BR112019020166A2

BR112019020166A2 - anticorpo que se liga especificamente a região n-terminal de lisil-trna sintetase exposta na membrana celular

Info

Publication number: BR112019020166A2
Application number: BR112019020166-1A
Authority: BR
Inventors: Sunghoon Kim; Hyun Bo Shim; Nam Hoon Kwon; Dae Young Han
Original assignee: Medicinal Bioconvergence Research Center
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2020-06-30
Also published as: CN110603055B; EP3610888A1; CA3058117A1; EP3610888A4; JP7345181B2; AU2018244677A2; CN110603055A; AU2018244677B2; RU2739393C1; JP2020515263A; CA3058117C; US11685791B2; AU2018244677A1; US20200102402A1

Abstract

The present invention relates to an antibody binding specifically to an N-terminal region of lysyl-tRNA synthetase which is exposed on the cell membrane and a use thereof and, more particularly, to an antibody having a certain complementary determining region (CDR) stipulated in the specification and binding specifically to an epitope including the sequence of SEQ ID NO: 97 in a lysyl-tRNA synthetase (KRS) N-terminal, or a fragment thereof, a use of the antibody or a fragment thereof in metastasis suppression and cancer diagnosis, and a pharmaceutical composition for prevention or treatment of an immune cell migration-related disease. Far superior in specific binding affinity to a KRS N-terminal region exposed on the cell membrane, the antibody or fragments thereof according to the present invention are effective for cancer diagnosis, have anti-cancer and metastasis inhibition effects, and can be very useful for preventing or treating an immune cell migration-related disease.

Description

ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A REGIÃO N-TERMINAL DE LISIL-TRNA SINTETASE EXPOSTA NA MEMBRANA CELULAR CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[01] O presente pedido reivindica prioridade do pedido de patente coreana No. 10-2017-0038775 depositado em 27 de março de 2017 e pedidos de patente coreana Nos. 10-2017-0118890 e 10-2017-0118917 depositados em 15 de setembro de 2017, respectivamente, cujas especificações inteiras são incorporadas aqui por referência em suas totalidades.

[02] A presente invenção refere-se a um anticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente a uma região N-terminal de lisi-tRNA sintetase exposta extracelularmente e uso deste e, mais especificamente, a um anticorpo ou fragmento — deste tendo sequências de região de determinação de complementaridade (CDR) particulares definidas no presente relatório descritivo e que se liga especificamente a um epítopo contendo a sequência de SEQ ID NO: 97 na N-terminal de lisil-tRNA sintetase (KRS), ao uso do anticorpo ou fragmento deste para a inibição de metástase do câncer, ao uso do anticorpo ou fragmento deste para o diagnóstico de câncer e a uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

TÉCNICA ANTERIOR

[03] Estudos recentes estabeleceram que Iisil-:RNA sintetase (KRS) humana geralmente presente no citosol é translocada para a membrana plasmática (membrana celular) para interagir com um receptor de laminina de 67 kDa (67LR) presente na membrana plasmática, dessa forma, promovendo a migração de células de tumor (ou de câncer) para afetar a metástase do câncer (Dae Gyu Kim et al., Chemical inhibition of prometastatic Iysyl-tRNA synthetase laminin receptor interaction, Nat Chem Biol. 2014 Jan; 10(1): 2934, Dae Gye Kim et. al. Interaction of two translational components, Iysyl-tRNA synthetase and p40/37LRP, in plasma membrane promotes laminin-dependent cell migration, FASEB J. (2012)26, 4142- 4159). A KRS humana (Nº de acesso Genbank NP 005539.1, etc) compreende uma extensão N-terminal (1-72), um domínio de ligação anticódon (73-209) e um domínio catalítico (220-597). A KRS humana é uma enzima essencial para a síntese de proteína e normalmente reside dentro do complexo de multitRNA sintetase (MSC) no citosol. No entanto, após a introdução de sinal de laminina, p38 MAPK fosforila KRS nos resíduos T52 e KRS é translocada para a membrana celular, onde KRS protege 67LR contra degradação mediada por ubiquitina. Também foi relatado que a KRS translocada para a membrana celular acelera a metástase do câncer pela estabilização e interação com o 67LR associado à metástase do câncer.

[04] Enquanto isso, as células imunes estão envolvidas em um mecanismo de defesa primário no corpo, mas a ativação excessiva de células imunes foi recentemente relatada como uma das principais patogêneses. A mobilidade aumentada de células imunes é normalmente observada mediante a ativação de células imunes inflamatórias e, especificamente, tal migração e invasão de células imunes são relatadas como estando intimamente envolvidas na patologia da doença nas seguintes doenças.

[05] Por exemplo, uma doença cardiovascular cujas lesões ocorrem no coração e artérias principais, inclui aterosclerose e uma doença da artéria coronária (Ross R et al, New Engl J Med, 1999:340(2):115-26, Poli G et al, Redox Biol 2013;1(1):125-30, Libby P et al, Circulation 2002;5;105(9):113543). A aterosclerose é uma doença inflamatória acionada por colesterol e é causada por ateroma composto de colesterol depositado na membrana interna de uma artéria e células imunes que migram do sangue para o interior de uma artéria. Ou seja, o ateroma é formado por migração de células imunes, tais como monócitos, para um sítio onde colesterol oxidado causa inflamação. A formação de ateroma torna áspera a superfície interior dos vasos sanguineos e engrossa a parede dos vasos sanguineos e, assim, o diâmetro interno dos vasos sanguineos se torna estreitado, resultando em distúrbios circulatórios. O estouro das membranas fibrosas que circundam o ateroma causa trombos nos vasos sanguineos e sangramento no ateroma e, assim, o diâmetro interno dos vasos sanguineos se torna rapidamente estreitado ou os vasos sanguineos se tornam bloqueados. Isto ocorre principalmente nos vasos sanguineos que fornecem sangue para O coração, vasos sanguineos que fornecem sangue para o cérebro, vasos sanguineos que fornecem sangue para os rins e vasos sanguineos periféricos,

dessa forma, causando uma doença isquêmica do coração, uma doença isquêmica cerebrovascular (acidente vascular cerebral), falência renal e uma doença arterial isquêmica dos membros. Sabía-se no passado que o ligante de quimiocina CC 2 (CCL2, MCP-1), que causa uma resposta inflamatória pela indução da migração de monócitos, desempenha um papel importante na ocorrência e desenvolvimento de tais doenças cardiovasculares e, portanto, novas medidas para tratar tais doenças cardiovasculares pela inibição da ação de CCL2 e a migração de monócitos resultante foi sugerida (Gu L et al., Mol Cell, 1998;2(2):275-81, Aiello RJ et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19(6):1518- 25, Gosling J1 et al., Clin Invest 1999;103(6):773-8, Harrington JR et al., Stem Cells 2000;18(1):65-6, Ikeda U et al., Clin Cardiol 2002;25(4):143-7).

[06] A hipertensão arterial pulmonar (PAH) é classificada como Grupo 1 no sistema de classificação clínica (ESC Guidelines, European Heart Journal 2015) da Organização Mundial de Saúde (“World Health Organization” - WHO) e é uma doença rara caracterizada clinicamente por dificuldade na respiração, um aumento na pressão arterial pulmonar média (mMPAP, mPAP > 25 mm Hg) e disfunção ventricular direita Vários fatores preexistentes, tais como hereditariedade, infecção e doenças relacionadas, estão envolvidos em tal hipertensão arterial pulmonar, mas a resposta imune resultante de lesão celular endotelial foi conhecida por agir como um fator patológico chave (Huertas et al., Circulation, 129:1332-1340, 2014). Quanto a tal fenômeno, uma série de processos de acordo com a invasão e disfunção de células imunes foi conhecida por ser profundamente associada a fenômenos patológicos e, especialmente, a interação entre células imunes e células endoteliais vasculares é conhecida por ser importante em PAH. Também foi relatado que a invasão de monócitos e macrófagos acelera o progresso da síndrome de Alport.

[07] Em doenças relacionadas à fibrose, as respostas inflamatórias (crônicas) contínuas ativam o programa de cura da ferida, levando à fibrose. Após a lesão ao tecido, as células imunes inflamatórias, tais como monócitos/macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e mastócitos, invadem o sítio lesionado rapidamente enquanto sendo ativado e secretam várias citocinas, que por sua vez ativam os fibroblastos circundantes, células epiteliais ou células musculares lisas em células do tipo mioblasto e estas células do tipo mioblasto produzem e secretam proteínas de matriz extracelular em quandes quantidades, por fim causando o acúmulo de proteínas de matriz extracelular em quandes quantidades e resultando em formação de cicatriz e fibrose ou hipertrofia do tecido (Gurtner GC et al., Trends Cell Biol. 15 : 599-607, 2005). Esta patologia é uma das causas fundamentais de: formação de cicatriz nos tecidos da pele, causada por feridas na pele devido a cortes, queimaduras, escaras e os similares; ou fibrose esclerosante do fígado, tecidos renais, vasculares e pulmonares. A fibrose também é conhecida por ser uma característica patológica principal em doenças autoimunes crônicas, tais como esclerodermia, artrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerosa, mielofibrose e lúpus eritematoso sistêmico. Também se sabe que a ativação de células imunes inflamatórias contribui para a patologia em doenças atópicas, asma, COPD, psoríase, queloide, retinopatia proliferativa e os similares.

[08] Especialmente no programa de cura da ferida, os fibroblastos ativados em células do tipo mioblasto são denominados miofibroblastos. Visto que os miofibroblastos estão no centro de todas as patologias de doença associadas à fibrose, a eliminação de mecanismos moleculares ou imunológicos induzindo a atividade de miofibroblastos é um elemento chave do tratamento da doença. Sabe-se amplamente que muitos tipos de imunidade inata ou imunidade adaptativa são importantes na ativação e diferenciação de fibroblastos e, portanto, eliminação de uma resposta inflamatória no local da ferida é um fator chave na interrupção da remodelagem do tecido em fibrose e manutenção da morfologia do tecido normal. No entanto, visto que a resposta inflamatória não é facilmente eliminada na prática, o entendimento dos mecanismos de imunidade inata e adaptativa para encontrar mediadores chave é importante no retardo da fibrose.

[09] Em alguns casos, monócitos, macrófagos e os similares contribuem para a cura da ferida, mas secretam o oxigênio reativo, nitrogênio e os similares e, assim, têm efeitos prejudiciais sobre as células circundantes. Portanto, monócitos e macrófagos, se não rapidamente removidos, causam mais dano ao tecido, resultando em fibrose. Portanto, a restrição de monócitos e macrófagos, que respondem primeiro nos estágios iniciais da doença, é considerada uma estratégia terapêutica para várias doenças crônicas relacionadas à inflamação e fibróticas.

[010]Sabe-se que quando o mecanismo de cura da ferida aciona uma resposta à fibrose, o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) associado à hemaglutinação recruta outras células imunes inflamatórias para dentro do local da ferida e T]GF-B1 acelera a síntese da matriz extracelular a partir de fibroblastos locais. No entanto, foi relatado que os fatores envolvidos na hemaglutinação induzem a fibrose mesmo quando os fatores são deficientes.

[011]Enquanto isso, o fato que Myc-KRS41-597 (AN) com uma deleção de 40 resíduos terminais em extensão N-terminal (N-ext) não é localizado na membrana plasmática indica que a região N-ext de KRS é uma região essencial na translocação de KRS para a membrana celular. Quanto à metástase do câncer, especificamente, sabe-se que a região N-ext de KRS está envolvida na ligação de KRS e 67LR na interação deste. Para usar este fato para propósitos terapêuticos ou diagnósticos, é necessário direcionar especificamente um sítio particular (especialmente, N-ext de KRS) na proteína KRS de acordo com as características de vários domínios que constituem a proteína KRS.

[012]No entanto, apesar da importância de aminoacil-RNA sintetases (ARSs) incluindo KRS como biomarcadores, ARSs são similares em vista da estrutura da proteína e, assim, os anticorpos obtidos por meio de imunização de animais com uma proteína ARS mostram uma reatividade cruzada, por exemplo, ligando com outras ARSs e, em muitos casos, anticorpos altamente sensíveis nem são produzidos.

[013]Nas doenças causadas por ativação excessiva de células imunes, como mencionado acima, fatores alvo para a prevenção da translocação (e invasão) de células imunes têm sido convencionalmente sugeridas e tentativas foram feitas para desviar métodos terapêuticos para tratar doenças que regulam os fatores alvo, mas as respectivas limitações deste estão sendo relatadas. Portanto, para o tratamento eficaz da doença, ainda é um desafio crítico estabelecer qual é o mediador chave e qual estratégia controlará o mediador chave, na mitigação de células imunes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[014]Embora estudando para construir um anticorpo que se liga especificamente a uma região N-terminal de KRS exposta extracelularmente, os presentes inventores verificaram que anticorpos tendo sequências de região de determinação de complementaridade (CDR) particulares, definidas no presente relatório descritivo mostraram especificidade de ligação e afinidade muito alta com a região N-terminal de KRS assim como metástase do câncer inibida in vivo. Adicionalmente, os presentes inventores verificaram que um aumento no nível de KRS na membrana celular de células imunes (monócitos/macrófagos) é um fenômeno patológico importante nas doenças relacionadas à migração e invasão de células imunes e, assim, KRS tem uma correlação particular com laminina (especialmente, laminina subtipo a4B2y1) e verificaram que anticorpos de ligação da N-terminal de KRS providos na presente invenção reduziam o nível de KRS aumentado na membrana celular de células imunes e realmente inibiram a migração e infiltração de células imunes e, assim, tinham um efeito de tratamento das doenças relacionadas, portanto, os presentes inventores concluíram a presente invenção.

[015]Portanto, um aspecto da presente invenção é prover um anticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente a um epítopo contendo a sequência de SEQ ID NO: 97 na N-terminal de lisil-RNA sintetase (KRS).

[016] Outro aspecto da presente invenção é prover um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção, um vetor de expressão recombinante compreendendo o polinucleotíideco e uma célula transformada com o vetor recombinante.

[017]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover um método para a produção de um anticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente a uma região N-terminal de lisil-t/RNA sintetase exposta extracelularmente, o método compreendendo: (a) transformação das células hospedeiras com o vetor de expressão recombinante; (b) incubação das células hospedeiras transformadas para produzir um anticorpo ou fragmento deste; e (c) coleta do anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras.

[018]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção como um ingrediente ativo para a inibição de metástase do câncer.

[019]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uma composição farmacêutica que consiste no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a inibição de metástase do câncer.

[020]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uma composição farmacêutica que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a inibição de metástase do câncer.

[021]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção como um ingrediente ativo para o diagnóstico de câncer.

[022] Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uma composição que consiste no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para o diagnóstico de câncer.

[023] Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uma composição que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para o diagnóstico de câncer.

[024]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção como um ingrediente ativo para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[025] Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uma composição farmacêutica que consiste no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[026]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uma composição farmacêutica que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[027]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uso do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a preparação de um agente para a inibição de metástase do câncer.

[028] Ainda outro aspecto da presente invenção é prover um método para a inibição da metástase do câncer em um indivíduo em necessidade deste, o método compreendendo a administração do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção ao indivíduo em uma quantidade eficaz para a inibição da metástase do câncer.

[029]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uso do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a preparação de um agente para o diagnóstico de câncer.

[030]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover um método para o diagnóstico de câncer em um indivíduo em necessidade deste, o método compreendendo a administração do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção ao indivíduo em uma quantidade eficaz para o diagnóstico de câncer.

[031]Ainda outro aspecto da presente invenção é prover uso do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a preparação de um agente para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[032] Ainda outro aspecto da presente invenção é prover um método para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes em um indivíduo em necessidade deste, o método compreendendo a administração do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção ao indivíduo em uma quantidade eficaz para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[033] De acordo com um aspecto da presente invenção, é provido um anticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente a um epítopo contendo a sequência de SEQ ID NO: 97 na N-terminal de lisi-tRNA sintetase (KRS).

[034]De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção, um vetor de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo e uma célula transformada com o vetor recombinante.

[035]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provido um método para a produção de um anticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente a uma região N-terminal de IisitRNA sintetase exposta extracelularmente, o método compreendendo: (a) transformação das células hospedeiras com o vetor de expressão recombinante; (b) incubação das células hospedeiras transformadas para produzir um anticorpo ou fragmento deste; e (c) coleta do anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras.

[036]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção como um ingrediente ativo para a inibição de metástase do câncer.

[037]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica que consiste no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a inibição de metástase do câncer.

[038]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a inibição de metástase do câncer.

[039]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção como um ingrediente ativo para o diagnóstico de câncer.

[040]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição que consiste no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para o diagnóstico de câncer.

[041]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção como um ingrediente ativo para o diagnóstico de câncer.

[042]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção como um ingrediente ativo para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[043] De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica que consiste no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[044]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[045]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provido uso do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a preparação de um agente para a inibição de metástase do câncer.

