JP4599568B2 - 腎障害の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、腎障害、とくに、傷害の激しい糸球体上皮障害を判定する腎障害の判定方法に関する。

現在、腎障害（腎不全）治療のための透析医療費は１兆円を超え、全医療費の約３%を占め、腎障害患者数は年々増加している。そして、その腎障害の中で、糸球体上皮が様々な原因により機能的あるいは構造的な障害を受けるものを糸球体上皮障害という。

ここで、糸球体上皮細胞は、ポドサイトと呼ばれ、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の外面に並ぶ、高度に分化した細胞である。ポドサイトは、濾過関門の確定的な成分であり、そして、ネフリン、ポドシン及びα‐アクチニン‐４のような、それらの特異蛋白の遺伝子突然変異が腎疾患蛋白尿の原因となることが見出されて来ている（非特許文献１及び非特許文献２）。位置的に、それらは貫壁性静水圧に曝されている。ポドサイトは、アクチン、ミオシン、そして、収縮能を持つ可能性が示唆されているアンジオテンシンIIのような血管作用薬の特定のレセプターを含む（非特許文献３及び非特許文献４）。それはまた、それらが、糸球体毛細血管の圧力の変化に反応し、それによって、灌流圧の変化に対して糸球体濾過量を調節する（非特許文献２〜非特許文献４）。

そして、その糸球体上皮障害の原因としては、炎症細胞から放出される活性酸素、蛋白分解酵素、あるいは血清中の毒素やメディエーターなどが考えられている。また、糸球体上皮障害は、腎硬化症に直接結びつく病態である。そのため、糸球体上皮障害を非浸襲的な方法で検出することは、糸球体上皮障害の早期発見につながり、腎硬化症への進展を阻止する早期治療を行うためにも、非常に重要である。

これまでに、ポドカリキシンなどの糸球体上皮特異蛋白をマーカーとして、非浸襲的な検出方法で糸球体上皮障害を判定しようとする例がある。

特許文献１には、簡便で所要時間が短く、かつ、ヒトポドカリキシンの定量も可能な、腎炎の診断に適用することができる、ヒトポドカリキシンの測定方法が開示されている。そして引用文献１の方法は、固相に結合した第１の抗ヒトポドカリキシン抗体と検体とを反応させた後、前記第１の抗ヒトポドカリキシン抗体とは対応エピトープが異なる第２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を反応させ、次いで固相に結合した該第２の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を測定することにより、検体中のヒトポドカリキシンを測定することができるというものである。

また、特許文献２には、腎障害に関連して見られる物質、例えば尿中のポドカリキシンおよび／またはネフリンを測定することによる、簡便な腎障害の検査手段が開示されている。そして引用文献２の方法は、腎障害に関連して見られるポドサイトの表面に存在するタンパク質を細胞表面から遊離させる処理を施すことにより、尿中に含有される細胞表面に存在する物質および／または遊離の物質を測定することができるというものである。
Schmid H,Henger A,Cohen CD,et al.:Gene expression profiles of podocyte-associated molecules as diagnostic markers in acquired proteinuric diseas.J Am Soc Nephrol 14:2958-2966,2003 Mundel P,Shankland SJ:Podocyte biology and response to injury.J Am Soc Nephrol 13:3005-3015,2002 Morton Mj,Hutchinson K,Mathieson PW,et al:Human podocytes possess a glomerular filtration.J Am Soc Nephrol 15:2981-2987,2004 Pavenstadt H,Kriz W,Kretzler M:Cell biology of glomerular podocyte.Physiol Rev 83:253-307,2003 特開平６−１１５０７号公報 国際公開第ＷＯ２００２／０３７０９９号パンフレット

ポドサイトは、炎症状態下でそれらの表現型を大きく変える。半月体形成性糸球体腎炎において、ポドサイト由来の細胞は一部、新たな半月体の形成過程に関与する。しかしながら、半月体細胞は、ポドカリキシンのようなポドサイト特異的マーカーを完全に欠く（J Am Soc Nephrol 15:61-67,2004）。崩壊する巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）のような進行性の糸球体症が、成熟ポドサイトマーカーの発現の減弱あるいは欠失を示すのに対して、そのような特異性のある成熟ポドサイトマーカーの発現は、大量の蛋白尿にもかかわらず、微小変化型疾患においてノーマルレベルを保つことを見出している（J Am Soc Nephrol 10:51-61,1999）。そして、ポドサイトの特異的マーカーは、傷害を受けるとその表面から消失し、それは、進行性の糸球体硬化症と関係している可能性があった。

また、糸球体上皮は、障害を受けると特異蛋白を欠失しやすく、従来、ポドカリキシン以外には尿で検出できる蛋白が報告されていなかった。

そのため、糸球体上皮が障害を受けた際に、ポドカリキシン以外に尿で検出できる蛋白を発見することは、その蛋白を糸球体上皮障害の判定に利用するためのマーカーとして使用するためにも、非常に重要であった。

