JP2013535194A - 細胞の稀少なサブ集団を検出するための方法及び細胞の高度に精製された組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる2010年7月23日出願の米国特許仮出願61/367,038号(代理人整理番号75820.160001)及び2010年11月17日出願の米国特許仮出願61/414,770号(代理人整理番号75820.160002)の利益を請求する。
を含む細胞集団中の標的細胞の存在を検出する方法を提供する。
を含む細胞集団中のヒト胚性幹細胞の存在を検出する方法を提供する。
ヒト多能性幹細胞、例えば限定しないがヒト胚性幹(hES)細胞、ヒト誘導多能性幹(iPS)細胞、ヒト成人幹細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト胎児幹細胞、ヒト間葉幹細胞、ヒト分娩後幹細胞、ヒト複能性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞細胞であってよい。別の実施形態においては、多能性幹細胞はEuropean Human Embryonic Stem Cell Registry‐hESCregに列挙されているhES細胞系統であってよい。別の実施形態においては、hES細胞系統は割球誘導hES細胞系統、例えばMA09又は参照により各々の全体が本明細書に組み込まれる米国特許7,893,315又は7,838,727記載の方法により誘導される他の細胞系統であってよい。
幹細胞を検出する従来の方法は非幹細胞における幹細胞遺伝子のバックグラウンド発現のため、そして、試料調製の間の細胞の損失のために、限定された感度しか有していなかった。本開示は、これらの限界を克服することができ、そして細胞集団中の稀少な細胞型を検出するための高感度の方法を与える方法を提供する。これらの方法を使用すれば、オペレーターは時間当たり細胞1〜10百万個の桁数で検査することができ、そして細胞集団中の標的細胞型の個々の細胞を検出できる。例示される実施形態は更にスループットを向上させる場合がある自動化又は半自動化の様式において実施してよい。例えば、分化した細胞をES細胞から作製する場合、残留ES細胞が幾らかでも細胞集団中に残存しているかどうかを調べることが望ましく、そしてES細胞の比率が予め設定された何らかの閾値を超過していれば所定ロットの細胞を廃棄してよい。数時間の作業の負担のみにより分化した細胞の各ロットから数百万の代表的な細胞を検査でき、残留ES細胞の非存在の大きく向上した保証を与えることができる。
一次抗体又は一次抗体にカップリングした分子に結合する二次抗体を検出可能なマーカーにカップリングすることができる。間接的カップリングの使用は例えばバックグラウンド結合を低減すること、及び/又は、シグナル増幅をもたらすことにより、シグナル対ノイズ比を向上させることができる。
加齢性黄斑変性(AMD)患者における窩下脈絡膜新生血管形成(CNV)の除去後の自系RPE脈絡膜シートの移植が成功したことを記載しているが、この操作法は平均視力の中程度の上昇をもたらしたのみであった。
を含む。この方法は地域の施設、例えば病因、診療所、医院及び他の医療施設において実施してよい。更に、患者にマッチするとして選択されたRPE細胞は、少数の細胞として保存した場合には、患者への投与の前に増殖させてよい。
網膜電位図応答、オプトメーター明瞭度閾値、又は光度閾値を計測することにより治療の効力又は防止をモニタリングする工程を含んでよい。方法は又、細胞の免疫原性又は眼における細胞の遊走をモニタリングすることにより治療の効力又は防止をモニタリングすることを含んでよい。
ここで細胞は、本明細書に開示した方法により増殖させてよいRPE細胞のライブラリを含むその細胞のバンクから選択され、
ここで各RPE細胞調製物はヒト集団中に存在する少なくとも1つMHC対立遺伝子に関して半接合又はホモ接合であり、
そしてここで該RPE細胞バンクは、細胞のバンクの他のメンバーと相対比較してMHC対立遺伝子の異なるセットに関して各々半接合又はホモ接合である細胞を含む。上記した通り、RPE細胞を派生させるために使用される半接合又はホモ接合のMHC対立遺伝子幹細胞を発生させるために、遺伝子ターゲティング又はヘテロ接合性の損失を使用してよい。
(i)全ての3種の胚葉の細胞に分化する能力、(ii)少なくともOct−4及びアルカリホスファターゼの発現、及び(iii)免疫無防備状態の動物に移植された場合に奇形腫を生じさせる能力に基づいて識別されることができる。用語は又、胚の割球1つ以上から、好ましくは胚の残余を破壊することなく単離された細胞を包含する。用語は又、非胚性細胞をプロセスに使用する場合であっても体細胞核転移により生産される細胞を包含する。ES細胞は精子又はDNAによる卵細胞の受精、核転移、単為生殖によるか、又はHLA領域におけるホモ接合性を有するES細胞を発生させる手段により、派生させてよい。ES細胞は又、精子と卵細胞の融合、核転移、単為生殖、又はクロマチンのリプログラミング及びリプログラミングされたクロマチンのその後の原形質膜内への取り込みによる細胞の生産により生産された接合子、割球、又は胚盤胞期の哺乳類胚から派生させた細胞でもある。本発明のヒト胚性幹細胞はMA01、MA09、ACT−4、No.3、H1、H7、H9、H14及びACT30胚性幹細胞を包含するがこれらに限定されない。特定の実施形態においては、RPE細胞を生産するために使用するヒトES細胞はGMP基準に従って派生及び維持される。