[046]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provido um método para a inibição da metástase do câncer em um indivíduo em necessidade deste, o método compreendendo a administração do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção ao indivíduo em uma quantidade eficaz para a inibição da metástase do câncer.

[047] De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provido uso do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a preparação de um agente para o diagnóstico de câncer.

[048]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provido um método para o diagnóstico de câncer em um indivíduo em necessidade deste, o método compreendendo a administração do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção ao indivíduo em uma quantidade eficaz para o diagnóstico de câncer.

[049]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provido uso do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a preparação de um agente para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[050]De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é provido um método para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes em um indivíduo em necessidade deste, o método compreendendo a administração do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção ao indivíduo em uma quantidade eficaz para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[051]A seguir, a presente invenção sera descrita em detalhes.

[052] Como usado aqui, o termo “região N-terminal de lisi-tRNA sintetase exposta extracelularmente” se refere a uma sequência particular exposta ao espaço extracelular ou na superfície da membrana celular quando KRS produzida nas células é translocada para a membrana celular (ou membrana plasmática) e pode se referir normalmente a uma sequência de comprimento parcial ou total de uma região de 1 a 72 aminoácidos na N-terminal de KRS. Além disso, há similaridade de sequência entre espécies na região N-terminal de KRS e, especialmente, a região N-terminal de KRS pode conter a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 97. Preferivelmente, a região N-terminal de KRS contém a sequência definida por SEQ ID NO: 75 para seres humanos, a sequência definida por SEQ ID NO: 113 para camundongos e a sequência definida por SEQ ID NO: 114 para ratos.

[053] Como usado aqui, o termo “KRS” se refere ao polipeptídeo de comprimento total conhecido como lisil-IRNA sintetase ou qualquer sequência de fragmento de KRS compreendendo a região N-terminal. Como descrito acima, os anticorpos ou fragmentos deste de acordo com a presente invenção especificamente detectam a região N-terminal de KRS exposta extracelularmente e, assim, também podem detectar o o polipeptídeo de comprimento total de KRS anterior ou qualquer sequência de fragmento de KRS contendo a região N-terminal. A sequência específica de KRS não é particularmente limitada desde que a sequência contenha o polipeptídeo definido por SEQ ID NO: 75 e seja conhecido como lisil- tRNA sintetase na técnica. Por exemplo, KRS da presente invenção inclui: uma sequência derivada de um ser humano (Homo sapiens) e conhecida como NCBI (Genbank) Nº de acesso NP 005539.1 ou os similares; uma sequência derivada de um camundongo (Mus musculus) e conhecida como NCBI (Genbank) Nº de acesso NP 444322.1 ou os similares; e uma sequência derivada de um rato (Rattus norvegicus) e conhecida como NCBI (Genbank) Nº de acesso XP 006255692.1 ou os similares e, além disso, referência pode ser feita às seguintes informações de sequência, mas não é limitada a isso: XP 005004655.1 (porquinho-da-índia: Cavia porcellus), XP 021503253.1 (esquilo, Meriones unguiculatus), XP 002711778.1 (coelho, Oryctolagus cuniculus), XP 536777.2

(cachorro, Canis lupus famiíiliaris, XP 003126904.2 (porco, Sus scrofa), XP 011755768.1 (macaco, Macaca nemestrina), XP OO08984479.1 (mico, Callithrix jacchus), XP 019834275.1 (vaca, Bos indicus) e XP 511115.2 (chimpanzé, Pan troglodytes). Com a máxima preferência, KRS pode ser um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 76 (Nº de acesso Genbank NP 005539.1).

[054]Na presente invenção, o anticorpo também é denominado imunoglobulina (lg) e é um termo genérico para proteínas que estão envolvidas na imunidade biológica por agirem seletivamente sobre antígenos. Um anticorpo inteiro encontrado na natureza usualmente consiste em dois pares de cadeia leve (LC) e cadeia pesada (HC), cada um dos quais é um polipeptídeo composto de vários domínios ou tem dois pares de HC/LC como uma unidade básica. Existem cinco tipos de cadeias pesadas que constituem anticorpos mamiíferos, que são denotados pelas letras gregas: a, 5, e, ye uy e diferentes tipos de cadeias pesadas constituem diferentes tipos de anticorpos: IgA, I1gD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. Existem dois tipos de cadeias leves que constituem anticorpos mamíferos, que são denotados por À e K.

[055]As cadeias pesadas e leves de anticorpos são estruturalmente divididas em uma região variável e uma região constante de acordo com a variabilidade de sequência de aminoácidos. A região constante da cadeia pesada é composta de três ou quatro regiões constantes de cadeia pesada, tais como CH1, CH2 e CH3 (anticorpos IgA, IgD e IgG) e CH4 (anticorpos IgE e IgM), de acordo com o tipo de anticorpo e a cadeia leve tem uma região constante CL. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves são, cada uma, compostas de um domínio de uma região variável de cadeia pesada (VH) ou uma região variável de cadeia leve (VL). A cadeia leve e a cadeia pesada são ligadas uma à outra por uma ligação de dissulfeto covalente enquanto regiões variáveis e regiões constantes deste são dispostas em paralelo e duas moléculas de cadeia pesada, que são ligadas com as cadeias leves, são ligadas uma à outra por duas ligações de dissulfeto covalentes, dessa forma, formando um anticorpo inteiro. O anticorpo inteiro se liga especificamente a um antígeno através das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves. O anticorpo inteiro é composto de dois pares de cadeias pesadas e leves (HC-LC) e, assim, uma molécula de anticorpo inteiro tem monoespecificidade divalente na qual uma molécula de anticorpo inteiro se liga a dois mesmos antígenos através de duas regiões variáveis.

[056]As regiões variáveis do anticorpo, que compreendem sítios de ligação a antígeno, são, cada uma, divididas em regiões framework (FRs) com baixa variabilidade de sequência e regiões de determinação de complementaridade (CDRs), que são regiões hipervariáveis com alta variabilidade de sequência. Em VH e VL, três CDRs e quatro FRs são dispostas na ordem de FR1I-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4 em uma direção a partir do N-terminal pata o C-terminal. As CDRs, que têm a mais alta variabilidade de sequência nas regiões variáveis do anticorpo, são sítios que se ligam diretamente a um antígeno e são muito importantes na especificidade antigênica do anticorpo.

[057]A presente invenção provê um anticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente a um epítopo contendo a sequência de SEQ ID NO: 97 na N- terminal de lisil-tRNA sintetase (KRS).

[058]Como usado aqui, o “epítopo” se refere a um determinante de proteína capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Um epítopo é usualmente composto de grupos superficiais de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tridimensionais específicas assim como características de carga específicas. Epitopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos uns dos outros pelo fato de que a ligação aos epítopos conformacionais, mas não aos epítopos não conformacionais é perdida na presença de solventes desnaturantes. Um epítopo pode compreender resíduos de aminoácido envolvidos diretamente na ligação (também denominado componente imunogênico do epítopo) e outros resíduos de aminoácido não diretamente envolvidos na ligação, por exemplo, resíduos de aminoácido bloqueados eficazmente pelo peptídeo específico de ligação ao antígeno (em outras palavras, o resíduo de aminoácido estando dentro da área ocupada do peptídeo específico de ligação ao antígeno).

[059] Preferivelmente, o epítopo é um sítio ao qual o anticorpo monoclonal N3 da presente invenção derivada da sequência N-terminal de KRS se liga e a sequência específica deste não é particularmente limitada visto que a sequência é uma região consecutiva compreendendo aminoácidos (KIsknelkrrlka) definidos por SEQ ID NO: 97 e pode usualmente consistir em uma sequência de 13-52 aminoácidos, mais preferivelmente, uma sequência de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, ou 42 aminoácidos, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

97.

[060] Preferivelmente, o epítopo da presente invenção pode incluir a sequências de aminoácido definida por SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 e SEQ ID NO: 101, que são derivadas da N-terminal humano de KRS; a sequências de aminoácido definida por SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 e SEQ ID NO: 106, que são derivadas da N-terminal de KRS de camundongo; e a sequências de aminoácido definida por SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110 e SEQ ID NO: 111, que são derivadas da N-terminal de KRS de rato. O epítopo pode ser mais preferivelmente a sequência de aminoácidos nas posições 15 a 29 na região N- terminal de KRS humana definida por SEQ ID NO: 75 (SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 e SEQ ID NO: 101) e com a máxima preferência a sequência de aminoácidos nas posições 15 a 42 na região N- terminal de KRS humana definida por SEQ ID NO: 75 (SEQ ID NO: 101).

[061]O “anticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente a uma região N-terminal de KRS exposta extracelularmente” provido na presente invenção compreende:

[062]uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo: região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR1) contendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 37; região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) contendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 39; e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) contendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 41 e;

[063]Juma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo: região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR1) contendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 43; região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR2) contendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 45; e região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR3) contendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 47.

[064] Os anticorpos compostos das sequências de CDR têm excelente capacidade de se ligar especificamente à região N-terminalli de KRS exposta extracelularmente. Esta característica é bem descrita nos exemplos do presente relatório descritivo. Em um exemplo da presente invenção, para construir fragmentos scFv que se ligam especificamente à região N-terminal de KRS exposta extracelularmente, um total de cinco etapas experimentais que se iniciam a partir da triagem primária através de triagem da biblioteca de fago scFv até ELISA indireto (triagem secundária), westem blotting (triagem terciária), imunoprecipitação (triagem quaternária) e coloração imunofluorescente (triagem quinária) foram realizadas para selecionar fragmentos scFv mostrando alta especificidade de ligação e afinidade de ligação em vista da ligação N-terminal de KRS. Um total de 1920 clones scFv foram selecionados na triagem primária através de triagem da biblioteca de fago scFv, mas quatro tipos de fragmentos, N3 scFv, N5 scFv, N7 scFv e N9 scFv, os quais têm a mais alta especificidade, foram finalmente selecionados através das cinco etapas de triagem. Além disso, os fragmentos scFv foram convertidos em anticorpos IgG, dessa forma, construindo anticorpos IgG IgG N3, IgG N5, IgG N7 e N9 e também se verificou que estes anticorpos mostram alta especificidade de ligação em vista da ligação N-terminal de KRS.

[065] Os anticorpos ou fragmentos deste que se ligam especificamente à região N- terminal de KRS exposta extracelularmente de acordo com a presente invenção são anticorpos tendo as seguintes conformações de CDR de regiões variáveis de cadeia pesada e leve, em que ((i), (ii), (iii) e (iv) abaixo indicam combinações de CDR de anticorpos N3, N5, N7 e N9 nos respectivos exemplos:

(1) uma região variável de cadeia pesada compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 1, região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 3 e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: e uma região variável de cadeia leve compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 7, região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 9 e região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 11;

(2) uma região variável de cadeia pesada compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 13, região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 15 e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 19, região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 21 e região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 23;

(3) uma região variável de cadeia pesada compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 25, região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 27 e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO:

29 e uma região variável de cadeia leve compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 31, região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 33 e região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 35 e; (4) uma região variável de cadeia pesada compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 37, região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 39 e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 43, região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 45 e região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 47.

[066]Com a máxima preferência, os anticorpos ou fragmentos deste de acordo com a presente invenção são caracterizados por compreender as seguintes regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve: nos anticorpos ou fragmentos deste, a região variável de cadeia pesada contém a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 49 (N3 VH), SEQ ID NO: 53 (N5 VH), SEQ ID NO: 57 (N7 VH) e SEQ ID NO: 61 (N9 VH) e a região variável de cadeia leve contém a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 51 (N3 VL), SEQ ID NO: 55 (N5 VL), SEQ ID NO: 59 (N7 VL) e SEQ ID NO: 63 (N9 VL).

[067]O anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) pode ser um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 898 e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87 e SEQ ID NO: 91.

[068]Com a máxima preferência, os anticorpos podem ser anticorpos compreendendo: uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 77 e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 79; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 81 e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 83; uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 85 e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 87; e uma cadeia pesada contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 89 e uma cadeia leve contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 91.

[069]O “anticorpo que se liga especificamente à região N-terminal de KRS exposta extracelularmente” de acordo com a presente invenção não é limitado ao tipo deste visto que o anticorpo tem as combinações de CDR ou combinações de VH e VL acima. Como um exemplo específico, o anticorpo pode ser selecionado do grupo que consiste em anticorpos IgG, IgA, IgM, IgE e IgD e pode ser preferivelmente um anticorpo IgG.

[070]Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos monoclonais ou anticorpos policlonais visto que os anticorpos têm as combinações de CDR ou combinações de VH e VL acima que se ligam especificamente à região N-terminal de KRS, mas são preferivelmente anticorpos monoclonais, que são um grupo de anticorpos cada um tendo sequências de aminoácido substancialmente idênticas em cadeias pesadas e leves.

[071]O anticorpo da presente invenção pode ser derivado de quaisquer animais incluindo mamíferos incluindo seres humanos e pássaros e pode ser preferivelmente derivado de seres humanos. No entanto, o anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo quimérico incluindo uma parte do anticorpo derivada de seres humanos e uma parte do anticorpo derivada de uma espécie diferente de animal. Ou seja, a presente invenção inclui todos os anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos e pode ser preferivelmente anticorpos humanos.

[072] Além disso, o fragmento do anticorpo da presente invenção se refere a um fragmento de anticorpo que retém capacidade de ligação específica de antígeno de um anticorpo inteiro. Preferivelmente, o fragmento retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% da afinidade de ligação N-terminal de KRS do anticorpo mãe. Especificamente, o fragmento pode ser na forma de Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, diacorpo, scFv ou os similares.

[073]Fab (fragmento, ligação ao antígeno) é um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo e é composto de uma cadeia pesada e uma cadeia leve cada uma que consiste em um domínio variável e um domínio constante. F(ab'), é um fragmento produzido pela hidrólise de pepsina de um anticorpo e F(ab'), tem uma forma na qual duas moléculas Fab são ligadas por meio de ligações de dissulfeto na região de articulação de cadeia pesada. F(ab') é um fragmento de anticorpo monomérico no qual uma articulação de cadeia pesada é adicionada a um Fab separado de fragmento F(ab'), pela redução de ligações de dissulfeto deste. Fv (fragmento variável) é um fragmento de anticorpo composto de somente respectivas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves. scFv (fragmento variável de cadeia única) é um fragmento de anticorpo recombinante no qual uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL) são ligadas uma à outra meio de um ligante de peptídeo flexível. O diacorpo se refere a um fragmento no qual VH e VL de scFv são ligadas por um ligante muito curto e, assim, não podem ser ligadas uma à outra e se ligam à VL e VH de outro scFv na mesma forma, respectivamente, para formar um dímero.

[074]Para os fins da presente invenção, o fragmento do anticorpo não é limitado à estrutura ou conformação deste visto que o fragmento do anticorpo retém especificidade de ligação à região N-terminal de KRS, mas pode ser preferivelmente scFv. O scFv de acordo com a presente invenção tem uma conformação de CDR ou conformação VH e VL específica da região N-terminal de KRS e a sequência deste não é particularmente limitada visto que o C-terminal de VH e o N-terminal de VL são ligados através de um ligante. O ligante não é particularmente limitado ao tipo deste visto que ele é conhecido como um ligante aplicado a scFv na técnica, mas pode ser um peptídeo contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 65. Especificamente, o scFv da presente invenção pode conter a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 67 (N3 scFv), SEQ ID NO: 69 (N5 scFv), SEQ ID NO: 71 (N7 scFv) e SEQ ID NO: 73 (N9 scFv).

[075]O anticorpo ou fragmento deste da presente invenção pode compreender uma substituição de aminoácido conservativa (também denominada uma variante conservativa do anticorpo) que não muda substancialmente a atividade biológica deste.

[076] Além disso, o anticorpo ou fragmento deste mencionado acima da presente invenção pode ser conjugado a uma enzima, um material fluorescente, um material radioativo e uma proteína, mas não é limitado a isso. Da mesma forma, métodos de conjugação dos materiais acima com o anticorpo foram bem- conhecidos na técnica.

[077]A presente invenção provê um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento deste mencionado acima de acordo com a presente invenção.

[078]No presente relatório descritivo, o polinucleotídeo pode ser descrito como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico e inclui: análogos de DNA ou RNA (por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeo e análogos de nucleotídeo de ocorrência não natural) gerados usando moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) ou análogos de nucleotídeo; e híbridos deste. O polinucleotídeo pode ser de filamento único ou de filamento duplo.

