JP6424826B2 - 組織切片における生体物質の定量法 - Google Patents
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Description
組織切片における生体物質の定量法であって、
(1)前記組織切片における第一の生体物質を特異的に染色する明視野観察可能な免疫染色(第一の免疫染色)を行い、
(2)前記組織切片における第二の生体物質を特異的に染色する蛍光物質内包ナノ粒子による免疫染色(第二の免疫染色)を行い、
(3)第一の免疫染色の染色像の位置と第二の免疫染色の染色像の位置を比較することによって、前記組織切片における第二の生体物質の発現位置を特定し、
(4)第二の免疫染色の染色像の蛍光量を測定することによって、第二の生体物質の発現量を特定する、
ことを含む定量法。
前記の第一の免疫染色の染色像と前記の第二の免疫染色の染色像の重なった位置について、前記の第二の免疫染色の染色像の蛍光量を測定する、[1]に記載の定量法。
前記の第一の免疫染色と前記の第二の免疫染色を同一の組織切片について行う、[1]又は[2]に記載の定量法。
本発明は、採取した組織切片において、特定の組織・細胞(以下、検出対象物という)を検出し、検出対象物上に発現している目的の生体物質(以下、定量対象物質という)の発現位置と発現量の両者を正確に特定する方法である。本発明で対象とする組織切片、検出対象物、定量対象物の組合せは、検査の目的に応じて選べばよく、例えば、肝臓組織切片における血管内皮細胞上に発現したVEGFR−1、VEGFR−2、VEGFR−3等の定量、食道組織切片におけるリンパ管内皮細胞上に発現したVEGFR−1、VEGFR−2、VEGFR−3等の定量、乳房組織切片における上皮細胞上に発現したKi67の定量等が挙げられる。
本発明における組織切片は、免疫染色方法が適用できる切片であれば特に限定されず、その作製方法は、公知の方法を用いることができる。例えば、病理切片として汎用されているパラフィン包埋切片、その他を組織切片として用いることができる。
本発明では、組織切片における第一の生体物質を特異的に染色する明視野観察可能な免疫染色(第一の免疫染色)と、組織切片における第二の生体物質を特異的に染色する蛍光物質内包ナノ粒子による免疫染色(第二の免疫染色)とを行う。すなわち、検出対象物は、第一の免疫染色の染色像によって検出し、定量対象物質は、第二の免疫染色の蛍光染色像の輝点、輝度分布によって定量する。
(a)第一の生体物質
第一の生体物質は、検出対象物における免疫染色(第一の免疫染色)の標的物質である。検査の目的に応じた程度に検出対象物に明視野観察可能な染色がされるように、検出対象物である組織・細胞上の抗原となる物質を第一の生体物質として選べばよい。例えば、血管内皮細胞の免疫染色にはCD31やCD34等を第一の生体物質とし、リンパ管内皮細胞の免疫染色にはポドプラニン等を第一の生体物質とし、上皮細胞の免疫染色にはサイトケラチン等を第一の生体物質とすればよい。
第一の生体物質と特異的に結合する抗体は、通常の方法を用いて取得することができる。
標識体は、組織切片上で標的物質に結合した標識化プローブを可視化するためのものであり、第一の標識化プローブに含まれる標識体は、明視野観察可能な染色をするための標識体である。
本発明の明視野観察を可能とする標識体の例としては、色素沈着を誘導する物質(色素沈着誘導標識体)、すなわち、基質を変化させて色素沈着性の化学種を生じさせる酵素が挙げられる。このような酵素として、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ(ALP)、グルコシダーゼ等の酵素を挙げることができる。
上記酵素により色素沈着性の物質に変換される基質として、色原性基質変換法に基づく従来公知のアッセイ法において、色原性基質として一般的に用いられる基質を用いることができる。このような基質の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)用基質などの酸化還元酵素用基質、アルカリホスファターゼ(ALP)用基質などのフォスファターゼ用基質、および、β−ガラクトシダーゼ用基質などのグリコシダーゼ用基質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
第一の標識化プローブは、前記の第一の生体物質と結合する抗体と前記の標識体とを結合させることにより得られる。この場合の抗体と標識体の結合方法に特に制限はなく、直接結合している場合の外に、2次抗体を介して結合している場合等も含まれることは前記の通りである。
(a)第二の生体物質
第二の生体物質は、定量対象物質における免疫染色(第二の免疫染色)の標的物質である。検査の目的に応じた定量が行われるように、定量対象物質上の抗原となる物質を選べばよいが、一般的には定量対象物質は蛋白質であり、その場合は定量対象物質自体が第二の生体物質である。第二の生体物質の例としては、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR−1、VEGFR−2、VEGFR−3)、細胞増殖関連蛋白Ki−67等が挙げられる。
第二の生体物質と特異的に結合する抗体は、通常の方法を用いて取得することができる。
標識体は、組織切片上で標的物質に結合した標識化プローブを可視化するためのものであり、第二の標識化プローブに含まれる標識体は、蛍光物質内包ナノ粒子である。
蛍光色素内包ナノ粒子は、前記の粒子1個に蛍光色素を2分子以上内包させたものである。内包させる蛍光色素には特に制限がなく、目的とする励起光、蛍光の波長その他に応じて選べばよい。
蛍光ナノ粒子内包粒子は、前記の粒子1個に蛍光ナノ粒子を2個以上内包させたものである。内包させる蛍光ナノ粒子には特に制限がなく、目的とする励起光、蛍光の波長その他に応じて選べばよい。
第二の標識化プローブは、前記の第二の生体物質と結合する抗体と前記の標識体とを結合させることにより得られる。この場合の抗体と標識体の結合方法に特に制限はなく、直接結合している場合の外に、2次抗体を介して結合している場合等も含まれることは前記の通りである。
本発明では、組織切片について、前記の第一の免疫染色及び前記の第二の免疫染色を実施する。この場合の両免疫染色は、それぞれの染色像の位置関係を比較して検出対象物上に発現している定量対象物質の発現位置を特定するために、同一組織切片について行うことが好ましいが、切片の切り出しにおいて隣接する組織切片についてそれぞれの免疫染色を実施することも可能である。
本発明では、第一の免疫染色の染色像の位置と第二の免疫染色の染色像の位置を比較することによって、組織切片における第二の生体物質の発現位置を特定する。ここで、第一の免疫染色の染色像は明視野観察可能な染色像であり、第二の免疫染色の染色像は蛍光染色の染色像であることは前記の通りである。従って、第一の免疫染色の染色像は光学顕微鏡によって観察し、第二の免疫染色の染色像は蛍光顕微鏡によって観察する。両染色像の位置の比較は、第二の免疫染色の輝点、輝度分布が第一の免疫染色の染色像のどの位置に該当するかが判断できる方法であれば特に制限はない。例えば、第一の免疫染色の染色像の画像と第二の免疫染色の染色像の画像をコンピューターに取り込み、両画像の位置関係を比較することによって、第二の免疫染色の輝点、輝度分布と第一の免疫染色の染色像との位置関係を判断することができる。このような解析ソフトとしては、例えば、市販画像解析ソフトImage Jが挙げられる。
検出対象物上に発現した定量対象物質(第二の生体物質)の発現量の特定は、前記で特定した第二の免疫染色の染色像の蛍光量を測定することによって行われる。この場合の蛍光量の測定とは、特定した輝点、輝度分布について、輝点数又は蛍光輝度を測定することである。
(1)第一の生体物質に対する明視野観察可能な免疫染色(第一の免疫染色)
肝臓組織スライド(Biomax社製T032a)をキシレンに浸漬し、パラフィンを除去後、クエン酸緩衝液(pH6.0)中15分間、オートクレーブ処理した。PBSを用いて洗浄後、10%ウサギ血清(ニチレイ社製)を添加し、室温下1時間放置した。
(a)抗体結合蛍光メラミン樹脂粒子(平均粒径150nm)の調製