(b)全3胚葉の細胞型(例えば外胚葉、中胚葉及び内肺葉の細胞型)に分化する能力を有し;そして(c)少なくとも1つの分子胚性幹細胞マーカーを発現する(例えばOct−4、アルカリホスファターゼ、SSEA3表面抗原、SSEA4表面抗原、NANOG、TRA160、TRA181、SOX2、REX1を発現する)細胞を指す。例示される多能性幹細胞は例えば当該分野で知られている方法を用いて形成でききる。例示される多能性幹細胞は胚盤胞期の胚のICMから派生させた胚性幹細胞、並びに分裂期又は桑実胚期の胚の割球1つ以上から派生させた胚性幹細胞(場合により胚の残余の破壊を伴わない)を包含する。そのような胚性幹細胞は受精によるか、又は、無性的な手段、例えば体細胞核転移(SCNT)、単為生殖及び雄性発生により生産された胚性の物質から発生させることができる。別の例示される多能性幹細胞は因子(本明細書においては、リプログラミング因子と称する)の組み合わせを発現させるか、又は発現を誘導することにより体細胞をリプログラミングすることにより発生させた誘導多能性幹細胞(iPS細胞)を包含する。iPS細胞は胎児、出生後、新生仔、幼若、又は成人の体細胞を用いて発生させてよい。特定の実施形態においては、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用できる因子は、例えばOct4(場合によりOct3/4と称する)、Sox2、c−Myc及びKlf4の組み合わせを包含する。他の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用できる因子は、例えばOct−4、Sox2、Nanog及びLin28の組み合わせを包含する。他の実施形態において、体細胞は少なくとも2つのリプログラミング因子、少なくとも3つのリプログラミング因子、又は4つのリプログラミング因子を発現させることによりリプログラミングされる。他の実施形態において、追加的なリプログラミング因子を発見し、そして単独又は1つ以上の知られたリプログラミング因子と組み合わせて使用することにより体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングする。iPS細胞は典型的には、胚性幹細胞と同じマーカーの発現により識別されることができるが、特定のiPS細胞系統はその発現プロファイルにおいて変動する場合がある。
短い培養期間の後であってもhES細胞の多能性状態を殆ど支援しないことが確認された。しかしながら、あらゆるOct−4陽性細胞は又、アルカリホスファターゼ及びGFPを発現し、従ってこのことにより本発明者等は、Oct−4発現はhES細胞を識別するために十分であると結論できた。
後に示すグラフにおけるゼロセット点として使用される100%hES細胞試料で観察される発現レベルに対して標準化した(RQ=相対的定量)。100%hES対照と比較した場合の未スパイク(0%hES)RPE試料に対するNanog(2.51log)、Oct−4(2.73log)及びSOX2(1.63log)の平均のダウンレギュレーションはこのロットに関する過去データと合致する。全てのhESマーカーのダウンレギュレーションは1%及び10%hES細胞でスパイクしたRPE細胞において劇的に低下した。
Claims (100)
- 下記工程:
(a)細胞集団を準備すること;
(b)第1の染色及び第2の染色を該細胞集団に適用すること、ここで該第1の染色は自身の発現が標的細胞の存在を示す第1のマーカーを検出し、そして該第2の染色は自身の発現がやはり同じ標的細胞の存在を示す第2のマーカーを検出し、そしてここで、該第1の染色は可視光下に検出可能であり、そして該第2の染色は紫外光下に検出可能であること;
(c)可視光下に該細胞集団を顕微鏡観察することにより該第1のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること;
(d)紫外光下に該第1のマーカーに関して陽性である該細胞を顕微鏡観察すること、及び、該検出された細胞の何れかが該第1のマーカー及び該第2のマーカーに関して陽性であるかどうか調べること;及び、
(e)該第1のマーカー及び該第1のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を標的細胞として識別すること;
を含む、細胞集団における標的細胞の存在を検出する、又は非存在を確認する方法。 - 下記工程:
(a)細胞集団を準備すること;
(b)第1の染色及び第2の染色を該細胞集団に適用すること、ここで 該第1の染色は自身の発現が標的細胞を示す第1のマーカーを検出し、そして第2の染色は自身の発現が同じ標的細胞を示す第2のマーカーを検出し、ここで該第1の染色は可視光下に検出可能であり、そして該第2の染色は可視光下に検出可能であり、そしてここで該第1の染色及び該第2の染色は目視により区別可能であること;
(c)可視光下に該細胞集団を顕微鏡観察することにより該第1のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること;