[079]O polinucleotídeo se refere a uma sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo composto de cadeias pesadas e leves cada uma tendo uma conformação de CDR ou conformação VH e VL específica da região N-terminal de KRS. O polinucleotídeo da presente invenção não é particularmente limitado à sequência deste visto que a sequência codifica o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção. Os polinucleotídeos que codificam as sequências de CDR mencionadas acima nos anticorpos descritos acima de acordo com a presente invenção não são particularmente limitados às sequências deste, mas podem conter preferivelmente a sequência de nucleotídeo definida por SEQ ID NO: 2

(cadeia pesada CDR1), SEQ ID NO: 4 (CDR?2 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 6 (CDR3 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 8 (CDR1 de cadeia leve), SEQ ID NO: 10 (CDR2 de cadeia leve), SEQ ID NO: 12 (CDR3 de cadeia leve), SEQ ID NO: 14 (CDR1 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 16 (CDR2 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 18 (CDR3 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 20 (CDR1 de cadeia leve), SEQ ID NO: 22 (CDR?2 de cadeia leve), SEQ ID NO: 24 (CDR3 de cadeia leve), SEQ ID NO: 26 (CDR1 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 28 (CDR2 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 30 (CDR3 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 32 (CDR1 de cadeia leve), SEQ ID NO: 34 (CDR2 de cadeia leve), SEQ ID NO: 36 (CDR3 de cadeia leve), SEQ ID NO: 38 (CDR1 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 40 (CDR2 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 42 (CDR3 de cadeia pesada), SEQ ID NO: 44 (CDR1 de cadeia leve), SEQ ID NO: 46 (CDR2 de cadeia leve), ou SEQ ID NO: 48 (CDR3 de cadeia leve).

[080] Além disso, os polinucleotídeos que codificam as VH e VL mencionadas acima no anticorpo de acordo com a presente invenção não são particularmente limitados às sequências deste, mas podem conter preferivelmente a sequência de nucleotídeo definida por SEQ ID NO: 50 (VH), SEQ ID NO: 52 (VL), SEQ ID NO: 54 (VH), SEQ ID NO: 56 (VL), SEQ ID NO: 58 (VH), SEQ ID NO: 60 (VL), SEQ ID NO: 62 (VH) ou SEQ ID NO: 64 (VL).

[081]Além disso, o polinucleotídeo que codifica o fragmento do anticorpo pode conter preferivelmente a sequência de nucleotídeo de qualquer um selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72 e SEQ ID NO: 74, que codifica fragmentos scFv de acordo com a presente invenção.

[082]Os polinucleotídeos que codificam o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção podem ser obtidos por um método conhecido na técnica. Por exemplo, com base nas sequências de DNA que codificam uma parte ou a totalidade das cadeias pesadas e leves do anticorpo ou sequências de aminoácido correspondentes, os polinucleotídeos podem ser sintetizados pelos métodos de síntese de oligonucleotídeo que são conhecidos na técnica, por exemplo, um método de reação em cadeia da polimerase (PCR).

[083]A presente invenção provê um vetor de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento deste de acordo com a presente invenção.

[084]Como usado aqui, a “recombinante”, é usada intercambiavelmente com “manipulação genética” e se refere à construção de um gene na forma que não existe na natureza, pelo uso de técnicas de experimento de clonagem molecular, tais como transformação genética, clivagem ou ligação.

[085] Como usado aqui, o termo “expressão” se refere à produção de proteínas ou ácidos nucleicos em células.

[086]Como usado aqui, o termo “vetor de expressão recombinante" é um vetor que pode expressar uma proteína alvo ou ácido nucleico (RNA) em uma célula hospedeira adequada e se refere a um construto de gene compreendendo elementos de controle essenciais que são ligados operacionalmente para serem capazes de expressar um inserto (gene) de polinucleotídeo. O termo “ligado operacionalmente” se refere à ligação funcional de uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico e uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína alvo ou RNA de modo a realizar funções gerais, o que significa a ligação entre eles de modo a permitir que um gene seja expresso pela sequência de controle de expressão. A sequência de controle de expressão se refere a uma sequência de DNA que controla a expressão de uma sequência de polinucleotídeos ligados operacionalmente em uma célula hospedeira particular. Tal sequência de controle de expressão inclui um promotor para a transcrição, qualquer sequência operadora para o controle de transcrição, uma sequência para codificar um sítio de ligação ribossômica de mMRNA apropriado, uma sequência para o controle da terminação de transcrição e translação, um códon de iniciação, um códon de terminação, um sinal de poliadenilação A, um intensificador e os similares.

[087]O vetor de expressão recombinante da presente invenção não é particularmente limitado ao tipo deste visto que o vetor é comumente usado em um campo de clonagem e exemplos do vetor de expressão recombinante incluem um vetor plasmídeo, um vetor cosmídeo, um vetor bacteriófago e um vetor viral, mas não são limitados a isso. Os exemplos do plsmídeo podem incluir plasmídeos derivados de Escherichia coli (9BR322, pBR325, pUC118, pUC119 e pET-22b(+)), plasmídeos derivados de Bacillus subtilis (pUB110 e pTP5) e plasmídeos derivados de levedura (YEp13, YEp24 e YCp50) e exemplos do vírus podem incluir: vírus animais, tais como retrovírus, adenovírus ou vírus vaccinia; e vírus de inseto, tais como baculovírus.

[088]O vetor de expressão recombinante de acordo com a presente invenção significa um construto de gene que é ligado operacionalmente de modo a ser capaz de expressar, em uma célula hospedeira adequada, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento deste composto de cadeias pesadas e leves tendo as conformações de CDR ou VH e VL mencionadas acima capazes de se ligar especificamente à região N-terminal de KRS.

[089] Os polinucleotídeos que codificam cadeias pesadas e leves do anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser contidos nos vetores de expressão recombinantes separados, respectivamente, ou podem ser contidos em um vetor de expressão recombinante.

A PRESENTE INVENÇÃO PROVÊ CÉLULAS TRANSFORMADAS COM O VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE DESCRITO ACIMA.

[090]As células da presente invenção não são particularmente limitadas ao tipo deste visto que as células podem ser usadas para expressar um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou um fragmento deste contido no vetor de expressão recombinante da presente invenção. As células (células hospedeiras) transformadas com o vetor de expressão recombinante de acordo com a presente invenção podem ser células procarióticas (por exemplo, E. coli), células eucarióticas (por exemplo, levedura ou outros fungos), células vegetais (por exemplo, células vegetais de tabaco ou tomate), células animais (por exemplo, células humanas, células de macaco, células de hamster, células de rato, células de camundongo ou células de inseto) ou hibridomas derivados destes. Preferivelmente, as células podem ser derivadas de mamíferos incluindo seres humanos.

[091]Procariotas exemplares adequados para o presente fim incluem organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus,

Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescens e Shigella, assim como Bacilli, por exemplo, B. subtilis e B. licheniformis, Pseudomonas, por exemplo, P. aeruginosa e Streptomyces. As células da presente invenção não são particularmente limitadas, visto que as células podem expressar o vetor da presente invenção, mas podem ser preferivelmente E. coli.

[092] Saccharomyces cerevisiae é mais frequentemente usado como um eucariota para as células da presente invenção. No entanto, vários outros gêneros, espécies e cepas podem ser usados, mas não são limitados a, por exemplo, hospedeiros de Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, tais como, K lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ANTCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234), Neurospora crassa; Schwanniomyces, tais como Schwanniomyces occidentalis e fungos filamentosos, por exemplo, hospedeiros de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tais como A. nidulans e A. niger.

[093]O termo “transformação” se refere a uma modificação do genótipo de uma célula hospedeira devido à introdução de polinucleotídeos exóticos e se refere a uma introdução de um polinucleotídeo exótico em uma célula hospedeira independente de um método usado para a transformação. O polinucleotídeo exótico introduzido na célula hospedeira é incorporado em e mantido no genoma da célula hospedeira ou é mantido sem a oncorporação nele e a presente invenção inclui ambos.

[094]O vetor de expressão recombinante capaz de expressar o anticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente à região N-terminal de KRS de acordo com a presente invenção pode ser introduzido nas células para a produção do anticorpo ou fragmento deste, por um método conhecido na técnica, por exemplo, mas não é limitado a, transfecção transiente, microinjeção, transdução, fusão celular, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por lipossoma, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por polibreno, eletroporação, pistola de genes e métodos conhecidos para a introdução de ácidos nucleicos nas células e a seguir pode transformar as células.

[095]A presente invenção provê um método para a preparação de um anticorpo ou fragmento deste que se liga especificamente a uma região N-terminal de lisil- tRNA sintetase exposta extracelularmente, o método compreendendo: (a) transformação das células hospedeiras com o vetor de expressão recombinante; (b) incubação das células hospedeiras transformadas para produzir um anticorpo ou fragmento deste e; (c) coletado anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras.

[096]Na etapa (a), a fim de produzir o anticorpo ou fragmento deste de acordo com a presente invenção, as células hospedeiras são transformadas com o vetor de expressão recombinante, no qual o polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento deste é ligado operacionalmente.

[097]Um técnico no assunto pode realizar a presente etapa ao selecionar o método de transformação adequado de acordo com as células hospedeiras e o vetor de expressão recombinante selecionados como descrito acima. Os vetores de expressão recombinantes compreendendo sequências de nucleotídeo de cadeias pesadas e leves podem ser co-transformados na mesma célula hospedeira para permitir que as cadeias pesadas e leves sejam expressas em uma célula ou os vetores de expressão recombinantes compreendendo sequências de nucleotídeo de cadeias pesadas e leves podem ser transformados em células hospedeiras separadas para permitir que as cadeias pesadas e leves sejam expressas separadamente.

[098]Na etapa (b), as células hospedeiras transformadas são incubadas para produzir polipeptídeos de cadeias pesadas e leves do anticorpo ou fragmento do anticorpo de acordo com a presente invenção a partir do vetor de expressão recombinante introduzido nas células hospedeiras.

[099]A composição média, condições de incubação e tempo de incubação para a incubação das células hospedeiras podem ser apropriadamente selecionados de acordo com um método comumente usado na técnica. As moléculas de anticorpo produzidas na célula hospedeira podem ser acumuladas no citoplasma celular,

podem ser secretadas fora da célula ou no meio de cultura por uma sequência sinal adequada ou podem ser direcionadas usando um periplasma ou os similares. Também é preferível que o anticorpo de acordo com a presente invenção tenha uma conformação funcional através do redobramento de proteínas usando um método conhecido na técnica de modo a manter a especificidade de ligação no N-terminal de KRS. Como para a produção de anticorpo tipo IgG, cadeias pesadas e leves podem ser expressas em células separadas e a seguir contatadas umas com as outras em uma etapa separada para constituir o anticorpo inteiro ou cadeias pesadas e leves podem ser expressas na mesma célula para formar o anticorpo inteiro dentro da célula.

[0100] Na etapa (c), o anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras é obtido.

[0101]Um técnico no assunto pode selecionar e controlar apropriadamente o método de coleta considerando as características de polipeptídeos do anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras, características das células hospedeiras, o modo de expressão ou o direcionamento ou não do polipeptídeo. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento deste secretado no meio de cultura pode ser coletado pela obtenção do meio de cultura, no qual as células hospedeiras são cultivadas, removendo impurezas através de centrifugação e os similares. À fim de, conforme necessário, excretar o anticorpo presente em organelas ou citoplasma específicos nas células para fora das células e coletar o anticorpo, as células podem ser lisadas dentro de um grau que não afeta a estrutura funcional do anticorpo ou o fragmento deste. O anticorpo obtido pode ser ainda submetido a um processo de remoção adicional de impurezas e a realização da concentração, através de cromatografia, filtração usando um filtro, diálise ou os similares.

[0102] O polipeptídeo no método de fabricação (produção) da presente invenção pode ser o anticorpo ou fragmento deste por si só da presente invenção e um polipeptídeo ao qual se liga ainda outra sequência de aminoácidos que não o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção. Neste caso, a sequência de aminoácidos pode ser removida do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção pelo uso de um método bem-conhecido por um técnico no assunto.

[0103]O anticorpo ou fragmento deste da presente invenção se liga especificamente à região N-terminal de KRS e, assim, é útil na análise diagnóstica para a detecção e quantificação de proteínas de KRS em, por exemplo, células particulares, tecidos ou soro. Especialmente, a região N-terminal de KRS exposta extracelularmente pode ser especificamente detectada sem lise celular. Portanto, a presente invenção provê um método para detecção específica de uma região N- terminal de lisitRNA sintetase exposta extracelularmente, o método compreendendo: contato do anticorpo ou fragmento deste com uma amostra; e detecção do anticorpo ou fragmento deste.

[0104]O método de detecção da presente invenção pode compreender uma etapa de preparação de uma amostra, que deve ser medida quanto à presença ou ausência de KRS (ou peptídeo N-terminal de KRS exposto extracelularmente) e a concentração deste pelo uso do anticorpo ou fragmento deste de acordo com a presente invenção (etapa (1)), antes do contato do anticorpo ou fragmento deste de acordo com a presente invenção com a amostra.

[0105] Um técnico no assunto pode selecionar adequadamente um método de detecção de proteína conhecido usando um anticorpo e preparar uma amostra adequada para o método selecionado. Além disso, a amostra pode ser células ou tecidos obtidos por biópsia, sangue, sangue integral, soro, plasma, saliva, fluido cerebrospinal ou os similares, que é coletada de um indivíduo a ser examinado quanto à presença ou ausência de câncer (especialmente, câncer de mama ou câncer de pulmão) ou metástase do câncer. Exemplos do método de detecção de proteína usando o anticorpo incluem, mas não são limitados a, western blotting, immune blotting, dot blotting, imuno-histoquímica, ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio, ensaio de ligação competitiva, imunoprecipitação e os similares. Por exemplo, para western blotting, uma preparação pode ser feita pela adição de um tampão adicional para a eletroforese a uma amostra ou lisado celular, seguido por ebulição e por imuno-histoquímica, um tratamento pode ser realizado por imobilização e bloqueio de fatias de células ou tecido, seguido pelo bloqueio.

[0106] A seguir, uma etapa de contato do anticorpo ou fragmento deste de acordo com a presente invenção com a amostra preparada na etapa descrita acima é realizada (etapa (2)).

[0107] O anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo ou fragmento deste que tem as conformações de CDR ou VH e VL descritas acima e se liga especificamente à região N-terminal de KRS e tipos específicos e organização de sequência deste são como descrito acima.

[0108] O anticorpo ou fragmento deste pode ser rotulado com uma porção detectável geral, para a “detecção” deste. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento deste pode ser rotulado com um radioisótopo ou rótulo fluorescente pelo uso da técnica descrita na literatura [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs]. Além disso, vários rótulos enzima-substrato são usáveis e exemplos do rótulo enzimático incluem: luciferase, tais como drosophila luciferase e luciferase bacteriana (patente norte-americana No. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazina dionise, malato desidrogenase, urase, peroxidase tal como peroxidase de rábano silvestre (HRPO), fosfatase alcalina, B-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidase (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidase heterocíclica (por exemplo, uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e os similares. As técnicas para conjugar enzimas a anticorpos são descritas em, por exemplo, literatura [0'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N. Y., 73: 147-166]. Os rótulos podem ser conjugados direta ou indiretamente a anticorpos usando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com a biotina e quaisquer rótulos pertencentes a três classes de categorias generalizadas citadas acima pode ser conjugado com avidina ou vice-versa. A biotina pode se ligar selecivamente à avidina e, portanto, este rótulo pode ser conjugado com um anticorpo de uma maneira indireta. Alternativamente, a fim de atingir a conjugação indireta de um rótulo com um anticorpo, o anticorpo pode ser conjugado com um pequeno hapteno (por exemplo, dioxina) e um dos diferentes tipos de rótulos recitados acima podem ser conjugados com um anticorpo anti-hapteno (por exemplo, anti- dioxin anticorpo). Portanto, a conjugação indireta de um rótulo com um anticorpo pode ser atingida.

[0109] Como usado aqui, o “contato” é usado em um senso geral deste e se refere à mistura, ligação ou toque de duas ou mais substâncias. O contato pode ser realizado in vitro ou em outro recipiente ou pode ser realizado in situ, in vivo, no indivíduo, no tecido ou na célula.

[0110]A seguir, uma etapa de detecção do anticorpo ou fragmento deste de acordo com a presente invenção a partir da amostra após a execução da etapa (2) é realizada (etapa (3)).

[0111] A “detecção” é realizada em um complexo do anticorpo ou fragmento deste de acordo com a presente invenção e um antígeno, o complexo sendo formado na amostra e se refere à detecção da presença ou ausência do peptídeo N-terminal de KRS (ou uma proteína incluindo o peptídeo, por exemplo, KRS) ou a medição (incluindo medição qualitativa, medição quantitativa ou ambos) do nível do peptídeo. Portanto, o método de detecção da presente invenção pode compreender ainda uma etapa de remoção de anticorpos extra ou fragmentos deste, que não formaram o complexo com a região N-terminal de KRS, após a execução da etapa (2) antes da etapa (3) a ser descrita posteriormente.