そこで、本発明は、障害を受けると特異蛋白を欠失しやすい糸球体上皮の、ポドカリキシン以外に尿で検出できる蛋白をマーカーとして使用し、非浸襲的な方法で糸球体上皮障害を判定することが可能な、腎障害の判定方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイを用いて腎臓に発現する遺伝子を網羅的に検出した本発明者らの研究（J Immunol 2003 Mar 15;170(6):3377-85）から、これまでに腎糸球体での発現が知られていなかった蛋白、ＳＭ２２αが傷害された糸球体の上皮細胞に発現することを見出した（Nephron Experimental Nephrology, in press）。詳細には、抗ＧＢＭ半月体形成性糸球体腎炎を伴うラット腎臓における、その遺伝子発現プロファイルを明らかにした。生後３日及び腎炎発症後７日に、強く発現したひとつの遺伝子は、ＳＭ２２αであった。そこで、本発明者らは、抗ＧＢＭ腎炎腎臓におけるＳＭ２２αの局在とその病理学的意義を詳細に調べた。そして、抗ＧＢＭ腎炎発症の際の、体腔内及び内臓の糸球体上皮細胞におけるＳＭ２２αの誘導発現を明らかにした。抗ＧＢＭ腎炎におけるその上皮細胞は、傷害されるとそれらの表現型が大きく変化し、そのため、平滑筋マーカーであるＳＭ２２αが発現する可能性があった。

そして本発明者らは、ＳＭ２２αが、糸球体上皮細胞障害のないヒトの尿検体では検出できず、腎生検で糸球体上皮細胞障害が激しい患者の尿検体では検出されることを発見した。このことから、本発明者らは、上皮細胞障害を示す各種腎疾患において、ＳＭ２２αが尿中に出現することが、糸球体上皮細胞障害を判定するための、マーカーの１つとなりうることを見出した。

ここで、上述のように、糸球体上皮は、障害を受けると特異蛋白を欠失しやすく、従来、ポドカリキシン以外には尿で検出できる蛋白が報告されていなかった。そのため、ＳＭ２２α蛋白が糸球体上皮に発現すること、そして、糸球体上皮障害を判定するためのマーカーの１つとなりうること、という今回の発見は重要であった。しかも、ポドカリキシンは細胞膜蛋白であるが、ＳＭ２２αは細胞質蛋白であること、ポドカリキシンまたはネフリンの発現が減弱あるいは欠失した傷害の強い細胞に発現することがわかった。このことから、今後、ポドカリキシンとは違った意味付けがなされる可能性があり、今後の検討によって、臨床的により重要な意義が見出される可能性がある。

このように、上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、ＳＭ２２αをＰＣＲ法または免疫化学的方法またはＥＬＩＳＡ法により検出するという、非浸襲的な検出方法で、腎障害、とくに傷害の激しい糸球体上皮障害を判定できることを見出し、本発明に想到した。

本発明における請求項１記載の腎障害の検出方法は、尿中のＳＭ２２αを検出することを特徴とする。

本発明における請求項２記載の腎障害の検出方法は、請求項１において、前記ＳＭ２２αの検出をＰＣＲ法または免疫化学的方法またはＥＬＩＳＡ法により行うことを特徴とする。

本発明における請求項３記載の腎障害の検出方法は、請求項２において、前記ＰＣＲ法をＳＭ２２α特異的プライマーを用いて行うことを特徴とする。

本発明における請求項４記載の腎障害の検出方法は、請求項２において、前記免疫化学的方法を抗ＳＭ２２α抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察することにより行うことを特徴とする。

本発明における請求項５記載の腎障害の検出方法は、請求項２において、前記ＥＬＩＳＡ法を抗ＳＭ２２α抗体を用いて行うことを特徴とする。

本発明における請求項６記載の腎障害の検出方法は、請求項１において、前記尿が遠心分離法により得られた尿沈渣または尿上清であることを特徴とする。

本発明における請求項７記載の腎障害の検出方法は、請求項１〜６において、前記腎障害が糸球体上皮障害であることを特徴とする。

本発明における請求項８記載の腎障害の検出方法は、請求項７において、前記糸球体上皮障害が、ポドカリキシンまたはネフリンの発現が減弱あるいは欠失した障害の激しい糸球体上皮障害であることを特徴とする。

糸球体上皮障害は腎硬化症に直接結びつく病態である。そのため、これを非侵襲的な尿検査で検出できることは、糸球体上皮障害の早期発見につながり、腎硬化症への進展を阻止する早期治療を実施することができる。また、糸球体上皮障害を早期に発見し、早期治療を実施することにより、透析療法を必要とする腎不全患者の増加に歯止めをかけることが期待できる。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明における腎障害の判定方法は、尿中のＳＭ２２αを検出することを特徴とする。

ここで、ＳＭ２２αは、血管平滑筋に強く発現している２２ｋＤａの細胞骨格蛋白であり、収縮性の平滑筋細胞（ＳＭＣｓ）のマーカーとして有名である（Differentiation 55:1-11,1993， J Biol Chem 262:5985-5991,1987）。それは、ＳＭＣｓにおいて特異的に発現する。そして、トランスゲリン（J Cell Biol 121:1065-1073,1993）、ｐ２７（Exp Cell Res 181:518-530,1989）及び、ＷＳ３−１０（Biochem Biophys Res Commun 187:1-7,1992）としても知られる。

