenga un bajo contenido de proteínas. Por ejemplo, el medio rico en nutrientes y bajo en proteínas incluye, pero no se limita, a MDBK-GM, OptiPro SFM, VP-SFM, DMEM, medio RPMI 1640, Id Me M, MEM, mezcla de nutrientes F-12, mezcla de nutrientes F-10 Eg M-2, medio DMEM/F-12, medio 1999, o MDBK-MM. Véase también la Tabla 2. Además, el medio rico en nutrientes y bajo en proteínas puede ser un medio que no soporte el crecimiento o el mantenimiento de células madre embrionarias.
Cuando se usa medio bajo en proteínas, el medio puede contener al menos aproximadamente 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %,7 %,6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2,5 %, 2 %, 1,5 %, 1 %, 0,75 %, 0. 5 %, 0,25 %, 0,20 %, 0,10 %, 0,05 %, 0,02 %, 0,016 %, 0,015 % o 0,010 % de proteína derivada de animal (por ejemplo, 10 % de FBS). Obsérvese que la referencia al porcentaje de proteína presente en el medio bajo en proteínas se refiere al medio solo y no tiene en cuenta la proteína presente en, por ejemplo, el complemento B-27. Así, se entiende que cuando las células se cultivan en medio bajo en proteínas y el complemento B-27, el porcentaje de proteína presente en el medio puede ser más alto.
El medio bajo en proteínas o sin proteína se complementa con el complemento B-27 sin suero. Los componentes nutrientes del suplemento B27 pueden comprender biotina, L-carnitina, corticosterona, etanolamina, D+-galactosa, glutatión reducido, ácido linoleico, acido linolénico, progesterona, putrescina, acetato de retinilo, selenio, triyodo-1-tironina (T3), DL-alfa-tocoferol (vitamina E), acetato de DL-alfa-tocoferol, albúmina de suero bovino, catalasa, insulina, superóxido dismutasa y transferrina. Cuando las células se cultivan en medio sin proteína complementado con B-27, sin proteína se refiere al medio antes de la adición de B-27.
Se pueden usar factores de crecimiento, agentes y otros complementos descritos en el presente documento solos o en combinación con otros factores, agentes o complementos para la inclusión en medios. Los factores, agentes y complementos se pueden añadir a los medios inmediatamente, o en cualquier momento durante o después del cultivo celular.
El medio también puede contener complementos, tales como heparina, hidrocortisona, ácido ascórbico, suero (por ejemplo, suero bovino fetal), o una matriz de crecimiento (por ejemplo, matriz extracelular de epitelio de córnea bovina, MATRIGEL® (matriz de membrana basal), o gelatina), fibronectina, fragmentos proteolíticos de fibronectina, laminina, trombospondina, agrecano y sindecano.
Los medios de cultivo pueden estar complementados con uno o más factores o agentes,
Los factores de crecimiento que se pueden usar incluyen, por ejemplo, EGF, FGF, VEGF y factor de crecimiento recombinante similar a la insulina. Los factores de crecimiento que se pueden usar en la presente invención también incluyen 6Ckine (recombinante), activina A, a-interferón, alfa-interferón, anfiregulina, angiogenina, factor de crecimiento celular endotelial p, elulina beta, p-interferón, factor neurotrófico derivado de cerebro, cardiotrofina-1, factor neurotrófico ciliar, quimioatrayente-1 de neutrófilos inducido por citocinas, complemento del crecimiento celular endotelial, eotaxina, factor de crecimiento epidérmico, péptido-78 activante de neutrófilos epiteliales, eritropoyetina, receptor-a de estrógenos, receptor-p de estrógenos, factor de crecimiento de fibroblastos (ácido/básico, estabilizado con heparina, recombinante), ligando de FLT-3/FLK-2 (ligando de FLT-3), gamma interferón, factor neurotrófico derivado de estirpe celular glial, Gly-His-Lys, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, GRO-alfa/MGSA, GRO-B, GRO-gamma, HCC-1, factor de crecimiento similar al factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, heregulina-alfa (dominio de EGF), proteína-1 de unión al factor de crecimiento de insulina, complejo de proteína-1 de unión al factor de crecimiento de tipo insulina/IGF-1, factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento similar a la insulina II, 2.5S factor de crecimiento nervioso (NGF), 7S-NGF, proteína inflamatoria de macrófagos1 p, proteína inflamatoria de macrófagos 2, proteína inflamatoria de macrófagos 3a, proteína inflamatoria de macrófagos 3p, proteína quimiotáctica de monocitos 1, proteína quimiotáctica de monocitos 2, proteína quimiotáctica de monocitos 3, neurotrofina-3, neurotrofina-4, NGF-p (recombinante humano o de rata), oncostatina M (recombinante humano o de ratón), extracto de pituitaria, factor de crecimiento de placenta, factor de crecimiento celular endotelial derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, pleiotrofina, rantes, factor de células madre, factor 1B derivado de células del estroma/factor estimulante del crecimiento de pre-linfocitos B, trombopoyetina, factor de crecimiento transformante alfa, factor de crecimiento transformante p1, factor de crecimiento transformante p2, factor de crecimiento transformante p3, factor de crecimiento transformante p5, factor de necrosis tumoral (a y p) y factor de crecimiento endotelial vascular.
Los agentes que se pueden usar según la presente invención incluyen citocinas, tales como interferón-a, interferón-a A/D, interferón-p, interferón-y, proteína-10 inducible por interferón-Y, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4, interleucina-5, interleucina-6, interleucina-7, interleucina-8, interleucina-9, interleucina-10, interleucina-11, interleucina-12, interleucina-13, interleucina-15, interleucina-17, factor de crecimiento de queratinocitos, leptina, factor inhibidor de leucemia, factor estimulante de colonias de macrófagos y proteína inflamatoria de macrófagos 1 a.
Los medios de cultivo pueden ser complementados con hormonas y antagonistas de hormonas, que incluyen, pero no se limitan a, 17B-estradiol, hormona adrenocorticotrópica, adrenomedulina, hormona estimulante de melanocitos alfa, gonadotropina coriónica, globulina de unión a corticosteroides, corticosterona, dexametasona, estriol, hormona foliculoestimulante, gastrina 1, glucagón, gonadotropina, hidrocortisona, insulina, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, L-3,3',5'-triyodotironina, L-3,3',5'-triyodotironina, leptina, hormona leutinizante, L-tiroxina, melatonina, MZ-4, oxitocina, hormona paratiroidea, PEC-60, hormona de crecimiento de la pituitaria, progesterona, prolactina, secretina, globulina de unión a hormonas sexuales, hormona estimulante tiroidea, factor liberador de tirotropina, globulina de unión a tiroxina y vasopresina. Los medios de cultivo pueden ser complementados con anticuerpos contra diversos factores que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo anti-receptor de lipoproteína de baja densidad, receptor anti-progesterona, anticuerpo interno, anticuerpo anti-cadena 2 de receptor de interferón alfa, anticuerpo anti-receptor 1 de quimiocina c-c, anticuerpo anti-CD 118, anticuerpo anti-CD 119, anticuerpo anti-factor-1 estimulante de colonias, anticuerpo anti­ receptor de CSF-1/c-fins, anticuerpo anti-factor de crecimiento epidérmico (AB-3), anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento epidérmico, anti-receptor de factor de crecimiento epidérmico, anticuerpo específico de fosfo, anticuerpo anti-factor de crecimiento epidérmico (AB-1), anticuerpo anti-receptor de eritropoyetina, anticuerpo anti-receptor de estrógenos, anti-receptor de estrógenos, anticuerpo de extremo C, anticuerpo antireceptor-B de estrógenos, anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento de fibroblastos, anti-factor de crecimiento de fibroblastos, anticuerpo básico, anticuerpo anti-cadena del receptor de interferón gamma, anticuerpo recombinante humano anti-interferón gamma, anticuerpo de extremo C anti-GFR alfa-l, anticuerpo de extremo C anti-GFR alfa-2, anticuerpo anti-factor estimulante de colonias de granulocitos (AB-1), anticuerpo anti­ receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos, anticuerpo anti-receptor de insulina, anticuerpo anti­ receptor del factor de crecimiento similar a la insulina-1, anticuerpo recombinante humano anti-interleucina-6, anticuerpo recombinante humano anti-interleucina-1, anticuerpo recombinante humano anti-interleucina-2, anticuerpo recombinante de ratón anti-leptina, anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento nervioso, antip60, anticuerpo de pollo, anticuerpo anti-proteína simular a la hormona paratiroidea, anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas, anticuerpo anti-receptor-B de factor de crecimiento derivado de plaquetas, anticuerpo anti-factor de crecimiento derivado de plaquetas-alfa, anticuerpo anti-receptor de progesterona, anticuerpo anti-receptor-alfa de ácido retinoico, anticuerpo anti-receptor nuclear de hormona tiroidea, anticuerpo anti-receptor-alfa 1/Bi nuclear de hormona tiroidea, anticuerpo anti-receptor de transferrina/CD71, anticuerpo anti-factor de crecimiento transformante-alfa, anticuerpo anti-factor de crecimiento transformante-B3, anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral-alfa y anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular.
Los medios de crecimiento adecuados a modo de ejemplo para su uso en los métodos descritos en el presente documento se enumeran en la Tabla 2.
Tabla 2. Formulaciones de medios de crecimiento.
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Epitelio pigmentario de la retina (RPE)
El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es la capa de células pigmentadas fuera de la retina neurosensorial entre la coroides subyacente (la capa de vasos sanguíneos detrás de la retina) y las células visuales de la retina de recubrimiento (por ejemplo, fotorreceptores - bastones y conos). El RPE es crítico para la función y la salud de los fotorreceptores y la retina. El RPE mantiene la función fotorreceptora recirculando fotopigmentos, suministrando, metabolizando y almacenando vitamina A, fagocitando segmentos externos de fotorreceptores de bastones, transportando hierro y moléculas pequeñas entre la retina y la coroides, manteniendo la membrana de Bruch y absorbiendo luz parásita para permitir una mejor resolución de las imágenes. Engelmann y Valtink (2004) "RPE Cell Cultivation". Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 242(1): 65-67; véase también Irina Klimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells, St EM CELL ANTHOLOGY 335-346 (Bruce Carlson ed., 2009).
El RPE maduro se caracteriza por su morfología celular en adoquín de células pigmentadas de negro y marcadores de células RPE que incluyen proteína de unión a retinaldehído celular (CRALBP), una proteína de unión a retinaldehído citoplásmico de 36 kD que también se encuentra en las microvellosidades apicales (Eisenfeld, et al. (1985) Experimental Research 41 (3): 299-304); RPE65, una proteína citoplásmica de 65 kD que participa en el metabolismo de retinoides (Ma, et al. (2001) Invest Opthalmol Vis Sci. 42(7): 1429-35; Redmond (2009) Exp Eye Res. 88(5): 846­ 847); bestrofina, un producto de 68 kD localizado en la membrana del gen de distrofia macular viteliforme de Best (VMD2) (Marmorstein, et al. (2000) PNAS 97(23): 12758-12763) y factor derivado de epitelio pigmentario (PEDF), una proteína de 48 kD secretada con propiedades angiostáticas (Karakousis, et al. (2001) Molecular Vision 7: 154-163; Jablonski, et al. (2000) The Journal of Neuroscience 20(19): 7149-7157).
Enfermedades de la retina
La degeneración de RPE puede provocar desprendimiento de retina, displasia retiniana o atrofia retiniana que está asociada con varias afecciones que alteran la visión que dan como resultado el daño de fotorreceptores y ceguera, tales como coroideremia, retinopatía diabética, degeneración macular (incluyendo degeneración macular senil), retinitis pigmentosa y enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus). Documento de patente WO 2009/051671.
Coroideremia. La coroideremia es una enfermedad degenerativa recesiva de la retina ligada al X que conduce a la degeneración de los coriocapilares, el epitelio pigmentario de la retina y el fotorreceptor del ojo provocada por mutaciones en el gen CHM, que codifica la proteína-1 de acompañamiento de Rab (REP-1). Genetics Home Reference (U.S. National Library of Medicine) [17 de octubre de 2010].
Retinopatía diabética. La retinopatía diabética es la enfermedad ocular diabética más común y la principal causa de ceguera en los Estados Unidos. La retinopatía diabética se provoca por cambios en los vasos sanguíneos de la retina. En general, la retinopatía diabética solo se puede controlar o ralentizar con cirugía, pero no se trata, y el paciente normalmente sigue padeciendo problemas de visión. Por lo tanto, existe una necesidad de terapias mejoradas para la retinopatía diabética. "Diabetic Retinopathy" (MayoClinic.org) [11 de febrero de 2010].
Degeneración macular. La degeneración macular senil (AMD) es la causa más común de ceguera legal en los Estados Unidos y Europa. La atrofia del RPE submacular y el desarrollo de neovascularizaciones coroideas (CNV) produce en segundo lugar la pérdida de la agudeza visual central. Los signos tempranos de la AMD son depósitos (drusas) entre el epitelio pigmentario de la retina y la membrana de Bruch. La atrofia geográfica central ("AMD seca") resulta de atrofia en los epitelios pigmentarios de la capa de la retina debajo de la retina, que provoca la pérdida de visión por pérdida de fotorreceptores (bastones y conos) en la parte central del ojo. La AMD neovascular o exudativa ("AMD húmeda") provoca pérdida de visión debido al crecimiento anormal de los vasos sanguíneos (la neovascularización coroidea) en los coriocapilares, a través de la membrana de Bruch, que conduce por último lugar a la fuga de sangre y proteínas debajo de la mácula. La hemorragia, el derrame y la cicatrización de estos vasos sanguíneos provocan con el tiempo un daño irreversible a los fotorreceptores y la rápida pérdida de visión si se deja sin tratar. Los actuales tratamientos para la degeneración macular incluyen una terapia antiangiogénica con ranibizumab (LUCENTIS®) o bevacizumab (AVASTIN®), fotocoagulación (cirugía láser), terapia fotodinámica con verteporfina (VISUDYNE®) y cirugía de desplazamiento de la hemorragia submacular. "Macular Degeneration". (MayoClinic.org) [octubre de 2010]. Sin embargo, el objetivo de estas terapias es detener la pérdida de visión adicional y, desafortunadamente, no se puede revertir el daño existente. Por lo tanto, existe una gran necesidad de tratamiento de degeneración macular.