(d)可視光下に該細胞集団の細胞を顕微鏡観察することにより該第2のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること;そして、
(e)標的細胞として該第1のマーカー及び該第2のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を(c)及び(d)で検出された細胞から識別すること;
を含む、細胞集団における標的細胞の存在を検出するか、又は非存在を確認する方法。 - 細胞集団から検出された標的細胞を除去又は単離することを更に含む請求項1又は2記載の方法。
- 細胞集団が多能性細胞1つ以上に由来する請求項1又は2記載の方法。
- 多能性細胞1つ以上に由来する細胞集団複数に対して行う請求項1又は2記載の方法。
- 該細胞集団が異なるHLA型の多能性細胞に由来する請求項5記載の方法。
- 該第1の染色が可視光下及び紫外光下に観察可能である請求項1又は2記載の方法。
- 該第1のマーカーが該標的細胞により発現されるアルカリホスファターゼを含む請求項1〜7の何れかに記載の方法。
- 該第1の染色が該第1のマーカーに特異的に結合する抗体を含み、そして該抗体がアルカリホスファターゼに直接又は間接的にカップリングする請求項1〜7の何れかに記載の方法。
- 該第1の染色がナフトールAS−BIホスフェート;5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート(BCIP)及びニトロブルーテトラゾリウム(NBT);BCIP試薬及びINTX試薬;ナフトールAS−BI及びファーストレッドバイオレットLB;テトラゾリウム塩;ジアゾ化合物;VECTOR(登録商標)Red;VECTOR(登録商標)Blue;VECTOR(登録商標)Black;及びp−ニトロフェニルホスフェート(pNPP)よりなる群から選択されるアルカリホスファターゼ基質を含む請求項8又は9の何れかに記載の方法。
- 該第1の染色がベクターレッド又はベクターブルーを含む請求項10記載の方法。
- 該第2の染色が該第2のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が蛍光標識に直接又は間接的にカップリングされる請求項1又は7〜11の何れかに記載の方法。
- 該第2のマーカーがアルカリホスファターゼ、Oct−4、Nanog、期特異的胚性抗原−3(SSEA−3)、期特異的胚性抗原−4(SSEA−4)、TRA−1−60、TRA−1−81、TRA−2−49/6E、Sox2、Lin28、成長分化因子3(GDF3)、低下発現1(REX1)、線維芽細胞成長因子4(FGF4)、胚細胞特異的遺伝子1(ESG1)、発生多能性関連2(DPPA2)、DPPA4、テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、SALL4、E−CADHERIN、クラスター指定30(CD30)、Cripto(TDGF−1)、GCTM−2、Genesis、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子(SCF又はc−Kitリガンド)よりなる群から選択される請求項12記載の方法。
- 該標的細胞が胚性幹細胞である請求項13記載の方法。
- 該第2のマーカーがOct−4及びNanogよりなる群から選択される請求項14記載の方法。
- 該一次抗体が蛍光標識を含む請求項12〜15の何れかに記載の方法。
- 該第2の染色が更に二次抗体を含む請求項12〜15の何れかに記載の方法。
- 該二次抗体が蛍光標識を含む請求項17記載の方法。
- 該蛍光標識がAlexa Fluor350、Alexa Fluor405、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor514、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor610、Alexa Fluor633、Alexa Fluor635、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750及びAlexa Fluor790、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、テキサスレッド、SYBRグリーン、DyLightFluors、緑色蛍光蛋白(GFP)、TRIT(テトラメチルローダミンイソチオール)、NBD(7−ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジアゾール)、テキサスレッド染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレジルファーストバイオレット、クレジルブルーバイオレット、ブリリアントクレジルブルー、p−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、5−カルボキシ−4',5'−ジクロロ−2',7'−ジメトキシフルオレセイン、TET(6−カルボキシ−2',4,7,7'−テトラクロロフルオレセイン)、HEX(6−カルボキシ−2',4,4',5',7,7'−ヘキサクロロフルオレセイン)、Joe(6−カルボキシ−4',5'−ジクロロ−2',7'−ジメトキシフルオレセイン)、5−カルボキシ−2',4',5',7'−テトラクロロフルオレセイン、5−カルボキシフルオレセイン、5−カルボキシローダミン、Tamra(テトラメチルローダミン)、6−カルボキシローダミン、Rox(カルボキシ−X−ローダミン)、R6G(ローダミン6G)、フタロシアニン類、アゾメチン類、シアニン類(例えばCy3、Cy3.5、Cy5)、キサンチン類、スクシニルフルオレセイン類、N,N−ジエチル−4−(5'−アゾベンゾトリアゾリル)−フェニルアミン、アミノアクリジン及び量子ドットよりなる群から選択される請求項16又は18記載の方法。
- 該蛍光標識がAlexa Fluor488を含む請求項19記載の方法。
- 該第2の染色が該第2のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が可視光下に観察可能な試薬に直接又は間接的にカップリングする請求項2〜11の何れかに記載の方法。
- 可視光下に観察可能な該試薬が金粒子、銀粒子、又はラテックス粒子を含む請求項21記載の方法。
- 該第2の染色が該第2のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が可視光下に観察可能な生成物を生成する反応を触媒する酵素に直接又は間接的にカップリングする請求項2〜11の何れかに記載の方法。
- 該酵素がアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、及びパーオキシダーゼよりなる群から選択される請求項23記載の方法。
- 該パーオキシダーゼがセイヨウワサビパーオキシダーゼを含む請求項24記載の方法。
- 該パーオキシダーゼを3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB);3,3’−ジアミノベンジジン(DAB);3−アミノ−9−エチルカルバゾール(AEC);4−クロロ−1−ナフトール;2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS);2,3,5−トリフェニルテトラゾリウムクロリド;2−クロロ−5,5−ジメチル−1,3−シクロヘキサンジオン;3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン;3,3′−ジアミノベンジジンテトラクロリド;3−ニトロテトラゾリウムブルークロリド;4−アミノフタルヒドラジド;4−クロロ−1−ナフトール;4−クロロ−7−ニトロベンゾフラザン;5−アミノサリチル酸;2塩酸ジカルボキシジン;グアイアコール;過酸化水素−尿素付加物;ヨードニトロテトラゾリウムクロリド;ルミノール;MTTホルマザン;N−(4−アミノブチル)−N−エチルイソルミノール;N−(6−アミノヘキシル)−N−エチルイソルミノール;ニトロテトラゾリウムブルークロリド;ピロガロール;テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド;テトラゾリウムブルークロリド指示薬;テトラゾリウムバイオレット;o−ジアニシジン;o−ジアニシジン2塩酸塩;o−フェニレンジアミン2塩酸塩;o−フェニレンジアミン遊離塩基;及びトランス−5−フェニル−4−ペンテニルヒドロパーオキシドよりなる群から選択されるパーオキシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項23又は24記載の方法。
- 該酵素がベータガラクトシダーゼを含む請求項24記載の方法。
- 該ベータガラクトシダーゼを、1−メチル−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド;2−ニトロフェニルβ−D−ガラクトピラノシド;4−メチルウンベリフェリルβ−D−ガラクトピラノシド;4−ニトロフェニルβ−D−ガラクトピラノシド;5−ブロモ−3−インドリルβ−D−ガラクトピラノシド;5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−D−ガラクトピラノシド;5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド;6−ブロモ−2−ナフチルβ−D−ガラクトピラノシド;6−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド;フルオレセインジ(β−D−ガラクトピラノシド);及びレゾルフィンβ−D−ガラクトピラノシドよりなる群から選択されるベータガラクトシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項27記載の方法。
- 該第2の染色が該第2のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、 該一次抗体が金粒子に直接又は間接的にカップリングし、そして該方法が更に該金粒子上に銀沈殿を形成することを含む請求項2〜11の何れかに記載の方法。
