JP2022095696A - 細胞の稀少なサブ集団を検出するための方法及び細胞の高度に精製された組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる2010年7月23日出願の米国特許仮出願61/367,038号(代理人整理番号75820.160001)及び2010年11月17日出願の米国特許仮出願61/414,770号(代理人整理番号75820.160002)の利益を請求する。
試験を必要とすると考えられる。誘導性自殺遺伝子は腫瘍又は奇形腫が生じ始めた後に治療の選択肢を与えるかもしれないとしても、腫瘍又は奇形腫の形成を完全に回避することが明らかに好ましい。更に又、細胞は、例えば自殺遺伝子を無効化し、細胞が潜在的に有害であり続けることができるようにする自殺遺伝子の突然変異又は消失により、自殺遺伝子の誘導に対して耐性となる。即ち、細胞集団中の幹細胞を直接検出する方法は又、未分化の幹細胞がせいぜい極めて低濃度で存在するか、好ましくは完全に非存在であることの保証を与えることが望まれる。
を含む細胞集団中の標的細胞の存在を検出する方法を提供する。
;N-(6-アミノヘキシル)-N-エチルイソルミノール;ニトロテトラゾリウムブルークロリド;ピロガロール;テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド;テトラゾリウムブルークロリド指示薬;テトラゾリウムバイオレット;o-ジアニシジン;o-ジアニシジン2塩酸塩;o-フェニレンジアミン2塩酸塩;o-フェニレンジアミン遊離塩基;及びトランス-5-フェニル-4-ペンテニルヒドロパーオキシドよりなる群から選択されるパーオキシダーゼ基質を含んでよい。
、クレジルファーストバイオレット、クレジルブルーバイオレット、ブリリアントクレジルブルー、p-アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、5-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、TET(6-カルボキシ-2',4,7,7'-テトラクロロフルオレセイン)、HEX(6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン)、Joe(6-カルボキシ-4',5'-
ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン)、5-カルボキシ-2',4',5',7'-
テトラクロロフルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン、5-カルボキシローダミン、Tamra(テトラメチルローダミン)、6-カルボキシローダミン、Rox(カルボキシ-X-ローダミン)、R6G(ローダミン6G)、フタロシアニン類、アゾメチン類、シアニン類(例えばCy3、Cy3.5、Cy5)、キサンチン類、スクシニルフルオレセイン類、N,N-ジエチル-4-(5'-アゾベンゾトリアゾリル)-フェニルアミン、アミノアクリジン及び量子ドットよりなる群から選択してよい。
細胞集団に本明細書に記載した方法を適用することにより該インジケーターの値を測定してよい。組成物は胚性幹細胞、iPS細胞、割球、内細胞塊、又は単為生殖的に活性化されてよい卵母細胞のような多能性幹細胞から分化したものであってよいRPE細胞を含んでよい。これらの多能性幹細胞は組み換え体又は遺伝子操作されてよい(例えば所望の治療蛋白を発現するため、又は黄斑変性のような遺伝子的不全に関与している遺伝子の発現を排除するために操作される)。RPE細胞は網膜の変性疾患を治療するために製剤化して使用してよい。更に又、多能性幹細胞誘導RPE細胞はRPE細胞の生存(インビトロ及び/又はインビボ)をモジュレートする剤を発見するため、RPE細胞の成熟を研究するため、又は、RPE細胞の成熟をモジュレートする剤を発見するためのスクリーニングアッセイにおいて使用できる。そのようなスクリーニングアッセイを使用して発見された材はインビトロ又はインビボで使用してよく、そして、網膜変性疾患を治療するために単独又はRPE細胞と組み合わせて使用できる追加的治療薬を提供してよい。1つの実施形態において、組成物はヒト多能性幹細胞から分化したヒトRPE細胞の実質的に精製された調製物を含んでよく、その場合、RPE細胞はmRNA及び蛋白レベルにおいて、RPE-65、ベストロフィン、PEDF、CRALBP、Otx2及びMITFを発現し、そして、細胞はOct-4、NANOG及びRex1の発現を実質的に欠失している。別の実施形態においては、RPE細胞は分化RPE細胞及び成熟分化RPE細胞を含み、そしてその場合、少なくとも成熟分化RPE細胞は更に、mRNA及び蛋白レベルにおいて、PAX2、pax-6及びチロシナーゼを発現する。別の実施形態においては、RPE細胞はヒトES細胞又はヒトiPS細胞から分化させる。
こと;及び、
を含む細胞集団中のヒト胚性幹細胞の存在を検出する方法を提供する。
ヒト多能性幹細胞、例えば限定しないがヒト胚性幹(hES)細胞、ヒト誘導多能性幹(iPS)細胞、ヒト成人幹細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト胎児幹細胞、ヒト間葉幹細胞、ヒト分娩後幹細胞、ヒト複能性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞細胞であってよい。別の実施形態においては、多能性幹細胞はEuropean Human Embryonic Stem Cell Registry‐hESCregに列挙されているhES細胞系統であってよい。別の実施形態においては、hES細胞系統は割球誘導hES細胞系統、例えばMA09又は参照により各々の全体が本明細書に組み込まれる米国特許7,893,315又は7,838,727記載の方法により誘導される他の細胞系統であってよい。
る機能性RPE細胞である。その他の実施形態において、RPE細胞は移植後の視覚的明瞭度を向上させる。
れらに限定されない胚性幹細胞マーカーの実質的な発現を欠失している。別の実施形態においては、RPE細胞はRPE65、CRALBP、PEDF、ベストロフィン、MITF、Otx2、PAX2、Pax 6及びチロシナーゼを包含するがこれらに限定されないRPE細胞マーカーを発現する。その他の実施形態において、RPE細胞は少なくとも1つの遺伝子を発現し、その場合少なくとも1つ遺伝子の発現はヒトES細胞における発現と相対比較してRPE細胞中で増大する。1つの実施形態において、RPE細胞は増大したアルファインテグリンサブユニット発現を示す。別の実施形態においては、アルファインテグリンサブユニットはアルファ1、2、3、4、5、6又は9である。更に別の実施形態において、発現はmRNA発現、蛋白発現、又はmRNAと蛋白の両方の発現である。
幹細胞を検出する従来の方法は非幹細胞における幹細胞遺伝子のバックグラウンド発現のため、そして、試料調製の間の細胞の損失のために、限定された感度しか有していなかった。本開示は、これらの限界を克服することができ、そして細胞集団中の稀少な細胞型を検出するための高感度の方法を与える方法を提供する。これらの方法を使用すれば、オペレーターは時間当たり細胞1~10百万個の桁数で検査することができ、そして細胞集団中の標的細胞型の個々の細胞を検出できる。例示される実施形態は更にスループットを向上させる場合がある自動化又は半自動化の様式において実施してよい。例えば、分化した細胞をES細胞から作製する場合、残留ES細胞が幾らかでも細胞集団中に残存しているかどうかを調べることが望ましく、そしてES細胞の比率が予め設定された何らかの閾値を超過していれば所定ロットの細胞を廃棄してよい。数時間の作業の負担のみにより分化した細胞の各ロットから数百万の代表的な細胞を検査でき、残留ES細胞の非存在の大きく向上した保証を与えることができる。
するため、未染色の細胞が目視可能であり、そして焦点面を必要に応じて調節することにより、プレーティングされた細胞を視野に渡って移動させる際に細胞が焦点内に残存できるようにする。可視光の使用は又、紫外光下に起こりえる光脱色を防止する。可視光下のスキャンは又、比較的低倍率で実施でき、これにより各顕微鏡視野中に観察される細胞数を増大でき、そしてスループットを上昇できる。次に第1のマーカーに関して陽性である細胞を紫外光下に検査することにより、これらの細胞が第2のマーカーも発現するかどうか調べる。マーカーの選択は多能性細胞におけるそれらの知られた発現に基づいてよく:例えばアルカリホスファターゼ(これは可視光でプレート全体を「スキャン」するために使用されるマーカーとしてES細胞と共に使用してよい)はES細胞中、それらが分化を開始する時に他のマーカーよりも長く在留することが知られている。即ち、細胞がアルカリホスファターゼに関して陽性である場合、それは第2のマーカーに関して陽性又は陰性である場合があり、そしてそのため、第1及び第2のマーカーに関して陽性である細胞はhES細胞であると考えられる。好ましくは(hES細胞に関してAP及びOct-4の場合と同様)第1のマーカーは標的細胞を頑健に染色する(それが他の細胞も同様に染色する可能性があるとしても)ことにより第2のマーカーに関して陽性である可能性があるが、第1のマーカーの発現は低いか検出不可能である細胞を観察する機会を逃すことを回避する。典型的には、写真の比較により重複視野中で観察される細胞の二重計上を回避できるように陽性細胞を写真撮影する。プレーティングされた細胞の総数は、1つ以上の代表的な顕微鏡視野の各々における全ての細胞を計数すること、及び、計数した総プレーティング面積の割合で計数した細胞数を割ることにより、求められる。最終的に、検出された標的細胞の数は検査した細胞の総数の比率として表示される。