Retinitis pigmentosa (RP). La retinitis pigmentosa (RP) es un grupo de enfermedades heredadas que dañan los fotorreceptores (por ejemplo, bastones y conos) en la retina que afecta a aproximadamente 1,5 millones de personas en todo el mundo. Por ejemplo, la RP recesiva autosómica es causada por mutaciones en la proteína de unión a retinaldehído en cis o RPE65. La progresión de RP es lenta y varía de paciente a paciente. Todos los pacientes con RP sufren cierta pérdida de visión, con ceguera nocturna como un síntoma temprano típico, seguido por visión en túnel, y algunos pueden perder toda la visión. "Retinitis Pigmentosa." American Optometric Association (octubre de 2010). Aunque el tratamiento con vitamina A y luteína ha mostrado cierta promesa en ralentizar el progreso de RP, no está disponible tratamiento eficaz.
Desprendimiento de retina. El desprendimiento de retina, que incluye desprendimiento de retina regmatógeno, desprendimiento de retina exudativo, seroso o secundario, y desprendimiento de retina traccional, es un trastorno del ojo en el que la retina se despega de su capa subyacente de tejido conjuntivo, que puede conducir a pérdida de visión y ceguera. Véase Ghazi y Green (2002) Eye 16: 41 1-421; Facts About Retinal Detachment [NE1Health Information] (octubre de 2010). Existe la necesidad de un tratamiento para el desprendimiento de retina.
Enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus). La enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus) es un tipo de degeneración macular, que incluye tanto una forma recesiva autosómica como una dominante, que provoca una pérdida progresiva de visión central de ambos ojos. Véase Gass y Hummer (1999) Retina 19(4): 297-301 y Aaberg (1986) Tr. Am. Ophth. Soc. LXXXIV: 453-487. Actualmente, no existen tratamientos disponibles para la enfermedad de Stargardt.
Células RPE en la medicina
Dada la importancia de RPE en mantener la salud visual y retiniana, el RPE y las metodologías para producir células RPE in vitro son de un interés considerable. Véase Lund, et al. (2001) Progress in Retinal and Eye Research 20(4): 415-449. Por ejemplo, un estudio informado en Gouras, et al. (2002) Investigative Ophthalmology & Visual Science 43(10): 3307-311 describe el trasplante de células RPE de ratones normales en ratones transgénicos RPE65-/- (un modelo de ratón de degeneración retiniana). Gouras desvela que el trasplante de células RPE sanas ralentizó la degeneración retiniana en los ratones RPE65-/-, pero después de 3,7 semanas empezó a disminuir su efecto saludable. Treumer, et al. (2007) Br J Opthalmol 91: 349-353 describe el trasplante satisfactorio de la lámina coroidea de RPE autóloga después de la retirada de una neovascularización coroidea (CNV) subfoveal en pacientes con degeneración macular senil (AMD), pero este procedimiento solo produjo un aumento moderado en la agudeza visual media.
Además, se han sugerido las células RPE como una posible terapia para el tratamiento de enfermedad de Parkinson, una enfermedad degenerativa crónica del cerebro. La enfermedad es causada por la degeneración de células neuronales especializadas en la región de los ganglios basales. La muerte de neuronas dopaminérgicas da como resultado la reducida síntesis de dopamina, un importante neurotransmisor, en pacientes con enfermedad de Parkinson. Ming y Le (2007) Chinese Medical Journal 120(5): 416-420 sugiere que el trasplante de células RPE de donantes de ojo en el estriado de pacientes con Parkinson suministra citocinas neurotróficas y antiinflamatorias beneficiosas para tratar la enfermedad de Parkinson.
Sin embargo, las células RPE obtenidas de donantes humanos tienen varios problemas espinosos. El primero es la escasez de donantes de ojos, y la necesidad actual es superior a la que podría cubrirse con tejido ocular donado. Segundo, las células RPE de donantes humanos pueden estar contaminadas con patógenos y pueden tener defectos genéticos. Tercero, las células RPE donadas derivan de cadáveres, que pueden no ser de calidad suficiente para ser útiles en trasplante. Por ejemplo, el RPE obtenido de cadáver puede tener defectos asociados a la edad que incluyen estar próximo a la senescencia. Además, las células RPE derivadas de tejido fetal han mostrado un potencial proliferativo muy bajo. Además, las células RPE obtenidas de cadáver varían ampliamente de lote a lote y se deben caracterizar para su seguridad antes del trasplante. Véase, por ejemplo, Irina Klimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells, en St Em CELL ANt Ho l Og Y 335-346 (Bruce Carlson ed., 2009). La obtención de células RPE de donantes humanos también puede incurrir en problemas con el consentimiento del donante y obstáculos reglamentarios, que complican la recogida y el uso de las células RPE para terapia. En la AMD, los pacientes y los pacientes ancianos también padecen degeneración de la membrana de Bruch, que complica el trasplante de células RPE. Véase Gullapalli, et al. (2005) Exp Eye Res. 80(2): 235-48,
También se ha intentado el uso terapéutico de células RPE autólogas (obtenidas del ojo "bueno" de un paciente) en ensayos limitados, pero ha demostrado ser poco satisfactorio. Las células autólogas están fundamentalmente limitadas debido a que las células autólogas tienen las mismas predisposiciones genéticas que pueden conducir al desarrollo de AMD. Véase, por ejemplo, Binder, et al. (2007) Progress in Retinal and Eye Research 26(5): 516-554. Además, las células RPE autólogas tienen capacidad proliferativa limitada (particularmente debido a que la AMD se desarrolla más frecuentemente en pacientes ancianos), que limita su utilidad en aplicaciones terapéuticas (por ejemplo, las células RPE pueden no trasplantarse bien y es menos probable que duren tiempo suficiente para una recuperación más completa de la visión).
Células madre embrionarias derivadas de células RPE (células hESC-RPE)
Se considera que las células madre embrionarias humanas (hES) son una fuente prometedora de células RPE de sustitución para uso clínico. Véase Idelson, et al (2009) Cell Stem Cell 5: 396-408. Sin embargo, numerosos problemas siguen atormentando su uso como terapéuticos, que incluyen el riesgo de formación de teratomas y la necesidad de poderosos fármacos inmunosupresores para vencer los problemas con el rechazo inmunitario. Por ejemplo, Wang, et al. (2010) Transplantation describe un estudio donde se diferenciaron células madre embrionarias de ratón en células RPE y luego se trasplantaron en un modelo de ratón de retinitis pigmentosa (ratones Rpe65rd12/Rperd23C57BL16). Aunque los ratones Rpe65rd12/Rperd12 que recibieron los trasplantes de células RPE mostraron una recuperación visual importante durante un periodo de 7 meses, esto se complicó por desprendimientos de retina y tumores.
Además, la transición de investigación básica a aplicación clínica está impedida por la necesidad de adherirse a las pautas expuestas por la Agencia Estadounidense del Medicamento, denominadas conjuntamente las actuales prácticas correctas de fabricación (GMP) y actuales buenas prácticas en materia de tejidos (GTP). En el contexto de la fabricación clínica de un producto para terapia celular, tal como RPE derivado de células hES, GTP regula el consentimiento del donante, la trazabilidad y el cribado de enfermedades infecciosas, mientras que GMP es relevante por la facilidad, procesos, pruebas y prácticas para producir un producto coherentemente seguro y eficaz para uso humano. Lu, et al. Stem Cells 27: 2126-2135 (2009). Así, existe una necesidad de un modo sistemático y dirigido para la producción de grandes números de células RPE adecuado para su uso en terapias de trasplante.
La patente y las solicitudes propiedad del cesionario de las presentes solicitudes han desvelado métodos de producción de células RPE mediante la diferenciación de células madre embrionarias en las patentes de EE. UU.
7.795.025, 7.794.704 y 7.736.896, serie de EE. UU. N212/682.712, así como la solicitud PCT N2 PCT/US10/57056, presentada el 17 de noviembre de 2010 (ahora publicada como el documento de patente WO 2011/063005) y titulada "Methods of Producing Human RPE Cells and Pharmaceutical Preparations of Human RPE Cells" (expediente de agente N° 75820.001020), y la solicitud de patente provisional de EE. UU. N.° 61/262.002, presentada el 17 de noviembre de 2009 (expediente de agente N° 75820.001000).
Métodos terapéuticos
Las células RPE y preparaciones farmacéuticas que comprenden células RPE producidas por los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para tratamientos basados en células. En el presente documento se describen métodos de tratamiento de una afección que implica degeneración retiniana que comprende administrar una cantidad eficaz de una preparación farmacéutica que comprende células RPE, en donde las células RPE derivan de células madre pluripotentes in vitro. Las afecciones que implican degeneración retiniana incluyen, por ejemplo, coroideremia, retinopatía diabética, atrofia retiniana, desprendimiento de retina, displasia retiniana y retinitis pigmentosa. Las células RPE descritas en el presente documento también se pueden usar en métodos de tratamiento de degeneración macular que incluyen, pero no se limitan a, degeneración macular senil (seca o húmeda), distrofia macular de Carolina del Norte, distrofia del fondo de Sorsby, enfermedad de Stargardt, distrofia en patrón, enfermedad de Best, malattia leventinese, coroiditis en panal de Doyne, drusas dominantes y drusas radiales. Las células RPE descritas en el presente documento también se pueden usar en métodos de tratamiento de enfermedad de Parkinson (PD).
Una característica común del trasplante de células es la baja supervivencia del injerto, por ejemplo, en muchos estudios de trasplante de células tiende a haber una pérdida de células inmediatamente después del trasplante (por ejemplo, en la primera semana). Esta pérdida de células no parece ser debida al rechazo de las células trasplantadas, sino a una incapacidad de un cierto porcentaje de células a ser retenido en el sitio del trasplante. Lo más probable es que esta falta de retención de células sea debida a varios factores, tales como el fallo de las células a unirse a una estructura subyacente, una falta de nutrientes suficientes, o a estrés físico en el sitio del trasplante. Después de esta disminución inicial de número de células, la supervivencia celular en diversos momentos después del trasplante puede variar considerablemente de estudio a estudio. Así, aunque algunos estudios muestran una disminución constante en los números, otros muestran resultados donde las células injertadas pueden llegar a un número estable. Sin embargo, un factor importante en la consideración del éxito de un trasplante es el porcentaje de receptores con injertos supervivientes después del trasplante celular.
A diferencia de las preparaciones previas, las células RPE en las preparaciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden sobrevivir un largo plazo después del trasplante. Por ejemplo, las células RPE pueden sobrevivir al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días. Además, las células RPE pueden sobrevivir al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 semanas; al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 meses; o al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años. Además, las células RPE pueden sobrevivir durante toda la vida del receptor del trasplante. Además, al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100 % de los receptores de células RPE descritas en el presente documento pueden mostrar supervivencia de las células RPE trasplantadas. Además, las células RPE descritas en el presente documento se pueden incorporar satisfactoriamente en la capa de RPE en el receptor del trasplante, formando una línea semicontinua de células y reteniendo la expresión de marcadores moleculares clave de RPE (por ejemplo, RPE65 y bestrofina). Las células RPE descritas en el presente documento también se pueden unir a la membrana de Bruch, formando una capa de RPE estable en el receptor del trasplante. Por tanto, las células RPE en el presente documento se describen sustancialmente libres de células ES y los receptores del trasplante no muestran crecimiento anormal o formación tumoral en el sitio del trasplante.
Los métodos de tratamiento de un paciente que padece una afección asociada a degeneración retiniana pueden comprender administrar una composición por vía local (por ejemplo, por inyección o inserción intraocular de una matriz que comprende la preparación farmacéutica). La administración intraocular de la preparación farmacéutica incluye, por ejemplo, administración en el cuerpo vítreo, por vía transcorneal, porciones subconjuntiva, yuxtaescleral, escleral posterior y subtenoniana del ojo. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 7.794.704; 7.795.025; 6.943.145; y 6.943.153.
También se describe en el presente documento un método de administración de células RPE humanas que se han obtenido de células madre embrionarias de complejidad reducida a un paciente. Este método puede comprender: (a) identificar un paciente que necesita tratamiento que implica administrar las células RPE humanas a él o a ella; (b) identificar proteínas MHC expresadas sobre la superficie de las células del paciente; (c) proporcionar una biblioteca de células RPE humanas de complejidad de MHC reducida producidas por el método de producción de células RPE de la presente invención; (d) seleccionar las células RPE de la biblioteca que hagan compatible las proteínas MHC de este paciente con sus células; (e) administrar cualquiera de las células de la etapa (d) a dicho paciente. Este método se puede realizar en un centro regional, tal como, por ejemplo, un hospital, una clínica, la consulta de un médico y otros centros sanitarios. Además, las células RPE seleccionadas como compatibles para el paciente, si se almacenan en pequeños números de células, se pueden expandir antes del tratamiento del paciente.
Las células RPE se pueden cultivar en condiciones para aumentar la expresión de las subunidades 1-6 o 9 de alfaintegrina en comparación con células RPE no cultivadas u otras preparaciones de células RPE antes del trasplante. Las células RPE descritas en el presente documento se pueden cultivar para elevar el nivel de expresión de las subunidades 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 9 de alfa-integrina. Las células RPE descritas en el presente documento se pueden cultivar en condiciones que promueven la expresión de las subunidades 1 -6 de alfa-integrina. Por ejemplo, las células RPE se pueden cultivar con agentes de activación de las integrinas que incluyen, pero no se limitan a, manganeso y el anticuerpo monoclonal (mAb) activante TS2/16. Véase Afshari, et al., Brain (2010) 133(2): 448-464.