[0112] Quando o anticorpo ou fragmento deste usado na etapa (2) descrita acima contém uma porção detectável, tal como fluorescência, isótopo radioativo ou enzima, que rotula diretamente o anticorpo ou fragmento deste, a detecção pode ser realizada por um método de detecção para a porção correspondente, conhecida na técnica. Por exemplo, a radioatividade pode ser medida por, por exemplo, contagem por cintilação e fluorescência pode ser quantificada usando um fluorômetro.

[0113] Quando o anticorpo ou fragmento deste, per se, usado na etapa (2) descrito acima não contém a porção detectável mencionada acima, a detecção indireta usando um anticorpo rotulado secundário com fluorescência, radioatividade, enzima ou os similares pode ser realizada. O anticorpo secundário se liga ao anticorpo ou fragmento deste (anticorpo primário), de acordo com a presente invenção.

[0114] Estudos recentes estabeleceram que lisil-t/RNA sintetase (KRS) humana presente no citosol é translocada para a membrana plasmática (membrana celular) para interagir com um receptor de laminina de 67 kDa (67LR) presente na membrana plasmática, dessa forma, promovendo a migração de células de tumor (ou de câncer) para afetar metástase do câncer (Dae Gyu Kim et al., Chemical inhibition of prometastatic Iysyl-tRNA synthetaselaminin receptor interaction, Nat Chem Biol. 2014 Jan; 10(1): 2934.). Aqui, sabe-se que a região de extensão N- terminal de KRS (N-ext) é essencial na translocação de KRS para a membrana celular. Quanto à metástase do câncer, especificamente, sabe-se que a região N- ext de KRS envolvida na ligação de KRS e 67LR na interação deste.

[0115] Os anticorpos e fragmentos deste de acordo com a presente invenção são excelentes na capacidade de ligação específica à região N-ext de KRS. De fato, os anticorpos e fragmentos deste de acordo com a presente invenção se ligam à região N-ext de KRS e, assim, inibem a ligação (interação) com um receptor de laminina, dessa forma, mostrando excelente capacidade de inibir a metástase do câncer. Isto é bem descrito nos exemplos da invenção. Um exemplo no presente relatório descritivo verificou que, como um resultado da administração do anticorpo de acordo com a presente invenção em modelos de metástase do câncer in vivo com câncer induzido, o anticorpo da presente invenção mostrou excelente capacidade inibidora da metástase do câncer de uma maneira dependente de dose. Especialmente, a capacidade inibidora da metástase do câncer do anticorpo da presente invenção foi excelente mesmo comparado com o composto YH16899, que é conhecido por inibir a metástase do câncer pela inibição da interação entre o receptor de laminina (67LR) e KRS.

[0116] Portanto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para a inibição de metástase do câncer e uma composição para o diagnóstico de câncer, cada uma das composições compreendendo o anticorpo ou fragmento deste mencionado acima da presente invenção como um ingrediente ativo para a inibição de metástase do câncer.

[0117] Adicionalmente, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para a inibição de metástase do câncer e uma composição para o diagnóstico de câncer, cada uma das composições que consiste no anticorpo ou fragmento deste mencionado acima da presente invenção.

[0118] Adicionalmente, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para a inibição de metástase do câncer e uma composição para o diagnóstico de câncer, cada uma das composições que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento deste mencionado acima da presente invenção.

[0119] O câncer não é particularmente limitado ao tipo deste visto que o câncer é conhecido como um tumor maligno na técnica e exemplo deste pode ser selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer do intestino grosso, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer gástrico, câncer do fígado, câncer de sangue, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer anal, câncer de cólon, câncer de mama, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma endometrial, câncer cervical, câncer vaginal, carcinoma vulvar, Doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer endócrino, câncer de tireóide, carcinoma da paratireóide, câncer adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer uterino, câncer de pênis, câncer de próstata, leucemia crônica ou aguda, linfoma de linfócitos, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma pélvico renal, tumor do SNC, linfoma primário do SNC, tumor da medula espinhal, glioma do tronco cerebral e adenoma de pituitária. Preferivelmente, o câncer pode ser câncer de mama ou câncer pulmonar.

[0120] A presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção como um ingrediente ativo para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[0121] Adicionalmente, a presente invenção provê uma composição farmacêutica que consiste no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[0122] Adicionalmente, a presente invenção provê uma composição farmacêutica que consiste essencialmente no anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[0123] Como usado aqui, o termo “células imunes” preferivelmente se refere a monócitos ou macrófagos.

[0124] Como usado aqui, o termo “doença relacionada à migração de células imunes” não é particularmente limitado ao tipo específico deste, visto que é conhecido na técnica que a migração excessiva (e invasão) de células imunes é a principal patogênese da doença e que exemplos deste podem ser selecionados do grupo que consiste em uma doença cardiovascular, uma doença fibrótica, uma doença inflamatória crônica e síndrome de Alport.

[0125] A doença cardiovascular não é particularmente limitada aos seguintes tipos específicos de doenças cardiovasculares e ela pode ser selecionada do grupo que consiste em hipertensão arterial pulmonar, aterosclerose, angina (angina pectoris), infarto do miocárdio, doença cerebrovascular isquêmica, arteriosclerose e esclerose mesentérica.

[0126] A doença fibrótica não é particularmente limitada aos seguintes tipos específicos das doenças fibróticas e pode ser selecionada do grupo que consiste em esclerodermia, artrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerosa, mielofibrose, fibrose pulmonar, fibrose hepática, cirrose hepática, fibrose renal, miofibrose, fibrose cardíaca, lúpus eritematoso sistêmico, fibrose hereditária, fibrose infecciosa (especialmente fibrose causada por infecção contínua), fibrose irritante (fibrose causada por exposição repetitiva a materiais irritantes, tais como tabaco e materiais tóxicos), fibrose causada por fibrose autoimune crônica causada por incompatibilidade antigênica durante o transplante de órgãos, fibrose por hiperlipidemia, fibrose por obesidade, fibrose diabética, fibrose por hipertensão e oclusão causada por fibrose em inserção do stent.

[0127] A doença inflamatória crônica pode ser selecionada do grupo que consiste em asma, dermatite atópica, eczema, psoríase, osteoartrite, gota, artrite psoriática, cirrose, esteato-hepatite não alcoólica, doença pulmonar obstrutiva crônica, rinite, retinopatia diabética, insuficiência renal diabética, neuropatia diabética e esclerose múltipla.

[0128] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode compreender o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção sozinho ou pode compreender ainda pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui, o termo “farmaceuticamente aceitável” se refere a uma composição não tóxica que é fisiologicamente aceitável, não inibe a ação de um ingrediente ativo quando administrada a seres humanos e normalmente não causa uma resposta alérgica ou respostas similares, tais como problemas gastroentéricos e tontura.

[0129] Na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, o anticorpo ou fragmento deste pode ser administrado em várias formas de dosagem oral e parenteral durante a administração clínica. O anticorpo ou fragmento deste, quando formulado, pode ser preparado usando um diluente ou um excipiente, tal como um material de enchimento, um extensor, um aglutinante, um agente umectante, um desintegrante ou um tensoativo, que é normalmente usado. As formulações sólidas para a administração oral incluem um comprimido, uma pílula, um pó, grânulos, uma cápsula, um trocisco e os similares. Estas formulações sólidas podem ser preparadas pela mistura de um derivado de arila da fórmula química 1 da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável deste com pelo menos um excipiente, por exemplo, amido, carbonato de cálcio e, sacarose ou lactose ou gelatina. Além disso, lubricantes, tais como estearato de magnésio e talco, podem ser usados ao lado dos excipientes simples. As formulações líquidas para a administração oral incluem uma suspensão, uma solução para o uso interno, uma emulsão, um xarope e os similares. Além dos diluentes simples que são usados frequentemente, tais como água e parafina líquida, vários excipientes, por exemplo, um agente umectante, um adoçante, um aroma, um conservante e os similares podem ser contidos nas formulações líquidas.

[0130] As formulações exemplares para a administração parenteral incluem uma solução aquosa estéril, um solvente não aquoso, um solvente de suspensão, uma emulsão, um agente de liofiização e um supositório. A composição para o tratamento da presente invenção pode ser preparada na forma de uma torta liofilizada ou uma solução aquosa a fim de misturar e armazenar qualquer veículo fisiologicamente aceitável, excipiente ou estabilizante (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, I9th Edition, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co.(Easton, PA: 1995)) e um anticorpo com pureza preferível. O veículo, excipiente ou estabilizante aceitável é não tóxico para um usuário na dose e concentração usadas e exemplos deste incluem: tampões, por exemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos com baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, por exemplo, albumina sérica, gelatina ou imunoglobulina; polímeros hidrofílicos, por exemplo, polivinil pirrolidona; aminoácidos, por exemplo, glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrina; agentes quelantes, por exemplo, EDT; álcoois de açúcar, por exemplo, manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal, por exemplo, sódio; e (ou) tensoativos não iônicos, por exemplo, Tween, pluronics ou polietilenoglico! (PEG).

[0131]O anticorpo da presente invenção pode ser administrado em uma quantidade farmaceuticamente eficaz a um indivíduo que luta contra o câncer ou uma doença relacionada à migração de células imunes. Como usado aqui, o termo “quantidade farmaceuticamente eficaz" se refere a uma quantidade que mostra uma resposta maior comparado com controle negativo e preferivelmente se refere a uma quantidade suficiente para tratar câncer, uma quantidade suficiente para inibir a metástase do câncer e uma quantidade suficiente para tratar uma doença relacionada à migração de células imunes. A quantidade total eficaz do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção pode ser administrada a um paciente como uma dose única ou pode ser administrada por um protocolo de tratamento fracionado, no qual doses múltiplas são administradas por um longo período de tempo. A dose do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção ao corpo humano pode ser normalmente 0,01-100 mg/kg/semana, preferivelmente, 0,1-20 mg/kg/semana e mais preferivelmente 5- mg/kg/semana. No entanto, quanto à dose do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção, uma dose eficaz deste com relação a um paciente é determinada considerando vários fatores, por exemplo, a via de administração da composição farmacêutica, o número de vezes de tratamento, a idade de um paciente, peso corporal, consição da saúde e sexo, a gravidade da doença, a dieta e a taxa de excreção e, portanto, considerando este fato, um técnico no assunto poderia determinar uma quantidade eficaz adequada do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção de acordo com o uso particular como um inibidor de metástase do câncer. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção não é particularmente limitada à forma de dosagem, via de administração e método de administração deste visto que a composição mostra efeitos da presente invenção.

[0132] A via de administração da composição da presente invenção pode ser um método de administração de anticorpo conhecido, por exemplo, a injeção ou infusão por uma via intravenosa, intraperitoneal, intracranial, subcutânea, intramuscular, intraocular, intra-arterial, cerebrospinal ou intralesional ou a injeção ou infusão pelo sistema de liberação prolongada descrito abaixo. Por exemplo, o anticorpo da presente invenção pode ser administrado sistemicamente ou localmente.

[0133] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com cirurgia, terapia hormonal, quimioterapia e métodos usando controlador de resposta biológica, para a prevenção ou tratamento de câncer.

[0134] A composição farmacêutica da presente invenção também pode ser usada sozinha ou em combinação com cirurgia, terapia hormonal, quimioterapia e métodos usando controlador de resposta biológica, para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[0135] O diagnóstico e prognóstico de câncer (ou metástase do câncer), de acordo com a presente invenção podem ser avaliados pela detecção de proteínas KRS (especialmente, região N-terminal de KRS exposta extracelularmente) na amostra biológica e o diagnóstico e prognóstico da doença relacionada à migração de células imunes de acordo com a presente invenção podem ser avaliados pela detecção de proteínas KRS (especialmente, região N-terminal de KRS exposta extracelularmente) na amostra biológica.

[0136] Como usado aqui, o termo “diagnóstico” se refere à identificação da presença ou características de uma condição patológica. Na presente invenção, o diagnóstico é identificar a ocorrência ou a probabilidade (risco) de câncer ou/e metástase do câncer ou uma doença relacionada à migração de células imunes.

[0137] O termo “detecção” é como descrito acima e a amostra biológica inclui sangue e outras amostras líquidas tendo origens biológicas, espécimes de biópsia, amostras de tecido sólido tais como cultura de tecido ou células derivadas deles. Mais especificamente, exemplos da amostra biológica podem incluir, mas não são limitados a, tecidos, extratos, lisados celulares, sangue integral, plasma, soro, saliva, fluido ocular, fluido cerebrospinal, suor, urina, leite, fluido ascítico, fluido sinuvial, fluido peritoneal e os similares. A amostra pode ser obtida de animais, preferivelmente mamíferos e com a máxima preferência seres humanos. A amostra pode ser pré-tratada antes do uso para a detecção. Exemplos do pré-tratamento podem incluir filtração, destilação, extração, concentração, desativação do ingrediente de interferência, adição de reagente e os similares. Além disso, ácidos nucleicos e proteínas isoladas da amostra podem ser usados para a detecção.

[0138] O anticorpo ou fragmento deste de acordo com a presente invenção pode ser provido como um kit diagnóstico. O kit não é particularmente limitado ao tipo deste visto que o kit é conhecido na técnica como um kit de ensaio que provê um peptídeo tendo um anticorpo ou um domínio de ligação particular como um componente e exemplos deste incluem um kit para western blotting, ELISA, radioimunoensaio, radioimunodifusão, imunodifusão de Ouchterlony, imunoeletroforese de foguete, imuno-histoquímica, ensaio de imunoprecipitação, ensaio de fixação de complemento, FACS, um microarranjo de proteínas ou os similares.

[0139] O anticorpo ou fragmento deste da presente invenção pode ser usado em um kit, isto é, uma combinação acondicionada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para a realização do ensaio diagnóstico. Onde o anticorpo é rotulado com uma enzima, o kit pode incluir substratos e cofatores exigidos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que provê o cromóforo ou fluoróforo). Além disso, outros aditivos podem ser incluídos tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e os similares. As quantidades relativas de vários reagentes podem ser variadas amplamente para prover concentrações em solução dos reagentes que otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Os reagentes podem ser providos como pós secos, usualmente liofilizados, incluindo excipientes que mediante a dissolução proverão uma solução de reagente tendo uma concentração apropriada.

[0140] A presente invenção provê uso do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a preparação de um agente para a inibição de metástase do câncer.

[0141] A presente invenção provê um método para a inibição da metástase do câncer em um indivíduo em necessidade deste, o método compreendendo a administração do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção ao indivíduo em uma quantidade eficaz para a inibição da metástase do câncer.

[0142] A presente invenção provê uso do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a preparação de um agente para o diagnóstico de câncer.

[0143] A presente invenção provê um método para o diagnóstico de câncer em um indivíduo em necessidade deste, o método compreendendo a administração do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção ao indivíduo em uma quantidade eficaz para o diagnóstico de câncer.

[0144] A presente invenção provê uso do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção para a preparação de um agente para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

[0145] A presente invenção provê um método para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes em um indivíduo em necessidade deste, o método compreendendo a administração do anticorpo ou fragmento deste da presente invenção ao indivíduo em uma quantidade eficaz para o tratamento da doença relacionada à migração de células imunes.

[0146] Como usado aqui, o termo “quantidade eficaz” se refere a uma quantidade para mostrar um efeito de alívio, tratamento, prevenção, detecção ou diagnóstico de câncer ou um efeito de inibição ou redução de metástase do câncer e se refere a uma quantidade para mostrar um efeito de alívio, tratamento, prevenção, detecção ou diagnóstico de uma doença relacionada à migração de células imunes. O termo “indivíduo” pode ser um animal, preferivelmente um mamífero,

especialmente um animal incluindo um ser humano e pode ser células, um tecido, um órgão ou os similares derivados de um animal. O indivíduo pode ser um paciente em necessidade do efeito.

[0147] Como usado aqui, o termo “tratamento” se refere amplamente ao alívio do câncer, uma doença relacionada ao câncer ou uma doença relacionada à migração de células imunes e pode incluir a cura ou substantialmente prevenir tal doença ou alívio de uma condição da doença e pode incluir o alívio, cura ou prevenção de um ou mais dos sintomas resultantes de câncer ou uma doença relacionada ao câncer, mas não é limitado a isso.

[0148] Como usado aqui, o termo “compreendendo” é usado sinonimamente com “contendo” ou “sendo caracterizado” e não exclui ingredientes ou etapas adicionais não mencionados na composição ou método. O termo “que consiste em” significa a exclusão de elementos, etapas ou ingredientes adicionais de outra forma não especificados. O termo “que consiste essencialmente em” significa incluindo os elementos ou etapas mencionados assim como qualquer elemento ou etapa que não afeta substancialmente as características básicas dos elementos ou etapas mencionados no escopo das composições ou métodos.