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)14.4mgを水22mLに加えて溶解した後、エマルゲン430(花王社製)の5%水溶液を2mL加えた。ホットスターラー上で撹拌しながら70℃に加熱した後、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)0.65gを加えた。ドデシルベンゼンスルホン酸(関東化学社製)の10%水溶液を680μL加え、70℃、50分間加熱撹拌した。その後、90℃に昇温して20分間加熱撹拌した。得られた粒子液から余剰の樹脂原料や色素等の不純物を取り除くため、純水による洗浄を行なった。遠心分離機(クボタ社製マイクロ冷却遠心機3740)にて20000Gで15分遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射し再分散した。遠心分離機、上澄み除去、超純水への再分散を5回繰り返した。
前記のストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子(平均粒径150nm)をPBSにより0.06nMに調製し、病理染色液とした。
前記(1)の肝臓組織スライドの組織切片と隣接する組織切片の肝臓組織スライドをキシレンに浸漬し、パラフィンを除去後、クエン酸緩衝液(pH6.0)中15分間、オートクレーブ処理した。PBSで洗浄後、10%ヤギ血清(ニチレイ社製)を添加し、室温下1時間放置した。PBSで洗浄後、抗VEGFR-2抗体(アブカム社製ウサギ抗体)を添加し、室温下30分間放置した。PBSで洗浄後、ビオチン標識抗ウサギ抗体(ニチレイ社製)を添加し、室温下で30分間放置した。これに、上記で調製した希釈後の病理染色液を添加し、室温下2時間反応させた後、PBSで洗浄を行った。
上記で作製した評価スライドについて、光学顕微鏡(カールツァイス社製)を用いて第一の免疫染色の染色画像を取得し、蛍光顕微鏡(カールツァイス社製)を用いて第二の免疫染色の蛍光染色画像を取得した。蛍光染色画像取得における励起波長は575〜600nm、蛍光波長は612〜682nmとした。
実施例1において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例1と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例1において、第一の免疫染色を抗CD34抗体(ニチレイ社製マウス抗体)を用いて実施した以外は、実施例1と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例3において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例3と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例1において、第二の免疫染色を抗VEGFR-1抗体(アブカム社製ウサギ抗体)を用いて実施した以外は、実施例1と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例5において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例5と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例3において、第二の免疫染色を抗VEGFR-1抗体(アブカム社製ウサギ抗体)を用いて実施した以外は、実施例3と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例7において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例7と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例1において、第一の免疫染色を抗ポドプラニン抗体(医学生物学研究所社製マウス抗体)を用いて実施し、第二の免疫染色を抗VEGFR-1抗体(アブカム社製ウサギ抗体)を用いて実施した以外は、実施例1と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例9において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例9と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例1において、第一の免疫染色を抗Cytokeratin AE1/AE3抗体(ダコ社製マウス抗体)を用いて実施し、第二の免疫染色を抗Ki67抗体(ニチレイ製ウサギ抗体)を用いて実施した以外は、実施例1と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例11において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例11と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例11において、第二の免疫染色を抗ER抗体(ニチレイ社製ウサギ抗体)を用いて実施した以外は、実施例11と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例13において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例13と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例11において、第二の免疫染色を抗PgR抗体(ベンタナ社製ウサギ抗体)を用いて実施した以外は、実施例11と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例15において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例13と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例1において、第一の免疫染色を抗CK7抗体(アクリスアンチボディーズ社製マウス抗体)を用いて実施した以外は、実施例1と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例17において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例17と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例17において、第二の免疫染色を抗VEGFR-1抗体(アブカム社製ウサギ抗体)を用いて実施した以外は、実施例17と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例19において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例19と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例17において、第二の免疫染色を抗VEGFR-3抗体(アブカム社製ウサギ抗体)を用いて実施した以外は、実施例17と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例21において、第二の免疫染色を第一の免疫染色と同じ肝臓組織スライドについて行った以外は、実施例21と同様な方法を実施して評価スライドを作成し、取得した第一の免疫染色の染色画像及び第二の免疫染色の蛍光染色画像を評価した。結果を表1−1に示す。
実施例1において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例2において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor(登録商標) 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例2と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は、インビトロジェン社の製品説明書の実施方法に従った。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