インビトロにおいて、ＳＭ２２αは、脱分化した継代末期のＳＭＣｓでは発現しないが、継代初期のＳＭＣｓにおいては強く発現する（Circ Res 73:193-204,1993， Development 122:2415-2425,1996）。ＳＭ２２αの機能は未だ十分に解明されていない。ＳＭ２２α欠損マウスは正常に発達し、組織学的に正常コントロールマウスと同様のように見える（Mol Cell Biol 21:1336-1344,2001）。しかしながら、ＳＭ２２αはアテローム硬化性ＳＭＣｓにおいては発現が低下し、アポEリポ蛋白とＳＭ２２α欠損の掛け合わせマウスでは、アテローム性動脈硬化病変の悪化をもたらす。それは、ＳＭ２２αが、動脈硬化において、収縮性から増殖性へのＳＭＣｓの表現型の変化をコントロールする可能性を示唆している（Circ Res 94:863-865.Epub 2004 Mar 2025,2004）。

また、ＳＭ２２αは、糸球体上皮細胞障害のないヒトの尿検体では検出できず、腎生検で糸球体上皮細胞障害が激しい患者の尿検体では検出された。したがって、尿中のＳＭ２２αを検出することにより、腎障害を判定することができる。

そして、特定の方法に限定されるものではないが、前記ＳＭ２２αの検出には、ＰＣＲ法または免疫化学的方法またはＥＬＩＳＡ法が好適に用いられる。

そして、前記ＰＣＲ法は、ＳＭ２２α特異的プライマーを用いて行う。

そして、前記免疫化学的方法は、抗ＳＭ２２α抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察することにより行う。

そして、前記ＥＬＩＳＡ法は、抗ＳＭ２２α抗体を用いて行う。

そして、前記尿は、遠心分離法により得られた尿沈渣または尿上清である。

ここで、ＳＭ２２αの検出を、ＰＣＲ法により行う場合、及び、免疫化学的方法により行う場合は、尿沈渣が好適に用いられる。

そして、ＥＬＩＳＡ法により行う場合は、尿上清が好適に用いられる。

このように、本発明における腎障害の判定方法により、腎障害、とくに糸球体上皮障害、中でも、ポドカリキシンまたはネフリンの発現が減弱あるいは欠失した傷害の激しい糸球体上皮障害を非浸襲的な検出方法で判定することができる。

以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。

［方法］
（動物）
雄WKYラット（７週齢）体重１９０−２１０ｇは、チャールズリバージャパン（横浜，日本）から購入し、ラットを、無作為に２つのグループに分け、初日に、ラット抗ＧＢＭ腎炎の導入のために、一つのグループのラットに、ウサギ抗ＧＢＭ血清（２００μｌ，約２ｍｇのＩｇＧを含んでいる）（Nephron 68:360-365,1994）を静脈注射により投与した。７日目に、ラットをジエチルエーテル吸入により麻酔し、それらの腎臓を摘出した。腎組織は、ノーザンブロット分析と免疫蛍光顕微鏡法のために凍結し、また、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法のために４％パラホルムアルデヒドで固定し、また、免疫組織化学的分析のためにカルノア液で固定した。別のグループは、ネガティブコントロールとして、ラットは抗ＧＢＭ血清投与せず、腎臓サンプルを前述の同じ方法で採取した。

（テンプレート調製）
全長のＳＭ２２αコーディング領域（６０１ｂｐ）のｃＤＮＡを増幅するために、2つのプライマー、５’‐ＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＴＣＣＡＴＣＣＴＡＴ‐３’、そして、５’‐ＡＣＴＧＡＴＣＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＧ‐３’を使用してＰＣＲを行った。そのＰＣＲ産物は、ノーザンブロットとｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法に用いるためｐＧＥＭ‐Ｔ（プロメガ コーポレーション，マディソン，ＷＩ）に挿入した。

（ノーザンブロット分析）
腎臓を摘出した後、腎組織は液体窒素中で凍結し、分析まで−８０℃で保存した。ホモジナイズした後、その組織サンプルのトータルＲＮＡを、メーカーのプロトコルに従って、ＲＮＡ抽出溶液（アイソジェン，ニッポンジーン，東京，日本）を用いて抽出した。ノーザンブロッティングのために、トータルＲＮＡを、１．５％アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン膜（ハイバンド Ｎ，アマシャム）に転写した。ラットＳＭ２２αのための^３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブは、ランダム プライムド ＤＮＡ ラベリング キット（ロシュ ダイアグノスティック，マンハイム，ドイツ）を用いて合成し、そのＲＮＡとともにハイブリダイズした。内在性コントロールとして、ＧＡＰＤＨを同じ膜上で検出した。Ｂａｓ ２０００（富士 フィルム，東京，日本）による放射線強度測定後、ＳＭ２２αのＧＡＰＤＨ発現に対する相対比率を標準化した。3回の実験結果から、スチューデントのｔ検定により統計的解析を行った。

（Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション）
ラットＳＭ２２αｃＲＮＡを用いてＩｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行った（Kidney Int 59:959-974,2001）。DIG ＲＮＡラベリングキット（ＳＰ６／Ｔ７；ロシュ）を用い、インビトロでジゴキシゲニン標識プローブの合成を行った。ＳＭ２２αアンチセンスｃＲＮＡプローブとセンスプローブ（ネガティブコントロール）は、同じテンプレートから合成し、ハイブリダイゼーションに使用した。以下の免疫学的検出方法は、DIG nucleic acid 検出キット（ロシュ）を用いて行った。

（組み換え型蛋白）
インフレームのＳＭ２２αｃＤＮＡ（２６０ｂｐ；８５番から１７０番を形成するアミノ酸のフルレングスの４３％に対応する）断片は、２つのプライマー；５’‐ＴＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧ‐３’、５’‐ＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧ‐３’を用いたＰＣＲにより準備した。そのＰＣＲ産物を、ｐＱＥ‐３０ＵＡベクター（キアゲン サイエンス，メリーランド，ＵＳＡ）に組み込み、そのベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ストレインＪＭ１０９（Toyobo，大阪，日本）に導入した。６ｘヒスチジンタグを付けたＳＭ２２α組み換え型蛋白（ｒＳＭ２２α）の生産物は、３７℃で４時間、１ｍMのイソプロピル‐β‐Ｄ‐１‐チオガラクトピラノシドで誘導した。その後、超音波により溶解し、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、ＱＩＡエクスプレスタイプIＶキット（キアゲン）を用いて、アフィニティー精製を行った。ｒＳＭ２２αの分子サイズは、約１０ｋＤａである。ウサギ抗ｒＳＭ２２α抗血清を得るために、ヒスチジンタグを付けたｒＳＭ２２α蛋白１ｍｇを等容積の完全フロイントアジュバント（ＦＡ）と混合し、ウサギの皮下に注射した。３週間後、ｒＳＭ２２α １ｍｇと不完全ＦＡを３週間おきに投与した。免疫投与開始後９週間、ウサギから採血し、血清を収集した。その抗ｒＳＭ２２αＩｇＧ抗体は、ハイトラップNHS-activated HPおよびハイトラッププロテインＧ ＨＰ（アマシャム バイオサイエンシーズ，ウィクストームス，スウェーデン）を用いて、アフィニティークロマトグラフにより精製した。

（ウェスタンブロット分析）
抗体の特異性を評価するために、１％トリトン‐Ｘ／リン酸緩衝液／プロテイナーゼ阻害剤を用いて正常ラットの大動脈から用意した溶解物１μｇを、還元性条件下で１６％ゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その蛋白は、二フッ化ポリビニリデン膜に転写し、ＴＢＳＴ（２０ｍＭ トリスＨＣＩ，ｐＨ８．０，０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５％トウィーン２０）で溶解した１０％粉末ミルクでブロッキングした。その後、ウサギ抗ｒＳＭ２２α抗体（１００μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩処理した。ペルオキシダーゼ複合体ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ，バーミンンガム，ＡＬ）は二次抗体として用いた。そして、ＥＣＬ（ウェスタンブロッティング検出試薬，アマシャム）を用いて可視化した。免疫前正常ウサギＩｇＧを抗体のコントロールとして使用した。

（免疫組織化学法）
腎臓組織はカルノア液で固定し、パラフィンに包埋し、１０μｍの薄切片とした。切片は、キシレン中で脱パラフィンし、１００％エタノールで再水和した。スライドは、１０分間、３％Ｈ_２Ｏ_２（ＰＢＳで溶解）で固定し、そして、１５分間、３％ＢＳＡ（ＰＢＳで溶解）でブロッキングした。ＳＭ２２αの検出のために、スライドを、４℃で一晩、ウサギ抗ｒＳＭ２２α抗体（１００μｇ／ｍｌ）で処理した。そして、二次抗体として、ペルオキシダーゼ複合体ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ダコ，カーピンテリア，ＣＡ）で処理した。その免疫複合体は、３，３’‐ジアミノベンジジン４塩酸塩（ダコ）で検出した。そして、対比染色はヘマトキシリンで行った。コントロール切片は、抗ｒＳＭ２２α抗体の代わりに、免疫前正常ウサギＩｇＧ（ジムド）で処理した。