EFEITOS VANTAJOSOS

[0149] Os anticorpos ou fragmentos deste de acordo com a presente invenção têm regiões de determinação de complementaridade (CDRs) particulares definidas no presente relatório descritivo e uma excelente capacidade de ligação específica a uma região N-terminall de KRS exposta extracelularmente. Adicionalmente, os anticorpos ou fragmentos deste de acordo com a presente invenção são especificamente direcionados à região N-terminal de KRS in vivo e, assim, inibem a interação entre o receptor de laminina e a região N-terminal de KRS, dessa forma, exercendo um excelente efeito sobre a inibição de metástase do câncer e pode controlar a migração de células imunes, dessa forma, exercendo um efeito muito considerável sobre a prevenção, alívio e tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0150] A Figura 1 mostra os resultados da seleção, através de western blotting (WB), de clones de fago scFv que se ligam à sequência de comprimento total de KRS ou fragmentos N-terminais de KRS.

[0151] A Figura 2 mostra os resultados da seleção, através de imunoprecipitação (IP), clones de fago scFv que se ligam à sequência de comprimento total de KRS ou fragmentos N-terminais de KRS.

[0152] A Figura 3a mostra os resultados, em que as células tendo região N- terminal de KRS exposta na membrana celular foram construídas através de expressão de myc-KRS T52D (mutante ativo) e foi investigado se os clones scFv N3, N5, N7 e N9 se ligaram à região exposta (KRS: significando myc-KRS T52D).

[0153] A Figura 3b mostra que no grupo de expressão de mutante inativo (myc- KRS T52A) ou WT-KRS (laminina não tratada), nenhum sinal de detecção foi observado apesar do tratamento com clones scFv N3, N5, N7 e N9 uma vez que a região N-terminal de KRS não foi exposta na membrana celular.

[0154] A Figura 3c mostra que quando as células transformadas com WT-KRS, T52D e T52A rotulados com myc foram tratadas com laminina e coloração scFv foi realizada, a coloração foi observada em sítios similares na localização da membrana de WT-KRS por laminina e mutante T52D e o myc transformado também foi colorido no mesmo sítio, mas coloração não foi observada em T52A (scFv: verde, myc: vermelho).

[0155] A Figura 4 mostra os resultados de western blotting de confirmação se clones scFv N3, N5, N7 e N9 se ligavam especificamente à N-terminal de KRS pelo uso de KRS de comprimento total (denotado por F, SEQ ID NO: 76), um fragmento de KRS com deleção de aminoácidos nas posições 1-71 na N-terminal (denotado por 1) e um fragmento de KRS composto de resíduos de aminoácido 1- 200 na N-terminal (denotado por 2).

[0156] A Figura 5a mostra os resultados de western blotting de confirmação da capacidade de ligação de KRS de IgG N3 e IgG N5 como representantes dentre os anticorpos da presente invenção.

[0157] A Figura 5b mostra os resultados de imunoprecipitação de confirmação da capacidade de ligação de KRS de IgG N3 e IgG N5 como representantes dentre os anticorpos da presente invenção.

[0158] A Figura 6a mostra os resultados de SPR de confirmação quantitativa da N-terminal de capacidade de ligação de KRS de IgG N3.

[0159] A Figura 6b mostra os resultados de SPR de confirmação quantitativa da N-terminal de capacidade de ligação de KRS de IgG N5.

[0160] A Figura 7a mostra os resultados, em que as células transformadas para expressar WT-KRS foram tratadas com laminina para expor extracelularmente a região N-terminal de KRS e a seguir tratadas com o anticorpo da presente invenção, IgG N3, para investigar a ligação de IgG N3 à região exposta através de coloração de imunofluorescência.

[0161] A Figura 7b mostra os resultados, em que as células tendo região N- terminal de KRS exposta extracelularmente foram construídas através de expressão de T52D-KRS (KRS marcada com myc mutante ativa) e a seguir tratadas com o anticorpo da presente invenção, IgG N3, para investigar a ligação de IgG N3 à região exposta através de coloração de imunofluorescência. Também foi confirmado, através de um experimento para conferir permeabilidade à membrana celular, que o anticorpo da presente invenção transloca para dentro das células e pode se ligar com a proteína KRS presente dentro das células.

[0162] A Figura 7c mostra os resultados, em que as células transformadas para expressar WT-KRS foram tratadas com laminina para expor extracelularmente a região N-terminal de KRS e a seguir tratadas com o anticorpo da presente invenção, IgG N5, para investigar a ligação de IgG N5 à região exposta através de coloração de imunofluorescência (IgG N5: verde).

[0163] A Figura 8 mostra os resultados do ensaio de MTT de confirmação que o anticorpo da presente invenção IgG N3 não tinha qualquer citotoxicidade.

[0164] A Figura 9a mostra os resultados de confirmação que a migração celular foi suprimida pelo tratamento com o anticorpo da presente invenção IgG N3.

[0165] A Figura 9b mostra os resultados de confirmação que o anticorpo da presente invenção IgG N3 suprimiu significativamente a migração celular de uma maneira dependente de dose.

[0166] A Figura 10 mostra esquematicamente um cronograma experimental de construção de modelos de metástase do câncer de camundongo, administração de substância terapêutica (anticorpo ou YH16899) e observação de metástase de pulmão nos modelos de camundongo, em um experimento usando modelos de metástase do câncer in vivo.

[0167]A Figura 11 mostra espécimes de pulmão de camundongo capazes de confirmação que metástase de câncer em pulmões foi suprimida significativamente pela administração do anticorpo da presente invenção, IgG N3, em modelos de metástase do câncer in-vivo. Os graus de progresso e gravidade da metástase do câncer poderiam ser avaliados a partir da contagem e condição dos nódulos gerados nos espécimes de pulmão.

[0168] A Figura 12 mostra os resultados de confirmação que a geração de nódulos pulmonares foi suprimida significativamente pela administração do anticorpo da presente invenção, IgG N3, comparado com o controle, em modelos de metástase do câncer in-vivo (isto é, metástase do câncer em pulmões foi suprimida significativamente).

[0169] A Figura 13 mostra comparativamente os tecidos pulmonares no controle e o grupo de tratamento IgG N3 e confirmou que uma quantidade significativamente grande de receptores de laminina foi expressa nos sítios de nódulo de metástase no controle comparado com o grupo tratado com o anticorpo da presente invenção.

[0170]A Figura 14 mostra os espécimes de pulmão de controle, grupo de tratamento YH16899, grupo de tratamento IgG N3 e mostra os resultados que a geração de nódulos pulmonares foi suprimida significativamente no grupo de tratamento YH16899 e no grupo de tratamento IgG N3 comparado com o controle.

[0171]A Figura 15 mostra a eficiência da inibição da metástase pulmonar (eficiência de inibição de formação de nódulo pulmonar) das substâncias do inibidor de metástase do câncer de acordo com a concentração de tratamento no grupo de tratamento YH16899 e no grupo de tratamento IgG N3.

[0172] A Figura 16 mostra os resultados de SPR de confirmação quantitativa da capacidade de ligação de IgG N3 a fragmentos de peptídeo N-terminais de KRS de seres humanos (h) (F1, F2, F3, F4 e F5) (barras cinza abaixo da sequência indicam a capacidade de ligação de anticorpo N3 às regiões correspondentes (F1 a F5) e quanto mais escura é a barra, mais forte é a capacidade de ligação).

[0173] A Figura 17 mostra os resultados de SPR de confirmação quantitativa da capacidade de ligação de IgG N3 a fragmentos de peptídeo N-terminais de KRS (F1, F3 e F5) de ser humano (h), camundongo (m) e rato (r) (barras cinza abaixo das sequências indicam a capacidade de ligação de anticorpo N3 às regiões correspondentes (F1 a F5) e quanto mais escura é a barra, mais forte é a capacidade de ligação).

[0174] A Figura 18a mostra os resultados do ensaio de migração transcavidade de comparação dos efeitos de colágeno, fibronectina e laminina sobre a migração de célula imune (monócito/macrófago) e provê imagens microscópicas das células em migração.

[0175] A Figura 18b é um gráfico que mostra contagens de células medidas (quantificadas) nas imagens microscópicas da Figura 18a.

[0176] A Figura 19a mostra os resultados do ensaio de migração transcavidade de comparação dos efeitos de vários subtipos de laminina (LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511 e LN521) em migração de célula imune (monócito/macrófago) e provê imagens microscópicas das células em migração.

[0177]A Figura 19b é um gráfico que mostra a contagem de células medidas (quantificadas) nas imagens microscópicas da Figura 19a.

[0178] A Figura 19c mostra os resultados de western blotting de confirmação que KRS aumentou na membrana de monócito/macrófago pelo tratamento com LN421.

[0179] A Figura 20a mostra os resultados do ensaio de migração transcavidade de comparação dos efeitos inibidores do anticorpo da presente invenção, IgG N3, na migração de monócito/macrófago específico de LN421 e provê imagens microscópicas das células em migração.

[0180] A Figura 20b é um gráfico que mostra as contagens de células medidas (quantificadas) nas imagens microscópicas da Figura 20a.

[0181] A Figura 20c mostra os resultados de western blotting de confirmação que o nível de KRS aumentou pelo tratamento com LN421 na membrana de monócito/macrófago foi reduzido pelo tratamento com o anticorpo da presente invenção, IgG N3.

[0182] A Figura 21a mostra uma mudança na pressão sistólica final do ventrículo direito (RVESP) pela administração do anticorpo da presente invenção, IgG N3, em modelos hipertensão arterial pulmonar (PAH) (IgG em simulação: controle nagativo, Ab 1 mpk: anticorpo N3 1 mpk, Ab 10 mpk: anticorpo N3 10 mpk, sildenafila: controle positivo).

[0183] A Figura 21b mostra uma mudança na pressão sistólica final do ventrículo esquerdo (LVESP) pela administração do anticorpo da presente invenção, IgG N3, em modelos de hipertensão arterial pulmonar (PAH) (IgG em simulação: controle nagativo, Ab Impk: IgG N3 1 mpk, Ab 10 mpk : IgG N3 10 mpk, sildenafila: controle positivo).

[0184] A Figura 22 mostra os resultados da coloração IHC de confirmação que a administração do anticorpo da presente invenção, IgG N3, reduziu a migração e invasão de células imunes nos modelos de hipertensão arterial pulmonar (PAH).

MODO PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[0185] A seguir, a presente invenção sera descrita em detalhes.

[0186] No entanto, os seguintes exemplos são meramente para a ilustração da presente invenção e não são destinados a limitar o escopo da presente invenção. EXEMPLO 1 Triagem da Biblioteca de scFy <1-1> Triagem de fagos scFv triagem primária

[0187] A fim de selecionar anticorpos scFv que se ligam especificamente somente à região N-terminal de KRS (SEQ ID NO: 75) exposta extracelularmente quando KRS é translocada para a membrana celular pelo sinal de laminina, na sequência de comprimento total de KRS (SEQ ID NO: 76), o ciclo repetido da exibição de fagos (“phage display panning”) foi realizado usando a biblioteca de fagos scFv derivada de células B humanas direcionadas a HA. A biblioteca de fagos de exibição scFv (tamanho da biblioteca: app. 7,6 x 10º biblioteca produzida por prof. Hyunbo Shim) usada no presente experimento é revelada na patente coreana No. 10-0961392. Como mostrado na Tabela 1 abaixo, as sequências de comprimento total de KRS e fragmentos de KRS com diferentes regiões particulares da N- terminal foram usadas como proteínas antigênicas para o ciclo repetido da exibição de fagos.

[0188] A um tubo imunológico contendo 1 ml de solução 1 X PBS, 1-10 ug de proteínas antigênicas foram adicionadas e incubadas a 37 ºC por 1 h a 200 rpm, dessa forma, revestindo a superfície interna do tubo com antígenos. A solução antigênica foi drenada e antígenos não revestidos foram removidos pela lavagem uma vez com água corrente. Para prevenir a ligação não específica entre proteínas antigênicas e fagos, o tubo imunológico e biblioteca de scFv foram incubados separadamente com 1 X PBST (0,05% de PBS contendo Tween 20) contendo 3% de leite desnatado à temperatura ambiente por 1 h. Depois que o leite desnatado foi removido do tubo imunológico, a biblioteca de scFv foi adicionada e incubada a 150 rpm por 1 h a 37 ºC, dessa forma, ligando fagos scFv aos antígenos. Depois que os fagos scFv foram incubados no tubo, fagos scFv não ligados foram removidos por lavagem duas ou cinco vezes com 1 X PBST.

[0189] Os fagos ScFv que se ligam especificamente aos respectivos antígenos KRS foram isolados dentro de 10 min por adição de 1 ml de trietilamina (100 mM) à temperatura ambiente e neutralizados com Tris (I M, pH 7,4). Os fagos scFv filtrados foram adicionados a E. coli ER2537 cultivado para OD<1, seguido pela infecção com incubação a 120 rpm por 1 h e 30 min a 37 ºC. E. coli infectado com os fagos foi centrifugado para remover parcialmente o sobrenadante de cultura, seguido pela redispersão e a seguir espalhado em placa de agarose com diâmetro de 15 cm contendo ampicilina e glicose (2%). No dia seguinte, 5 ml de meio SB foram aplicados para coletar todas as células desenvolvidas na placa e glicerol (50%) foi adicionado a 0,5 vez o volume total, seguido pela mistura e a seguir a mistura foi dispensada em porções de 1 ml e armazenada a -80 ºC (estoque do ciclo repetido de scFv). A seguir, 20 ul do estoque preparado foram semeados em 20 ml de solução de SB, seguido pela incubação e a seguir construídos em biblioteca de fagos scFv (1 ml) para a etapa seguinte de ciclo repetido de fagos pelo uso de fagos auxiliares. O procedimento acima para o isolamento de fagos que expressam scFv específico de antígenos foi repetido duas ou três vezes. <1-2> Triagem de anticorpos scFv que se ligam especificamente através de ELISA triagem secundária

[0190] Foi investigado através de ELISA indireto se os fagos expressos por scFv selecionados no Exemplo <1-1> se ligavam aos fragmentos N-terminais ou de KRS de comprimento total mencionados acima.

[0191] O produto scFv obtido por três rodadas de ciclo repetido foi diluído e aplicado sobre placa de agarose com diâmetro de 10 cm. No dia seguinte, as respectivas colônias foram selecionadas e incubadas em placa de 96 cavidades contendo 200 ul de meio SB. Depois que as colônias foram verificadas para crescerem bem em geral, IPTG (1 mM) foi adicionado, seguido pela incubação a ºC por 16 h, dessa forma, induzindo a produção de scFv. No dia seguinte, a placa de 96 cavidades foi centrifugada para isolar somente células e a seguir as células foram lisadas com solução de TES, seguido pela recentrifugação, dessa forma, separando somente o sobrenadante. O sobrenadante obtido foi submetido a ELISA indireto para selecionar scFv que se liga especificamente a antígenos. As placas foram revestidas com antígenos de KRS de comprimento total ou os antígenos de fragmento N-terminal, respectivamente, incubados com o sobrenadante de cultura contendo scFv e a seguir incubados com anticorpo anti- HA-HRP (Roche Applied Science) como um anticorpo secundário. O desenvolvimento da cor foi realizado usando tetrametil benzimidina (TMB, Thermo scientific) e a seguir interrompido usando H2SO, (1 M) e a absorbância foi lida a 450 nm usando leitor de ELISA. ELISA foi realizado em antígenos de controle (vazio) e os antígenos descritos acima (Ag) ao mesmo tempo para selecionar somente colônias com valores positivos. Do total de 1920 colônias submetidas a ELISA, 93 colônias foram selecionadas como sendo positivas (vide a Tabela 1). Tabela 1 | Completo | 1-20 | 13- |31- |1-29/5-34 [10- |15- |24- | Total ss] as Resultados | 288 384 384 |192 [192 [192 1920 do ciclo repetido ess rm Err: Ee =)

<1-3> Sequenciamento

[0192] As sequências foram analisadas para filtrar o mesmo Ab com sequências de CDR sobrepostas fora das 93 colônias selecionadas através da triagem de ELISA no Exemplo <1-2>. O sequenciamento foi realizado especificamente pelo seguinte método: depois que os clones scFv de retenção de E. coli foram cultivados, fagemídeos foram obtidos por miniprep. Os fagemídeos foram sequenciados usando iniciador Omp (Hye young Yang, et. al., 2009, Mol. Cells 27, 225-235). A sequência, assim, obtida foi usada para verificar as sequências de regiões de CDR dos fagemídeos pelo programa Bioedit. Fora destes, os clones com sequências de CDR sobrepostas foram eliminados para verificar clones scFv das respectivas sequências de CDR independentes. Tabela 2 Antígeno (fragmento de KRS) Completo /1- |13- [31- |1- |5- /10- [15- [24- | Total ade ls da ss E Clones 10 1 | 1 1 4 2 38 [amas

[0193] Como um resultado da triagem de anticorpos com sequências de CDR sobrepostas através de sequenciamento, 38 clones scFv com sequências de CDR diferentes foram obtidos como mostrado na Tabela 2. <1-4> Triagem de anticorpos scFv que se ligam especificamente através de western blotting Triagem terciária

[0194] Foi investigado através de western blotting se 38 clones scFv isolados no Exemplo <1-3> especificamente se ligaram a KRS.