- 該第2のマーカーがアルカリホスファターゼ、Oct−4、Nanog、期特異的胚性抗原−3(SSEA−3)、期特異的胚性抗原−4(SSEA−4)、TRA−1−60、TRA−1−81、TRA−2−49/6E、Sox2、成長分化因子3(GDF3)、低下発現1(REX1)、線維芽細胞成長因子4(FGF4)、胚細胞特異的遺伝子1(ESG1)、発生多能性関連2(DPPA2)、DPPA4、テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、SALL4、E−CADHERIN、クラスター指定30(CD30)、Cripto(TDGF−1)、GCTM−2、Genesis、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子(SCF又はc−Kitリガンド)よりなる群から選択される請求項21〜29の何れかに記載の方法。
- 該標的細胞が胚性幹細胞である請求項30記載の方法。
- 該第2のマーカーがOct−4及びNanogよりなる群から選択される請求項31記載の方法。
- 該第1の染色が該第2のマーカーに特異的に結合する第1の一次抗体を含み、該第1の一次抗体が可視光下に観察可能な第1の試薬に直接又は間接的にカップリングする請求項1〜2又は12〜32の何れかに記載の方法。
- 可視光下に観察可能な該第1の試薬が金粒子、銀粒子、又はラテックス粒子を含む請求項33記載の方法。
- 該第1の染色が該第1のマーカーに特異的に結合する第1の一次抗体を含み、該第1の一次抗体が可視光下に観察可能な生成物を生成する反応を触媒する第1の酵素に直接又は間接的にカップリングする請求項1〜2又は12〜32の何れかに記載の方法。
- 該第1の酵素がアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ及びパーオキシダーゼよりなる群から選択される請求項35記載の方法。
- 該第1の酵素がカップリングする該パーオキシダーゼがセイヨウワサビパーオキシダーゼを含む請求項36記載の方法。
- 該第1の酵素がカップリングする該パーオキシダーゼを3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB);3,3’−ジアミノベンジジン(DAB);3−アミノ−9−エチルカルバゾール(AEC);4−クロロ−1−ナフトール;2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS);2,3,5−トリフェニルテトラゾリウムクロリド;2−クロロ−5,5−ジメチル−1,3−シクロヘキサンジオン;3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン;3,3′−ジアミノベンジジンテトラクロリド;3−ニトロテトラゾリウムブルークロリド;4−アミノフタルヒドラジド;4−クロロ−1−ナフトール;4−クロロ−7−ニトロベンゾフラザン;5−アミノサリチル酸;2塩酸ジカルボキシジン;グアイアコール;過酸化水素−尿素付加物;ヨードニトロテトラゾリウムクロリド;ルミノール;MTTホルマザン;N−(4−アミノブチル)−N−エチルイソルミノール;N−(6−アミノヘキシル)−N−エチルイソルミノール;ニトロテトラゾリウムブルークロリド;ピロガロール;テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド;テトラゾリウムブルークロリド指示薬;テトラゾリウムバイオレット;o−ジアニシジン;o−ジアニシジン2塩酸塩;o−フェニレンジアミン2塩酸塩;o−フェニレンジアミン遊離塩基;及びトランス−5−フェニル−4−ペンテニルヒドロパーオキシドよりなる群から選択されるパーオキシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項36又は37記載の方法。
- 該第1の酵素がベータガラクトシダーゼを含む請求項35記載の方法。
- 該第1の酵素がカップリングする該ベータガラクトシダーゼを1−メチル−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド;2−ニトロフェニルβ−D−ガラクトピラノシド;4−メチルウンベリフェリルβ−D−ガラクトピラノシド;4−ニトロフェニルβ−D−ガラクトピラノシド;5−ブロモ−3−インドリルβ−D−ガラクトピラノシド;5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−D−ガラクトピラノシド;5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド;6−ブロモ−2−ナフチルβ−D−ガラクトピラノシド;6−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド;フルオレセインジ(β−D−ガラクトピラノシド);及びレゾルフィンβ−D−ガラクトピラノシドよりなる群から選択されるベータガラクトシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項27記載の方法。