La pauta de tratamiento particular, la vía de administración y la terapia adyuvante se pueden adecuar basándose en la afección particular, la intensidad de la afección y la salud general del paciente. La administración de las preparaciones farmacéuticas que comprenden las células RPE puede ser eficaz en reducir la intensidad de los síntomas y/o prevenir la degeneración adicional en la afección del paciente. Por ejemplo, la administración de una preparación farmacéutica que comprende células RPE puede mejorar la agudeza visual del paciente. Además, la administración de las células RPE puede ser eficaz para restaurar completamente la pérdida de visión u otros síntomas. Además, la administración de células RPE puede tratar síntomas de lesiones a la capa RPE endógena.
Preparaciones farmacéuticas de células RPE
Las células RPE se pueden formular con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, las células RPE se pueden administrar solas o como un componente de una formulación farmacéutica. Los compuestos objeto se pueden formular para administración en cualquier forma conveniente para su uso en medicina. Las preparaciones farmacéuticas adecuadas para administración pueden comprender las células RPE, en combinación con una o más disoluciones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina equilibrada (BSS)), dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles que se pueden reconstituir en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos o agentes de suspensión o espesantes.
Cuando se administran, las preparaciones farmacéuticas pueden estar en una forma fisiológicamente aceptable sin pirógenos. La preparación que comprende células RPE usada en los métodos descritos en el presente documento se puede trasplantar en una suspensión, gel, coloide, suspensión o mezcla. Además, la preparación se puede encapsular o inyectar deseablemente en una forma viscosa en el humor vítreo para la administración al sitio del año retiniano o coroideo. Por tanto, en el momento de la inyección, se pueden suspender células crioconservadas RPE con solución salina equilibrada comercialmente disponible para lograr la osmolalidad y concentración deseadas para administración por inyección subrretiniana.
Las células RPE se pueden administrar en una formulación oftálmica farmacéuticamente aceptable por inyección intraocular. Cuando se administra la formulación por inyección intravítrea, por ejemplo, la disolución se puede concentrar de manera que se minimicen los volúmenes que se pueden administrar. Las concentraciones para inyectables pueden estar en cualquier cantidad que sea eficaz y no tóxica, que dependen de los factores descritos en el presente documento. Las preparaciones farmacéuticas de células RPE para el tratamiento de un paciente se pueden formular a dosis de al menos aproximadamente 104 células/mL. Las preparaciones de células RPE para el tratamiento de un paciente se formulan en dosis de al menos aproximadamente 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o 1010 células RPE/mL. Por ejemplo, las células RPE se pueden formular en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las preparaciones farmacéuticas de células RPE descritas en el presente documento pueden comprender al menos aproximadamente 1.000; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; o 9.000 células RPE. Las preparaciones farmacéuticas de células RPE pueden comprender al menos aproximadamente 1x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104, 9x104, 1 x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1 x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x1075x107, 6x1077x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1 x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1 x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010 o 9x1010 células RPE. Las preparaciones farmacéuticas de células RPE pueden comprender al menos aproximadamente 1 x102-1x103, 1 x102-1x104, 1 x104-1 x105 o 1 x103-1x106 células RPE. Las preparaciones farmacéuticas de células RPE pueden comprender al menos aproximadamente 10.000, 20.000, 25.000, 50.000, 75.000, 100.000, 125.000, 150.000, 175.000, 180.000, 185.000, 190.000 o 200.000 células RPE. Por ejemplo, la preparación farmacéutica de células RPE puede comprender al menos aproximadamente 20.000-200.000 células RPE en un volumen de al menos aproximadamente 50-200 pL. Además, la preparación farmacéutica de células RPE puede comprender al menos aproximadamente 180.000 células RPE en un volumen de al menos aproximadamente 150 pL.
Se pueden formular células RPE para administración en un vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable, de forma que la preparación se mantenga en contacto con la superficie ocular durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que las células penetren en las regiones afectadas del ojo como, por ejemplo, la cámara anterior, la cámara posterior, el cuerpo vítreo, el humor acuoso, el humor vítreo, la córnea, el iris/ciliar, el cristalino, la coroides, la retina, la esclerótica, el espacio supracoroideo, la conjuntiva, el espacio subconjuntivo, el espacio epiescleral, el espacio intracorneal, el espacio epicorneal, la parte plana, regiones avasculares quirúrgicamente inducidas, o la mácula.
El volumen de preparación administrado según los métodos descritos en el presente documento puede depender de factores tales como el modo de administración, el número de células RPE, la edad y el peso del paciente, y el tipo y la intensidad de la enfermedad que está tratándose. Si se administra por inyección, el volumen de las preparaciones farmacéuticas de células RPE puede ser de al menos aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 o 5 mL. El volumen puede ser al menos aproximadamente 1 -2 mL. Por ejemplo, si se administra por inyección, el volumen de las preparaciones farmacéuticas de células RPE puede ser al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 100, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169,170, 171, 172, 173, 174, 175, 176,177, 178, 179, 180, 181,182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 o 200 pL (microlitros). Por ejemplo, el volumen de una preparación puede ser desde al menos aproximadamente 10-50, 20-50, 25-50 o 1 -200 pL. El volumen de una preparación puede ser al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 pL.
Por ejemplo, la preparación puede comprender al menos aproximadamente 1x103, 2x1033x103, 4x103, 5x103.6x103, 7x103, 8x103, 9x103, 1 x104, 2x104, 3x104, 4x104, 5x104, 6x104, 7x104, 8x104 o 9x104 células RPE por pL. La preparación puede comprender 2000 células RPE por pL, por ejemplo, 100.000 células RPE por 50 pL, o 180.000 células RPE por 90 pL.
El método de tratamiento de la degeneración retiniana puede comprender además la administración de un inmunosupresor. Los inmunosupresores que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo policlonal anti­ globulina de linfocito (ALG), anticuerpo policlonal anti-globulina de timocito (ATG), azatioprina, BASILIXIMAB® (anticuerpo anti-receptor de IL-2Ra), ciclosporina (ciclosporina A), DACLIZUMAB® (anticuerpo anti-receptor de IL-2Ra), everolimus, ácido micofenólico, RITUXIMAB® (anticuerpo anti-CD20), sirolimus y tacrolimus. Los inmunosupresores se pueden administrar a al menos aproximadamente 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg. Cuando se usan inmunosupresores, se pueden administrar por vía sistémica o por vía local, y se pueden administrar antes de, concomitantemente con, o tras la administración de las células RPE. La terapia con inmunosupresores continúa durante semanas, meses, años, o indefinidamente, tras la administración de células RPE. Por ejemplo, el paciente se puede administrar con 5 mg/kg de ciclosporina durante 6 semanas después de la administración de las células RPE.
El método de tratamiento de la degeneración retiniana puede comprender la administración de una dosis única de células RPE. Por tanto, los métodos de tratamiento descritos en el presente documento pueden comprender un ciclo de terapia donde las células RPE se administran múltiples veces durante un cierto periodo. Los ciclos de tratamiento a modo de ejemplo pueden comprender tratamientos semanales, cada dos semanas, mensuales, trimestrales, dos veces al año o anuales. Alternativamente, el tratamiento puede desarrollarse en fases por las que inicialmente se requieren dosis múltiples (por ejemplo, dosis diarias durante la primera semana), y posteriormente se necesitan dosis cada vez menos frecuentes.
Si se administran por inyección intraocular, las células RPE se pueden administrar una o más veces periódicamente durante toda la vida de un paciente. Por ejemplo, las células RPE se pueden administrar una vez al año, una vez cada 6-12 meses, una vez cada 3-6 meses, una vez cada 1 -3 meses, o una vez cada 1 -4 semanas. Alternativamente, puede ser conveniente una administración más frecuente para ciertas afecciones o trastornos. Si se administra por un implante o dispositivo, las células RPE se pueden administrar una vez, o una o más veces periódicamente durante la vida útil del paciente, según sea necesario para el paciente particular y el trastorno o afección que está tratándose. Similarmente, se contempla una pauta terapéutica que cambia con el tiempo. Por ejemplo, se puede necesitar un tratamiento más frecuente en la aparición (por ejemplo, tratamiento diario o semanal). Con el tiempo, a medida que mejora la afección del paciente, se puede necesitar tratamiento menos frecuente o incluso ningún tratamiento adicional.
Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender además la etapa de monitorizar la eficacia del tratamiento o la prevención midiendo respuestas del electrorretinograma, umbral de agudeza optomotora o umbral de luminancia en el sujeto. El método también puede comprenden monitorizar la eficacia del tratamiento o la prevención monitorizando la inmunogenicidad de las células o la migración de las células en el ojo.
Las células RPE se pueden usar en la fabricación de un medicamento para tratar degeneración retiniana. La divulgación también describe el uso de la preparación que comprende células RPE en el tratamiento de ceguera. Por ejemplo, se pueden usar las preparaciones que comprenden células RPE humanas para tratar degeneración retiniana asociada a varias enfermedades que alteran la visión que dan como resultado el daño de fotorreceptores y ceguera, tales como retinopatía diabética, degeneración macular (incluyendo degeneración macular senil, por ejemplo, degeneración macular senil húmeda y degeneración macular senil seca), retinitis pigmentosa y enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus). La preparación puede comprender al menos aproximadamente 5.000-500.000 células RPE (por ejemplo, 100.000 células RPE) que se pueden administrar a la retina para tratar degeneración retiniana asociada a varias enfermedades que alteran la visión que dan como resultado daño de fotorreceptores y ceguera, tales como retinopatía diabética, degeneración macular (incluyendo degeneración macular senil), retinitis pigmentosa y enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus).
Las células RPE pueden ser células RPE humanas. Obsérvese, sin embargo, que las células humanas se pueden usar en pacientes humanos, así como en modelos animales o pacientes animales. Por ejemplo, las células humanas se pueden probar en modelos de ratón, rata, gato, perro o primate no humano de degeneración retiniana. Además, las células humanas se pueden usar terapéuticamente para tratar animales en necesidad de las mismas, tal como en veterinaria.
Modos de administración
La preparación farmacéutica se puede formular en un vehículo farmacéuticamente aceptable según la vía de administración. Por ejemplo, la preparación se puede formular para ser administrada al espacio subrretiniano del ojo. La preparación que comprende células RPE se puede administrar a un ojo o a ambos ojos en el mismo paciente. La administración de ambos ojos puede ser secuencial o simultánea. Por ejemplo, la preparación que comprende células RPE se puede formular como una suspensión, disolución, suspensión, gel o coloide.
Las células RPE se pueden administrar por vía local por inyección (por ejemplo, inyección intravítrea), o como parte de un dispositivo o implante (por ejemplo, un implante). Por ejemplo, la preparación se puede administrar por inyección en el espacio subrretiniano del ojo. Por tanto, la preparación se puede administrar por vía transcorneal. Por ejemplo, las células se pueden trasplantar en el espacio subrretiniano usando cirugía de vitrectomía. Además, en el momento de la inyección, las células RPE se pueden resuspender con solución salina equilibrada comercialmente disponible para lograr la osmolalidad y concentración deseadas para administración por inyección subrretiniana.
Dependiendo del método de administración, las células RPE se pueden añadir a soluciones acuosas tamponadas y equilibradas con electrolito, soluciones acuosas tamponadas y equilibradas con electrolito con un polímero lubricante, pomada basada en aceite mineral o vaselina, otros aceites, liposomas, ciclodextrinas, polímeros o geles de liberación sostenida.
Matrices para su uso con células RPE
Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender una etapa de administrar RPE como un implante o dispositivo. El dispositivo puede ser un implante bioerosionable para tratar una afección médica del ojo que comprende un agente activo dispersado dentro de una matriz de polímero biodegradable, en donde al menos aproximadamente el 75 % de las partículas del agente activo tienen un diámetro inferior a aproximadamente 10 gm. El implante bioerosionable se dimensiona para la implantación en una región ocular. La región ocular puede ser una cualquiera o más de la cámara anterior, la cámara posterior, la cavidad vítrea, la coroides, el espacio supracoroideo, la conjuntiva, el espacio subconjuntivo, el espacio epiescleral, el espacio intracorneal, el espacio epicorneal, la esclerótica, la parte plana, regiones avasculares quirúrgicamente inducidas, la mácula y la retina. El polímero biodegradable puede ser, por ejemplo, un copolímero de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), películas biodegradables de ácido poli(DL-láctico-co-glicólico), o sustratos de polímero de PLLA/PLGA. La relación entre monómeros de ácido láctico y glicólico en el polímero es aproximadamente 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 por ciento en peso, más preferentemente aproximadamente 50/50. El copolímero de PLGA puede ser aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 a aproximadamente 90 por ciento en peso del implante bioerosionable. El copolímero de PLGA puede ser desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 50 por ciento en peso, preferentemente aproximadamente 40 por ciento en peso del implante bioerosionable. Las células RPE se pueden trasplantar junto con un polímero biocompatible, tal como ácido poliláctico, ácido poli(láctico-co-glicólico), 50:50 de PDLGA, 85:15 de PDLGA y membrana biodegradable INON GTR® (mezcla de polímeros biocompatibles). Véanse las patentes de EE. UU. N° 6.331.313; 7.462.471; y 7.625.582. Véase también Hutala, et al. (2007) "In vitro biocompatibility of degradable biopolymers in cell line cultures from various ocular tissues: Direct contact studies". Journal of Biomedical Materials Research 83A(2): 407-413; Lu, et al (1998) J Biomater Sci Polym Ed 9: 1187-205; y Tomita, et al. (2005) Stem Cells 23: 1579-88.
Ensayos de cribado
También se describe en el presente documento un método de cribado para identificar agentes que modulan la madurez de células RPE. Por ejemplo, se pueden usar células RPE diferenciadas de células ES humanas para cribar agentes que promueven la maduración de RPE. Se pueden usar agentes identificados, solos o en combinación con células RPE, como parte de una pauta de tratamiento. Alternativamente, se pueden usar agentes identificados como parte de un método de cultivo para mejorar la supervivencia de células RPE diferenciadas in vitro.