[0195] Os clones scFv de colônia única positivos foram incubados em 5 ml de meio SB contendo canamicina (Bactotritona 30 g, extrato de levedura 20 9, tampão MOPS 109g/L) para iniciar a cultura de sementes e após a incubação durante a noite, a cultura foi transferida para 500 ml de meio SB contendo canamicina. Quando o valor OD a 600 nm alcançou cerca de 0,5, IPTG foi adicionado para alcançar 1 mM, seguido pela incubação a 30 ºC durante a noite, dessa forma, expressando proteínas scFv no periplasma de E. coli. No dia seguinte, E. coli obtidos através de centrifugação foram suspensos em tampão 1 X TES (50 mM Tris, 1 MM EDTA, 20% de sacarose, pH 8,0) e a seguir 0,2 X TES foi adicionado por 1,5 vez, seguido pela mistura e a seguir sobrenadante foi tirado através de centrifugação, dessa forma, extraindo o periplasma.

[0196] Finalmente, 5 MM MgSO;, foi adicionado aos anticorpos scFv extraídos do periplasma e o material resultante foi misturado com contas de NI-NTA equilibradas anteriormente com PBS, seguido pela agitação por 1 h em um armazenamento a frio para ligar o anticorpo às contas de Ni-NTA. Depois disso, a cromatografia por afinidade foi realizada para lavar suficientemente as proteínas não ligadas com PBS. Após lavagem adicional suficiente com um tampão contendo 5 mM imidazol, os anticorpos scFv ligados foram eluídos usando 200 mM tampão de imidazol. Os anticorpos eluídos foram dializados e a pureza destes foi verificada por eletroforese. A quantificação de proteína foi realizada por ensaio BCA e a quantidade de anticorpos purificados foi registrada e a seguir uma determinada quantidade deste foi dispensada e a seguir armazenada congelada.

[0197] Como descrito acima, os anticorpos scFv extraídos do periplasma foram usados para investigar usando western blotting se os anticorpos scFv ligados aos fragmentos N-terminais de KRS respectivos ou de KRS de comprimento total. À seguir, 30 ug de lisado celular HCT116 sofreram eletroforese através de SDS PAGE, foram transferidos para a membrana de PVDF e a seguir bloqueados com 3% de leite desnatado. Depois disso, os anticorpos scFv extraídos foram adicionados a 1,0 ug/ul, seguido pela incubação por 1 h. Os anticorpos scFv não ligados foram lavados e para a detecção, a ligação de scFv com antígenos foi incubada com anticorpos anti-HA secundários ligados com peroxidase de rábano silvestre (HRP) e sensibilização da película foi realizada usando reagente ECL como um substrato em uma sala escura. As bandas sensibilizadas foram comparadas com marcadores de molécula padrão para identificar bandas que correspondem aos tamanhos da KRS de comprimento total e os respectivos fragmentos.

[0198] Através do western blotting, clones scFv com bandas altamente fracas (bandas fracas) e bandas não específicas (bandas duplas) foram excluídos.

Portanto, 13 clones scFv foram selecionados e estes resultados são mostrados na Figura 1. <1-5> Triagem de anticorpos scFv que se ligam especificamente através de imunoprecipitação triagem quaternária

[0199] A imunoprecipitação foi realizada para investigar se os clones scFv selecionados no Exemplo <1-4> de fato se ligavam a KRS nativa. Os clones scFv purificados e o lisado celular HCT116 foram submetidos à ligação Ag-Ab e imunoprecipitação foi realizada utilizando marcador de scFv HA.

[0200] Especificamente, as células HCT116 foram lisadas em 20 mM tampão Tris- HCI (pH 7,4, tampão de lise) contendo 150 mM NaCl, 0,5% de Triton X-100, 0,1% de SDS e um inibidor de protease. Cada scFv (5 ug) foi adicionado a 500 ug de lisado celular HCT116 e a seguir incubado a 4 ºC durante a noite. A seguir, 30 ul de contas de agarose anti-HA foram adicionados, seguido pela incubação a 4 ºC por 4 h. O sobrenadante foi removido através de centrifugação. O precipitado, assim, obtido foi dissolvido em tampão de amostra de SDS e fervido por 7 min. À etapa de dissolução e ebulição foi repetida duas vezes.

[0201] Cada uma das amostras imunoprecipitadas preparadas através do procedimento descrito acima foi submetida à eletroforese através de SDS PAGE, transferida para a membrana de PVDF e a seguir bloqueada com 3% de leite desnatado. Depois disso, os anticorpos policlonais de KRS (coelho, Neomics, Co. Ltd. &%NMS-01-0005) foram adicionados, seguido pela incubação por 1 h. Depois que os anticorpos não ligados foram lavados, anticorpos secundários anticoelho (ThermoFisher Scientific, Hf31460) foram adicionados, seguido pela incubação. Após a incubação com os anticorpos secundários, a sensibilização da película foi realizada usando reagente ECL com um substrato em uma sala escura. As bandas sensibilizadas foram comparadas com marcadores de molécula padrão para identificar bandas que correspondem aos tamanhos da KRS de comprimento total e os respectivos fragmentos.

[0202] Portanto, 12 clones scFv foram selecionados e estes resultados são mostrados na Figura 2. <1-6> Triagem de anticorpos scFv de ligação específica através de imunofluorescência triagem quinária

[0203] A imunofluorescência foi realizada para investigar se os clones scFv selecionados no Exemplo <1-5> de fato se ligavam à região N-terminal de KRS exposta na membrana celular. A fim de fazer um fenômeno no qual KRS é exposta na membrana, o mutante KRS-T52D (mutante ativo) foi usado. Especificamente, as células A549 foram semeadas em lamela de vidro (1 x 10º célula, com base em placa de 12 cavidades) e após 24 h, myc-KRS WT/ myc- KRS T52D (mutante ativo/ myc-KRS T52A (mutante inativo) foram superexpressas, respectivamente. Após a incubação por 24 h, as células foram incubadas usando meios livres de soro (meios RPMI 1640) a 37 ºC por 1 h. Depois disso, as células foram tratadas com 10 pg/ml de laminina (L2020; Sigma) e a seguir incubadas a 37 ºC por 1 h. Cada um dos vetores myc-KRS T52D (mutante ativo) e myc-KRS T52A (mutante inativo) foi construído usando vetor pcDNA3-myc-KRS WT como uma estrutura principal através de mutagênese sítio- dirigida (QuikChange IL Site-Directed Mutagenesis kit, Agilent, 4200523).

[0204] As amostras preparadas foram lavadas com PBS (4 ºC), fixadas pelo tratamento com 4% de paraformaldeído por 10 min e a seguir lavadas. As amostras foram bloqueadas com bloco de CAS por 10 min e tratadas com os anticorpos scFv e Myc por 2 h. Depois disso, os anticorpos não ligado foram lavados e incubados com anticorpos secundários por 1 h em uma sala escura. À coloração DAP! foi realizada por 10 min antes da montagem.

[0205] Como mostrado na Figura 3, os resultados experimentais mostraram que um total de quatro clones scFv (N3, N5, N7 e N9) não ligados ao mutante inativo (T52A) e WT-KRS (laminina não tratada), mas ligados a células de mutante ativo somente foram selecionados. Quando o tratamento com laminina foi realizado para a indução da localização da membrana de WT-KRS e a coloração scFv foi realizada, regiões de coloração similares foram observdas em mutante WT-KRS e T52D.

[0206] Foi confirmado que estes clones especificamente se ligam à superfície celular (ponta). <1-7> Verificação da capacidade de ligação específica à N-terminal de KRS

[0207] Para investigar se os clones scFv (N3, N5, N7 e N9) finalmente selecionados através de Exemplo <1-6> de fato se ligavam à N-terminal de KRS,

KRS de comprimento total (denotado por F, SEQ ID NO: 76), um fragmento de KRS com deleção em aminoácidos nas posições 1-71 na N-terminal (definido por SEQ ID NO: 1) e um fragmento de KRS composto de resíduos de aminoácido 1- 200 na N-terminal (definido por SEQ ID NO: 2) foram usados para conduzir western blotting.

[0208] As células A549 foram transformadas pelo método como descrito no Exemplo <1-6> usando polinucleotídeos que codificam KRS de comprimento total e fragmentos de KRS. Depois disso, as células foram lisadas e western blotting foi realizado pelo mesmo método como descrito no Exemplo <1-4>,

[0209] Como mostrado na Figura 4, os resultados confirmaram que todos os clones scFv selecionados (N3, N5, N7 e N9) mostraram bandas somente no fragmento com aminoácidos em 1-200 na N-terminal enquanto mostram nenhuma banda no fragmento 1 sem aminoácidos nas posições 1-72 na N-terminal. Foi, portanto, verificado que todos os clones scFv N3, N5, N7 e N9 especificamente se ligavam à N-terminal de KRS. <1-8> Sequenciamento de clones scFv específicos da ligação N-terminal de

KRS

[0210] Os clones scFv (N3, N5, N7 e N9) finalmente selecionados através de Exemplo <1-6> foram analisados para a conformação de CDR e sequências de VH e VL deste. O sequenciamento foi realizado pelo mesmo método que descrito no Exemplo <1-3>.

[0211] Como um resultado de sequenciamento, N3 scFv consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 67, que contém a sequência ligante de SEQ ID NO: 65 no meio deste. Além disso, N3 VH consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 49 e N3 VL consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 51. Como um resultado de sequenciamento, CDRs respectivas contidas em VH e VL de N3, N3 VH compreende CDR1 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 1, CDR2 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 3 e CDR3 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 5 e N3 VL compreende CDR1 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 7, CDR2 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 9 e CDR3 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 11.

[0212] O scFv N5 consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 69, que contém a sequência ligante de SEQ ID NO: 65 no meio deste. Além disso, N5 VH consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 53 e N5 VL consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 55. N5 VH compreende CDR1 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 13, CDR2 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 15 e CDR3 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 17 e N5 VL compreende CDR1 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 19, CDR?2 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 21 e CDR3 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 23.

[0213] O scFv N7 consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 71, que contém a sequência ligante de SEQ ID NO: 65 no meio deste. Além disso, N7 VH consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 57 e N7 VL consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 59. N7 VH compreende CDR1 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 25, CDR2 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 27 e CDR3 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 29 e N7 VL compreende CDR1 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 31, CDR?2 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 33 e CDR3 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 35.

[0214] O scFv N9 consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 73, que contém a sequência ligante de SEQ ID NO: 65 no meio deste. Além disso, N9 VH consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 61 e N9 VL consiste na sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 63. N9 VH compreende CDR1 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 37, CDR2 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 39 e CDR3 de cadeia pesada definida por SEQ ID NO: 41 e N9 VL compreende CDR1 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 43, CDR?2 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 45 e CDR3 de cadeia leve definida por SEQ ID NO: 47. Exemplo 2 Conversão de anticorpos scFv em anticorpos IgG e avaliação de capacidade de ligação específica deste <2-1> Conversão de anticorpos scFv em anticorpos IgG

[0215] Primeiro, os polinucleotídeos que codificam scFv foram amplificados por meio de PCR a partir de genomas de fagos N3, N5, N7 e N9. As sequências de nucleotídeo dos iniciadores usados para amplificar um gene de região VH dos anticorpos scFv: Direta (AGA GAG TGT ACA CTC CCA GGC GGC CGA GGT GCA G, SEQ ID NO: 93), Reversa (CGC CGC TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GCT CAC GGT GAC CAG, SEQ ID NO: 94). As sequências de nucleotídeo dos iniciadores usados para amplificar um gene de VL região dos anticorpos scFv: Direta (AAG CGG CCG CCA CCA TGG GAT GGA GCT GTA TCA TCC TCT TCT

TGG TAG CAA CAG CTA CAG GTG TAC ACT CCC AGT CTG TGC TGA CTC AG, SEQ ID NO: 95), Reversa (CGC CGC CGT ACG TAG GAC CGT CAG CTT GGT, SEQ ID NO: 96)

[0216] A PCR foi realizada com cada DNA de fago (50 ng) como um modelo pelo uso dos iniciadores (10 pmol cada) em condições de: 95 ºC/3 min; 95 ºC/30 s, 60 ºC/30 s, 72 ºC/30 s, 30 ciclos; e 72 ºC/5 min, dessa forma, amplificando o gene VH ou VL de scFv N3, N5, N7, ou N9. O produto PCR foi inserido no vetor pcDNA3.4 usado na produção de IgG usando enzimas de restrição. As proteínas de cadeia pesada e leve de IgG foram codificadas individualmente em plasmídeos separados.

[0217] Os vetores construídos compreendendo DNA que codifica cadeias pesadas e leves de cada uma das IgGs (a seguir, denominadas IgG N3, IgG N5, IIGN7 e IgG N9, respectivamente) contendo regiões variáveis scFv foram cotransformados em células 293F de estilo livre para expressar as cadeias pesadas e leves juntamente nas células. As células 293F transformadas foram incubadas em condições de 37 ºC e 8% de CO, por 7 dias e o sobrenadante foi obtido. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de membrana de acetato de celulose (tamanho de poro 0,22 um, Corning) e purificado usando coluna A de proteína CaptivA'Y PriMAB (Repligen, USA). As concentrações dos anticorpos obtidos foram medidas usando kit BCA (Pierce, 23225) e as proteínas de anticorpo de IgG produzidas em condições de redução e não redução foram analisadas. <2-2> Verificação da capacidade de ligação de KRS de IgG convertida = Western blotting e imunoprecipitação

[0218] A capacidade de ligação de KRS das IgGs construídas no Exemplo <2-1> foi investigada por western blotting (WB) e imunoprecipitação. O Western blotting foi realizado da mesma maneira que descrito no Exemplo <1-4> e a imunoprecipitação foi realizada da mesma maneira que descrito no Exemplo <1- 5>.

[0219] Os resultados verificaram que as IgGs construídas na presente invenção se ligavam a KRS e a Figura 5 mostra estes resultados usando IgG N3 e IgG N5 como representantes. <2-3> Verificação da capacidade de ligação específica da N-terminal de KRS de lgGs SPR convertidas

[0220] A capacidade de ligação quantitativa das proteínas de anticorpo purificadas (IgG N3 e IgG N5) ao antígeno (KRS 1-207 aa) foi medida usando biosensor Biacore 2000 SPR (ressonância plasmônica de superfície) (GE healthcare, US). Depois que KRS foi imobilizado em um chip sensor (CM5, GE healthcare, US), proteínas de anticorpo (6,25-100 nM), que foram serialmente diluídas com solução tampão HES (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% de tensoativo P20), foram deixadas fluir em uma taxa de 30 ul/ímin por 3 min e 1 M NaCl/20 mM NaOH foi deixado fluir em uma taxa de 30 ulímin por 3 min, dessa forma, induzindo a dissociação de proteínas ligadas ao antígeno. À IgG em simulação foi usada como controle. As condições de experimento específicas são como a seguir: Antígeno imobilizado: KRS Nível imobilizado: 185 RU Anticorpo: IgG N3 e IgG N5 Tampão em execução: tampão HBS-N Regeneração: 2 M NaCl, 20 mM NaOH (fluxo 30 ul / min 1 min) Tabela 3 [e] Em Mm | IgG N3 1,09E+05

[0221] A Tabela 3 mostra constantes de taxa cinética e constantes de dissociação de equilíbrio medidas para IgG N3 e IgG N5 pelo uso de Biacore 2000 SPR. À afinidade foi obtida a partir das constantes de taxa cinética (ka e kd) e constantes de dissociação de equilíbrio (KD) pelo uso de avaliação de BIA software ver. 3.2. A Figura 6 mostra os reultados do gráfico SPR de IgG N3 e IgG N5, respectivamente. Foi confirmado a partir da Figura 6 e Tabela 3 que IgG N3 e IgG N5 da presente invenção têm alta capacidade de ligação específica à região N- terminal de KRS. Nenhum sinal de ligação foi observado em IgG em simulação como controle. <2-4> Verificação da capacidade de ligação específica da N-terminal de KRS de IgG convertida coloração de imunofluorescência

[0222] Para investigar se as IgGs construídas na presente invenção de fato se ligavam à região de KRS exposta na membrana celular, a imunofluorescência foi realizada. A coloração de imunofluorescência foi realizada pelo mesmo método que descrito no Exemplo <1-6> pelo uso de IgG N3 e IgG N5 como representantes.