、又は当該分野で知られた他の方法により有糸分裂的に不活性化されていてよいフィーダー細胞上、又はフィーダー細胞によりコンディショニングされた培地中にプレーティングすることを包含する。多くの適当なフィーダー細胞型が当該分野で知られており、例えば一次線維芽細胞培養物、例えばネズミ胚性線維芽細胞(MEF)、ヒト成人皮膚線維芽細胞、STO細胞、その他が包含される。ES細胞のフィーダーフリーの維持のための培養条件は当該分野で知られており、そして、マトリゲル、ラミニン、副腎皮質刺激ホルモン、コンディショニング培地、又は何れかのこれらの組み合わせを包含してよい。フィーダーフリー培地を包含する例示されるES細胞の培地は参照により各々の全体が本明細書に組み込まれるCarpenter等、Dev Dyn. 2004 Feb;229(2):243-58; Xu等、Nat Biotechnol. 2001Oct;19(10):971-4; Rosler等、Dev Dyn. 2004 Feb;229(2):259-74; and Amit等、BiolReprod.2004 Mar;70(3):837-45;WO01/51616;米国特許6,800,480
;米国特許出願公開2009/0275128;米国特許出願公開2008/0064099;及び米国特許出願公開2007/0160974に記載されている。
イの感度)の保持はRPE細胞培養条件(MEFの非存在、及びhES細胞が分化する培地)よりは寧ろhES細胞培養条件(hES細胞培地上の培養)を使用することにより、大きく向上することを明らかにしている。
ンドリルホスフェート(BCIP)及びニトロブルーテトラゾリウム(NBT/チアゾリルブルー/ニトロBT)(例えばアルカリホスファターゼブルーマイクロウエル基質(SIGMA-ALDRICH(登録商標)));BCIP試薬及びINTX試薬(SIGM
A-ALDRICH(登録商標));ナフトールAS-BI及びファーストレッドバイオレットLB(例えば白血球アルカリホスファターゼキット(SIGMA-ALDRICH(登録商標)が包含され;沈殿を形成する基質はテトラゾリウム塩の還元又は着色されたジアゾ化合物の生成の何れかに基づいている(例えばVECTOR(登録商標)Red、VECTOR(登録商標)Blue、Vector(登録商標)Black、p-ニトロフェニルホスフェート、BCIP/NBTAP基質キット、及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム)。場合により、アルカリホスファターゼ阻害剤、例えばレバミソール((S)-6-フェニル-2,3,5,6-テトラヒドロイミダゾ[2,1-b][1,3]チアゾール)又は熱処理を使用することにより望ましくないバックグラウンドのアルカリホスファターゼ活性を阻害してよい。
ット;o-ジアニシジン;o-ジアニシジン2塩酸塩;o-フェニレンジアミン2塩酸塩;o-フェニレンジアミン遊離塩基;及びトランス-5-フェニル-4-ペンテニルヒドロパーオキシドを包含する。
一次抗体又は一次抗体にカップリングした分子に結合する二次抗体を検出可能なマーカーにカップリングすることができる。間接的カップリングの使用は例えばバックグラウンド結合を低減すること、及び/又は、シグナル増幅をもたらすことにより、シグナル対ノイズ比を向上させることができる。
オレセイン、TET(6-カルボキシ-2', 4, 7, 7'-テトラクロロフルオレセイン)、HEX(6-カルボキシ-2',4, 4', 5', 7, 7'-ヘキサクロロフルオレセイ
ン)、Joe(6-カルボキシ-4', 5'-ジクロロ-2', 7'-ジメトキシフルオレセイン)、5-カルボキシ-2',4', 5', 7'-テトラクロロフルオレセイン、5-カル
ボキシフルオレセイン、5-カルボキシローダミン、Tamra(テトラメチルローダミン)、6-カルボキシローダミン、Rox(カルボキシ-X-ローダミン)、R6G(ローダミン6G)、フタロシアニン類、アゾメチン類、シアニン類(例えばCy3、Cy3.5、Cy5)、キサンチン類、スクシニルフルオレセイン類、N,N-ジエチル-4-(5'-アゾベンゾトリアゾリル)-フェニルアミン及びアミノアクリジンにカップリン
グした抗体を利用する。他の例示される蛍光分子は特許文献[例えば参照により各々全体
が本明細書に組み込まれる米国特許6,207,299、6,322,901、6,576,291、6,649,138(混合疎水性/親水性重合体転移剤が量子ドットの表面に結合している表面修飾法)、米国特許6,682,596、6,815,064(合金又は混合シェルに関する)]、及び技術文献[例えば"Alternative Routes toward High Quality CdSe Nanocrystals, " (Qu等、NanoLett., 1(6):333-337 (2001)]に記載されている量子ドットを包含する。種々の表面化学及び蛍光特性を有する量子ドットが特にInvitrogen Corporation,Eugene,Oreg.,Evident
Technologies(Troy,N.Y.)及びQuantum Dot Corporation(Hayward,Calif.)から販売されている。量子ドットは又、合金化された量子ドット、例えばZnSSe、ZnSeTe、ZnSTe、CdSSe、CdSeTe、ScSTe、HgSSe、HgSeTe、HgSTe、ZnCdS、ZnCdSe、ZnCdTe、ZnHgS、ZnHgSe、ZnHgTe、CdHgS、CdHgSe、CdHgTe、ZnCdSSe、ZnHgSSe、ZnCdSeTe、ZnHgSeTe、CdHgSSe、CdHgSeTe、InGaAs、GaAlAs及びInGaNを包含する。合金化量子ドット及びそれを作製するための方法は、例えば、米国特許出願公開2005/0012182及びPCT公開WO2005/001889に開示されている。
及びSSEA4、腫瘍拒絶抗原(TRA)-1-60、TRA-1-80、アルカリホスファターゼ、NANOG、及びRex1を包含するがこれらに限定されないES細胞マーカーの発現を実質的に欠いていてもよい。即ち、ES細胞と比較してRPE細胞はOct-4、NANONG及び/又はRex1の発現を実質的に欠いている。
E細胞をであってよい。本発明は又、ヒトRPE細胞、ヒトRPE細胞の実質的に精製された集団、ヒトRPE細胞を含む医薬調製物、及びヒトRPE細胞の低温保存された調製物を提供する。調製物は、ヒト胚性幹細胞誘導RPE細胞、ヒトiPS細胞誘導RPE細胞を含む調製物、及び、分化したES細胞誘導RPE細胞を含む実質的に精製された(非RPE細胞に関して)調製物であってよい。
質的に含有しないか、又はRPE細胞よりなるものであってよい。例えば、RPE細胞の実質的に精製された調製物は約25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%未満の非RPE細胞型を含んでよい。例えばRPE細胞調製物は約25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%又は0.0001%未満の非RPE細胞を含んでよい。
06、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010又は9x1010個/mlのRPE細胞を含んでよい。RPE細胞調製物は、少なくとも約5,000~10,000、50,000~100,000、100,000~200,000、200,000~500,000、300,000~500,000又は400,000~500,000個/mlのRPE細胞を含んでよい。RPE細胞調製物は少なくとも約20,000~50,000個/mlのRPE細胞を含んでよい。また、RPE細胞調製物は少なくとも約5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、75,000、80,000、100,000又は500,000個/mlのRPE細胞を含んでよい。
て調製してよい。
109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010又は9x1010個のRPE細胞を含んでよい。
してよい。
かの他の温度で凍結してよい。低温凍結された細胞は適切な容器中に保存し、そして細胞の損傷の危険性を低減し、そして細胞が解凍に耐えうる可能性を最大限とするために保存用に調製してよい。RPE細胞は分化の直後、インビトロ成熟化の後、又はある培養期間の後に低温保存してよい。RPE細胞は又、室温に維持するか、又は例えば約4℃で冷蔵してもよい。
/mlのRPE細胞を含んでよい。低温保存されたRPE細胞調製物は、少なくとも約1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109又は9x109個/mlのRPE細胞を含んでよい。低温保存されたRPE細胞集団のRPE細胞は哺乳類RPE細胞、例えばヒトRPE細胞であってよい。
来のRPE細胞又はRPE細胞系統(例えばAPRE19)とは区別可能となるように、区別可能な構造的及び機能的な特性を付与してよい。
又、上記明示した方法の工程の何れも、より多くのRPE細胞を生産するために反復(例えば多数のRPE細胞を生産するためにスケールアップ)してよい。