Las células RPE se pueden usar como una herramienta de investigación en ámbitos tales como una empresa farmacéutica, química o de biotecnología, un hospital, o una institución académica o de investigación. Dichos usos incluyen el uso de células RPE diferenciadas de células madre embrionarias en ensayos de cribado para identificar, por ejemplo, agentes que se pueden usar para promover la supervivencia de RPE in vitro o in vivo, o que se pueden usar para promover la maduración de RPE. Agentes identificados se pueden estudiar in vitro o en modelos animales para evaluar, por ejemplo, su posible uso solo o en combinación con células RPE.
En el presente documento se describe un método de identificación de agentes que promueven la maduración de RPE que comprende proporcionar una célula RPE, poner en contacto dicha célula RPE con un agente, evaluar dicha célula RPE para signos de madurez y luego identificar un agente que promueve la maduración de RPE cuando dicho agente provoca que la célula RPE muestre signos de madurez. Los signos de madurez pueden ser el nivel de pigmentación, los niveles de expresión génica y la morfología como se trata en el presente documento.
Aplicaciones comerciales y métodos
Ciertos aspectos de la presente divulgación se refieren a la producción de células RPE para alcanzar cantidades comerciales. Las células RPE se pueden producir a gran escala, guardar si fuera necesario, y suministrar a hospitales, profesionales clínicos u otros centros sanitarios.
Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación se refieren a métodos de producción, almacenamiento y distribución de células RPE producidas por los métodos desvelados en el presente documento. Después de la producción de RPE, las células RPE se pueden recoger, purificar y opcionalmente almacenar antes del tratamiento de un paciente. Las células RPE pueden ser opcionalmente específicas de paciente, o se pueden seleccionar específicamente basándose en HLA u otro perfil inmunológico. Por ejemplo, una vez un paciente presenta una indicación tal como, por ejemplo, retinopatía diabética, degeneración macular (incluyendo degeneración macular senil), retinitis pigmentosa, atrofia retiniana, desprendimiento de retina, displasia retiniana y enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus), las células RPE se pueden ordenar y proporcionar en un modo oportuno. Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a métodos de producción de células RPE para obtener células a escala comercial, preparaciones de células que comprenden células RPE derivadas de dichos métodos, así como métodos para proporcionar (es decir, producir, opcionalmente guardar y vender) células RPE a hospitales y profesionales clínicos. La producción de células RPE diferenciadas o células RPE diferenciadas maduras puede ser aumentada de escala para uso comercial.
En el presente documento también se describen métodos para llevar a cabo un negocio farmacéutico que comprenden establecer un sistema de distribución para distribuir la preparación para su venta o pueden incluir establecer un grupo de ventas para la comercialización de la preparación farmacéutica.
En el presente documento también se describen métodos de suministro de células RPE a hospitales, centros de salud y profesionales clínicos, por lo que las células RPE producidas por los métodos desvelados en el presente documento se guardan, se piden a demanda por un hospital, centro de salud o profesional clínico, y se administran a un paciente en necesidad de terapia de células RPE. Un hospital, centro sanitario o profesional clínico pide células RPE basándose en los datos específicos de paciente, se producen células RPE según las especificaciones del paciente y posteriormente se suministran al hospital o profesional clínico que hizo el pedido. Por ejemplo, después de que se elija que una preparación particular de células RPE es adecuada para un paciente, es a partir de aquí que se expande para alcanzar cantidades apropiadas para el tratamiento del paciente.
Aspectos adicionales de la divulgación se refieren a una biblioteca de células RPE que puede proporcionar células compatibles con posibles receptores del paciente. Por consiguiente, se describe un método para llevar a cabo un negocio farmacéutico, que comprende la etapa de proporcionar preparaciones de células RPE que son homocigóticas para al menos un antígeno de histocompatibilidad, en donde las células se eligen de un banco de dichas células que comprende una biblioteca de células RPE que se puede expandir por los métodos desvelados en el presente documento, en donde cada preparación de células RPE es hemicigótica o homocigótica para al menos un alelo de MHC presente en la población humana, y en donde dicho banco de células RPE comprende células que son cada una hemicigótica o homocigótica para un conjunto diferente de alelos de MHC con respecto a los otros miembros en el banco de células. Como se ha mencionado anteriormente, se puede usar la manipulación genética dirigida o pérdida de heterocigosidad para generar las células madre de alelo de MHC hemicigótico u homocigótico usadas para obtener las células RPE.
En el presente documento también se describen métodos de obtención de células ES humanas de un paciente y luego de generación y de expansión de células RPE derivadas de las células ES. Estas células RPE se pueden almacenar. Además, estas células RPE se pueden usar para tratar el paciente del que se obtuvieron las células ES o un pariente del paciente.
La presente divulgación muestra que las células RPE humanas pueden ser diferenciadas de forma fiable y expandidas a partir de células ES humanas en condiciones bien definidas y reproducibles - que representan una fuente inagotable de células para pacientes con trastornos degenerativos de la retina. La concentración de estas células no estaría limitada por la disponibilidad, sino que podría ajustarse a las necesidades clínicas precisas del individuo. También sería posible la infusión o el trasplante repetido de la misma población de células a lo largo de la vida del paciente si el médico lo considera necesario. Además, la capacidad para crear bancos de estirpes hES de HLA compatible o de complejidad reducida a partir de los cuales se pudieran producir células RPE podría reducir posiblemente o eliminar por completo la necesidad de fármacos inmunosupresores y/o protocolos inmunomoduladores.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que los comúnmente entendidos por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque en la invención o prueba de la presente invención se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Para definir aún más la invención, en el presente documento se proporcionan los siguientes términos y definiciones.
Como se usa en la descripción en el presente documento y en todas las reivindicaciones que siguen, el significado de "un", "una", "el" y "la" incluye referencia al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, como se usa en la descripción en el presente documento, el significado de "en" incluye "en" y "sobre", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
En toda esta memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implican la inclusión de un número entero establecido o grupos de números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.
"Cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere en líneas generales a la cantidad de un compuesto o células que, cuando se administra a un paciente para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad. La cantidad eficaz puede ser una cantidad eficaz para la profilaxis, y/o una cantidad eficaz para la prevención. La cantidad eficaz puede ser una cantidad eficaz para reducir, una cantidad eficaz para prevenir la incidencia de signos/síntomas, para reducir la intensidad de la incidencia de signos/síntomas, para eliminar la incidencia de signos/síntomas, para ralentizar el desarrollo de la incidencia de signos/síntomas, para prevenir el desarrollo de la incidencia de signos/síntomas y/o efectuar la profilaxis de la incidencia de signos/síntomas. La "cantidad eficaz" puede variar dependiendo de la enfermedad y su intensidad y la edad, peso, antecedentes médicos, susceptibilidad y afecciones preexistentes, del paciente que se va a tratar. El término "cantidad eficaz" es sinónimo de "cantidad terapéuticamente eficaz" para los fines de la presente divulgación.
"Embrión" o "embrionario", como se usa en el presente documento, se refiere en líneas generales a una masa de células en desarrollo que no se ha implantado en la membrana uterina de un hospedador materno. Una "célula embrionaria" es una célula aislada o contenida en un embrión. Esto también incluye blastómeros, obtenidos ya en el estadio de dos células, y blastómeros agregados.
"Células madre embrionarias" (células ES), como se usa en el presente documento, se refiere en líneas generales a células derivadas de la masa celular interna de blastocitos o mórulas que se han sometido a pases sucesivamente como estirpes celulares. Las células ES se pueden obtener de la fecundación de un óvulo con esperma o ADN, transferencia nuclear, partenogénesis, o por medios para generar células ES con homocigosidad en la región de HLA. Las células ES también se pueden referir a células derivadas de un cigoto, blastómeros, o embrión de mamífero de estadio blastocisto producido por la fusión de un espermatozoide y un óvulo, transferencia nuclear, partenogénesis, o la reprogramación de cromatina y posterior incorporación de la cromatina reprogramada en una membrana plasmática para producir una célula. Las células madre embrionarias, independientemente de su fuente o el método particular usado para producirlas, se pueden identificar basándose en: (i) la capacidad para diferenciar en células de las tres capas germinales, (ii) expresión de al menos Oct-4 y fosfatasa alcalina, y (iii) capacidad para producir teratomas cuando se trasplantan en animales inmunodeprimidos. El término también incluye células aisladas de uno o más blastómeros de un embrión, preferentemente sin destruir el resto del embrión. El término también incluye células producidas por transferencia nuclear de células somáticas, incluso cuando se usan células no embrionarias en el proceso. Las células ES se pueden derivar de la fecundación de un óvulo con un espermatozoide o ADN, transferencia nuclear, partenogénesis, o por medios para generar células ES con homocigosidad en la región HLA. Las células ES también son células derivadas de un cigoto, blastómeros, o embrión de mamífero de estadio blastocisto producido por la fusión de un espermatozoide y un óvulo, transferencia nuclear, partenogénesis, o la reprogramación de cromatina y posterior incorporación de la cromatina reprogramada en una membrana plasmática para producir una célula. Las células madre embrionarias humanas de la presente divulgación pueden incluir, pero no se limitan a, células madre embrionarias MA01, MA09, ACT-4, N° 3, H1, H7, H9, H14 y ACT30. En ciertas realizaciones, las células ES humanas usadas para producir células RPE se obtienen y mantienen según normas GMP.
"Células derivadas de embrión" (EDC), como se usa en el presente documento, se refiere en líneas generales a células derivadas de mórula, células derivadas de blastocisto que incluyen las de la masa celular interna, escudo embrionario, o epiblasto, u otras células madre pluripotentes del embrión temprano, que incluyen endodermo, ectodermo y mesodermo primitivo, y sus derivados. "EDC" también incluye blastómeros y masas celulares de blastómeros individuales agregados o embriones de estadios variables de desarrollo, pero excluye células madre embrionarias humanas que se han sometido a pases como estirpes celulares.
"Degeneración macular", como se usa en el presente documento, se refiere en líneas generales a enfermedades caracterizadas por una pérdida progresiva de visión central asociada a anomalías de la membrana de Bruch, la retina neural y el epitelio del pigmento de la retina. Las enfermedades de degeneración macular incluyen, pero no se limitan a, degeneración macular senil, distrofia macular de Carolina del Norte, distrofia del fondo de Sorsby, enfermedad de Stargardt, distrofia en patrón, enfermedad de Best, malattia leventinese, coroiditis en panal de Doyne, drusas dominantes y drusas radiales.
"Célula madre pluripotente", como se usa en el presente documento, se refiere en líneas generales a una célula capaz de proliferación indefinida prolongada o prácticamente in vitro mientras que retiene su estado indiferenciado, presenta un cariotipo estable (preferentemente normal), y que tiene la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinativas (es decir, ectodermo, mesodermo y endodermo) en las condiciones apropiadas.
"Células madre embrionarias pluripotentes", como se usa en el presente documento, se refiere en líneas generales a células que: (a) son capaces de inducir teratomas cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes (SCID); (b) son capaces de diferenciarse en tipos de células de las tres capas germinativas (por ejemplo, tipos de células ectodérmicas, mesodérmicas y endodérmicas); y (c) expresan al menos un marcador molecular de células madre embrionarias (por ejemplo, expresan Oct-4, fosfatasa alcalina, antígeno de superficie SSEA 3, antígeno de superficie SSEA 4, NANOG, TRA 160, T rA 181, SOX2, REX1). Las células madre pluripotentes a modo de ejemplo se pueden generar usando, por ejemplo, métodos conocidos en la técnica. Las células madre pluripotentes a modo de ejemplo incluyen células madre embrionarias derivadas de ICM de embriones en estadio de blastocisto, así como células madre embrionarias derivadas de uno o más blastómeros de un embrión en estadio de escisión o en estadio de mórula (opcionalmente sin destruir el resto del embrión). Dichas células madre embrionarias se pueden generar de material embrionario producido por fecundación o por medios asexuales, que incluyen transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), partenogénesis y androgénesis. Las células madre pluripotentes adicionales a modo de ejemplo incluyen células madre pluripotentes inducidas (células iPS) generadas por reprogramación de una célula somática que expresa o que induce la expresión de una combinación de factores (denominados en el presente documento factores de reprogramación). Las células iPS se pueden generar usando células somáticas fetales, posnatales, de recién nacido, juveniles o adultas. En ciertas realizaciones, los factores que se pueden usar para reprogramar las células somáticas a células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, una combinación de Oct4 (algunas veces denominado Oct 3/4), Sox2, c-Myc y Klf4. En otras realizaciones, los factores que se pueden usar para reprogramar las células somáticas a células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, una combinación de Oct-4, Sox2, Nanog y Lin28. En otras realizaciones, las células somáticas se reprograman expresando al menos 2 factores de reprogramación, al menos tres factores de reprogramación, o cuatro factores de reprogramación. En otras realizaciones, se identifican factores de reprogramación adicionales y se usan solos o en combinación con uno o más factores de reprogramación que se sabe que reprograman una célula somática a una célula madre pluripotente. Las células iPS se pueden identificar normalmente por la expresión de los mismos marcadores que las células madre embrionarias, aunque una estirpe de células iPS particular puede variar en su perfil de expresión.
"Célula RPE", "célula RPE diferenciada", "célula RPE derivada de ES", como se usa en el presente documento, se pueden usar indistintamente en todo el presente documento para referirse en líneas generales a una célula RPE diferenciada de una célula madre pluripotente usando un método de la invención. El término se usa genéricamente para referirse a células RPE diferenciadas, independientemente del nivel de madurez de las células, y así puede englobar células RPE de diversos niveles de madurez. Las células RPE pueden ser visualmente reconocidas por su morfología en adoquín y el aspecto inicial del pigmento. Las células RPE también se pueden identificar molecularmente basándose en la ausencia sustancial de expresión de marcadores de células madre embrionarias, tales como Oct-4 y NANOG, así como basándose en la expresión de marcadores de RPE tales como RPE-65, PEDF, CRALBP y bestrofina. Así, a menos que se especifique de otro modo, células RPE, como se usa en el presente documento, se refiere a células RPE diferenciadas in vitro de células madre pluripotentes.
"Célula RPE madura" y "célula RPE diferenciada madura", como se usa en el presente documento, se pueden usar indistintamente en todo el presente documento para referirse en líneas generales a cambios que ocurren después de la diferenciación inicial de células RPE. Específicamente, aunque las células RPE se pueden reconocer, en parte, basándose en el aspecto inicial del pigmento, después de la diferenciación las células RPE maduras se pueden reconocer basándose en la mejora de la pigmentación.