実施例3において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例4において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例4と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は比較例2に記載した通りである。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
実施例5において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例6において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例6と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は比較例2に記載した通りである。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
実施例7において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例8において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例6と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は比較例2に記載した通りである。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
実施例9において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例10において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例10と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は比較例2に記載した通りである。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
実施例11において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例12において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例10と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は比較例2に記載した通りである。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
実施例13において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例14において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例10と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は比較例2に記載した通りである。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
実施例15において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例16において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例16と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は比較例2に記載した通りである。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
実施例17において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例18において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例18と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は比較例2に記載した通りである。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
実施例19において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例20において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例20と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は比較例2に記載した通りである。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
実施例21において、第一の免疫染色は実施せず、第二の免疫染色のみ実施し、評価スライドした。取得した染色画像の評価結果を表1−2に示す。
実施例22において、第二の免疫染色をストレプトアビジン結合SulfoRhodamine101色素内包メラミンナノ粒子の代わりにStreptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いて実施した以外は、実施例22と同様な方法を実施して評価スライドを作製した。Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate (インビトロジェン社製)を用いた第二の免疫染色の実施方法は比較例2に記載した通りである。得られた評価スライドを評価した。評価結果を表1−2に示す。
表1に示すように、隣接する別の組織切片の評価スライドを使用した場合であっても、第一の免疫染色の染色像と第二の組織切片の染色像を比較することにより、特定の組織、細胞上の第二の生体物質の発現位置(第二の免疫染色の蛍光染色画像の輝点、輝度分布の位置)を特定することができた(実施例)。また、同一の組織切片の評価スライドを使用した場合には、スライドを変えることなく、第二の生体物質の発現位置を容易かつ正確に特定することができた(実施例)。なお、第一の免疫染色を行わない場合は、特定の組織、細胞に対する第二の生体物質の発現位置を特定することは困難であった(比較例)。
2・・・VEGFR2
Claims (4)
- 組織切片における生体物質の定量法であって、
(1)前記組織切片における第一の生体物質を特異的に染色する明視野観察可能な免疫染色(第一の免疫染色)を行い、
(2)前記組織切片における第二の生体物質を特異的に染色する蛍光物質内包ナノ粒子による免疫染色(第二の免疫染色)を行い、
(3)第一の免疫染色の染色像の位置と第二の免疫染色の染色像の位置を比較することによって、前記組織切片における第二の生体物質の発現位置を特定し、
(4)第二の免疫染色の染色像の蛍光量を測定することによって、第二の生体物質の発現量を特定する、
ことを含む定量法。 - 前記の第一の免疫染色の染色像と前記の第二の免疫染色の染色像の重なった位置について、前記の第二の免疫染色の染色像の蛍光量を測定する、請求項1に記載の定量法。
- 前記の第一の免疫染色と前記の第二の免疫染色を同一の組織切片について行う、請求項1又は2に記載の定量法。
- 下記(I)および(II)の少なくとも一方を満たす請求項1〜3のいずれか一項に記載の定量法。
(I)前記第一の生体物質が、CD31、CD34、またはポドプラニンである。
(II)前記第二の生体物質が、VEGFR−1、VEGFR−2、またはVEGFR−3である。
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