- 該第1の染色が該第1のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、該一次抗体が金粒子に直接又は間接的にカップリングし、 そして該方法が更に該金粒子上に銀沈殿を形成することを含む請求項1〜2又は12〜32の何れかに記載の方法。
- 第1のマーカーが、アルカリホスファターゼ、Oct−4、Nanog、期特異的胚性抗原−3(SSEA−3)、期特異的胚性抗原−4(SSEA−4)、TRA−1−60、TRA−1−81、TRA−2−49/6E、Sox2、成長分化因子3(GDF3)、低下発現1(REX1)、線維芽細胞成長因子4(FGF4)、胚細胞特異的遺伝子1(ESG1)、発生多能性関連2(DPPA2)、DPPA4、テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、SALL4、E−CADHERIN、クラスター指定30(CD30)、Cripto(TDGF−1)、GCTM−2、Genesis、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子(SCF又はc−Kitリガンド)よりなる群から選択される請求項33〜41の何れかに記載の方法。
- 該標的細胞が胚性幹細胞である請求項42記載の方法。
- 該第2のマーカーがOct−4、Oct−4、Lin28、Sox2、Klf4、n−又はc−Myc及びNanogよりなる群から選択される請求項43記載の方法。
- 該第1のマーカーが該第2のマーカーとは異なる請求項42〜44の何れかに記載の方法。
- 該標的細胞が胚性幹細胞であり、そして該第2のマーカーがアルカリホスファターゼ、Oct−4、Nanog、期特異的胚性抗原−3(SSEA−3)、期特異的胚性抗原−4(SSEA−4)、TRA−1−60、TRA−1−81、TRA−2−49/6E、Sox2、成長分化因子3(GDF3)、低下発現1(REX1)、線維芽細胞成長因子4(FGF4)、胚細胞特異的遺伝子1(ESG1)、発生多能性関連2(DPPA2)、DPPA4、テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、SALL4、E−CADHERIN、クラスター指定30(CD30)、Cripto(TDGF−1)、GCTM−2、Genesis、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子(SCF又はc−Kitリガンド)よりなる群から選択される上記請求項の何れかに記載の方法。
- 該細胞集団がレイヨウ、ウシ、ラクダ、ネコ、マメジカ(ネズミジカ)、 チンパンジー、乳牛、シカ、イヌ、キリン、ヤギ、モルモット、ハムスター、カバ、ウマ、ヒト、マウス、非ヒト霊長類、ヒツジ類、イノシシ、ブタ、プロングホーン、ウサギ、ラット、マカク、サイ,ヒツジ、バク、及び有蹄類よりなる群から選択される種の細胞を含む上記請求項の何れかに記載の方法。
- 該細胞集団がヒト細胞を含む請求項47記載の方法。
- 細胞集団中の細胞の概数を測定することを更に含む上記請求項の何れかに記載の方法。
- 該細胞集団中の細胞の少なくとも90%を可視光下に検査することにより該第1のマーカーに関して陽性である細胞を検出する上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 該第1のマーカーに関して陽性である各細胞を、その細胞が該第2のマーカーに関して陽性であるかどうかを調べるために検査する請求項50記載の方法。
- 該細胞集団が少なくとも105個の細胞、少なくとも106個の細胞、少なくとも107個の細胞、少なくとも108個の細胞、少なくとも109個の細胞、少なくとも1010個の細胞、又は105〜1010個の細胞を含有する上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 該第1のマーカー及び該第2のマーカーが胚性幹細胞マーカーである上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 細胞の該集団が胚性幹細胞のインビボ又はインビトロの分化により生産される上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 該標的細胞が多能性細胞、胚性幹細胞、又は誘導多能性(iPS)細胞である上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 該細胞集団が多能性細胞、胚性幹細胞、又は誘導多能性(iPS)細胞から分化した細胞を更に含む請求項55の方法。
- 該細胞集団を標的細胞型の増殖又は維持に好都合な条件下に培養する上記請求項の何れかに記載の方法。
- 該標的細胞型が胚性幹細胞である請求項57記載の方法。
- 該培養条件がフィーダー細胞上で該細胞集団を培養することを含む請求項58記載の方法。
- 該フィーダー細胞がMEFである請求項59記載の方法。
- 胚性幹細胞又はiPS細胞から分化した該細胞が網膜色素上皮(RPE)細胞である請求項56〜60の何れかに記載の方法。
- 該RPE細胞がヒトのものである請求項61記載の細胞。
- 該RPE細胞が下記工程:
(a)多能性幹細胞を準備すること;
(b)多能性幹細胞を培養することにより多能性幹細胞の多層集団又は多能性幹細胞を含む胚様体を形成すること;