"Pigmentado", como se usa en el presente documento, se refiere, en líneas generales, a cualquier nivel de pigmentación, por ejemplo, la pigmentación que ocurre inicialmente cuando las células RPE se diferencian de células ES. La pigmentación puede variar con la densidad celular y la madurez de las células RPE diferenciadas. La pigmentación de una célula RPE puede ser la misma que una célula RPE promedio después de la diferenciación terminal de la célula RPE. La pigmentación de una célula RPE puede estar más pigmentada que la célula RPE promedio después de la diferenciación terminal de la célula RPE. La pigmentación de una célula RPE puede estar menos pigmentada que la célula RPE promedio después de la diferenciación terminal.
"Signos" de enfermedad, como se usa en el presente documento, se refiere, en líneas generales, a cualquier anomalía indicativa de enfermedad, descubrible en un examen del paciente; una indicación objetiva de enfermedad, a diferencia de un síntoma, que es una indicación subjetiva de enfermedad.
"Síntomas" de enfermedad, como se usa en el presente documento, se refiere, en líneas generales, a cualquier fenómeno patológico o desviación de la normalidad en la estructura, función o sensación, experimentada por el paciente e indicativo de enfermedad.
"Terapia", "terapéutico", "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere, en líneas generales, a tratar una enfermedad, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos, y/o aliviar la enfermedad, causando la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos. La terapia engloba la profilaxis, la prevención, el tratamiento, la cura, el remedio, la reducción, el alivio y/o proporcionar alivio de una enfermedad, signos y/o síntomas de una enfermedad. La terapia engloba un alivio de signos y/o síntomas en pacientes con signos y/o síntomas de enfermedad en curso (por ejemplo, ceguera, deterioro de la retina). La terapia también engloba "profilaxis" y "prevención". La profilaxis incluye prevenir la enfermedad que ocurre posterior al tratamiento de una enfermedad en un paciente o la reducción de la incidencia o intensidad de la enfermedad en un paciente. El término "reducido", para el fin de la terapia, se refiere, en líneas generales, a la reducción clínica significativa en los signos y/o los síntomas. La terapia incluye tratar recaídas o signos y/o síntomas recurrentes (por ejemplo, degeneración retiniana, pérdida de visión). La terapia engloba, pero no se limita a, impedir la aparición de signos y/o síntomas en cualquier momento, así como reducir los signos y/o síntomas existentes y eliminar los signos y/o síntomas existentes. La terapia incluye tratar enfermedad crónica ("mantenimiento") y enfermedad aguda. Por ejemplo, el tratamiento incluye tratar o prevenir recaídas o la reaparición de signos y/o síntomas (por ejemplo, ceguera, degeneración retiniana).
La presente invención se describirá ahora más completamente con referencia a los siguientes ejemplos, que son ilustrativos solo y no se deben considerar limitantes de la invención descrita anteriormente.
EJEMPLOS
La invención que se escribe ahora, en general, será más fácilmente entendida como referencia a los siguientes ejemplos, que están incluidos simplemente para los fines de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención.
Ejemplo 1
En estudios preclínicos en animales, los presentes inventores han buscado la presencia de teratoma/tumores que se podrían desarrollar a partir de células hES, si estaban presentes en productos celulares de epitelio pigmentario de la retina humano (hRPE). Cuando los animales se inyectaron con 100 % de células hES, se detectaron teratomas (al microscopio) en cuatro semanas. Sin embargo, no se detectaron tumores cuando las células hRPE se enriquecieron con 1 % o menos células hES. La máxima fracción permitida de células hES en el producto es al menos un orden de magnitud inferior a la concentración de hES, que conducirá a teratomas en ratones, es decir, inferior al 0,1 %. Idealmente, sería deseable medir con exactitud la concentración de células hES incluso a valores mucho más bajos de estos, o preferentemente ser capaces de indicar que no existen células hES en el producto de células hRPE. Como se trata anteriormente, los métodos convencionales (tales como RT-PCR, transferencia Western y citometría de flujo) son insuficientemente sensibles para la determinación de si existen algunas células hES residuales en una población de aproximadamente 500.000 células diferenciadas.
Ejemplo 2
Este ejemplo describe un ensayo que tiene exquisita sensibilidad para la detección de células hES pluripotentes en una población de células. Usando este ensayo, se probaron células diferenciadas de células hES para determinar si células hES residuales permanecieron en la población. Este ensayo puede proporcionar valiosa información de seguridad debido a que cualquier célula hES residual tiene el potencial de formar tumores tras la implantación en un receptor.
En este ejemplo, se demuestra que dos aspectos diferentes del ensayo (cada uno de los cuales se podría usar independientemente entre sí) contribuyeron a la sensibilidad del ensayo: primero, siembra en condiciones que soportaron el mantenimiento de células hES para minimizar la diferenciación de células que podría dar como resultado la pérdida de expresión de marcadores de células hES; y segundo, desarrollo de una técnica que permitió la evaluación de cada célula en una población, con un operario cualificado capaz de observar entre aproximadamente uno y diez millones de células por hora.
Es actualmente aceptado en la bibliografía científica que las células hES pluripotentes (que pueden formar teratomas in vivo) expresan un conjunto conocido de marcadores moleculares, y la expresión de Oct-4 es crítica para la retención de pluripotencia, mientras que la pérdida de este marcador se asocia con diferenciación celular. Cualquier célula que exprese este marcador a un nivel detectable se puede observar como pluripotente y así no se desea en el producto final. Se puede observar que una célula que ha perdido la expresión de Oct-4 ya no es pluripotente. En este ensayo, las células se examinaron primero para tinción positiva para fosfatasa alcalina bajo luz visible, luego se examinaron para expresión de Oct-4 por inmunofluorescencia.
Se obtuvieron células de epitelio pigmentario de la retina humano (hRPE) diferenciando células madre embrionarias humanas (hES) como se describe en la patente de EE. UU. N° 7.736.896, serie de EE. UU. N° 12/682.712 y serie de EE. UU. N° 61/262.002. Las células hRpE se diferenciaron de la estirpe de células hES MA09 que se originó de un único blastómero humano como se describe en la patente de EE. UU. N° 7.893315. Estas células se designaron MA09-hRPE.
Se determinó la sensibilidad del ensayo para detectar células hES en cultivos de células RPE. En estos experimentos, se prepararon mezclas de células MA09-hRPE y hES, que contenían 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 % o 10 % de hES (un total de -200.000 células) y se sembraron por triplicado. Las células se sembraron en dos tipos diferentes de condiciones de cultivo: o condiciones de cultivo de RPE (específicamente, sembrar sobre placas de 4 pocillos recubiertas de gelatina en medio EGM®-2 (Lonza Biologies, Basilea, Suiza) según el procedimiento normal para cultivar células hRPE), o condiciones de cultivo de células hES (condiciones que soportan el crecimiento y el mantenimiento de células hES que en este experimento se sembraron en MEF y usando hES-GM acondicionado; véase la Tabla 2). Las células hES usadas fueron una estirpe de células hES GFP-positivas (H1 o WA01). Usando esta estirpe de células hES GFP-positivas, fue posible detectar la presencia de células que se habían obtenido de las células hES si las células siguieron siendo pluripotentes o se diferenciaron. Después de estos experimentos iniciales usando H1, se confirmó que se obtuvieron resultados similares con otra estirpe de células hES, MA09, que no expresó GFP pero que se pudo detectar usando anticuerpo anti-núcleos humanos que tiñeron células humanas (incluyendo las células hES) pero no tiñeron MEF (que son de origen de ratón).
Después de la siembra, las células se cultivaron para permitir la fijación al sustrato, entonces las células se fijaron con 2 % de paraformaldehído, se permeabilizaron con 0,1 % de sustituto de NP-40 (que se puede hacer inmediatamente o hasta varias semanas después de la fijación, por ejemplo, después de aproximadamente 24 horas) y se tiñeron para fosfatasa alcalina (AP) y Oct-4. Se detectó AP usando VECTOR® Blue (Vector Laboratories) según las instrucciones del fabricante, que produce una tinción que es detectable bajo luz visible. Se detectó Oct-4 usando inmunofluorescencia (usando esencialmente los mismos métodos que se describen en el Ejemplo 7, más adelante). Usando un objetivo de escasa resolución de un microscopio fluorescente, primero se barrió todo el pocillo en luz visible transmitida como un patrón repetitivo de arriba a derecha-al borde-abajo-izquierda al borde-abajo-derecha... que busca en cada célula en la placa la tinción azul de célula indicativa de actividad de fosfatasa alcalina. Debido a que las células se observaban bajo luz visible, también fueron visibles las células no teñidas, y el foco del microscopio se ajustó según se necesitara para corregir desviaciones verticales durante el barrido, asegurando así que las células siguieran en el plano focal. Una vez se encontró una célula teñida de azul, se volvió a examinar a mayor resolución (objetivo 20x) bajo luz ultravioleta para la tinción de Oct-4 y luego para GFP. Debido a que la duración de la observación bajo luz ultravioleta se mantuvo baja por este método, no se fotoblanqueron tinciones de Oct-4 y GFP. Se presentan fotomicrografías representativas en la FIG. 1. Los paneles superiores muestran células GFP-positivas (izquierda) y Oct-4 positivas (derecha) mezcladas con células RPE en una relación 1:10 (10 %). La tinción con DAPI (panel izquierdo inferior) muestra que todas las células presentes en el campo (tanto RPE como hES) y el panel derecho inferior muestran tinción con fosfatasa alcalina. Aumentos 200x.
Debido a que la tinción de AP es detectable bajo luz visible, como cribado primario debido a que permitió a los presentes inventores examinar rápidamente cada célula en la población (200.000 células en este ejemplo). Las células que fueron AP-positivas se examinaron bajo luz ultravioleta para tinción de Oct-4 y expresión de GFP. Las células positivas para AP, Oct-4 y GFP son pluripotentes, mientras que las células que son GFP positivas y Oct-4 negativas son descendencia diferenciada de células pluripotentes. Algunas células AP positivas fueron GFP-negativas y Oct-4 negativas, que indica que se puede usar AP para identificar rápidamente posibles células hES, y las células se pueden examinar entonces para un segundo marcador de células hES (Oct-4 en este ejemplo) para identificar células hES. Debido a que las células hES añadidas fueron constitutivamente GFP-positivas, se interpretó que las células detectadas que fueron AP positivas pero negativas para Oct-4 y negativas para GFP no se habían originado a partir de las células hES añadidas, sino que resultaron de células AP-positivas ocasionales dentro de la población de MEF.
Cuando las células se sembraron en condiciones de cultivo de RPE, los presentes inventores encontraron que más del 50 % de las células GFP-positivas fueron Oct-4-negativas, que confirmó que las condiciones de cultivo de RPE soportan escasamente el estado pluripotente de las células hES incluso después de una corta duración del cultivo. Sin embargo, cada célula Oct-4 positiva también expresó fosfatasa alcalina y GFP, por lo que esto permitió llegar a la conclusión a los presentes inventores de que la expresión de Oct-4 era suficiente para identificar células hES.
Sin embargo, cuando las células se sembraron en condiciones de cultivo de células hES, se retuvo la expresión de Oct-4 en una fracción mucho mayor de las células GFP-positivas, que permitió la detección de células hES Oct-4 positivas en cultivos enriquecidos con tan solo 0,001 % de células hES. Esto está de acuerdo con las observaciones de los presentes inventores de que la condición de cultivo para el crecimiento de células RPE no es propicio para el mantenimiento de cultivos de células hES, sino que en su lugar provoca que las células hES se diferencien (véase el Ejemplo 3 a continuación).
La fosfatasa alcalina fue más sensible que Oct-4, permitiendo la detección de solo 5 células de entre aproximadamente 178.000. Así, se eligió el ensayo de fosfatasa alcalina como el método de cribado primario. Sin embargo, debido a que AP no es un marcador único de células hES, su expresión identifica posibles células hES que se pueden confirmar con un marcador más definitivo, como Oct-4. Se observaron positivos falsos para AP (negativos para GFP u Oct-4), y se usa Oct-4 como ensayo de confirmación. Con 0,001 % de células hES, un total de 5 células en los tres pocillos dieron positivo por tinción para fosfatasa alcalina y fueron positivo para GFP. Así, usando estos métodos se llegó a la conclusión de que el límite de detección para la detección inmunofluorescente de células hES en cultivos celulares de células RPE era 5/600.000 células (0,0008 %).
Ejemplo 3
Este ejemplo describe los resultados de un estudio de enriquecimiento in vitro. Su fin fue mostrar que todas las hESC añadidas, incluso con alto porcentaje, se diferenciaban en condiciones de cultivo de RPE durante un transcurso de 6 semanas o 2 pases - que es inferior al tiempo que separa RPE en la recogida para la crioconservación de hESC o EB diferenciado.
El estudio de enriquecimiento in vitro se realizó con células MA09 y con H1-GFP. Los cultivos contuvieron mezclas de hESC y RPE, con 1 %, 10 % o 20 % de células hES. Las poblaciones de células se evaluaron por tinción y Q-PCR a las 3 semanas (p1) y 6 semanas (p2). La observación microscópica de cultivos mostró que hESC empezó a diferenciarse casi inmediatamente, formando estructuras 3D que rompieron la integridad de la monocapa de RPE y así se vieron fácilmente. Al final del tiempo en cultivo, no se encontraron células Oct-4 positivas, pero persistió cierta tinción con fosfatasa alcalina. Se pensó que la tinción con AP era el resultado de hESC diferenciadas, ya que la diferenciación puede producir diversos tipos de células, algunas de las cuales podrían ser positivas para fosfatasa alcalina.
Tabla 3. Mezclas de células usadas en el estudio de enriquecimiento in vitro.