織分析、接着結合の導電性を用いながら試験することにより、又は電子顕微鏡を用いた評価により行ってよい。
標)幹細胞培地、OptiProSFM、VPSFM、EGM2又はMDBKMM中で培養してよい。例えばStem Cell Information (Culture of humanEmbryonic Stem Cells (hESC))[NIHウエブサイト、2010]を参照できる。hES細胞はGMP基準に従っ
て使用及び維持されてよい。
絶抗原(TRA)-1-60、TRA-1-80、アルカリホスファターゼ、NANOG、及びRex1を発現する。所定の直系に分化するICMの細胞と同様、培養物中のhES細胞を分化するように誘導してよい。例えばhES細胞を本明細書に記載した画定された条件下にヒトRPEに分化させてよい。
ヒトEmbryonic Stem Cell Registryも参照できる。使用してよい例示されるヒト胚性幹細胞系統はMA09細胞である。MA09細胞の単離及び調製は以前に、Klimanskaya等、(2006)“ヒトEmbryonicStem Cell lines Derived from Single Blastomeres.”Nature444:481‐485に記載されている。
産されることができる。
%、4%、3%、2.5%、2%、1.5%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.20%、0.10%、0.05%、0.02%、0.016%、0.015%又は0.010%の動物由来蛋白(例えば10%FBS)を含有してよい。ただし、低蛋白培地中に存在する蛋白のパーセンテージに言及する場合、それは培地単独を指しており、例えばB27補給物中に存在する蛋白は計上していないことに留意しなければならない。即ち、細胞を低蛋白培地とB27補給物との中で培養する場合、培地中に存在する蛋白のパーセンテージはより高くなる場合があると理解される。
成長因子β2、形質転換成長因子β3、形質転換成長因子β5、腫瘍壊死因子(α及びβ)及び血管内皮成長因子を包含する。
局在68kD産物(Marmorstein等、(2000)PNAS97(23): 12758‐12763)及び色素上皮由来
因子(PEDF)、即ち血管新生抑制特性を有する48kDの分泌蛋白(Karakousis等、(2001)MolecularVision 7:154‐163; Jablonski等、(2000)The Journal of Neuroscience
20(19): 7149‐7157)を特徴とする。
2010]。
がRPの進行を遅らせることがある程度示されているが、有効な治療法はない。
膜剥離を包含する網膜剥離は、網膜が自身の支持組織の伏在層から剥離する眼の障害であり、視力喪失及び盲目をもたらす場合がある。Ghazi and Green (2002)Eye 16:411‐421;Facts About Retinal Detachment[NEI Health Information](October 2010)を参照できる。網膜剥離の治療法が望まれている。
法はない。
る研究はトランスジェニックRPE65-/-マウス(網膜変性のマウスモデル)内への正常マウス由来のRPE細胞の移植を記載している。Gourasは健常RPE細胞の移植はRPE65-/-マウスにおける網膜変性を緩徐化したが、3.7週間後にはその健全な作用は減衰し始めたことを開示している。Treumer等、(2007)Br J Opthalmol 91: 349‐353は
加齢性黄斑変性(AMD)患者における窩下脈絡膜新生血管形成(CNV)の除去後の自系RPE脈絡膜シートの移植が成功したことを記載しているが、この操作法は平均視力の中程度の上昇をもたらしたのみであった。
Chinese Medical Journal 120(5): 416‐420はパーキンソン病を治療するために有益な
神経栄養性及び抗炎症性のサイトカインを供給するためのパーキンソン病患者の線条内への眼ドナー由来のRPE細胞の移植を示唆している。
原料をヒトドナーとすることは又、ドナーの同意の問題及び規制に夜制約を被る場合があり、治療のためのRPE細胞の採取及び使用を複雑化させている。AMDにおいては、患者及び高齢患者は又、ブルーフ膜の変性にも罹患しており、RPE細胞移植を複雑化している。Gullapalli等、(2005)Exp Eye Res. 80(2): 235‐48を参照できる。
られているが、満足できないものであることが解っている。自系細胞はAMDの発症をもたらした可能性がある同じ遺伝子的傾向を有するため、自系細胞には基本的に限界がある。例えばBinder等、(2007) Progress in Retinal and Eye Research 26(5): 516‐554を
参照できる。更に、自系RPE細胞は限定的な増殖能力を有し(特にAMDは最も頻繁には高齢患者において発症するため)、これが治療用途におけるその利用性を制限している(例えばRPE細胞は良好に移植されない場合があり、そして視力のより完全な回復のために十分な長期間に渡って持続する可能性が低い)。
せ、そして次に色素性網膜炎のマウスモデル(Rpe65rd12/Rperd12C57BL6マウス)内に移植するという試験を記載している。RPE細胞移植物を移植されたRpe65rd12/Rperd12マウスは7ヶ月の期間有意な視力の回復を示さなかったが、これは網膜剥離及び腫瘍を合併していた。
たガイドラインに準拠する必要性により制約されている。hES細胞由来RPEのような細胞療法製品の臨床製造の文脈において、GTPはドナーの同意、トレーサビリティー及び感染症スクリーニングを統括しているのに対し、GMPはヒト使用のために一貫して安全及び有効である製品を生産するための施設、プロセス、試験及び実施状況に関連している。Lu等、StemCells 27: 2126‐2135(2009)。即ち、移植療法における使用に適するRPE細胞を多数生産するための系統的直接的態様が望まれている。
月17日出願のPCT出願PCT/US10/57056(現在はWO2011/063005として公開)(代理人整理番号75820.001020)及び2009年11月17日出願の米国特許仮出願61/262,002(代理人整理番号75820.001000)において胚性幹細胞の分化を介してRPE細胞を生産する方法を開示している。
ースカロライナ黄斑変性、ソーズビー基底部ジストロフィー、シュタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、マラッティア・レベンテティネーズ、ドインの蜂巣状脈絡膜症、優性ドルーゼン及び放射状ドルーゼンを包含するがこれらに限定されない黄斑変性を治療するための方法において使用してよい。本明細書に記載するRPE細胞はまたパー
キンソン病(PD)を治療する方法において使用してよい。
者を識別すること;(b)患者の細胞の表面に発現しているMHC蛋白を識別すること;
(c)本発明のRPE細胞を生産するための方法により作製された低MHC複雑性のヒトRPE細胞のライブラリを準備すること;(d)この患者の自身の細胞上のMHC蛋白にマッチするRPE細胞をライブラリから選択すること;(e)該患者に工程(d)由来の細胞の何れかを投与すること
を含む。この方法は地域の施設、例えば病因、診療所、医院及び他の医療施設において実施してよい。更に、患者にマッチするとして選択されたRPE細胞は、少数の細胞として保存した場合には、患者への投与の前に増殖させてよい。
4、5、6又は9の発現レベルを上昇させるように培養されてよい。本明細書に記載するRPE細胞は、アルファインテグリンサブユニット1~6の発現を促進する条件下で培養されてよい。例えば、マンガン及び活性化モノクローナル抗体(mAb)TS2/16を包含するがこれらに限定されないインテグリン活性化剤と共にRPE細胞を培養してよい。Afshari等、Brain (2010) 133(2): 448‐464を参照できる。
、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010又は9x1010個のRPE細胞を含んでよい。RPE細胞の医薬調製物は少なくとも約1x102~1x103、1x102~1x104、1x104~1x105又は1x103~1x106個のRPE細胞を含んでよい。RPE細胞の医薬調製物は少なくとも約10,000、20,000、25,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、175,000、180,000、185,000、190,000又は200, 000個のRPE細胞を含んでよい。例えば、RPE細胞の医薬調製物は少なくとも約50~200μLの容量中少なくとも約20,000~200,000個のRPE細胞を含んでよい。更に又、RPE細胞の医薬調製物は少なくとも約150μLの容量中に少なくとも約180,000個のRPE細胞を含んでよい。
3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104個のRPE細胞をμL当たり含んでよい。調製物はμL当たり2000個のRPE細胞、例えば50μL当たり100,000個のRPE細胞、又は、90μL当たり180,000個のRPE細胞を含んでよい。
Research 83A(2): 407‐413; Lu等、(1998) J BiomaterSci Polym Ed 9: 1187‐205; and Tomita等、(2005) Stem Cells 23: 1579‐88を参照できる.