（免疫蛍光顕微鏡法）
ビオチン標識ウサギ抗ｒＳＭ２２α抗体を得るために、抗ｒＳＭ２２α抗体を、ハイトラップ ＮＨＳアクティベイト ＨＰ（アマシャム）を用いて、イムノアフィニティークロマトグラフ法により精製した。そして、ビオチンラベリングキットＮＨ_２（同仁化学研究所，熊本，日本）を用いてビオチン標識した。二重標識のために、凍結腎臓組織を３μｍの薄切片にカットし、アセトンで１時間固定した。その連続切片は、ビオチンブロッキングシステム（ダコ）でブロッキングし、ビオチン標識したウサギ抗ｒＳＭ２２α抗体（１２μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩処理した。そして、その後、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識ストレプトアビジン（ＢＤバイオサイエンシーズファーミンゲン）で処理した。つぎに、そのスライドは、マウス抗ポドカリキシン抗体（４Ｄ５）（原正則医師により提供された）（Nephron Clin Pract 95:c91-99,2003， J Am Soc Nephrol 14:3111-3126,2003）、あるいは、ポドサイトマーカーとして、抗ネフリン抗体（ｍＡｂ ５‐１‐６）（J Immunol 141:807-814,1988， Kidney Int 57:1949-1961,2000）で処理した。続いて、抗ポドカリキシン抗体のためにローダミン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ、あるいは、抗ネフリン抗体のためにローダミン標識抗マウスＩｇＧ１（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ，バーミンガム，ＵＳＡ）で処理した。さらに、二重染色は、抗ｒＳＭ２２α抗体と汎白血球マーカーとして抗ＯＸ‐１抗体（セロテック，オックスフォード，ＵＫ）、内皮細胞マーカーとして抗ＲＥＣＡ‐１抗体（セロテック）、あるいは、メサンギウム細胞マーカーとして抗ＯＸ‐７抗体（セロテック）を用いて行った。二次抗体として、ローダミン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ）を使用した。コントロール切片は、抗ラットｒＳＭ２２α抗体の代わりに、ビオチン標識した正常ウサギＩｇＧ（ジムド）を用いて処理した。

（結果）
［ノーザンブロット分析によるＳＭ２２α発現の上昇の確認］
本発明者らは、抗ＧＢＭ腎炎ラット腎臓における、網羅的な遺伝子発現のプロファイルを発表した（J Immunol 2003 Mar 15;170(6):3377-85）。その中で、腎炎モデル経過中に、ＳＭ２２αの遺伝子発現が上昇したことを見出した。そこで、本発明者らはまずノーザンブロット分析によりその発現の増加を確認した。図１に示されるように、ＳＭ２２αｍＲＮＡは、コントロールラットの腎臓においても構成的に発現していたが、抗ＧＢＭ腎炎ラットにおいて平均２．７倍増加した（図１）。

図１：Ａ）ノーザンブロットは、ＳＭ２２αの^３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブ（ａ，ｂ）、あるいはハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＨＤ（ｃ，ｄ）で行った。正常ラット（ａ，ｃ）、または、抗ＧＢＭ腎炎ラット（ｂ，ｄ）の腎臓からのトータルＲＮＡ（３０μｇ）を泳動した。図は、独立した３実験から、代表的な結果を提示した。Ｂ）ＳＭ２２αとＧＡＰＨＤのメッセージの放射線強度は、Ｂａｓ‐２０００（富士フィルム）で測定した。コントロール（ａ）と抗ＧＢＭ腎炎ラット腎臓（ｂ）からのＳＭ２２αのＧＡＰＤＨに対する比率を示した（ｎ＝３，^＊ｐ＜０．０５）。

［腎臓におけるＳＭ２２αｍＲＮＡ及びＳＭ２２α蛋白の局在］
抗ＧＢＭ血清の投与後７日に、糸球体に細胞増殖を伴う半月体形成と線維素析出及び多核巨細胞がボーマン嚢腔に観察された。この時点の腎臓組織を用いて、ラットＳＭ２２αｃＲＮＡプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法によりｍＲＮＡの発現の局在を調べた（図２）。抗ＧＢＭ腎炎の腎臓組織切片を、ＳＭ２２αのアンチセンスｃＲＮＡプローブ（ａ）、あるいは、センスプローブ（ｂ）とともにハイブリダイズした。（倍率：ｘ４００）。図２に示すように、抗ＧＢＭ腎炎ラット腎臓において、ＳＭ２２αｍＲＮＡは、血管と糸球体上皮細胞（ボーマン嚢上皮細胞とポドサイト）において発現していた。コントロールラット腎臓においては、糸球体では発現しなかったが、血管においてのみ発現した。

腎臓におけるＳＭ２２αを蛋白レベルで検出するために、本発明者らは、ヒスチジンタグを付けたラット組み換え型ＳＭ２２α（ｒＳＭ２２α；約１０ｋＤａ, 図３a-e）でウサギに免疫投与することにより、抗ラットｒＳＭ２２α抗体を用意した。免疫投与後の血清は、抗ｒＳＭ２２α ＩｇＧとしてアフィニティー精製した。その抗ｒＳＭ２２α ＩｇＧは、２２ｋＤａの大動脈の蛋白を特異的に認識した（図３f,g）。

図３：
発現ベクターに組み込んだＳＭ２２αを大腸菌(JM109)に導入し、in vitroで、rＳＭ２２αを発現誘導した。誘導前(a),誘導後の菌溶解液(b),アフィニティーカラムで処理する前の菌溶解液上清(c), アフィニティーカラムからの抽出物(d:pH5.9, e:pH4.5 条件下での抽出物)をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより展開し、クマシーブルー染色した。ｒＳＭ２２αは分子量約10 kDaである。