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Se sembraron suspensiones recién preparadas de células hRPE y hES, mezcladas en las relaciones anteriores, sobre placas de 6 pocillos y 4 pocillos recubiertas con gelatina en medio EGM-2 según el procedimiento normal para cultivar células hRPE. El medio EGM-2 es propicio para la proliferación de células hRPE. Las placas de control de 4 pocillos se fijaron con 2 % de paraformaldehído o se recogieron (para el análisis por qPCR) en el día 3, para evaluar el aspecto inicial de estos cultivos. Las placas de 6 pocillos restantes se cultivaron hasta la confluencia, momento en el que el medio se cambió a MDBK-MM, que se utiliza para el mantenimiento de células hRPE. Después de aproximadamente 3 semanas, los cultivos o se fijaron o se recogieron (para qPCR) o se sometieron a pases en placas de 6 pocillos o placas de 4 pocillos. Las placas se cultivaron durante 3 semanas adicionales antes de que o se fijaran o se recogieran para qPCR. Este cultivo simuló el proceso de fabricación desde el aislamiento de las colonias de RPE diferenciadas hasta el producto final.
En el estudio 1, las células hES añadidas a los cultivos fueron células MA09. Las placas fijadas se tiñeron para el marcador de células hES, Oct-4, usando inmunofluorescencia indirecta, seguido por anticuerpos secundarios conjugados con Alexa (identificación como una luz emitida roja) y DAPI para la visualización de los núcleos y se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia invertido. Se determinó la actividad de fosfatasa alcalina sobre las mismas placas usando el kit VECTOR® Blue (Vector Laboratories, Burlingame, CA), Además, se examinaron cultivos vivos bajo el microscopio de contraste de fases o usando óptica de modulación de Hoffman (HMC) para irregularidades en la monocapa.
En el estudio 2, las células hES añadidas a los cultivos fueron células H1-GFPp que expresan constitutivamente GFP. Estas células hES y su descendencia son fácilmente detectables debido a su expresión de GFP, que permite la detección de las células ES o su durante todo el periodo de cultivo independientemente de si siguieron siendo pluripotentes o se diferenciaron. Se realizó qPCR usando el ensayo de expresión génica TaqMan (Applied Biosystems) que ensayó la expresión de Oct-4, Nanog, Rex-1 y Sox2. Se usó la expresión génica de beta-actina para la normalización.
El estudio 3 fue idéntico al estudio 2, excepto que las células MA09-RPE se sometieron a un pase adicional en cultivo antes de mezclarse con las células hES H1-GFPp.
Resultados del estudio 1.
Puesto que no existe medio directo para identificar positivamente las células madre embrionarias MA09 en cultivo, el objetivo principal de este experimento que implicaba el enriquecimiento de células hES MA09 en cultivos de células hRPE fue determinar si las células que se tiñen para actividad de Oct-4 o de fosfatasa alcalina (que son específicos para células ES) se podrían detectar en estos cultivos mixtos. Los resultados indicaron que, aunque se detectaron células positivas por tinción para tanto Oct-4 como fosfatasa alcalina (tinción doble) a los 3 días, no hubo tinción positiva definitiva para los marcadores de células madre embrionarias a las 3 semanas. Dichas células con tinción doble positiva a los 3 días se encontraron principalmente en colonias típicas de tipo ES y tuvieron morfología similar a ES. El examen microscópico de todos los cultivos mostró que el 100 % (control positivo) de las células hES se comportó en un modo de célula madre embrionaria típica, es decir, se diferenciaron, formando estructuras tridimensionales con algunos agregados de tipo cuerpo embrioide de flotación libre. Aunque los cultivos de RPE puros (control negativo) mostraron comportamiento de crecimiento de RPE típico, es decir, se alargaron y se pigmentaron menos durante la fase proliferativa y recuperaron el aspecto pigmentado poligonal epitelial después de que se estableciera la monocapa y el medio se cambió a MDBK-MM. Sin embargo, en todos los cultivos mixtos (1 %, 10 %, 20 % de células hES), la presencia de dos tipos diferentes de células fue fácilmente perceptible, que varió de algunas irregularidades en la monocapa que se parecían a derivados diferenciados de células hES a grandes estructuras similares a cuerpos embrioides en gemación y otras estructuras 3D para la diferenciación de células hES. Se observaron algunos grupos de células positivas para fosfatasa alcalina en el 10 % y el 20 % de cultivos, pero la morfología de estas células teñidas fue muy diferente de las células ES - estas fueron o células que se parecían a fibroblastos o pequeños grupos de células dentro de los agregados tridimensionales de diferenciación de células ES. En dichos agregados tridimensionales, el nivel de unión de anticuerpos no específicos, o "ruido", fue superior a en monocapas de células, pero los presentes inventores no pudieron correlacionar ninguno de los parches brillantemente teñidos con núcleos teñidos con DAPI, que sería indicativo de tinción positiva para Oct-4.
Resultados del estudio 2 y 3.
Los resultados de estos estudios se tratan juntos, puesto que los resultados usando ambos cultivos de células hRPE fueron idénticos. En el día 2, se detectaron células GFP-positivas que tuvieron la morfología de colonias de células hES y presencia bien detectable de Oct-4 por inmunotinción, confirmando así la presencia de ES en los cultivos de RPE. Las células hES crecieron y se diferenciaron formando agregados tridimensionales muy estacados en cultivos de RPE y fácilmente detectables (tanto por morfología de los derivados como por el brillo de masas celulares GFP-positivas). La observación morfológica que confirma la presencia de célula hES diferenciada se observó incluso en el 1 % de relación de hES:RPE. Sin embargo, al final de las tres semanas, no fue detectable Oct-4 en los núcleos, excepto por células individuales ocasionales en el 100 % de cultivos de células hES (que está de acuerdo con las observaciones previas de los presentes inventores de presencia de células raras positivas para Oct-4 en cultivos de células de hES en diferenciación de 3 semanas). No se determinó la naturaleza específica de estas células diferenciadas, pero pareció que se diferenciaron bastante por esta vez.
Las Tablas 4 a 8 resumen las observaciones morfológicas y los resultados de tinción para estos cultivos. En estas tablas, - significa indetectable, ? significa señal detectable pero no convincentemente específica, significa señal detectable, + significa señal muy fuerte y ++ significa señal fuerte y específica.
Tabla 4. Colonias con morfología de células hES
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Tabla 5. Células con morfología de hESC distinta de RPE o sin diferenciar
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Tabla 6. Tinción de Oct-4
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Tabla 7. Actividad de fosfatasa alcalina
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Tabla 8. Células GFP-positivas (células hES o sus derivados) en cultivos enriquecidos con células H1.
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Conclusiones
hESC y sus derivados son detectables por observación microscópica en tanto cultivos tempranos como tardíos de células RPE incluso cuando se añadieron al 1 % de concentración. Las colonias de células hES (más o menos diferenciadas) son visibles en el día 3 cuando las células RPE son todavía planas y están por debajo de la confluencia. Después de tres semanas en cultivo, la observación microscópica revela grandes masas celulares derivadas de hESC que son muy diferentes de la morfología de RPE y fácilmente perceptibles.
En el día 3, algunas de las células hESC presentes en el cultivo todavía siguen siendo pluripotentes, pero en el día 22 el resultado dependió de la fracción de células hES en el cultivo inicial. En los cultivos que contuvieron inicialmente 20 % de células hES o menos, todas las células se diferenciaron en el día 22. Sin embargo, en los cultivos que contuvieron inicialmente 100 % de células hES, algunas células Oct-4 positivas siguieron siendo detectables a los 22 días.
La tinción con Oct-4 es detectable en el día 3. En el 1 % de cultivos hESC, las células Oct-4 positivas fueron más difíciles de detectar, pero en el 10 % y el 20 % estas células fueron fácilmente detectadas.
Cuando se usaron células H1-GFPp, el marcador GFP estuvo presente en todas las etapas del experimento y fue fácilmente detectable en el 10 % y el 20 % de hESC en el día 3. En el día 22 fue muy fácil de detectar en todas las concentraciones diferentes, a medida que crecieron los derivados de hESC.
Ejemplo 4
Este ejemplo describe otras observaciones al seguir cultivando las poblaciones mixtas de células hES y células RPE que se describieron en el Ejemplo 3.
Después de tres semanas en cultivo en el pase 2, las células o se recogieron en tampón RLT para Q-PCR o se fijaron con 2 % de PFA y se tiñeron para Oct-4. Se detectó actividad de fosfatasa alcalina usando el colorante VECTOR® Blue según las instrucciones del fabricante. Las muestras se montaron en VECTASHIELD® con DAPI y se examinaron/fotografiaron.
Se observaron varias áreas de colorante azul (que indica la presencia de producto de reacción de fosfatasa alcalina) en varias muestras. Sin embargo, ninguna de estas células fue positiva para Oct-4 ni se detectaron otras células positivas para Oct-4 en ningún campo examinado. Estos resultados indican que las células ES siguieron en el cultivo. La tinción de fosfatasa alcalina observada podría ser el resultado de la diferenciación de células ES para producir otros tipos de células que tienen actividad de fosfatasa alcalina.
Estuvieron presentes células GFP-positivas en todas las muestras examinadas y su morfología fue indicativa de diversos derivados de células ES, pero no se parecieron a las células ES.
Los controles positivos (células hES MA09 cultivadas durante tres días) mostraron nivel muy alto de tinción de Oct-4 y actividad de fosfatasa alcalina.
Conclusiones
Se diferencian las células hES mezcladas con células RPE y cultivadas en medio de RPE, pero continúan creciendo en estado diferenciado. Se podrían realizar varias pruebas adicionales para detectar cualquier posible contaminación de células ES.
Para cultivos tempranos de células RPE (2 a 3 días) teñidos para Oct-4/fosfatasa alcalina, en esta etapa las células están por debajo de confluencia y crecieron como una monocapa y no han depositado demasiada matriz extracelular que cree ruido de fondo, por lo que la presencia de cualquier célula individual o grupo pequeño debe ser fácil de detectar. Para estudios de inmunofluorescencia, un tamaño de muestra de al menos 200.000 células, preferentemente por triplicado, daría mayor sensibilidad.
A medida que crecen y maduran los cultivos de RPE, la presencia de células hES crearía irregularidades en la monocapa que varía de una única célula de morfología no epitelial a grandes agregados tridimensionales que pueden albergar células ES indiferenciadas. Aunque las células individuales de morfología distinta de RPE pueden ser RPE transdiferenciadas o senescentes, o progenitores retinianos, grandes agregados de células 3D de una morfología típica para las células ES en diferenciación podrían sugerir la presencia de células hES en el cultivo.
Ejemplo 5
Se acepta en líneas generales que las células hES, cuando crecen en las condiciones que no soportan su estado pluripotente (tales como en células nodriza, matriz definida o medios definidos), se diferencian muy rápidamente. Esta diferenciación está asociada con la pérdida de marcadores moleculares de pluripotencia, tales como Oct-4 y fosfatasa alcalina. Las condiciones de cultivo de RPE no soportan el crecimiento indiferenciado de células hES, por lo tanto, se propuso (y confirmó por estos experimentos) que en el momento cuando se fija la mezcla de células hES inicialmente pluripotentes con células RPE, muchas de las células hES habrían perdido o regulado por disminución la expresión de Oct-4 y así se vuelven indetectables.
Para cuantificar el efecto de las condiciones de cultivo sobre la sensibilidad de detección de células hES, se mezclaron bajas concentraciones de células H1-GEPp con células MA09-hRPE y se sembraron o en condiciones que favorecían el mantenimiento de su estado pluripotente o en condiciones que no. Específicamente, las células o se cultivaron en medios de cultivo de hES en células nodrizas de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), o en medios de crecimiento endotelial complementados con 2 % de FBS (EGM-2) sobre gelatina. EGM-2 es un medio que es propicio para la proliferación de RPE, pero no mantiene el estado pluripotente de células hES. Para reducir el tiempo para que ocurra la diferenciación en el cultivo, las células se cultivaron durante solo 16 horas antes ser fijadas. Las células se tiñeron entonces para fosfatasa alcalina y Oct-4 y se examinaron al microscopio como se describe en el Ejemplo 2. Para las poblaciones de células sembradas en medios de células ES en células nodriza, aproximadamente el 80 % de las células GFP-positivas fueron positivas para AP y Oct-4. A diferencia, para las poblaciones de células sembradas en medios de EGM-2, solo aproximadamente el 20 % de las células GFP-positivas fueron positivas para AP y Oct-4. A partir de estos resultados, los presentes inventores llegan a la conclusión de que sembrar en condiciones que favorezcan el mantenimiento del estado pluripotente puede mejorar enormemente la sensibilidad de detección de células hES en una población de células.
Ejemplo 6
Este ejemplo muestra la insensibilidad relativa de la PCR en tiempo real para detectar subpoblaciones de células raras.
Métodos
Se evaluó el LOD de qRT-PCR usando mezclas de células MA09-RPE y células hES MA09. Se descongelaron células MA09-RPE crioconsevadas y se contaron, y también se descongelaron hES MA09 y se contaron (usando tinción de fosfatasa alcalina para determinar el número de células hES pluripotentes presentes). Entonces las mezclas estuvieron formadas por 400.000 células, siendo el 100 %, 10 %, 1 %, 0,1 %, 0,01 % o 0 % de las células hES y siendo el resto MA09-RPE. Se usó un kit de aislamiento de ARN RNeasy de Qiagen para extraer ARN de las mezclas de células dando como resultado un volumen final de 30 pL de ARN por muestra. Entonces se sintetizó ADNc a partir de 10 pL de ARN con el kit de síntesis de ADNc Quantitect de Qiagen dando como resultado un volumen final de 20 pL de ADNc. Entonces se probó un pL de ADNc para la expresión génica relativa de repeticiones por triplicado normalizadas a la señal de beta-actina presente en cada muestra. Se realizó el análisis de expresión génica usando StepOne Plus de Applied Biosystems con la versión de software 2.1 y ensayos de expresión génica de TaqMan de Life Technologies siguiendo las condiciones de ciclos recomendadas por el fabricante para la cuantificación relativa de Ct comparativa.