細胞は患者の仕様に従って生産され、そしてその後、注文を出した病院又は医師に供給される。例えば、特定のRPE細胞調製物を患者に適するものとして選択した後、これを患者治療に適する量に到達するまで増殖させる。
ここで各RPE細胞調製物はヒト集団中に存在する少なくとも1つMHC対立遺伝子に関して半接合又はホモ接合であり、
そしてここで該RPE細胞バンクは、細胞のバンクの他のメンバーと相対比較してMHC対立遺伝子の異なるセットに関して各々半接合又はホモ接合である細胞を含む。上記した通り、RPE細胞を派生させるために使用される半接合又はホモ接合のMHC対立遺伝子幹細胞を発生させるために、遺伝子ターゲティング又はヘテロ接合性の損失を使用してよい。
い。有効量は低下させるために有効な量、徴候/症状の発生を防止するため、徴候/症状の発生の重症度を低下させるため、徴候/症状の発生を排除するため、徴候/症状の発生の進行を緩徐化するため、徴候/症状の発生の進行を防止するため、及び/又は徴候/症状の発生の予防を行うために有効な量であってよい。「有効量」は疾患及びその重症度及び治療すべき患者の年齢、体重、病歴、感受性、及び既往症により変動してよい。「有効量」という用語は本発明の目的のためには「治療有効量」と同義である。
(i)全ての3種の胚葉の細胞に分化する能力、(ii)少なくともOct-4及びアルカリホスファターゼの発現、及び(iii)免疫無防備状態の動物に移植された場合に奇形腫を生じさせる能力に基づいて識別されることができる。用語は又、胚の割球1つ以上から、好ましくは胚の残余を破壊することなく単離された細胞を包含する。用語は又、非胚性細胞をプロセスに使用する場合であっても体細胞核転移により生産される細胞を包含する。ES細胞は精子又はDNAによる卵細胞の受精、核転移、単為生殖によるか、又はHLA領域におけるホモ接合性を有するES細胞を発生させる手段により、派生させてよい。ES細胞は又、精子と卵細胞の融合、核転移、単為生殖、又はクロマチンのリプログラミング及びリプログラミングされたクロマチンのその後の原形質膜内への取り込みによる細胞の生産により生産された接合子、割球、又は胚盤胞期の哺乳類胚から派生させた細胞でもある。本発明のヒト胚性幹細胞はMA01、MA09、ACT-4、No.3、H1、H7、H9、H14及びACT30胚性幹細胞を包含するがこれらに限定されない。特定の実施形態においては、RPE細胞を生産するために使用するヒトES細胞はGMP基準に従って派生及び維持される。
書において使用する場合、広範には桑実胚派生細胞、胚盤胞派生細胞、例えば内細胞塊、胎盾、又は原外胚葉のもの、早期の胚の他の多能性幹細胞、例えば原始内胚葉, 外胚葉, and 中胚葉及びそれらのは生物を指す。「EDC」は又、割球及び集合した単独の割球に由来する細胞塊、又は発生の種々の期に由来する胚を包含するが、細胞系統として継代されているヒト胚性幹細胞は除外する。
(b)全3胚葉の細胞型(例えば外胚葉、中胚葉及び内肺葉の細胞型)に分化する能力を有し;そして(c)少なくとも1つの分子胚性幹細胞マーカーを発現する(例えばOct-4、アルカリホスファターゼ、SSEA3表面抗原、SSEA4表面抗原、NANOG、TRA160、TRA181、SOX2、REX1を発現する)細胞を指す。例示される多能性幹細胞は例えば当該分野で知られている方法を用いて形成でききる。例示される多能性幹細胞は胚盤胞期の胚のICMから派生させた胚性幹細胞、並びに分裂期又は桑実胚期の胚の割球1つ以上から派生させた胚性幹細胞(場合により胚の残余の破壊を伴わない)を包含する。そのような胚性幹細胞は受精によるか、又は、無性的な手段、例えば体細胞核転移(SCNT)、単為生殖及び雄性発生により生産された胚性の物質から発生させることができる。別の例示される多能性幹細胞は因子(本明細書においては、リプログラミング因子と称する)の組み合わせを発現させるか、又は発現を誘導することにより体細胞をリプログラミングすることにより発生させた誘導多能性幹細胞(iPS細胞)を包含する。iPS細胞は胎児、出生後、新生仔、幼若、又は成人の体細胞を用いて発生させてよい。特定の実施形態においては、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用できる因子は、例えばOct4(場合によりOct3/4と称する)、Sox2、c-Myc及びKlf4の組み合わせを包含する。他の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用できる因子は、例えばOct-4、Sox2、Nanog及びLin28の組み合わせを包含する。他の実施形態において、体細胞は少なくとも2つのリプログラミング因子、少なくとも3つのリプログラミング因子、又は4つのリプログラミング因子を発現させることによりリプログラミングされる。他の実施形態において、追加的なリプログラミング因子を発見し、そして単独又は1つ以上の知られたリプログラミング因子と組み合わせて使用することにより体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングする。iPS細胞は典型的には、胚性幹細胞と同じマーカーの発現により識別されることができるが、特定のiPS細胞系統はその発現プロファイルにおいて変動する場合がある。
素沈着、例えばRPE細胞がES細胞から分化する際に初期に起こる色素沈着を指す。色素沈着は分化したRPE細胞の細胞密度及び成熟度により変動してよい。RPE細胞の色素沈着はRPE細胞の終末分化の後の平均的RPE細胞と同様であってよい。RPE細胞の色素沈着はRPE細胞の終末分化の後の平均的RPE細胞よりも高値に色素沈着してよい。RPE細胞の色素沈着は終末分化の後の平均的RPE細胞よりも低値に色素沈着してよい。
細胞の集団中に数個の残留hES細胞があるかどうかを測定するためには感度が不十分である。
め、その発現は潜在的hES細胞を識別し、そしてこれはOct-4のようなより確定的なマーカーにより確認できる。AP擬陽性が観察(GFP又はOct-4陰性)されており、そしてOct-4を確認アッセイとして使用する。0.001%のhES細胞を用いた場合、3ウェル中合計5個の細胞がアルカリホスファターゼに関して陽性に染色され、そしてGFP陽性であった。即ち、これらの方法を用いた場合、RPE細胞培養物中のhES細胞の免疫蛍光検出に関する検出限界は5/600,000細胞(0.0008%)と結論された。
た後に、固定するかqPCR用に採取した。この培養は分化RPEコロニーの単離から最終産物までの製造プロセスをシミュレーションするものであった。
施することが必要である。
合な条件、又は、そうではない条件下の何れかでプレーティングした。詳細には、細胞をマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞(MEF)上のhES細胞培地中、又はゼラチン上の2%FBS添加内皮培養培地(EGM-2)中の何れかで培養した。EGM-2はRPE増殖を支援するがhES細胞の多能性状態を維持しない培地である。培地中で分化が起こるための時間を減少させるために、細胞を僅か16時間のみ培養した後に固定した。次に細胞をアルカリホスファターゼ及びOct-4で染色し、実施例2に記載したとおり顕微鏡検査した。フィーダー細胞上のES細胞培地中にプレーティングした細胞集団に関しては、GFP陽性細胞の約80%がAP及びOct-4に関して陽性であった。これとは対照的に、EGM-2培地にプレーティングした細胞集団については、GFP陽性細胞の僅か20%のみがAP及びOct-4に関して陽性であった。これらの結果から、本発明者等は、多能性状態の維持に好都合な条件下のプレーティングは細胞集団におけるhES細胞の検出の感度を大きく向上させることができると結論した。
MA09も解凍して計数した(存在する多能性hES細胞の数を求めるためアルカリホスファターゼ染色を使用)。次に100%、10%、1%、0.1%、0.01%又は0%の細胞がhES細胞、残余がMA09-RPEとなるように細胞400,000個から混合物を形成した。Qiagenより入手したRNeasyRNA単離キットを用いて細胞混合物からRNAを抽出し、試料当たり30μLのRNAの最終容量とした。次にcDNAをQiagenより入手したQuantitectcDNA合成キットを用いてRNA10μLから合成し、最終容量20μLのcDNAとした。次にcDNA1μLを各試料中に存在するベータアクチンシグナルに標準化した3連において相対的遺伝子発現に関して試験した。遺伝子発現分析は、ソフトウエアバージョン2.1を有するApplied
Biosystems StepOne Plus及びLife Technologiesから入手したTaqMan遺伝子発現アッセイを用いながら、比較Ct相対定量のための製造元の推奨するサイクル条件に従って実施した。
後に示すグラフにおけるゼロセット点として使用される100%hES細胞試料で観察される発現レベルに対して標準化した(RQ=相対的定量)。100%hES対照と比較した場合の未スパイク(0%hES)RPE試料に対するNanog(2.51log)、Oct-4(2.73log)及びSOX2(1.63log)の平均のダウンレギュレーションはこのロットに関する過去データと合致する。全てのhESマーカーのダウンレギュレーションは1%及び10%hES細胞でスパイクしたRPE細胞において劇的に低下した。