このｒＳＭ２２αをウサギに免疫し、得られた抗ｒＳＭ２２α抗体の特異性を確かめるために、正常ラットからの大動脈の溶解物１μｇを、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより展開した。その後、二フッ化ポリビニリデン膜に転写（トランスファー）し、抗ｒＳＭ２２αＩｇＧ抗体(g)あるいは免疫前のウサギＩｇＧ抗体(f)とともに処理し、続いて、ペルオキシダーゼ複合体ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体により処理した。特異的なバンドを矢印で示した。

つぎに、抗ＧＢＭ腎炎ラットの腎臓切片において、この抗体を用いて免疫組織化学的研究を行った。そして、半月体細胞とボーマン嚢上皮細胞とポドサイトにおけるＳＭ２２αの局在を確かめた。図４に示すように、血管壁における強い染色は、抗ＧＢＭ腎炎ラットとコントロールの両方に観察された。そして、ＳＭ２２α蛋白の分布は、ＳＭ２２αｍＲＮＡの分布とほとんど一致していた。抗ＧＢＭ腎炎（ａ，ｂ）あるいはコントロール（ｃ，ｄ）ラットの腎臓からのパラフィン切片は、ウサギ抗ｒＳＭ２２αＩｇＧ（ａ，ｃ）あるいはコントロールウサギＩｇＧ（ｂ，ｄ）で処理した。そして、その後、ペルオキシダーゼ複合体ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体で処理した。（倍率：ｘ４００）

［ＳＭ２２αとほかの特異的マーカーとの位置関係］
ＳＭ２２αとほかのポドサイト特異的マーカーとの関係を調べるために、初め、抗ｒＳＭ２２α抗体と抗ポドカリキシン抗体を用いて二重蛍光免疫染色を行った。まず、抗ＧＢＭ腎炎（上パネル）とコントロールラット（下パネル）の腎臓の凍結切片をビオチン標識ウサギ抗ｒＳＭ２２αＩｇＧ抗体と抗ポドカリキシン抗体で二重染色した。（倍率：ｘ４００）図５に示すように、ポドカリキシンは、コントロールの糸球体のポドサイトにおいて全体的に検出された。しかしながら、抗ＧＢＭ腎炎においては、ポドカリキシンは部分的に欠損していた。ＳＭ２２αは、ポドカリキシンが欠失あるいは減弱した糸球体の上皮細胞において発現することが示された。

つぎに、ほかのポドサイト特異的マーカーであるネフリンを用いて、ＳＭ２２αの局在を確認した。抗ＧＢＭ腎炎（上パネル）とコントロールラット（下パネル）の腎臓の凍結切片で、ビオチン標識ウサギ抗ｒＳＭ２２αＩｇＧ抗体と抗ネフリン抗体で二重染色を行った。（倍率：ｘ４００）図６に示されるように、抗ＧＢＭ腎炎腎臓の糸球体は、ネフリンの発現を部分的に欠いていた。ＳＭ２２αは、糸球体のそのような領域に検出された。そして、それは、どの細胞におけるネフリンとも共染色されなかった。

ＳＭ２２αが、抗ＧＢＭ腎炎腎臓の糸球体において、ほかの細胞成分の発現との関係を調べるために、抗ｒＳＭ２２α抗体と汎白血球マーカーであるＯＸ‐１を用いて、二重染色を行った。抗ＧＢＭ腎炎（上パネル）とコントロールラット（下パネル）の腎臓の凍結を、ビオチン標識ウサギ抗ｒＳＭ２２αＩｇＧ抗体と抗ＯＸ‐１抗体で二重染色した。（倍率：ｘ４００）抗ＧＢＭ腎炎において、ＯＸ‐１は、糸球体の浸潤白血球に検出された（図７）。ＳＭ２２αの局在はＯＸ‐１の局在と一致していなかった。

また、ＳＭ２２αと内皮細胞の特異的マーカーであるＲＥＣＡ‐１、及び、ＳＭ２２αとメサンギウム細胞のマーカーであるＯＸ‐７との二重染色を行った。抗ＧＢＭ腎炎（上パネル）とコントロールラット（下パネル）の腎臓の凍結切片を、ビオチン標識ウサギ抗ｒＳＭ２２αＩｇＧ抗体と抗ＲＥＣＡ‐１抗体、及び、ビオチン標識ウサギ抗ｒＳＭ２２αＩｇＧ抗体と抗ＯＸ‐７抗体で二重染色した。（倍率：ｘ４００）ＳＭ２２αは、ＲＥＣＡ‐１（図８）とＯＸ‐７（図９）のどちらとも共染色されなかった。

上記の結果は、ＳＭ２２αが、抗ＧＢＭ腎炎が発症した際に、ポドサイトの特異的マーカーであるポドカリキシンとネフリンが減弱あるいは欠失した激しく損傷したポドサイトと、傷害を受けたボウマン嚢上皮細胞において、誘導的に発現することが示された。