[0223] Como mostrado na Figura 7A, os resultados confirmaram que IgG N3 se ligava à favorável e especificamente à região N-terminal de KRS exposta extracelularmente quando a localização da membrana de WT-KRS foi induzida pelo tratamento com laminina. Como mostrado na Figura 7B, o experimento usando T52D-KRS (KRS marcada com myc mutante ativa) também mostrou que o anticorpo da presente invenção se ligava favoravelmente à região N-terminal de KRS exposta extracelularmente e quando as células experimentais se tornavam permeabilizadas, as proteínas KRS presentes no citosol eram detectadas em alta sensibilidade. Também foi confirmado como mostrado na Figura 7C que IgG N5 se ligava à favorável e especificamente à região N-terminal de KRS exposta extracelularmente quando a localização da membrana de WT-KRS foi induzida pelo tratamento com laminina.

[0224] Portanto, foi verificado que os anticorpos providos na presente invenção têm alta especificidade de ligação em relação a região N-terminal de KRS exposta extracelularmente. Exemplo 3 Verificação do efeito inibidor sobre a metástase do câncer <3-1> Avaliação da Citotoxicidade

[0225] O ensaio de MTT foi realizado em IgG N3 como um representante. As células AS549 foram semeadas em placas de 96 cavidades (5.000 célula/cavidade) e incubadas. As células foram lavadas com meios livres de soro e a seguir tratadas com IgG em simulação humana e IgG N3 de O, 50, 100, 500 nM (em meios livres de soro). Após 24 h de incubação, a solução de MTT foi adicionada com 50 ug/cavidade, seguido pela incubação por 4 h. Depois que a solução de MTT foi removida, as cavidades foram tratadas com 100 ul de DMSO e a seguir a absorbância foi medida a 570 nm.

[0226] Como mostrado na Figura 8, os resultados experimentais confirmaram que o anticorpo da presente invenção mostra nenhuma citotoxicidade. <3-2> Ensaio de Migração Celular

[0227] A migração celular foi medida usando uma câmara de 24 cavidades Transwell com membrana de policarbonato (8,0 um tamanho de poro, Costar) como revelado na técnica anterior (Park, S. G. et al, Human Iysyl-t(RNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 6356-6361 (2005)). Na câmara Transwell, a cavidade inferior foi revestida com 10 ug de laminina (em gelatina) e seca com UV. Depois disso, as células A549 foram suspensas em meio RPIM livre de soro e a seguir colocadas em uma concentração de 1 x 10º células por cavidade na câmara superior. À câmara foi tratada com IgG N3 ou IgG em simulação humana (controle) a 100 nM ou 500 nM, seguido pela incubação por 24 h. Depois disso, a câmara foi lavada duas vezes com PBS e tratada com 70% de MeOH (em PBS) por 30 min. À câmara foi novamente lavada duas vezes com PBS e tratada com solução de hematoxilina por 30 min. A câmara foi lavada três vezes com DW e a membrana na câmara foi cortada e montada no vidro deslizante.

[0228] Como mostrado na Figura 9A, os resultados experimentais mostraram que IgG N3 inibiu significativamente a migração de células A549. Os resultados experimentais também mostraram que este efeito inibidor da migração celular era dependente da dose (vide a Figura 9B). <3-3> Avaliação de efeito inibidor da metástase do câncer em modelos de metástase do câncer in-vivo

[0229] Visto que KRS pode acelerar a migração celular através de 67LR associado à metástase do câncer, os modelos de tumor (câncer) animal foram construídos usando células 4T7-1 de câncer de mama de camundongo (Korean Cell Line Bank), que são bem passíveis de sofrer metástase no pulmão. Os modelos animais de câncer de mama ortotópico foram construídas pela injeção de 4 x 10º células 4T1 no coxim de gordura de seis camundongos de 7 semanas de idade BALB/cCAnCr (Doo Yeol Biotech).

[0230] O câncer foi injetado no coxim de gordura mamária e após 10 dias (Dia 10), os tecidos com câncer foram ressecados do coxim de gordura. Após um dia (Dia 11), IgG N3 (10 mg/kg) foi administrada duas vezes na semana por duas semanas em intervalos de 3 dias (um total de quatro vezes, Dias 11, 14, 18 e 21) por meio de injeção i.v. por veia caudal e a mesma dose de IgG em simulação de controle (Thermo *t31154) também foi administrada. Uma semana após a conclusão do cronograma complete de dosage de anticorpo, ou seja, 28 dias após a injeção de câncer, os camundongos foram sacrificados para retirar o tecido pulmonar. Mediante autópsia do tecido pulmonary, o pulmão foi inflado por injeção de uma solução fisiológica no brônquio através de uma seringa, coletado e a seguir armazenado em solução Bouin (Sigma tHT10132) por 24 h. Depois disso, os nódulos com metástase em cada lobo do pulmão foram contados através de um microscópio.

[0231] Como mostrado nas Figuras 11 e 12, os resultados experimentais confirmaram que muitos nódulos foram gerados no pulmão devido à metástase do câncer em controle e tais nódulos foram suprimidos significativamente no grupo de tratamento IgG N3. A Figura 13 mostra comparativamente os tecidos pulmonares no controle e o grupo de tratamento IgG N3 e confirmou que uma quantidade significativamente grande de receptores de laminina foi expressa nos sítios de nódulo de metástase no controle comparado com o grupo tratado com o anticorpo da presente invenção. <3-4> Comparação do efeito com composto de metástase anticâncer (YH16899) em modelos de metástase do câncer in-vivo

[0232] Sabe-se na literatura mencionada acima “Dae Gyu Kim et al., (2014) que o composto YH16899 tem um efeito sobre a inibição da metástase do câncer pela supressão da interação entre 67LR e KRS. A seguir, o efeito inibidor da metástase do câncer foi comparado entre YH16899 e IgG N3, o anticorpo da presente invenção. A construção de modelos de tumor in-vivo e a observação da condição de metástase de pulmão foram realizadas pelo mesmo método que no Exemplo <3-3>. YH16899 foi oralmente administrado a 100 mpk todo dia. IgG N3 foi injetada intravenosamente em concentrações diferentes (1 mpk, 10 mpk) através das caudas do camundongo.

[0233] Como mostrado nas Figuras 14 e 15, os resultados experimentais confirmaram que a contagem de nódulos pulmonares foi reduzida significativamente de uma maneira dependente de dose no grupo de tratamento IgG N3 e o tratamento meramente com 1 mpk de IgG N3 inibiu significativamente a metástase do câncer comparado com os grupos de tratamento com YH16899 (100 mpk). Exemplo 4 Verificação dos sítios de ligação de anticorpos KRS <4-1> Sítios de ligação de KRS humana de anticorpos monoclionais de KRS

[0234] Para investigar os sítios de ligação de KRS humana de IgG N3 dentre os anticorpos KRS construídos acima, ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi realizada como abaixo.

[0235] Primeiro, o anticorpo IgG N3 foi imobilizado diante de Biacore T200 (GE Healthcare) equipado com Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) pelo uso de um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare). A seguir, os peptídeos mostrados na Tabela 4 dissolvidos abaixo na solução de PBS em concentrações correspondentes foram deixados fluir por 60 s. A seguir, a PBS foi deixada fluir por 5 min. A seguir, a capacidade de ligação foi analisada por Biacore T200 Evaluation software v2.0 (GE Healthcare). Tabela 4 Informações sobre Peptídeos Ládida] Santicitasasdatacantd ate tuçaia BAI Cai IEA

F3 (10-38) | KY/DGSEPKLSKNELKRRLKAEKKVAEKEA [| H Bs1toj eo | F4 (15-42)| EPKLSKNELKRRLKAEKKVAEKEAKQKE H B337 100 F5 (24-49) KRRLKAEKKVAEKEAKQKELSEKQLS H B084 101 mF1 (1- 28) MATLQESEVKVDGEQKLSKNELKRRLKA M 8230 102 mF2 (3- 34) QESEVKVDGEQKLSKNELKRRLKAEKKLA 3383 103 mF3 (10- 37) KVDGEQKLSKNELKRRLKAEKKLAEKEA M 3268 104 mF4 (15- 1) QKLSKNELKRRLKAEKKLAEKEAKQKE 3253 105 mF5 (24- 48) RRLKAEKKLAEKEAKQKELSEKQLN M 2997 106 rF1 (1-28) | MATLREGEVKLDGEPKLSKNELKRRLKA | R BM rF2 (3-34) | REGEVKLDGEPKLSKNELKRRLKAEKKLA | R 636 rF3 (10- 37) KLDGEPKLSKNELKRRLKAEKKLAEKEA 3251 rF4 (15- 1) PKLSKNELKRRLKAEKKLAEKEAKQKE R 3222 110 rF5 (24- 48) RRLKAEKKLAEKEAKQKELSEKQLN 2997 111

[0236] Como mostrado na Figura 16, os resultados mostraram que o anticorpo IgG N3 se ligava a epítopos F1, F2, F3 e F4, mas não o epítopo F5. Além disso, a capacidade de ligação ao epítopo F4 foi mais forte e a capacidade de ligação a F3, F2 e F1 foi mais forte naquela ordem.

[0237] Estes resultados poderiam confirmar que o principal sítio de ligação de anticorpo IgG N3 corresponde aos resíduos de aminoácido nas posições 15 a 29 na região N-terminal de KRS.

<4-2> Atividade cruzada interespécies de anticorpo monoclonal KRS

[0238] O exemplo acima validou o sítio de ligação de KRS humana do anticorpo KRS IgG N3 e para investigar se IgG N3 mostrou atividade cruzada com outras espécies de camundongo (m) e rato (r), ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi realizada como abaixo.

[0239] Da mesma maneira que o método experimental descrito no Exemplo 4-1 acima, o anticorpo IgG N3 foi imobilizado no chip pelo uso de um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare). A seguir, os peptídeos mostrados na Tabela 4 acima dissolvidos em solução PBS em concentrações correspondentes foram deixados fluir por 60 s e PBS foi deixada fluir por 5 min. A seguir, a capacidade de ligação foi analisada por Biacore T200 Evaluation software v2.0 (GE Healthcare).

[0240] Como mostrado na Figura 17, os resultados mostraram que o anticorpo IgG N3 se ligava a epítopos F1, F2, F3 e F4 de ser humano (h), camundongo (m) e rato (r), mas não o epítopo F5. A capacidade de ligação mais forte ao epítopo F3 do que F1 foi a mesma que dentre sere humano, camundongo e rato (dados de F2 e F4 não mostrados)

[0241] Estes resultados poderiam confirmar que o anticorpo IgG N3 é capaz de atividade cruzada interespécies. Exemplo 5 Verificação do papel do sinal de laminina na migração e invasão de células imunes

[0242] Foi investigado quais das várias matrizes extracelulares que constituem os vasos sanguineos aceleraram a migração e invasão de monócitos/macrófagos. Os métodos experimentais específicos para o ensaio de migração transcavidade usando colágeno, fibronectina e laminina como matrizes extracelulares foram como abaixo. A transcavidade (Corning, f3421-5mm) foi revestida com gelatina (0,5 mg/ml) e a seguir RAW 264.7 células (1 x 10º células/cavidade) foram semeadas na câmara superior. Cada DMEM livre de soro (500 ul) contendo laminina (laminin mixture, Biolamina), fibronectina, ou colágeno (10 pg/ml) foi colocado na câmara de fundo. Após 24 h, as células não em migração presentes na parte superior da membrana foram removidas por chumaços de algodão. As células na câmara de fundo foram fixadas por tratamento com 70% de metanol por 30 min e a seguir coloridas com 50% de hematoxilina por 30 min. Após a coloração, a membrana foi tirade e montada na lâmina e a seguir as células em migração presentes na superfície de fundo da membrana foram observadas e quantificadas através de um microscópio de alta resolução.

[0243] Como mostrado nas Figuras 18a e 18b, os resultados experimentais confirmaram que fora as várias matrizes extracelulares, a laminina acelerou a migração de monócito/macrófago cxom mais força. Exemplo 6 Efeitos da Migração e Invasão de Células Imunes por Subtipos de Laminina

[0244] Os efeitos de subtipos de laminina sobre a migração e invasão de células imunes foram avaliados. O ensaio de migração transcavidade foi realizado pelo mesmo método que no Exemplo 5 usando LN111, LN211, LN221, LN411, LN421, LN511 e LN521 (10 pg/ml) como várias proteínas do subtipo laminina (adquirida de Biolamina). As sequências específicas dos subtipos de laminina podem ser referenciadas cadeia a4 de SEQ ID NO: 115, cadeia a2 de SEQ ID NO: 121, cadeia a5 de SEQ ID NO: 122, cadeia B2 de SEQ ID NO: 117, cadeia B1 de SEQ ID NO: 123 e cadeia y1 de SEQ ID NO: 119, de acordo com as cadeias que constituem os respectivos subtipos de laminina.

[0245] As células RAW 264.7 (2 x 10º célula) foram incubadas por 18 h, tratadas com 1 ug/ml de cada subtipo de laminina em DMEM livre de soro e a seguir colhidas a O h, 12 h e 24 h. A proteína de célula RAW 264.7 foi separada em frações de citosol e membrana pelo uso do ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit (Calbiotech, catttf 539790). A proteína obtida foi submetida à eletroforese, transferida para a membrana de PVDF (Milipore) e bloqueada com 3% de leite desnatado. Depois disso, o antcorpo monoclonal KRS (coelho, Neomics, Co. Ltd. %tNMS-01-0005) foi adicionado, seguido pela incubação por 1 h. Depois que os anticorpos não ligados foram lavados, anticorpos anticoelho secundários (ThermoFisher Scientific, 431460) foram adicionados, seguido pela incubação. Após a incubação com os anticorpos secundários, a sensibilização da película foi realizada usando reagente ECL como um substrato em uma sala escura. As bandas sensibilizadas foram comparadas com marcadores de molécula padrão para identificar bandas que correspondessem aos tamanhos de KRS. Os anticorpos Na+/K+ ATPase (Abcam) e tubulina (Sigma) foram usados para a identificação do marcador de membrana plasmática e citosol, respectivamente.

[0246] Como mostrado nas Figuras 19a e 19b, os resultados experimentais confirmaram que monócitos/macrófagos migram ao responderem especificamente ao subtipo a4B2y1 (LN421) dentre todos os subtipos de laminina testados. Ou seja, foi confimado que monócitos/macrófagos migraram e invadiram especificamente respondendo a LN421. Como mostrado na Figura 19c, foi confirmado que o tratamento de monócitos/macrófagos com LN421 aumentou a quantidade de KRS detectada na região da membrana celular, mas diminuiu parcialmente a quantidade de KRS detectada na região do citosol. Estes resultados indicam que KRS, que está geralmente presente na região do citosol após a expressão dentro dos monócitos/macrófagos, é translocada para a região da membrana celular pelo tratamento com LN421 e que um aumento de KRS na região da membrana celular imune corresponde a um fenômeno patológico importante nas doenças associado à migração e invasão de células imunes. Exemplo 7 Construção de anticorpo para a redução do nível de KRS da membrana celular e verificação do efeito de controle da migração/invasão de células imunes

[0247] O efeito sobre a migração e invasão de células imunes foi investigado usando anticorpo IgG N3 como um respresentante dentre os anticorpos construídos no Exemplo 1 acima. Os métodos experimentais específicos foram como a seguoir. A transcavidade (Corning, t3421-5mm) foi revestida com gelatina (0,5 mg/ml) e a seguir as células RAW 264.7 (1 x 10º células/cavidade) foram semeadas na câmara superior. DMEM livre de soro (500 ul) contendo laminina 421 (1 ug/ml) foi colocado na câmara de fundo. A câmara superior foi tratada com cada anticorpo a 100 nM. Após 24 h, a imobilização com 70% de metanol foi realizada por 30 min e a seguir coloração com 50% de hematoxilina foi realizada por 30 min. As células não em migração presentes na parte superior da membrana foram removidas por chumaços de algodão e a seguir a membrana foi tirada e montada na lâmina. As células em migração presentes na superfície de fundo da membrana doram observadas por um microscópio de alta resolução

(Figura 20a) e as células foram contadas nas imagens obtidas e traçadas no gráfico (Figura 20b).

[0248] As células RAW 264.7 foram tratadas com laminina 421 (1 uo/ml) e anticorpo (100 nM), incubadas por 24 h e colhidas. Depois disso, a colheita foi separada nas frações de membrana e citosol pelo uso do ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit (Calbiochem), amostrada e a seguir submetida a western blotting com relação a KRS. O método específico deste foi como descrito no Exemplo 6.

[0249] Como mostrado nas Figuras 20a e 20b, os resultados experimentais confirmaram que o anticorpo da presente invenção inibiu eficaz e especificamente a migração de monócito/macrófago dependente de LN421. Como mostrado na Figura 20c, foi confirmado que o tratamento com LN421 aumentou o nível de KRS na membrana celular do monócito/macrófago e o tratamento com anticorpo IgG N3 reduziu eficazmente o nível de KRS na membrana celular. Foi confirmado ainda que o nível de KRS no citosol foi reduzido no grupo de tratamento do anticorpo IgG N3.