りの総細胞数に対し、幾つかの無作為に選んだ視野において視野当たりの核(DAPI染色)を計数した。AP染色は多能性細胞に加えて他の細胞型においても発現されるため、AP+/Oct4-細胞はMEFを起源とすると考えられ;即ち、各々のAP陽性細胞をOct-4に関して検査し、そして二重陽性細胞をhES細胞として計上した。Oct-4とGFPの比較により求めた場合、多能性細胞から分化型への僅かな損失があったが、これらのhESCに対して最適化した条件下では、この損失は最小限である(MEF非存在及びRPE培地中では損失は遥かに大きかった)。
Labs)を用いながらアルカリホスファターゼ(青)の存在下で培養物を染色した。AP色変化が完了した後、染色を除去し、細胞を洗浄し、そしてDAPIで染色した(蛍光DNA染色)。
ンテージは、それらが免疫染色のために固定化される時点までに、Oct-4発現に関してはダウンレギュレートされており、これにより元の細胞集団におけるhES細胞の検出の感度が減衰すると考えられる。
記実施例において記載したとおり可視光下に検査することによりAP陽性細胞を識別し;次にAP陽性細胞を紫外光下に検査することにより第2の抗体によっても標識される細胞を検出する。第1及び第2の抗体の両方に結合する細胞を標的型の細胞として識別する。場合により、標的細胞型の増殖及び/又は生存に好都合な条件下に細胞集団をプレーティングする。場合により、検査する細胞の総数の推定は、例えば、無作為視野中の細胞数を計数し、そして計数した総面積にまでスケールアップすることにより行い、そして細胞の所定の最小数を検査することにより所望のレベルの感度を確保してよい。培養条件がフィーダー細胞の存在を包含する場合、細胞集団の計数は、フィーダー細胞に由来する細胞集団を区別する標識(例えば種特異的抗体又は直系特異的抗体、ここでフィーダー細胞は細胞集団とは異なる種又は型のものである)の存在下で実施されてよく、これは2連のウェル中で実施してよい。
は、各々個々の全てが特定的及び個別に参照により本明細書に組み込まれるように示される場合と同様の程度にまで参照により全体が本明細書に組み込まれる。以下の米国特許仮出願、即ち2007年10月12日出願の60/998,766、2007年10月12日出願の60/998,668、2008年1月2日出願の61/009,908及び2008年1月2日出願の61/009,911の各々の開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。更に、WO2009/051671の開示も参照により全体が本明細書に組み込まれる。
Claims (100)
- 下記工程:
(a)細胞集団を準備すること;
(b)第1の染色及び第2の染色を該細胞集団に適用すること、ここで該第1の染色は自身の発現が標的細胞の存在を示す第1のマーカーを検出し、そして該第2の染色は自身の発現がやはり同じ標的細胞の存在を示す第2のマーカーを検出し、そしてここで、該第1の染色は可視光下に検出可能であり、そして該第2の染色は紫外光下に検出可能であること;
(c)可視光下に該細胞集団を顕微鏡観察することにより該第1のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること;
(d)紫外光下に該第1のマーカーに関して陽性である該細胞を顕微鏡観察すること、及び、該検出された細胞の何れかが該第1のマーカー及び該第2のマーカーに関して陽性であるかどうか調べること;及び、
(e)該第1のマーカー及び該第1のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を標的細胞として識別すること;
を含む、細胞集団における標的細胞の存在を検出する、又は非存在を確認する方法。 - 下記工程:
(a)細胞集団を準備すること;
(b)第1の染色及び第2の染色を該細胞集団に適用すること、ここで 該第1の染色は自身の発現が標的細胞を示す第1のマーカーを検出し、そして第2の染色は自身の発現が同じ標的細胞を示す第2のマーカーを検出し、ここで該第1の染色は可視光下に検出可能であり、そして該第2の染色は可視光下に検出可能であり、そしてここで該第1の染色及び該第2の染色は目視により区別可能であること;
(c)可視光下に該細胞集団を顕微鏡観察することにより該第1のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること;
(d)可視光下に該細胞集団の細胞を顕微鏡観察することにより該第2のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること;そして、
(e)標的細胞として該第1のマーカー及び該第2のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を(c)及び(d)で検出された細胞から識別すること;
を含む、細胞集団における標的細胞の存在を検出するか、又は非存在を確認する方法。 - 細胞集団から検出された標的細胞を除去又は単離することを更に含む請求項1又は2記載の方法。
- 細胞集団が多能性細胞1つ以上に由来する請求項1又は2記載の方法。
- 多能性細胞1つ以上に由来する細胞集団複数に対して行う請求項1又は2記載の方法。
- 該細胞集団が異なるHLA型の多能性細胞に由来する請求項5記載の方法。
- 該第1の染色が可視光下及び紫外光下に観察可能である請求項1又は2記載の方法。
- 該第1のマーカーが該標的細胞により発現されるアルカリホスファターゼを含む請求項1~7の何れかに記載の方法。
- 該第1の染色が該第1のマーカーに特異的に結合する抗体を含み、そして該抗体がアルカリホスファターゼに直接又は間接的にカップリングする請求項1~7の何れかに記載の方法。
- 該第1の染色がナフトールAS-BIホスフェート;5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(BCIP)及びニトロブルーテトラゾリウム(NBT);BCIP試薬及びINTX試薬;ナフトールAS-BI及びファーストレッドバイオレットLB;テトラゾリウム塩;ジアゾ化合物;VECTOR(登録商標)Red;VECTOR(登録商標)Blue;VECTOR(登録商標)Black;及びp-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)よりなる群から選択されるアルカリホスファターゼ基質を含む請求項8又は9の何れかに記載の方法。
- 該第1の染色がベクターレッド又はベクターブルーを含む請求項10記載の方法。
- 該第2の染色が該第2のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が蛍光標識に直接又は間接的にカップリングされる請求項1又は7~11の何れかに記載の方法。
- 該第2のマーカーがアルカリホスファターゼ、Oct-4、Nanog、期特異的胚性抗原-3(SSEA-3)、期特異的胚性抗原-4(SSEA-4)、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、Sox2、Lin28、成長分化因子3(GDF3)、低下発現1(REX1)、線維芽細胞成長因子4(FGF4)、胚細胞特異的遺伝子1(ESG1)、発生多能性関連2(DPPA2)、DPPA4、テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、SALL4、E-CADHERIN、クラスター指定30(CD30)、Cripto(TDGF-1)、GCTM-2、Genesis、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子(SCF又はc-Kitリガンド)よりなる群から選択される請求項12記載の方法。
- 該標的細胞が胚性幹細胞である請求項13記載の方法。
- 該第2のマーカーがOct-4及びNanogよりなる群から選択される請求項14記載の方法。
- 該一次抗体が蛍光標識を含む請求項12~15の何れかに記載の方法。
- 該第2の染色が更に二次抗体を含む請求項12~15の何れかに記載の方法。
- 該二次抗体が蛍光標識を含む請求項17記載の方法。
- 該蛍光標識がAlexa Fluor350、Alexa Fluor405、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor514、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor610、Alexa Fluor633、Alexa Fluor635、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750及びAlexa Fluor790、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、テキサスレッド、SYBRグリーン、DyLightFluors、緑色蛍光蛋白(GFP)、TRIT(テトラメチルローダミンイソチオール)、NBD(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール)、テキサスレッド染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル
酸、クレジルファーストバイオレット、クレジルブルーバイオレット、ブリリアントクレジルブルー、p-アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、5-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、TET(6-カルボ
キシ-2',4,7,7'-テトラクロロフルオレセイン)、HEX(6-カルボキシ-2',
4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン)、Joe(6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン)、5-カルボキシ-2',4',5',7'-テトラクロロフルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン、5-カルボキシローダミン、Tamra(テトラメチルローダミン)、6-カルボキシローダミン、Rox(カルボキシ-X-ローダミン)、R6G(ローダミン6G)、フタロシアニン類、アゾメチン類、シアニン類(例えばCy3、Cy3.5、Cy5)、キサンチン類、スクシニルフルオレセイン類、N,N-ジエチル-4-(5'-アゾベンゾトリアゾリル)-フェニルアミン、アミノアクリジン及び量子ドットよりなる群から選択される請求項16又は18記載の方法。 - 該蛍光標識がAlexa Fluor488を含む請求項19記載の方法。
- 該第2の染色が該第2のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が可視光下に観察可能な試薬に直接又は間接的にカップリングする請求項2~11の何れかに記載の方法。
- 可視光下に観察可能な該試薬が金粒子、銀粒子、又はラテックス粒子を含む請求項21記載の方法。
- 該第2の染色が該第2のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が可視光下に観察可能な生成物を生成する反応を触媒する酵素に直接又は間接的にカップリングする請求項2~11の何れかに記載の方法。
- 該酵素がアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、及びパーオキシダーゼよりなる群から選択される請求項23記載の方法。
- 該パーオキシダーゼがセイヨウワサビパーオキシダーゼを含む請求項24記載の方法。
- 該パーオキシダーゼを3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB);3,3’-ジアミノベンジジン(DAB);3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC);4-クロロ-1-ナフトール;2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS);2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド;2-クロロ-5,5-ジメチル-1,3-シクロヘキサンジオン;3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン;3,3′-ジアミノベンジジンテトラクロリド;3-ニトロテトラゾリウムブルークロリド;4-アミノフタルヒドラジド;4-クロロ-1-ナフトール;4-クロロ-7-ニトロベンゾフラザン;5-アミノサリチル酸;2塩酸ジカルボキシジン;グアイアコール;過酸化水素-尿素付加物;ヨードニトロテトラゾリウムクロリド;ルミノール;MTTホルマザン;N-(4-アミノブチル)-N-エチルイソルミノール;N-(6-アミノヘキシル)-N-エチルイソルミノール;ニトロテトラゾリウムブルークロリド;ピロガロール;テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド;テトラゾリウムブルークロリド指示薬;テトラゾリウムバイオレット;o-ジアニシジン;o-ジアニシジン2塩酸塩;o-フェニレンジアミン2塩酸塩;o-フェニレンジアミン遊離塩基;及びトランス-5-フェニル-4-ペンテニルヒドロパーオキシドよりなる群から選択されるパーオキシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項23又は24記載の方法。
- 該酵素がベータガラクトシダーゼを含む請求項24記載の方法。
- 該ベータガラクトシダーゼを、1-メチル-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノ
シド;2-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド;4-メチルウンベリフェリルβ-D-ガラクトピラノシド;4-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド;5-ブロモ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド;5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド;5-ブロモ-6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド;6-ブロモ-2-ナフチルβ-D-ガラクトピラノシド;6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド;フルオレセインジ(β-D-ガラクトピラノシド);及びレゾルフィンβ-D-ガラクトピラノシドよりなる群から選択されるベータガラクトシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項27記載の方法。 - 該第2の染色が該第2のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、 該一次抗体が金粒子に直接又は間接的にカップリングし、そして該方法が更に該金粒子上に銀沈殿を形成することを含む請求項2~11の何れかに記載の方法。
- 該第2のマーカーがアルカリホスファターゼ、Oct-4、Nanog、期特異的胚性抗原-3(SSEA-3)、期特異的胚性抗原-4(SSEA-4)、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、Sox2、成長分化因子3(GDF3)、低下発現1(REX1)、線維芽細胞成長因子4(FGF4)、胚細胞特異的遺伝子1(ESG1)、発生多能性関連2(DPPA2)、DPPA4、テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、SALL4、E-CADHERIN、クラスター指定30(CD30)、Cripto(TDGF-1)、GCTM-2、Genesis、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子(SCF又はc-Kitリガンド)よりなる群から選択される請求項21~29の何れかに記載の方法。
- 該標的細胞が胚性幹細胞である請求項30記載の方法。
- 該第2のマーカーがOct-4及びNanogよりなる群から選択される請求項31記載の方法。
- 該第1の染色が該第2のマーカーに特異的に結合する第1の一次抗体を含み、該第1の一次抗体が可視光下に観察可能な第1の試薬に直接又は間接的にカップリングする請求項1~2又は12~32の何れかに記載の方法。
- 可視光下に観察可能な該第1の試薬が金粒子、銀粒子、又はラテックス粒子を含む請求項33記載の方法。
- 該第1の染色が該第1のマーカーに特異的に結合する第1の一次抗体を含み、該第1の一次抗体が可視光下に観察可能な生成物を生成する反応を触媒する第1の酵素に直接又は間接的にカップリングする請求項1~2又は12~32の何れかに記載の方法。
- 該第1の酵素がアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ及びパーオキシダーゼよりなる群から選択される請求項35記載の方法。
- 該第1の酵素がカップリングする該パーオキシダーゼがセイヨウワサビパーオキシダーゼを含む請求項36記載の方法。
- 該第1の酵素がカップリングする該パーオキシダーゼを3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB);3,3’-ジアミノベンジジン(DAB);3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC);4-クロロ-1-ナフトール;2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS);2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド;2-クロロ-5,5-ジメチル-1,3-シクロヘキサ