（考察）
ＳＭ２２αの発現の増加は、ＤＮＡマイクロアレイを用いたラット抗ＧＢＭ腎炎モデルの本発明者らの網羅的な遺伝子発現分析において認められた（J Immunol 2003 Mar 15;170(6):3377-85）。この研究において、本発明者らは、この腎炎が発症すると、ＳＭ２２αがポドサイトとボウマン嚢上皮細胞に新たに発現することを解明した。また、ＳＭ２２αが、成熟分化したポドサイト特異的マーカーであるポドカリキシンとネフロンが減弱あるいは欠失したポドサイトにおいて、発現することを見出した。ポドサイトは、炎症状態下において傷害を受けると、表現型を変化させることが良く知られている（J Am Soc Nephrol 15:61-67,2004， J Am Soc Nephrol 10:51-61,1999， Kidney Int 53:918-925,1998）。

糸球体上皮細胞は、発生学的には、間葉系組織に由来する（J Am Soc Nephrol 14 Suppl 1:S42-47,2003）。傷害を受けると、それらは間葉系の形質に分化転換する（J Am Soc Nephrol 14 Suppl 1:S42-47,2003， Nephrol Dial Transplant 17 Suppl 9:11-15,2002）。成熟ポドサイトは、アクチン、ミオシン、α‐アクニチン、タリン及びビンキュリンのような、主要な収縮性蛋白を含む筋肉装置を備えた収縮性の筋細胞の性格を有する（Lab Invest 59:673-682,1988）。そのため、平滑筋細胞マーカーであるＳＭ２２αの発現は、激しく傷害されたポドサイトにおける、表現型の変化あるいは細胞の分化転換の結果であると理解される。その体腔壁の上皮細胞もまた、ラット抗ＧＢＭ糸球体腎炎における半月体形成において、分化転換を示すことが分かっている（Nephrol Dial Transplant 14:2860-2872,1999， Nephron 92:203-212,2002）。これらの糸球体上皮細胞において、ＳＭ２２αの発現は、新たな分化転換の一つと見なことができる。

ただし、ほかの細胞が、傷害されたポドサイトが糸球体基底膜から離れた後、置き替わる可能性がある。汎白血球のマーカーであるＯＸ‐１は、ＳＭ２２αと共局在していなかったため、そして、通常ＳＭ２２αを発現している平滑筋細胞は、たとえ、激しい炎症状態下においても、内臓あるいは体腔壁の糸球体の上皮組織に移動し、置き替わることは考えられないため、ＳＭ２２αの発現は、傷害された上皮細胞の表現型変化の結果と見なすことができるのではないか。しかしながら、ポドサイトに遺伝的にタグを付けたマウスを用いて、ポドサイトが傷害されると、体腔壁上皮細胞は糸球体の表面に移動する可能性があることが示されている（J Am Soc Nephrol 16:2257-2262,2005）。抗ＧＢＭ腎炎が誘発されると、ボウマン嚢上皮細胞もまた、ＳＭ２２αを発現したので、糸球体係蹄表面におけるＳＭ２２α陽性細胞の一部は、ボウマン嚢上皮細胞に由来する可能性があった。しかしながら、時折、ポドカリキシンとＳＭ２２αが近接して陽性になるので、糸球体係蹄表面の上皮におけるＳＭ２２αの発現は、少なくとも一部分において、ポドサイトの表現型の変化の結果であることを示唆していた。

傷害されたポドサイトにおけるＳＭ２２αの発現の機能的意義は、不明のままである。ポドサイトは元来、収縮装置を備えているため（Lab Invest 59:673-682,1988）、それらの表現型の変化は、より大きな収縮性をもたらす可能性がある。あるいは、血管壁の平滑筋細胞におけるＳＭ２２αの役割は、硬化性血小板形成のレギュレーターであることが示唆されているので（Circ Res 94:863-865. Epub 2004 Mar 2025,2004）、傷害された糸球体上皮細胞におけるＳＭ２２αの発現誘導は、炎症性損傷に対する防御に関与する可能性がある。

腎臓病に関連するほかの平滑筋細胞特異的蛋白としては、α‐平滑筋細胞アクチン（α‐ＳＭＡ）がある。腎臓細胞におけるα‐ＳＭＡの新たな発現は、糸球体硬化症と管状間質性線維症を引き起こす、細胞の筋線維芽細胞への変化を意味する（Kidney Int 41:530-532,1992， Exp Nephrol 3:308-318,1995， Kidney Int 41:1134-1142,1992， J Am Soc Nephrol 5:201-209,1994， Nephrol Dial Transplant 13:1652-1661,1998）。とくに、メサンギウム細胞におけるその発現は、細胞増殖と関連することが見出された（J Clin Invest 87:847-858,1991）。その後、ラットＴｈｙ１腎炎（J Clin Invest 87:847-858,1991）、及び、ヒトＩｇＡ腎症（Nephrol Dial Transplant 9:1418-1425,1994， Am J Kidney Dis 34:902-910,1999）におけるメサンギウム細胞傷害のマーカーとして認められている。しかしα‐ＳＭＡは、以前の報告（J Clin Invest 87:847-858,1991）でも本発明者ら（データ示さず）によっても、ＳＭ２２αと対照的に、ポドサイトを含むラット抗ＧＢＭ腎炎腎臓のどの糸球体細胞においても検出されなかった。そしてそれは、その二つの分子が、腎臓疾患において異なる特性と機能を持っている可能性を示唆している。