(c)細胞培養物中にRPE細胞が出現するために十分な期間、多層集団又は胚様体を培養すること;及び、
(d)培養物からRPE細胞を単離すること;
を含む方法により作製される請求項61又は62記載の方法。 - 該多能性幹細胞が誘導多能性幹(iPS)細胞、胚性幹(ES)細胞、成人幹細胞、造血幹細胞、胎児幹細胞、間葉性幹細胞、分娩後幹細胞、複能性幹細胞、又は胚性生殖細胞である請求項63記載の方法。
- 多能性幹細胞がヒトES細胞又はヒトiPS細胞である請求項63記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約7〜10日間である請求項63〜65の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約2週間である請求項63〜65の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約3週間である請求項63〜65の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約4週間である請求項63〜65の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約5週間である請求項63〜65の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約6週間である請求項63〜65の何れか一項に記載の方法。
- 該RPE細胞培養物がマウス胚性フィーダー細胞(MEF)及びヒト胚性幹細胞(hES)を実質的に含有しない請求項61〜71の何れか一項に記載の方法。
- RPE細胞のリッチ化された培養物を増殖させるために使用される培地が未分化の多能性幹細胞の増殖又は維持を支援しない請求項61〜72の何れか一項に記載の方法。
- 標的細胞が脂肪細胞;骨髄線維芽細胞;心筋細胞;軟骨細胞;分化RBC及びWBC直系;内皮骨髄線維芽細胞;外胚葉;外胚葉前駆体;胚様体(EB);胎生期癌(EC);胚性幹(ES);内胚葉;内皮;造血細胞;造血幹細胞(HSC)、付随体、内皮前駆体;肝細胞;ケラチノサイト;間葉;間葉性幹細胞(MSC);中胚葉;MSC前駆体;筋芽細胞;筋細胞;神経前駆体;神経幹細胞;ニューロン;稀突起神経膠細胞;骨芽細胞;膵上皮;膵島;膵前駆体;骨格筋細胞;平滑筋;間質性(間葉)前駆細胞;及び白血球(WBC)よりなる群から選択される請求項1〜74の何れか一項に記載の方法。
- 第1のマーカー及び第2のマーカーが表1に記載するとおり上記標的細胞と関連しているマーカーである請求項71記載の方法。
- 工程(a)の前に、標的細胞型のメンテナンス細胞に好都合な条件下に細胞集団を培養することを更に含む上記請求項の何れかに記載の方法。
- 標的細胞が胚性幹細胞又は誘導多能性(iPS)細胞である請求項76記載の方法。
- 該培養条件が胚性幹細胞培地及びマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞の存在を含む請求項77記載の方法。
- 標的細胞型を含む第2の細胞集団をプレーティングすること、及び、工程(a)の該細胞集団と同じ方法により該第2の細胞集団を分析することにより該方法の検出限界を明確化することを更に含む上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 該第2の細胞集団が該標的細胞型よりなるか、本質的にこれよりなる請求項79記載の方法。
- 該第2の細胞集団が細胞の第1の群及び細胞の第2の群の混合物を含み、細胞の該第1の群が標的細胞型と同じ型のものである請求項79記載の方法。
- 細胞の該第2の群が工程(a)の該細胞集団と本質的に同じコンスティテュエンシーを有する請求項81記載の方法。
- 細胞の該第1の群及び細胞の該第2の群における細胞の数の比が1:10;1:100;1:1,000;1:10,000;1:100,000;1:1,000,000;1:10,000,000;1:100,000,000;1:1,000,000,000;1:10と1:100との間;1:10と1:1,000との間;1:10と1:10,000との間;1:10と1:100,000との間;1:10と1:1,000,000との間;1:10と1:10,000,000との間;1:10と1:100,000,000との間;1:10と1:1,000,000,000との間;1:100と1:1,000との間;1:100と1:10,000との間;1:100と1:100,000との間;1:100と1:1,000,000との間;1:100と1:10,000,000との間;1:100と1:100,000,000との間;1:100と1:1,000,000,000との間;1:1,000と1:10,000との間;1:1,000と1:100,000との間;1:1,000と1:1,000,000との間;1:1,000と1:10,000,000との間;1:1,000と1:100,000,000との間;1:1,000と1:1,000,000,000との間;1:10,000と1:100,000との間;1:10,000と1:1,000,000との間;1:10,000と1:10,000,000との間;1:10,000と1:100,000,000との間;1:10,000と1:1,000,000,000との間;1:100,000と1:1,000,000との間;1:100,000と1:10,000,000との間;1:100,000と1:100,000,000との間;1:100,000と1:1,000,000,000との間;1:1,000,000と1:10,000,000との間;1:1,000,000と1:100,000,000との間;1:1,000,000と1:1,000,000,000との間;1:10,000,000と1:100,000,000との間;1:10,000,000と1:1,000,000,000との間;及び1:100,000,000と1:1,000,000,000との間よりなる群から選択される請求項81又は82記載の方法。