Los ensayos de qRT-PCR para Nanog, Oct-4 y SOX2 se normalizaron al nivel de expresión observado en el 100 % de las muestras de células hES (RQ = cuantificación relativa) que sirve de punto de referencia cero en el gráfico de más adelante. La regulación por disminución media de Nanog (2,51 log), Oct-4 (2,73 log) y SOX2 (1,63 log) para la muestra de RPE sin enriquecimiento (0 % de hES) en comparación con el control de 100 % de hES está de acuerdo con los datos históricos para este lote. La regulación por disminución de todos los marcadores de hES se redujo espectacularmente en células RPE enriquecidas con 1 % y 10 % de células hES.
Resultados
La FIG. 2A-C ilustra gráficamente la expresión génica relativa (detectada por qRT-PCR) para (A) Oct-4; (B) Nanog; y (C) SOX2. La diferencia estadísticamente significativa entre el control de RPE (0 % de hES) frente al 0,1 % de muestra enriquecida es evidente para Nanog y Oct-4. Sin embargo, al 0,1 % de dosis enriquecida, el grado de regulación por disminución de SOX2 es comparable al observado en 100 % de muestra de RPE. La expresión para los tres marcadores de células hES en la muestra con 0,001 % de enriquecimiento es indistinguible de la observada en el 100 % de control de RPE. Por lo tanto, el ensayo de qRT-PCR no detectaría una posible contaminación de células hES al nivel del 0,01 %.
En este estudio, el LOD de qRT-PCR para dos (Nanog y Oct-4) de los tres marcadores de hES estuvo en el nivel del 0,1 % de células hES. Sin embargo, dependiendo del grado de regulación por disminución para un lote particular de RPE, es cuestionable si la qRT-PCR daría una indicación coherente y fiable de la contaminación de células hES incluso a este nivel. En conclusión, el ensayo de qRT-PCR para la expresión de hES es 3 a 4 órdenes de magnitud menos sensible que los ensayos de inmunotinción descritos anteriormente.
Ejemplo 7
Este ejemplo demuestra además la exquisita sensibilidad de detección de células hES raras dentro de una población de células RPE usando métodos de tinción. Estos experimentos miden la sensibilidad de un ensayo para detectar hESC indiferenciadas (pluripotentes) en una población de RPE. Se enriquecieron RPE con números definidos y relativamente bajos de hESC (tanto H1 como MA09 en diferentes experimentos) sobre MEF en medio de hESC durante un tiempo mínimo que permitía que las células se unieran y se extendieran, por lo que siguen estando adheridas durante el procedimiento de inmunotinción. Estas condiciones (MEF, medio hESC-GM acondicionado, exposición mínima a RPE) conservó la pluripotencia de hESC. Después de 14-16 h, se fijaron las placas y se tiñeron, luego se examinaron. Se contaron los núcleos por campo (colorante DAPI) en varios campos aleatorios para el número total de células por pocillo examinadas. Debido a que la tinción de AP se expresa en otros tipos de células, además de células pluripotentes, las células AP+/Oct4- se originaron probablemente a partir de MEF; así, se examinó cada célula AP-positiva para Oct-4, y se contaron células doble positivas como células hES. Como se ha determinado por comparación de Oct-4 y GFP, hubo una pequeña pérdida de células pluripotentes en la diferenciación, pero en estas condiciones optimizadas para hESC, esta pérdida es mínima (la pérdida fue mucho más alta sin MEF y en medio RPE).
Métodos
Se prepararon células MA09 hES y RPE en una relación entre 8 células hES y 10 millones de células RPE. Los controles negativos consistieron en células RPE sin células hES añadidas. Se suspendieron dos millones de células RPE que contenían un promedio calculado de 1,6 células hES en medio de crecimiento celular acondicionado de hES y se sembraron en placas de 6 pocillos que contenían 500.000 células nodriza (MEF que fueron previamente tratadas con mitomicina C) para promover la retención de pluripotencia de hES. Las células se cultivaron durante aproximadamente 16 horas antes de la fijación y tinción. Después de 14-18 horas, se retiró el medio, se aclararon los cultivos con PBS, se permeabilizaron con 0,1 % de NP-40 (10 minutos) y se aclararon otra vez. Se bloqueó la unión no específica con 10 % de suero de cabra normal (30-60 minutos). Se añadieron anticuerpos primarios contra Oct-4, seguido por lavado e incubación en anticuerpos marcados con fluorescencia secundarios. Se realizó un control de ensayo para confirmar las condiciones de tinción y para eliminar la tinción no específica atribuida a MEF presentes en los cultivos usando tinción doble con anticuerpo nuclear anti-humano (anti-HuNu) y Oct-4. Entonces se tiñeron los cultivos para la presencia de fosfatasa alcalina (azul) usando Vector Blue (Vector Labs). Después de que se completara el cambio de color de AP, se retiró el colorante y las células se lavaron y se tiñeron con DAPI (colorante fluorescente de ADN).
Cuando se usan células MA09 que no tienen GFP u otro marcador interno, los presentes inventores incluyeron un control de hESC en MEF solo (sin RPE) teñido para los mismos marcadores más núcleos anti-humanos. Debido a que las células hES son propensas a la diferenciación sin el refuerzo mutuo de células hES circundantes, este experimento de control permitió a los presentes inventores determinar el límite superior del número de células hES sin diferenciar que podrían seguir después de la siembra. En estos experimentos de control, se sembraron los mismos números de células hES en el misma área de placa en MEF en medio de células hES (hES-GM acondicionado; véase la Tabla 2), pero en ausencia de células RPE. Entonces se tiñeron los cultivos con un anticuerpo anti-núcleos humanos (anti-HuNu) para permitir la detección de células humanas encima de las MEF y se contaron las células hES sin diferenciar restantes. Estas mediciones determinaron cuántas células hES sin diferenciar quedarían cuando se sembraran en condiciones de baja densidad, pero en las mejores condiciones de cultivo (siembra en medio de hES en MEF). Se usó el número de células hES sin diferenciar detectadas en estas placas de control como denominador cuando se calcula el porcentaje de células indiferenciadas que se detectaron. Cuando se introdujeron 5 células hES por cada 600.000 como se calculó, se detectaron al menos dos positivos dobles. Cuando se introducen dichos bajos números de células contaminantes, puede aumentar el protagonismo de los efectos de "ruido", ya que la pérdida de células durante las manipulaciones, tales como el pipeteado, es constante y no se correlaciona con la disminución del porcentaje de células contaminantes.
Resultados
Como se trata anteriormente, una fracción considerable de células hES pueden perder la tinción de Oct-4 durante la evolución temporal (24 horas) del cultivo antes de un ensayo de inmunotinción. La pérdida de tinción de Oct-4 fue atribuible al mantenimiento de los cultivos en medio de crecimiento RPE antes de la tinción. Los estudios adicionales confirmaron una pérdida similar de expresión de Oct-4 en células hES MA09 durante el transcurso del cultivo (aproximadamente 18 horas). Así, dependiendo de las condiciones del ensayo, se regularon por disminución un porcentaje de las células hES inicialmente pluripotentes para la expresión de Oct-4 para cuando se fijaron para inmunotinción, que disminuiría la sensibilidad de detección de células hES en la población original de células.
Para minimizar la pérdida de expresión de Oct-4, se modificaron las condiciones de ensayo para incorporar el uso de células nodriza de MEF y medio de crecimiento acondicionado hES para promover la persistencia de marcadores pluripotentes de hES durante el transcurso del ensayo. Se retuvo AP como una herramienta de cribado primaria debido a que la señal positiva (colorante azul de células) se puede observar en un campo brillante, que permite al operario seguir en el foco del plano. A diferencia, el barrido de células para la fluorescencia requiere la visualización de las células bajo luz fluorescente, que puede dar como resultado que las células se desvíen del plano de foco y pueda conducir a la ausencia de una señal positiva. Además, la tinción de AP permite al operario examinar cada célula entre millones para señalar células AP positivas para el posterior examen para confirmar la expresión de Oct-4.
Estos estudios confirmaron que este método de detección de subpoblaciones raras de células hES MA09 pluripotentes en una población de células RPE presenta una exquisita sensibilidad.
Para cada uno de los dos estudios informados en este ejemplo, todas las células en 4 a 5 pocillos de una placa de 6 pocillos se inspeccionaron primero para tinción de AP (azul). Entonces se volvió a examinar cualquier célula AP positiva para fluorescencia roja, que indica la presencia de Oct-4. Las células se examinaron para tinción usando el mismo método de barrido que se describe en los ejemplos precedentes (que buscan células teñidas de azul en el campo brillante, que se mueven de la parte superior izquierda de la placa en un patrón "derecha-abajo-izquierda-abajo, repetir" hasta que se haya inspeccionado el campo inferior derecho. De esta forma, cada célula AP positiva teñida de azul se inspeccionó para el colorante Oct-4 (rojo). Se determinó el número total de células inspeccionadas por pocillo contando el número de núcleos teñidos con DAPI en fotomicrografías de tres campos seleccionados al azar (0,26 mm2 / campo) y multiplicando las células medias por campo por el número total de campos por cada seis pocillos (960 mm2 por pocillo / 0,26 mm2 por campo) = 3692 campos por seis pocillos. Obsérvese que cada pocillo también contuvo aproximadamente 500.000 MEF, por lo que se estableció un pocillo de referencia que solo contenía MEF y los núcleos de MEF también se tiñeron con DAPI y se contaron para obtener números precisos de RPE/células hES excluyendo MEF. Como alternativa, se podría determinar el número de células humanas (a diferencia de MEF derivado de ratón) contado por pocillo contando las células teñidas con un marcador específico de humano, tal como HuNu.
En estos estudios, una respuesta positiva se definió como un mínimo de dos células teñidas dobles en preparaciones de RPE enriquecidas en una relación calculada de 1,6 células hES MA09 por cada 2 millones de células RPE. El LOD para detectar hES contaminantes está, por tanto, a un nivel del 0,00008 %. Obsérvese que esto es un orden de magnitud más sensible que el previamente informado para los estudios de GFP-hES. Al menos dos factores explican la potenciada sensibilidad 1) el uso de medio acondicionado con MEF y hES para retener la pluripotencia de hES y 2) el aumento del número de células inspeccionadas aumenta la sensibilidad del ensayo.
Los resultados de estos estudios se resumen en la Tabla 9 a continuación.
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En un estudio adicional, dos operarios cegados examinaron los pocillos que contenían el 100 % de células RPE y células RPE enriquecidas con 0,0001 % de hES. Todos los operarios identificaron todas las células positivas dobles (teñidas con Oct-4/AP) en el pocillo enriquecido mientras que no se observó tinción de hES por ningún operario en el 100 % de control de RPE.
Ejemplo 8
Este ejemplo describe un método adicional a modo de ejemplo de detección de células diana dentro de una población. Se detectan células diana usando un primer anticuerpo acoplado directa o indirectamente a fosfatasa alcalina (AP) y un segundo anticuerpo acoplado a una marca fluorescente. Este método se puede usar para detectar células raras de un tipo que no expresan AP (o expresan insuficientemente AP que es insuficiente para la robusta detección). Además, este método se puede usar para detectar células raras que expresan endógenamente AP (por ejemplo, células ES), en cuyo caso cabría esperar que el anticuerpo acoplado a AP aumentara la intensidad de tinción de AP. El primer y segundo anticuerpos se unen específicamente a diferentes marcadores del tipo de célula rara. Por ejemplo, donde el tipo de célula diana sea una célula ES, los anticuerpos se unen específicamente a dos marcadores de células ES diferentes, tales como fosfatasa alcalina, Oct-4, Nanog, antígeno embrionario específico de estadio 3 (SSEA-3), antígeno embrionario específico de estadio 4 (SSEA-4), TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, Sox2, factor de crecimiento y de diferenciación 3 (GDF3), expresión I reducida (REX1), factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4), gen específico de células embrionarias 1 (ESG1), 2 asociado a la pluripotencia del desarrollo (DPPA2), DPPA4, transcriptasa inversa de la telomerasa (hTERT), SALL4, E-CADHERINA, grupo de diferenciación 30 (CD30), Cripto (TDGF-1), GCTM-2, Genesis, factor nuclear de células germinativas y factor de células madre (SCF o el ligando c-Kit).
El acoplamiento respectivo de los anticuerpos a AP y la marca fluorescente puede ser directo o indirecto, por ejemplo, mediante un anticuerpo secundario, afinidad de actina/biotina, y otros métodos de acoplamiento indirecto. Entonces se tiñen las células para la actividad de fosfatasa alcalina para permitir la visualización de células que se unen al primer anticuerpo bajo luz visible. Entonces se examina la población de células bajo luz visible como se describe en los ejemplos precedentes para identificar células AP-positivas; entonces se examinan las células AP-positivas bajo luz ultravioleta para detectar células que también se marcan por el segundo anticuerpo. Las células que se unen tanto al primer como al segundo anticuerpo se identifican como células del tipo diana. Opcionalmente, la población de células se siembra en condiciones que favorezcan el crecimiento y/o la supervivencia del tipo de célula diana. Opcionalmente, se estima el número total de células examinando, por ejemplo, contando los números de células en campos aleatorios y cambiando la escala hasta el área total contada, y se pueden examinar un número mínimo predeterminado de células para garantizar un nivel deseado de sensibilidad. Donde las condiciones de cultivo incluyen la presencia de células nodriza, el recuento de la población de células se puede realizar en presencia de una marca que distingue la población de células de las células nodriza (por ejemplo, un anticuerpo específico de especie o anticuerpo específico de linaje, donde las células nodriza son de una especie o tipo diferente que la población de células), que se puede realizar en un pocillo por duplicado.