結論として、本発明における研究は、平滑筋細胞特異的マーカーであるＳＭ２２αが、抗ＧＢＭ腎炎における激しく傷害された糸球体上皮細胞において、新規に発現することを示した。興味深いことに、ＳＭ２２α発現は、ポドカリキシンまたはネフリンが減弱あるいは欠失しているポドサイトにおいて誘導的に発現していた。したがって、糸球体におけるＳＭ２２αの発現は、炎症状態下における糸球体血管壁傷害と上皮障害の優れたマーカーである可能性がある。

（ＰＣＲ法によるＳＭ２２αの検出）
新鮮尿５０−２００ｍｌから遠心分離法（１５００ｒｐｍ，５分間）により尿沈渣を得た。ＳＭ２２α特異的プライマーは、一般的な方法で作製した。尿沈渣からトータルＲＮＡを採取し、ＲＴ‐ＰＣＲ法によりＳＭ２２αの検出を行った。

ＳＭ２２αは、糸球体上皮細胞障害のないヒトの尿検体では検出されず、腎生検で激しい糸球体上皮細胞障害が確認された患者の尿検体では検出された。このように、尿中のＳＭ２２αを検出することにより、腎障害、とくにポドカリキシンまたはネフリンの発現が減弱あるいは欠失している傷害の激しい糸球体上皮細胞障害を判定することができる。

Ａ）ＳＭ２２αの^３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブ（ａ，ｂ）、あるいはハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＨＤ（ｃ，ｄ）を用いたノーザンブロット分析結果を示す写真である。Ｂ）コントロール（ａ）と抗ＧＢＭ腎炎ラット腎臓（ｂ）からのＳＭ２２αのＧＡＰＤＨに対するシグナル強度の比率を示すグラフである。 抗ＧＢＭ腎炎腎臓（ａ，ｂ）とコントロール（ｃ，ｄ）におけるＳＭ２２αｍＲＮＡ発現の局在を示す、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション結果を示す顕微鏡写真である。（倍率：ｘ４００） ｒＳＭ２２αのin vitroでの誘導・作製過程と、抗ｒＳＭ２２α抗体の特異性を確かめるための、正常ラットの大動脈の溶解物のウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。 腎臓におけるＳＭ２２α蛋白の局在を示す、抗ＧＢＭ腎炎ラット（ａ，ｂ）とコントロールラット（ｃ，ｄ）の腎臓の免疫組織化学的分析結果を示す顕微鏡写真である。（倍率：ｘ４００） ＳＭ２２αとポドカリキシンの共免疫染色を示す、抗ＧＢＭ腎炎（上パネル）とコントロールラット（下パネル）の腎臓の蛍光顕微鏡写真である。（倍率：ｘ４００） ＳＭ２２αとネフリンの共免疫染色を示す、抗ＧＢＭ腎炎（上パネル）とコントロールラット（下パネル）の腎臓の蛍光顕微鏡写真である。（倍率：ｘ４００） ＳＭ２２αと汎白血球マーカーであるＯＸ‐１の共免疫染色を示す、抗ＧＢＭ腎炎（上パネル）とコントロールラット（下パネル）の腎臓の蛍光顕微鏡写真である。（倍率：ｘ４００） ＳＭ２２αと内皮細胞マーカーであるＲＥＣＡ‐１の共免疫染色を示す、抗ＧＢＭ腎炎（上パネル）とコントロールラット（下パネル）の腎臓の蛍光顕微鏡写真である。（倍率：ｘ４００） ＳＭ２２αとメサンギウム細胞マーカーであるＯＸ‐７の共免疫染色を示す、抗ＧＢＭ腎炎（上パネル）とコントロールラット（下パネル）の腎臓の蛍光顕微鏡写真である。（倍率：ｘ４００）

Claims (8)

1. 尿中のＳＭ２２αを検出することを特徴とする腎障害の検出方法。
2. 前記ＳＭ２２αの検出をＰＣＲ法または免疫化学的方法またはＥＬＩＳＡ法により行うことを特徴とする請求項１記載の腎障害の検出方法。
3. 前記ＰＣＲ法をＳＭ２２α特異的プライマーを用いて行うことを特徴とする請求項２記載の腎障害の検出方法。
4. 前記免疫化学的方法を抗ＳＭ２２α抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察することにより行うことを特徴とする請求項２記載の腎障害の検出方法。
5. 前記ＥＬＩＳＡ法を抗ＳＭ２２α抗体を用いて行うことを特徴とする請求項２記載の腎障害の検出方法。
6. 前記尿が遠心分離法により得られた尿沈渣または尿上清であることを特徴とする請求項１記載の腎障害の検出方法。
7. 前記腎障害が糸球体上皮障害であることを特徴とする請求項１〜６記載の腎障害の検出方法。
8. 前記糸球体上皮障害が、ポドカリキシンまたはネフリンの発現が減弱あるいは欠失した障害の激しい糸球体上皮障害であることを特徴とする請求項７記載の腎障害の検出方法。