- 該第2の細胞集団中の標的細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%が標的細胞の該第1のマーカー及び該第2のマーカーに関して陽性として検出される請求項79〜83の何れか一項に記載の方法。
- 工程(a)の該細胞集団と同じ培養条件と期間の下に標的細胞型の第3の細胞集団をプレーティングすること、及び、該第3の細胞集団中の標的細胞型の細胞を検出及び計数することにより、該培養条件下に標的細胞の該第1及び第2のマーカーの発現を維持する標的細胞型の細胞の比率を測定することを更に含む請求項79〜84の何れか一項に記載の方法。
- 該第2の細胞集団における標的細胞型の細胞の予測される数を測定するため補正計数として該培養条件下に維持される標的細胞型の細胞の該集団を用いながら該第2の細胞集団を用いて測定される方法の検出限界を計算する請求項85記載の方法。
- 該第2の細胞集団中及び/又は該第3の細胞集団中の該標的細胞が標的細胞又はそれらの子孫を識別する別のマーカーを発現する請求項79〜86の何れか一項に記載の方法。
- 該別のマーカーがGFP又は細胞により発現される別の蛍光蛋白を含む請求項87記載の方法。
- 標的細胞がウィルス感染細胞、癌性又は前癌性の細胞、癌幹細胞及び免疫細胞から選択される上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 標的細胞を含有すると推定される組成物が骨髄、血球、又は膵細胞である請求項89記載の方法。
- 標的細胞を含有すると推定される細胞集団が、細胞ソーティング、放射線照射、化学療法又は標的細胞を除去するための他の手段により予め処理されている請求項89記載の方法。
- 幹細胞を本質的に含有しない該幹細胞に由来する体細胞を含む組成物。
- 細胞及び存在する幹細胞の数又は割合を示すインジケーターを含む組成物であって、該組成物中の細胞の代表となる細胞集団に適用される上記請求項の何れかに記載の方法を用いて該インジケーターの値を測定する上記組成物。
- 少なくとも105個の細胞、少なくとも106個の細胞、少なくとも107個の細胞、少なくとも108個の細胞、少なくとも109個の細胞、少なくとも1010個の細胞、又は105と1010個の間の細胞を含む請求項93記載の組成物。
- 低温保存された細胞を含む請求項92〜94の何れかに記載の組成物。
- 下記工程:
(a) 細胞集団を準備すること;
(b) 第1の染色及び第2の染色を該細胞集団に適用すること、ここで該第1の染色はアルカリホスファターゼを検出し、そして該第2の染色は胚性幹細胞を示すマーカーを検出し、そして該第1の染色に関して陽性である細胞は可視及び紫外光下に検出可能であり、そして該第2の染色に関して陽性である細胞は紫外光下に検出可能であること;
(c) 該第1のマーカーに関して陽性である細胞を検出するために可視光下に該細胞集団の細胞を顕微鏡観察すること;
(e) 紫外光下に該第1のマーカーに関して陽性である該細胞を顕微鏡観察すること、及び、細胞が該第1のマーカー及び該第2のマーカーに関して陽性であるかどうか測定すること;及び、
(f) 該第1のマーカー及び該第2のマーカーに関して陽性である細胞を胚性幹細胞として識別すること;
を含む細胞集団中のヒト胚性幹細胞の存在を検出する方法。 - フィーダー細胞上のhES細胞培地中に細胞集団をプレーティングすること、hES細胞を示すマーカーを検出する染色を適用すること、及び該マーカーに関して陽性である細胞を識別することを含む、細胞集団中のヒト胚性幹(hES)細胞の存在を検出する方法。
- 該細胞集団に第3の染色を適用すること、ここで該第3の染色は自身の発現が標的細胞の存在を示す第3のマーカーを検出すること;該細胞集団の細胞を顕微鏡観察することにより該第3のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること;及び該第1のマーカー、該第2のマーカー及び該第3のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を標的細胞として識別することを更に含む何れかの上記請求項に記載の方法。
- 該第3の染色が該第1の染色から、及び該第2の染色から目視により区別可能である請求項98記載の方法。
- 該第3の染色が可視光下又は紫外光下に検出可能である請求項98又は99記載の方法。
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