Ejemplo 9
Este ejemplo describe un método adicional a modo de ejemplo de detección de células diana dentro de una población. La población de células se tiñe para detectar dos marcadores diferentes de células diana usando un primer y segundo colorante que son visualmente distinguibles entre sí. Por ejemplo, las células se pueden marcar con un primer y segundo anticuerpo, cada uno acoplado directa o indirectamente a dos enzimas diferentes que catalizan las reacciones que dan productos visibles (por ejemplo, seleccionados de entre fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y una peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante). Las células se ponen entonces en contacto con sustratos de las dos enzimas diferentes para catalizar reacciones que dan un producto visible, en donde los sustratos se eligen de forma que sus productos sean colores diferentes entre sí. Alternativamente, los productos pueden ser del mismo color, pero elegidos para tener patrones de tinción distinguibles (por ejemplo, uno acoplado a un anticuerpo que tiñe núcleos y el otro acoplado a un anticuerpo que tiñe la membrana citoplásmica). Como un ejemplo, una de las enzimas puede ser fosfatasa alcalina y su sustrato puede ser Vector Red o Vector Blue (que produce productos rojos y azules, respectivamente), y la otra enzima puede ser una peroxidasa y su sustrato puede ser 3,3'-diaminobencidina (DAB) (que produce un producto marrón oscuro). Otra enzima a modo de ejemplo que se puede usar es beta-galactosidasa con el sustrato X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido) (que produce un producto azul) que se puede usar fácilmente junto con peroxidasa/DAB (producto marrón) o AP/Vector Red (producto rojo). Otras combinaciones adecuadas de combinaciones de enzima/sustrato que producen productos visualmente distinguibles son fácilmente identificables mediante experimentación rutinaria. Una ventaja de este método es que las células raras se pueden detectar usando luz visible solo sin la necesidad de examen bajo luz fluorescente. Además, si se desea, se puede utilizar una marca fluorescente adicional (por ejemplo, acoplada a un anticuerpo contra un tercer marcador), que permite así la verificación adicional de si se detectaron células (es decir, marcadas por la primera y/o segunda marca) por examen bajo luz ultravioleta.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro de detección de la presencia de o de confirmación de la ausencia de células madre pluripotentes residuales en una población de células diferenciadas de dichas células madre pluripotentes, que comprende:
(a) proporcionar una población de células diferenciadas en condiciones que favorezcan el crecimiento o el mantenimiento de dichas células madre pluripotentes;
(b) aplicar un primer colorante y un segundo colorante a dicha población de células,
en donde dicho primer colorante detecta un primer marcador y dicho primer marcador comprende fosfatasa alcalina expresada por dichas células madre pluripotentes; y dicho segundo colorante detecta un segundo marcador cuya expresión es indicativa de la presencia de dichas células madre pluripotentes, y
(i) en donde dicho primer colorante es detectable bajo luz visible y dicho segundo colorante es detectable bajo luz ultravioleta, o
(ii) en donde dicho primer colorante es detectable bajo luz visible y dicho segundo colorante es detectable bajo luz visible, y en donde dicho primer colorante y dicho segundo colorante son distinguibles visualmente; o
(iii) en donde dicho primer colorante es observable bajo luz visible y bajo luz ultravioleta y dicho segundo colorante es detectable bajo luz ultravioleta, o
(iv) en donde dicho primer colorante es observable bajo luz visible y bajo luz ultravioleta y dicho segundo colorante es detectable bajo luz visible;
(c) observar al microscopio las células de dicha población de células bajo visible o luz ultravioleta para detectar células que sean positivas para dicho primer marcador;
(d) observar al microscopio las células que son positivas para dicho primer marcador bajo visible o luz ultravioleta y determinar si cualquiera de dichas células es positiva para dicho primer marcador y dicho segundo marcador; y
(e) identificar una célula que es positiva para dicho primer marcador y dicho segundo marcador como una célula madre pluripotente, o confirmar la ausencia de células madre pluripotentes si no se identifican células positivas para dicho primer marcador y dicho segundo marcador.
2. El método in vitro de la reivindicación 1
en donde dichas células madre pluripotentes son células de carcinoma embrionario, células madre embrionarias o células pluripotentes inducidas (iPS).
3. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde el método se efectúa en una pluralidad de poblaciones de células derivadas de una o más células pluripotentes opcionalmente en donde dichas poblaciones de células derivan de células pluripotentes de diferentes tipos de HLA.
4. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde dichas células madre pluripotentes y dicha población de células diferenciadas son células humanas.
5. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde dicho primer colorante es observable bajo luz visible y bajo luz ultravioleta.
6. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5 en donde dicho primer colorante comprende un sustrato de fosfatasa alcalina seleccionado del grupo que consiste en: naftol AS-BI fosfato; fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) y nitroazul de tetrazolio (NBT); reactivo BCIP y reactivo INTX; naftol AS-BI y Fast Red Violet LB; sales de tetrazolio; compuestos diazo; Vector Red; Vector Blue, Vector Black; y p-nitrofenilfosfato (pNPP), preferentemente en donde dicho primer colorante comprende Vector Red o Vector Blue.
7. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho primer colorante comprende
(a) un anticuerpo que se une específicamente a dicho primer marcador, en donde dicho primer anticuerpo se acopla directa o indirectamente a un reactivo coloreado o una enzima capaz de producir un reactivo coloreado, opcionalmente en donde dicho reactivo coloreado comprende partículas de oro, partículas de plata o partículas de látex.8
8. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1(i) y (iii), y 2-7, en donde dicho segundo colorante comprende
(a) un anticuerpo primario que se une específicamente a dicho segundo marcador, en donde dicho anticuerpo primario se acopla directa o indirectamente a una marca fluorescente; y opcionalmente
(b) un anticuerpo secundario que comprende una marca fluorescente.
9. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 (ii) y (iv), y 2-7, en donde el segundo colorante comprende un anticuerpo primario que se une específicamente a dicho segundo marcador,
en donde dicho anticuerpo primario se acopla directa o indirectamente a un reactivo que es observable bajo luz visible, opcionalmente en donde dicho reactivo que es observable bajo luz visible comprende partículas de oro, partículas de plata o partículas de látex, o
en donde dicho anticuerpo primario se acopla directa o indirectamente a una enzima que cataliza una reacción que produce un producto que es observable bajo luz visible, opcionalmente en donde dicha enzima se selecciona del grupo que consiste en: beta-galactosidasa y peroxidasa, preferentemente en donde dicha peroxidasa comprende peroxidasa de rábano picante, o
en donde dicho anticuerpo primario se acopla directa o indirectamente a partículas de oro y dicho método comprende además formar un precipitado de plata sobre dichas partículas de oro.
10. El método in vitro de la reivindicación 8 en donde
dicha marca fluorescente se selecciona del grupo que consiste en: Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 94, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750 y Alexa Fluor 790, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Texas Red, SYBR Green, Dy Light Fluors, proteína verde fluorescente (GFP), TRIT (tetrametilrrodaminaisotiol), NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), colorante Texas Red, ácido ftálico, ácido tereftálico, ácido isoftálico, violeta de cresilo rápido, azul-violeta de cresilo, azul de cresilo brillante, ácido para-aminobenzoico, eritrosina, biotina, digoxigenina, 5-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína, TET (6-carboxi-2',4,7,7'-tetraclorofluoresceína), HEX (6-carboxi-2',4,4',5',7,7'-hexaclorofluoresceína), Joe (6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína) 5-carboxi-2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína, 5-carboxifluoresceína, 5-carboxirrodamina, Tamra (tetrametilrrodamina), 6-carboxirrodamina, Rox (carboxi-X-rodamina), R6G (rodamina 6G), ftalocianinas, azometinas, cianinas (por ejemplo Cy3, Cy3.5, Cy5), xantinas, succinilfluoresceínas, N,N-dietil-4-(5'-azobenzotriazolil)-fenilamina, aminoacridina y puntos cuánticos.
11. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicho segundo marcador se selecciona del grupo que consiste en: Oct-4, Nanog, antígeno embrionario específico de estadio 3 (SSEA-3), antígeno embrionario específico de estadio 4 (SSeA-4), TRA-1 -60, TRA-1 -81, TRA-2-49/6E, Sox2, factor de crecimiento y de diferenciación 3 (GDF3), expresión reducida 1 (REX 1), factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4), gen específico de células embrionarias 1 (ESG1), 2 asociado a la pluripotencia del desarrollo (DPPA2), DPPA4, transcriptasa inversa de la telomerasa (hTERT), s Al L4, E-CADHERiNa , grupo de diferenciación 30 (CD30), Cripto (TDGF-1), GCTM-2, Genesis, factor nuclear de células germinativas y factor de células madre (SCF o el ligando c-kit).
12. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicha célula madre pluripotente residual es una célula madre embrionaria y en donde dicho segundo marcador se selecciona de Oct-4 y Nanog.
13. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además determinar el número aproximado de células en la población de células o
en donde al menos 90 % de las células en dicha población de células se examinan bajo luz visible para detectar células que son positivas para dicho primer marcador, opcionalmente en donde cada célula que es positiva para dicho primer marcador se examina para determinar si esa célula es positiva para dicho segundo marcador o
en donde dicha población de células contiene al menos 105 células, al menos 106 células, al menos 107 células, al menos 108 células, al menos 109 células, al menos 1010 células, o entre 105 y 1010 células o
en donde dicha población de células diferenciadas se produce por diferenciación in vitro de células madre embrionarias.
14. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dichas condiciones que favorecen el crecimiento o el mantenimiento de dichas células madre pluripotentes comprenden cultivo en células nodriza, opcionalmente en donde dichas células nodriza son MEF.
15. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde dichas células madre pluripotentes son células madre embrionarias o células pluripotentes inducidas (iPS) y en donde dichas células diferenciadas son células del epitelio pigmentario de la retina (RPE).
16. El método in vitro de la reivindicación 15, en donde dichas células RPE se preparan por un método que comprende: (a) proporcionar células madre pluripotentes que son células madre pluripotentes inducidas (iPS) o células madre embrionarias (ES);
(b) cultivar las células madre pluripotentes para formar una población multicapa de células madre pluripotentes o cuerpos embrioides que comprenden células madre pluripotentes;
(c) cultivar la población multicapa o cuerpos embrioides durante una duración suficiente para que las células RPE aparezcan en el cultivo de células; y
(d) aislar las células RPE del cultivo,
opcionalmente en donde la duración de la etapa (c) es al menos aproximadamente 7-10 días o al menos aproximadamente 2 semanas o al menos aproximadamente 3 semanas o al menos aproximadamente 4 semanas o al menos aproximadamente 5 semanas o al menos aproximadamente 6 semanas, opcionalmente en donde el cultivo en las etapas (b) y (c) es sustancialmente sin células nodriza embrionarias (EF) de ratón y es sustancialmente sin células madre embrionarias humanas y comprende un medio de cultivo que no soporta el crecimiento o el mantenimiento de células madre pluripotentes indiferenciadas.
17. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde el método detecta células madre pluripotentes que están presentes en tan solo el 0,0008 % de la población de células diferenciadas.
18. El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -17, que comprende además sembrar una segunda población de células que comprende células madre pluripotentes y analizar la segunda población de células por el método de la reivindicación 1, estableciendo así el límite de detección de dicho método
opcionalmente en donde dicha segunda población de células consiste en o consiste esencialmente en células madre pluripotentes, u
opcionalmente en donde dicha segunda población de células comprende una mezcla de un primer grupo de células y un segundo grupo de células, en donde dicho primer grupo de células es células madre pluripotentes, opcionalmente en donde dicho segundo grupo de células tiene esencialmente la misma constitución que dicha población de células de la etapa (a) de la reivindicación 1,
y opcionalmente en donde la relación entre el número de células en dicho primer grupo de células y dicho segundo grupo de células se selecciona del grupo que consiste en: 1:10; 1:100; 1:1.000; 1:10.000; 1:100.000; 1:1.000.000; 1:10.000.000; 1:100.000.000; 1:1.000.000.000; entre 1:10 y 1:100; entre 1:10 y 1:1.000; entre 1:10 y 1:10.000; entre 1:10 y 1:100.000; entre 1:10 y 1:1 .000.000; entre 1:10 y 1:10.000.000; entre 1:10 y 1:100.000.000; entre 1:10 y 1:1.000.000.000; entre 1:100 y 1:1 .000; entre 1:100 y 1:10.000; entre 1:100 y 1:100.000; entre 1:100 y 1:1.000.000; entre 1:100 y 1:10.000.000; entre 1:100 y 1:100.000.000; entre 1:100 y 1:1.000.000.000; entre 1:1 .000 y 1:10.000; entre 1:1.000 y 1:100.000; entre 1:1.000 y 1:1.000.000; entre 1:1.000 y 1:10.000.000; entre 1:1.000 y 1:100.000.000; entre 1: 1 .000 y 1:1 .000.000.000; entre 1:10.000 y 1:100.000; entre 1:10.000 y 1:1.000.000; entre 1:10.000 y 1:10.000.000; entre 1:10.000 y 1:100.000.000; entre 1:10.000 y 1:1.000.000.000; entre 1:100.000 y 1:1.000.000; entre 1:100.000 y 1:10.000.000; entre 1:100.000 y 1:100.000.000; entre 1:100.000 y 1:1.000.000.000; entre 1:1 .000.000 y 1:10.000.000; entre 1:1.000.000 y 1:100.000.000; entre 1:1.000.000 y 1:1.000.000.000; entre 1:10.000.000 y 1:100.000.000; entre 1:10.000.000 y 1:1.000.000.000; y entre 1:100.000.000 y 1:1.000.000.000, y/o
opcionalmente en donde al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de las células madre pluripotentes en dicha segunda población de células se detecta como positivas para dicho primer marcador y dicho segundo marcador de células madre pluripotentes, opcionalmente en donde dichas células madre pluripotentes en dicha segunda población de células expresan un marcador adicional que identifica células madre pluripotentes o su descendencia.
19. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende además aplicar un tercer colorante a dicha población de células diferenciadas, en donde dicho tercer colorante detecta un tercer marcador cuya expresión es indicativa de la presencia de células madre pluripotentes, observar al microscopio las células de dicha población de células diferenciadas para detectar células que son positivas para dicho tercer marcador; e identificar células que son positivas para dicho primer marcador, dicho segundo marcador y dicho tercer marcador como células madre pluripotentes, opcionalmente en donde dicho tercer colorante se distingue visualmente de dicho primer colorante y de dicho segundo colorante y/u opcionalmente en donde dicho tercer colorante es detectable bajo luz visible o bajo luz ultravioleta.
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