ンジオン;3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン;3,3′-ジアミノベンジジンテトラクロリド;3-ニトロテトラゾリウムブルークロリド;4-アミノフタルヒドラジド;4-クロロ-1-ナフトール;4-クロロ-7-ニトロベンゾフラザン;5-アミノサリチル酸;2塩酸ジカルボキシジン;グアイアコール;過酸化水素-尿素付加物;ヨードニトロテトラゾリウムクロリド;ルミノール;MTTホルマザン;N-(4-アミノブチル)-N-エチルイソルミノール;N-(6-アミノヘキシル)-N-エチルイソルミノール;ニトロテトラゾリウムブルークロリド;ピロガロール;テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド;テトラゾリウムブルークロリド指示薬;テトラゾリウムバイオレット;o-ジアニシジン;o-ジアニシジン2塩酸塩;o-フェニレンジアミン2塩酸塩;o-フェニレンジアミン遊離塩基;及びトランス-5-フェニル-4-ペンテニルヒドロパーオキシドよりなる群から選択されるパーオキシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項36又は37記載の方法。 - 該第1の酵素がベータガラクトシダーゼを含む請求項35記載の方法。
- 該第1の酵素がカップリングする該ベータガラクトシダーゼを1-メチル-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド;2-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド;4-メチルウンベリフェリルβ-D-ガラクトピラノシド;4-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド;5-ブロモ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド;5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド;5-ブロモ-6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド;6-ブロモ-2-ナフチルβ-D-ガラクトピラノシド;6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド;フルオレセインジ(β-D-ガラクトピラノシド);及びレゾルフィンβ-D-ガラクトピラノシドよりなる群から選択されるベータガラクトシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項27記載の方法。
- 該第1の染色が該第1のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、該一次抗体が金粒子に直接又は間接的にカップリングし、 そして該方法が更に該金粒子上に銀沈殿を形成することを含む請求項1~2又は12~32の何れかに記載の方法。
- 第1のマーカーが、アルカリホスファターゼ、Oct-4、Nanog、期特異的胚性抗原-3(SSEA-3)、期特異的胚性抗原-4(SSEA-4)、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、Sox2、成長分化因子3(GDF3)、低下発現1(REX1)、線維芽細胞成長因子4(FGF4)、胚細胞特異的遺伝子1(ESG1)、発生多能性関連2(DPPA2)、DPPA4、テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、SALL4、E-CADHERIN、クラスター指定30(CD30)、Cripto(TDGF-1)、GCTM-2、Genesis、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子(SCF又はc-Kitリガンド)よりなる群から選択される請求項33~41の何れかに記載の方法。
- 該標的細胞が胚性幹細胞である請求項42記載の方法。
- 該第2のマーカーがOct-4、Oct-4、Lin28、Sox2、Klf4、n-又はc-Myc及びNanogよりなる群から選択される請求項43記載の方法。
- 該第1のマーカーが該第2のマーカーとは異なる請求項42~44の何れかに記載の方法。
- 該標的細胞が胚性幹細胞であり、そして該第2のマーカーがアルカリホスファターゼ、Oct-4、Nanog、期特異的胚性抗原-3(SSEA-3)、期特異的胚性抗原-
4(SSEA-4)、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、Sox2、成長分化因子3(GDF3)、低下発現1(REX1)、線維芽細胞成長因子4(FGF4)、胚細胞特異的遺伝子1(ESG1)、発生多能性関連2(DPPA2)、DPPA4、テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、SALL4、E-CADHERIN、クラスター指定30(CD30)、Cripto(TDGF-1)、GCTM-2、Genesis、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子(SCF又はc-Kitリガンド)よりなる群から選択される上記請求項の何れかに記載の方法。 - 該細胞集団がレイヨウ、ウシ、ラクダ、ネコ、マメジカ(ネズミジカ)、 チンパンジー、乳牛、シカ、イヌ、キリン、ヤギ、モルモット、ハムスター、カバ、ウマ、ヒト、マウス、非ヒト霊長類、ヒツジ類、イノシシ、ブタ、プロングホーン、ウサギ、ラット、マカク、サイ,ヒツジ、バク、及び有蹄類よりなる群から選択される種の細胞を含む上記請求項の何れかに記載の方法。
- 該細胞集団がヒト細胞を含む請求項47記載の方法。
- 細胞集団中の細胞の概数を測定することを更に含む上記請求項の何れかに記載の方法。
- 該細胞集団中の細胞の少なくとも90%を可視光下に検査することにより該第1のマーカーに関して陽性である細胞を検出する上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 該第1のマーカーに関して陽性である各細胞を、その細胞が該第2のマーカーに関して陽性であるかどうかを調べるために検査する請求項50記載の方法。
- 該細胞集団が少なくとも105個の細胞、少なくとも106個の細胞、少なくとも107個の細胞、少なくとも108個の細胞、少なくとも109個の細胞、少なくとも1010個の細胞、又は105~1010個の細胞を含有する上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 該第1のマーカー及び該第2のマーカーが胚性幹細胞マーカーである上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 細胞の該集団が胚性幹細胞のインビボ又はインビトロの分化により生産される上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 該標的細胞が多能性細胞、胚性幹細胞、又は誘導多能性(iPS)細胞である上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 該細胞集団が多能性細胞、胚性幹細胞、又は誘導多能性(iPS)細胞から分化した細胞を更に含む請求項55の方法。
- 該細胞集団を標的細胞型の増殖又は維持に好都合な条件下に培養する上記請求項の何れかに記載の方法。
- 該標的細胞型が胚性幹細胞である請求項57記載の方法。
- 該培養条件がフィーダー細胞上で該細胞集団を培養することを含む請求項58記載の方法。
- 該フィーダー細胞がMEFである請求項59記載の方法。
- 胚性幹細胞又はiPS細胞から分化した該細胞が網膜色素上皮(RPE)細胞である請求項56~60の何れかに記載の方法。
- 該RPE細胞がヒトのものである請求項61記載の細胞。
- 該RPE細胞が下記工程:
(a)多能性幹細胞を準備すること;
(b)多能性幹細胞を培養することにより多能性幹細胞の多層集団又は多能性幹細胞を含む胚様体を形成すること;
(c)細胞培養物中にRPE細胞が出現するために十分な期間、多層集団又は胚様体を培養すること;及び、
(d)培養物からRPE細胞を単離すること;
を含む方法により作製される請求項61又は62記載の方法。 - 該多能性幹細胞が誘導多能性幹(iPS)細胞、胚性幹(ES)細胞、成人幹細胞、造血幹細胞、胎児幹細胞、間葉性幹細胞、分娩後幹細胞、複能性幹細胞、又は胚性生殖細胞である請求項63記載の方法。
- 多能性幹細胞がヒトES細胞又はヒトiPS細胞である請求項63記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約7~10日間である請求項63~65の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約2週間である請求項63~65の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約3週間である請求項63~65の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約4週間である請求項63~65の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約5週間である請求項63~65の何れか一項に記載の方法。