[0250] Estes resultados confirmaram que o anticorpo da presente invenção tem possibilidade como um novo agente terapêutico para doenças envolvidas na migração de células imunes, tais como monócitos/macrófagos. Exemplo 8 Verificação do efeito sobre doença relacionada à migração de células imunes em modelos in-vivo

[0251] Como nos exemplos acima, o seguinte experimento foi executado usando anticorpo IgG N3 como um representante dentre os anticorpos da presente invenção. Métodos

1. Construção do modelo de hipertensão arterial pulmonar (PAH) e administração da substância de teste

[0252] Para induzir PAH em ratos SD com sete semanas de idade (Orient Bio), 60 mMpk de monocrotalina (MCT) foram injetados subcutaneamente. Depois disso, os ratos foram divididos em quatro grupos (cinco animais por grupo) e administrados com 1 mpk de IgG humana em simulação (Thermo Fisher Scientific, controle nagativo), 1 mpk de IgG N3, 10 mpk de IgG N3 10 e 25 mpk de sildenafila (controle positivo) por três semanas. Todos os anticorpos foram injetados i.v. duas vezes por semana e sildenafila foi oralmente administrada todo dia.

2. Medição do fluxo sanguíneo e pressão arterial

[0253] Após três semanas, os ratos foram anestesiados com isoflurano e medidos quanto ao fluxo sanguíneo e pressão arterial pelo uso de um sistema de medição pneumático de alta precisão (sistema de pressão e volume cardiovascular MPVS, nome do modelo: MPVS Ultra, fabricante: Millar Instruments). A pressão sistólica final do ventrículo direito (RVESP), pressão diastólica final do ventrículo direito, pressão sistólica final do ventrículo esquerdo, pressão diastólica final do ventrículo esquerdo foram medidas usando um cateter exclusivo (cateter de pressão de rato Mikro-Tip, fabricante: Millar Instruments). O débito cardíaco foi medido usando uma sonda de fluxo sanguíneo perivascular (Transonic Flow probes, fabricante: Millar Instruments) e o método experimental deste foi realizado pelo mesmo método que revelado na seguinte literatura: Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Kass DA. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc 2008;3(9):1422-34.

3. Imuno-histoquímica (IHC)

[0254] Os pulmões coletados foram fixados em paraformaldeído (PFA), de acordo com o procedimento comum e a seguir infiltrado e embebido com parafina através de lavagem, desidratação e clareamento. Os blocos de parafina do tecido pulmonar do rato foram microsseccionados até uma espessura de 6 um e lâminas foram fabricadas. Depois disso, a coloração foi realizada como abaixo. A amostra foi primeiro tratada com xileno por 5 min três vezes, tratada com 100% de etanol, 95% de etanol, 90% de etanol e 70% de etanol e DW naquela ordem por 2 min e lavada com PBS por 5 min. Após tratamento com 0,3% de H2O,, a amostra foi lavada com PBS por 5 min duas vezes. A amostra foi imersa em 0,01 M tampão de citrato, aquecida e lavada com PBS-T (0,03% de Tween 20). Depois disso, a amostra foi bloqueada (2% de BSA & 2% de soro de cabra em PBS) à temperatura ambiente por 30 min. A amostra foi colorida com anticorpo anti-CD68 (1 : 200, clone ED1, Abcam) a 4 ºC durante a noite. A amostra foi lavada com

PBS-T por 5 min três vezes e a seguir tratada com polymer-HRP anti-mouse envision kit (DAKO) a 4 ºC por 1 h. A amostra foi lavada com PBS-T três vezes e a seguir a cor foi desenvolvida pelo tratamento com tampão de substrato DAB e cromogênio DAB 20. O tecido colorido foi tratado com hematoxilina de Mayer (Sigma) por 1 min e a seguir tratado com 70% de etanol, 90% de etanol, 95% de etanol e 100% de etanol naquela ordem por 2 min cada duas vezes. Por último, o tecido foi tratado com xileno três vezes por 5 min e a seguir observado sob um microscópio óptico. Resultados <8-1> Verificação das mudanças de pressão sanguínea e débito cardíaco.

[0255] Os modelos de PAH, que é uma doença tendo relação próxima entre a invasão de células imunes e fenômenos patológicos, foram tratados com anticorpo IgG N3 (1 mpk ou 10 mpk) por 3 semanas (i.v., duas vezes por semana) e a seguir medidos quanto à pressão sistólica final do ventrículo direito (RVESP), pressão diastólica final do ventrículo direito (RVEDP), pressão sistólica final do ventrículo esquerdo (LVESP), pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (LVEDP) e débito cardíaco (CO). Os resultados deste são mostrados na Tabela 5. Tabela 5 simulação + N3 Ab Impk | + N3 Ab 10mpk | Sildenafila (n=4) (n=5) (n=5) (n=5) mmHg -*-.

(n=4) (n=5) (n=5) (n=4)

[0256] (Nenhuma medição de CO para um animal de MCT + grupo IgG em simulação morreu de anestesia e um animal do grupo de tratamento com sildenafila morreu durante a cirurgia)

[0257] A hipertensão arterial pulmonar faz com que a pressão final do ventrículo direito suba devido ao estreitamento da artéria pulmonar, resultando em falência do ventrículo direito. Além disso, o mecanismo de recompensa deste é destruído devido à hipertensão contínua, resultando em hipertrofia do ventrículo direito seguido pela dilatação do ventrículo direito. Isto causa a compressão do ventrículo esquerdo devido ao movimento do septo ventricular, resultando em reduções no volume disatólico final e débito cardíaco do ventrículo esquerdo (WooSeok Lee, et al., Clinical Characteristics and Prognostic Factors of Patients with Severe Pulmonary Hypertension, Korean Circulation J 2007;37:265-270). Como resultado, a hipertensão arterial pulmonar é principalmente associada ao ventrículo direito, mas também está envolvida nas funções do ventrículo esquerdo.

[0258] Os pacientes com PAH mostraram um aumento de RVESP, que também foi observado nos modelos animais de PAH do presente experimento. No que diz respeito a isso, como mostrado na Figura 21a, o anticorpo N3 reduziu significativamente RVESP em ambas as concentrações deste e reduziu favoravelmente RVESP do que especialmente sildenafila, o fámarco de controle positivo.

[0259] Além disso, uma redução na pressão sistólica final do ventrículo esquerdo (LVESP) devido à administração do anticorpo IgG N3 não foi observada e, em vez disso, como mostrado na Figura 21b, LVESP aumentou significativamente no grupo administrado com o anticorpo da presente invenção. Portanto, o anticorpo da presente invenção está em contraste com sildenafila usada como um agente terapêutico existente para a hipertensão arterial pulmonar em que sildenafila causa dilatação arterial pulmonar e dilatação arterial sistêmica, dessa forma, ariscando uma redução na pressão sanguínea sistêmica.

[0260] Ou seja, foi confirmado que o anticorpo da presente invenção mostrou uma tendência a ter um baixo efeito sobre a pressão arterial sistêmica comparado com sildenafila e este efeito é considerado uma característica favorável de um agente terapêutico considerando que a administração de sildenafila pode ter um risco de desenvolver hipotensão nos sítios clínicos. Além disso, a hipertensão arterial pulmonar grave causa falência RV sistólica, que pode ser acompanhada por baixo débito cardíaco e hipotensão sistêmica.

[0261] Por outro lado, espera-se que um tratamento para aliviar a hipertensão arterial pulmonar pelo anticorpo da presente invenção aumente o débito cardíaco e a pressão sanguínea sistêmica, dessa forma, normalizando a pressão sanguínea.

[0262] Em geral, foi confirmado que a administração do anticorpo da presente invenção reduziu o risco de efeitos colaterais de fármacos terapêuticos existentes e mostrou alívio dos sintomas de PAH e efeitos do tratamento. <8-2> Ecocardiografia

[0263] A descoberta do ventrículo esquerdo em formato de D indicando sobrecarga de pressão no ventrículo direito foi observada em três animais no grupo de administração de MCT sozinho (isto é, modelos de PAH de não administração de substância de teste) e três animais no grupo de administração de MCT + sildenafila, mas não foi observada nos grupos de administração do anticorpo terapêutico.

[0264] Além disso, como mostrado na Tabela 6 abaixo, os pesos corporais dos respectivos grupos aumentaram até graus similares, com nenhuma diferença significativa. Ou seja, não se observou que as descobertas indicavam sinais anormais, incluindo redução de peso anormal, causada pela administração do anticorpo terapêutico. Tabela 6 o Seo tam o O sírio | simulação (n=5) mpk Sildenafila (n=4) (n=5) (n=5) absoluta (g 14,2 14,6 12,3 26,4 % 7,8 5,2 5,0 10,5 <8-3> Verificação da migração de monócito/macrófago e graus de infiltração

[0265] A coloração IHC foi realizado com relação a CD68, que é um marcador de monócito/macrófago, pelo uso dos tecidos pulmonares de cada grupo experimental. Como mostrado na Figura 22, os resultados experimentais confirmaram que os grupos tratados com anticorpos IgG N3 da presente invenção reduziram explicitamente a infilttação de monócito/macrófago em tecidos pulmonares e tal efeito dói significativamente melhor do que aquele de sildenafila.

Aplicabilidade Industrial

[0266] Como descrito acima, os anticorpos ou fragmentos deste de acordo com a presente invenção têm sequências de CDR (região de determinação de complementaridade) particulares definidas no presente relatório descritivo e capacidade de ligação específica excelente à região N-terminal de KRS exposta extracelularmente e, assim, podem ser usados no diagnóstico de uma doença (por exemplo, câncer) conhecida por ser acompanhada por comportamentos específicos de KRS. Adicionalmente, os anticorpos ou fragmentos deste de acordo com a presente invenção também são especificamente direcionados à região N-terminal de KRS in vivo e, assim, inibem a interação entre o receptor de laminina e a região N-terminal de KRS para exercer um excelente efeito inibidor sobre a metástase do câncer e, portanto, podem ser usados como um agente terapêutico. Adicionalmente, os anticorpos ou fragmentos deste de acordo com a presente invenção podem controlar a migração de células imunes e, assim, podem ser muito vantajosamente usados na prevenção, alívio e tratamento de doenças relacionadas à migração de células imunes e, portanto, têm alta aplicabilidade industrial.

Claims

U7 REIVINDICAÇÕES:

1. ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE, caracterizado por se ligar especificamente a um epítopo contendo a sequência de SEQ ID NO: 97 na N-terminal de lisil-|IRNA sintetase (KRS).

2. —ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo epítopo ser selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 114.

3. — ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento deste se liga especificamente a uma região N-terminal de lisiltRNA sintetase exposta extracelularmente e é caracterizado por compreender: uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo: região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR1) contendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 37; região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) contendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 39; e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) contendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29 e SEQID NO: 41 e; uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo: região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 (CDR1) contendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 43; região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 (CDR2) contendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 45; e região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 (CDR3) contendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: e SEQ ID NO: 47.

4. — ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE, de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo ou fragmento deste é caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve que são selecionadas do grupo que consiste em: uma região variável de cadeia pesada compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 1, região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 3 e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 7, região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 9 e região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 11; uma região variável de cadeia pesada compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 13, região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 15 e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 19, região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 21 e região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 23;

uma região variável de cadeia pesada compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 25, região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 27 e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 29 e uma região variável de cadeia leve compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 31, região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 33 e região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 35 e; uma região variável de cadeia pesada compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 37, região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 39 e região de determinação de complementaridade de cadeia pesada 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 41 e uma região variável de cadeia leve compreendendo região de determinação de complementaridade de cadeia leve 1 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 43, região de determinação de complementaridade de cadeia leve 2 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 45 e região de determinação de complementaridade de cadeia leve 3 contendo a sequência de aminoácidos definida por SEQ ID NO: 47.

5. — ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela região variável de cadeia pesada conter a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 61 e a região variável de cadeia leve conter a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 63.

6. —ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo anticorpo ser selecionado do grupo que consiste em IgG, IgA, IgM, IgE e IgD e pelo fragmento ser selecionado do grupo que consiste em diacorpo, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv e scFv.

7. —ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo scFv conter a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 73.

8. — POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por codificar o anticorpo ou fragmento deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, caracterizado por compreender o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 8.

10. CÉLULA, caracterizada por ser transformada com o vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 9.

11. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A UMA REGIÃO N-TERMINAL DE LISIL-TRNA SINTETASE EXPOSTA EXTRACELULARMENTE, sendo o método caracterizado por compreender: transformação das células hospedeiras com o vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 9; incubação das células hospedeiras transformadas para produzir um anticorpo ou fragmento deste e; coleta do anticorpo ou fragmento deste produzido nas células hospedeiras.

12. MÉTODO PARA DETECÇÃO ESPECÍFICA DE UMA REGIÃO N-TERMINAL DE LISIL-TRNA SINTETASE EXPOSTA EXTRACELULARMENTE, sendo o método caracterizado por compreender: contato do anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação 1, com uma amostra e; detecção do anticorpo ou fragmento deste.

13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA A INIBIÇÃO DA METÁSTASE DO CÂNCER, caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação 1, como um ingrediente ativo.

14. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo câncer ser selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer do intestino grosso, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer gástrico, câncer do fígado, câncer de sangue, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer anal, câncer de cólon, câncer de mama, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma endometrial, câncer cervical, câncer vaginal, carcinoma vulvar, doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer endócrino, câncer de tireóide, carcinoma da paratireóide, câncer adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer uterino, câncer de pênis, câncer de próstata, leucemia crônica ou aguda, linfoma de linfócitos, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma pélvico renal, Tumor do SNC, linfoma primário do SNC, tumor da medula espinhal, glioma do tronco cerebral e adenoma de pituitária.

15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo câncer ser câncer de mama ou câncer de pulmão.

16. COMPOSIÇÃO PARA O DIAGNÓSTICO DE CÂNCER, caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação 1, como um ingrediente ativo.

17. COMPOSIÇÃO — FARMACÊUTICA PARA A PREVENÇÃO OU

TRATAMENTO DE UMA DOENÇA RELACIONADA À MIGRAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES, caracterizada por compreender o anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação 1, como um ingrediente ativo.

18. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pela doença relacionada à migração de células imunes ser selecionada do grupo que consiste em uma doença cardiovascular, uma doença fibrótica, uma doença inflamatória crônica e síndrome de Alport.

19. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pela doença cardiovascular ser selecionada do grupo que consiste em hipertensão arterial pulmonar, aterosclerose, angina (angina pectoris), infarto do miocárdio, doença cerebrovascular isquêmica, arteriosclerose e esclerose mesentérica.

20. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pela doença fibrótica ser selecionada do grupo que consiste em esclerodermia, artrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerosa, mielofibrose, fibrose pulmonar, fibrose hepática, cirrose hepática, fibrose renal, miofibrose, fibrose cardíaca, lúpus eritematoso sistêmico, fibrose hereditária, fibrose infecciosa, fibrose irritante, fibrose por doença autoimune crônica, fibrose causada por incompatibilidade antigênica durante o transplante de órgãos, fibrose por hiperlipidemia, fibrose por obesidade, fibrose diabética, fibrose por hipertensão e oclusão causada por fibrose durante a inserção do stent.

21. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pela doença inflamatória crônica ser selecionada do grupo que consiste em asma, dermatite atópica, eczema, psoríase, osteoartrite, gota, artrite psoriática, cirrose, esteato-hepatite não alcoólica, doença pulmonar obstrutiva crônica, rinite, retinopatia diabética, insuficiência renal diabética, neuropatia diabética e esclerose múltipla.

22. USO DO ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se destinar à preparação de um agente para a inibição da metástase do câncer.

23. MÉTODO PARA A INIBIÇÃO DA METÁSTASE DO CÂNCER EM UM INDIVÍDUO EM NECESSIDADE DESTE, sendo o método caracterizado por compreender a administração do anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação 1, ao indivíduo em uma quantidade eficaz para a inibição da metástase do câncer.

24. USO DO ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se destinar à preparação de um agente para o diagnóstico de câncer.

25. MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO DE CÂNCER EM UM INDIVÍDUO EM NECESSIDADE DESTE, sendo o método caracterizado por compreender a administração do anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação 1, ao indivíduo em uma quantidade eficaz para o diagnóstico de câncer.

26. USO DO ANTICORPO OU FRAGMENTO DESTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se destinar à preparação de um agente para o tratamento de uma doença relacionada à migração de células imunes.

27. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UMA DOENÇA RELACIONADA À

MIGRAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES EM UM INDIVÍDUO EM NECESSIDADE DESTE, sendo o método caracterizado por compreender a administração do anticorpo ou fragmento deste, de acordo com a reivindicação 1, ao indivíduo em uma quantidade eficaz para o tratamento da doença relacionada à migração de células imunes.