- 工程(c)の期間が少なくとも約6週間である請求項63~65の何れか一項に記載の方法。
- 該RPE細胞培養物がマウス胚性フィーダー細胞(MEF)及びヒト胚性幹細胞(hES)を実質的に含有しない請求項61~71の何れか一項に記載の方法。
- RPE細胞のリッチ化された培養物を増殖させるために使用される培地が未分化の多能性幹細胞の増殖又は維持を支援しない請求項61~72の何れか一項に記載の方法。
- 標的細胞が脂肪細胞;骨髄線維芽細胞;心筋細胞;軟骨細胞;分化RBC及びWBC直系;内皮骨髄線維芽細胞;外胚葉;外胚葉前駆体;胚様体(EB);胎生期癌(EC);胚性幹(ES);内胚葉;内皮;造血細胞;造血幹細胞(HSC)、付随体、内皮前駆体;肝細胞;ケラチノサイト;間葉;間葉性幹細胞(MSC);中胚葉;MSC前駆体;筋芽細胞;筋細胞;神経前駆体;神経幹細胞;ニューロン;稀突起神経膠細胞;骨芽細胞;
膵上皮;膵島;膵前駆体;骨格筋細胞;平滑筋;間質性(間葉)前駆細胞;及び白血球(WBC)よりなる群から選択される請求項1~74の何れか一項に記載の方法。 - 第1のマーカー及び第2のマーカーが表1に記載するとおり上記標的細胞と関連しているマーカーである請求項71記載の方法。
- 工程(a)の前に、標的細胞型のメンテナンス細胞に好都合な条件下に細胞集団を培養することを更に含む上記請求項の何れかに記載の方法。
- 標的細胞が胚性幹細胞又は誘導多能性(iPS)細胞である請求項76記載の方法。
- 該培養条件が胚性幹細胞培地及びマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞の存在を含む請求項77記載の方法。
- 標的細胞型を含む第2の細胞集団をプレーティングすること、及び、工程(a)の該細胞集団と同じ方法により該第2の細胞集団を分析することにより該方法の検出限界を明確化することを更に含む上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 該第2の細胞集団が該標的細胞型よりなるか、本質的にこれよりなる請求項79記載の方法。
- 該第2の細胞集団が細胞の第1の群及び細胞の第2の群の混合物を含み、細胞の該第1の群が標的細胞型と同じ型のものである請求項79記載の方法。
- 細胞の該第2の群が工程(a)の該細胞集団と本質的に同じコンスティテュエンシーを有する請求項81記載の方法。
- 細胞の該第1の群及び細胞の該第2の群における細胞の数の比が1:10;1:100;1:1,000;1:10,000;1:100,000;1:1,000,000;1:10,000,000;1:100,000,000;1:1,000,000,000;1:10と1:100との間;1:10と1:1,000との間;1:10と1:10,000との間;1:10と1:100,000との間;1:10と1:1,000,000との間;1:10と1:10,000,000との間;1:10と1:100,000,000との間;1:10と1:1,000,000,000との間;1:100と1:1,000との間;1:100と1:10,000との間;1:100と1:100,000との間;1:100と1:1,000,000との間;1:100と1:10,000,000との間;1:100と1:100,000,000との間;1:100と1:1,000,000,000との間;1:1,000と1:10,000との間;1:1,000と1:100,000との間;1:1,000と1:1,000,000との間;1:1,000と1:10,000,000との間;1:1,000と1:100,000,000との間;1:1,000と1:1,000,000,000との間;1:10,000と1:100,000との間;1:10,000と1:1,000,000との間;1:10,000と1:10,000,000との間;1:10,000と1:100,000,000との間;1:10,000と1:1,000,000,000との間;1:100,000と1:1,000,000との間;1:100,000と1:10,000,000との間;1:100,000と1:100,000,000との間;1:100,000と1:1,000,000,000との間;1:1,000,000と1:10,000,000との間;1:1,000,000と1:100,000,000との間;1:1,000,000と1:1,000,000,000との間;1:10,000,000と1:100,000,000との間;1:10,000,0
00と1:1,000,000,000との間;及び1:100,000,000と1:1,000,000,000との間よりなる群から選択される請求項81又は82記載の方法。 - 該第2の細胞集団中の標的細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%が標的細胞の該第1のマーカー及び該第2のマーカーに関して陽性として検出される請求項79~83の何れか一項に記載の方法。
- 工程(a)の該細胞集団と同じ培養条件と期間の下に標的細胞型の第3の細胞集団をプレーティングすること、及び、該第3の細胞集団中の標的細胞型の細胞を検出及び計数することにより、該培養条件下に標的細胞の該第1及び第2のマーカーの発現を維持する標的細胞型の細胞の比率を測定することを更に含む請求項79~84の何れか一項に記載の方法。
- 該第2の細胞集団における標的細胞型の細胞の予測される数を測定するため補正計数として該培養条件下に維持される標的細胞型の細胞の該集団を用いながら該第2の細胞集団を用いて測定される方法の検出限界を計算する請求項85記載の方法。
- 該第2の細胞集団中及び/又は該第3の細胞集団中の該標的細胞が標的細胞又はそれらの子孫を識別する別のマーカーを発現する請求項79~86の何れか一項に記載の方法。
- 該別のマーカーがGFP又は細胞により発現される別の蛍光蛋白を含む請求項87記載の方法。
- 標的細胞がウィルス感染細胞、癌性又は前癌性の細胞、癌幹細胞及び免疫細胞から選択される上記請求項の何れか一項に記載の方法。
- 標的細胞を含有すると推定される組成物が骨髄、血球、又は膵細胞である請求項89記載の方法。
- 標的細胞を含有すると推定される細胞集団が、細胞ソーティング、放射線照射、化学療法又は標的細胞を除去するための他の手段により予め処理されている請求項89記載の方法。
- 幹細胞を本質的に含有しない該幹細胞に由来する体細胞を含む組成物。
- 細胞及び存在する幹細胞の数又は割合を示すインジケーターを含む組成物であって、該組成物中の細胞の代表となる細胞集団に適用される上記請求項の何れかに記載の方法を用いて該インジケーターの値を測定する上記組成物。
- 少なくとも105個の細胞、少なくとも106個の細胞、少なくとも107個の細胞、少なくとも108個の細胞、少なくとも109個の細胞、少なくとも1010個の細胞、又は105と1010個の間の細胞を含む請求項93記載の組成物。
- 低温保存された細胞を含む請求項92~94の何れかに記載の組成物。
- 下記工程:
(a) 細胞集団を準備すること;
(b) 第1の染色及び第2の染色を該細胞集団に適用すること、ここで該第1の染色は
アルカリホスファターゼを検出し、そして該第2の染色は胚性幹細胞を示すマーカーを検出し、そして該第1の染色に関して陽性である細胞は可視及び紫外光下に検出可能であり、そして該第2の染色に関して陽性である細胞は紫外光下に検出可能であること;
(c) 該第1のマーカーに関して陽性である細胞を検出するために可視光下に該細胞集
団の細胞を顕微鏡観察すること;
(e) 紫外光下に該第1のマーカーに関して陽性である該細胞を顕微鏡観察すること、
及び、細胞が該第1のマーカー及び該第2のマーカーに関して陽性であるかどうか測定すること;及び、
(f) 該第1のマーカー及び該第2のマーカーに関して陽性である細胞を胚性幹細胞と
して識別すること;
を含む細胞集団中のヒト胚性幹細胞の存在を検出する方法。 - フィーダー細胞上のhES細胞培地中に細胞集団をプレーティングすること、hES細胞を示すマーカーを検出する染色を適用すること、及び該マーカーに関して陽性である細胞を識別することを含む、細胞集団中のヒト胚性幹(hES)細胞の存在を検出する方法。
- 該細胞集団に第3の染色を適用すること、ここで該第3の染色は自身の発現が標的細胞の存在を示す第3のマーカーを検出すること;該細胞集団の細胞を顕微鏡観察することにより該第3のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること;及び該第1のマーカー、該第2のマーカー及び該第3のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を標的細胞として識別することを更に含む何れかの上記請求項に記載の方法。
- 該第3の染色が該第1の染色から、及び該第2の染色から目視により区別可能である請求項98記載の方法。
- 該第3の染色が可視光下又は紫外光下に検出可能である請求項98又は99記載の方法。
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