WO2015102341A1 - 항 krs 모노클로날 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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김성훈
최연식
심현보
이남주
박민화
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-KRS antibody that selectively binds to Lysyl-tRNA synthetase (KRS) and its use. More specifically, an antibody or fragment thereof that binds to human KRS, a method for producing the same, and a cancer or an autoimmune disease comprising the same. And it relates to a composition for diagnosing inflammatory diseases.
  • KRS Lysyl-tRNA synthetase
  • Aminoacyl-tRNA synthetase is an enzyme that attaches a specific amino acid to its corresponding tRNA.
  • Higher organisms consist of 23 enzymes, including 3 kinds of enzymes involved in the formation of mul t isynthetase complexes, including ⁇ 1 ( ⁇ 43), (AIMP2) p38, and (AIMP3) pl8.
  • ⁇ 1 ⁇ 43
  • AIMP2 p38
  • AIMP3 pl8 a kind of enzymes involved in the formation of mul t isynthetase complexes
  • KRS Lisyl-tRNA synthetase
  • TNF— ⁇ increased TNF- ⁇ activity of macrophage cells by signaling by p38 mi togen act ivivated kinase.
  • KRS has been reported to promote or promote migrat ions in cells.
  • KRS has also recently been found to be involved in a variety of diseases. The presence of autoantibodies against KRS has been reported in patients with inflammatory myopathic diseases, and KRS binds to this enzyme in S0D1 gene mutations, which cause Lou Gehrig's disease. It has been reported to promote cancer cell metastasis by contributing to the stabilization of.
  • Antibodies of the present invention are expected to be of high diagnostic and industrial availability as well as for research in view of their excellent sensitivity and no cross-reaction between ARS.
  • the inventors of the present invention while studying antibodies that specifically bind to KRS, found fragments that specifically bind to KRS in a library made by phage display method, and completed the present invention by clarifying its sequence and binding specificity. . It is therefore an object of the present invention to provide antibodies or fragments thereof that bind to human KRS. Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the antibody or fragment thereof. Another object of the present invention . It is to provide a vector comprising the polynucleotide. Another object of the present invention is to provide a cell comprising the vector. Another object of the present invention is to provide a method for producing an antibody or fragment thereof that binds to human KRS.
  • the present invention provides a complementarity determining region (CDR) Ll comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a complementarity determining region (CDR) L2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a sequence.
  • CDR complementarity determining region
  • Antibody light chain variable region comprising a complementarity determining region (CDR) L3 comprising an amino acid sequence represented by number 3 (CDR) Hl comprising a amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5
  • Human KRS comprising an antibody heavy chain variable region (VH) comprising a complementarity determining region (CDR) H2 comprising an amino acid sequence as represented by and a complementarity determining region (CDR) H3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the antibody or fragment thereof.
  • the present invention provides a vector comprising the polynucleotide
  • the present invention provides a cell comprising the vector.
  • the present invention is to culture the cells under the condition that the polynucleotide is expressed, to produce a polypeptide comprising a light chain and heavy chain variable region and the cell or culture " Provided is a method for producing an antibody or fragment thereof that binds to a human KRS comprising recovering the polypeptide.
  • the present invention provides a sample of an antibody or fragment thereof. It provides a KRS specific detection method comprising the step of contacting with and detecting the antibody or fragment thereof.
  • the present invention provides a cancer diagnostic composition comprising the antibody or fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the antibody or fragment thereof for the preparation of a diagnostic agent for cancer.
  • the present invention provides a method for preparing a biological sample, the method comprising the steps of: (a) obtaining a biological sample from an individual; (b) measuring the KRS protein level in the biological sample using the antibody or fragment thereof of claim 1; c) comparing the KRS protein level with the KRS protein level in a normal individual.
  • the present invention provides a composition for diagnosing autoimmune diseases comprising the antibody or fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the antibody or fragment thereof for the preparation of a diagnostic agent for autoimmune diseases.
  • the present invention provides a method for preparing a biological sample comprising: (a) obtaining a biological sample from an individual, (b) measuring the KRS protein level in the biological sample using the antibody or fragment thereof ( c) providing a method for diagnosing autoimmune disease in an individual, comprising comparing the KRS protein level with that of a normal individual.
  • the present invention provides a composition for diagnosing inflammatory disease comprising the antibody or fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the antibody or fragment thereof for the preparation of a diagnostic agent for inflammatory diseases.
  • the present invention provides a method for preparing a biological sample, the method comprising the steps of: (a) obtaining a biological sample from an individual; (b) measuring the KRS protein level in the biological sample using the antibody or fragment thereof of claim 1; c) comparing the KRS protein level with the KRS protein level of a normal individual.
  • the present invention provides a complementarity determining region (CDR) Ll comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a complementarity determining region (CDR) L2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • CDR complementarity determining region
  • An antibody light chain variable region comprising a complementarity determining region (CDR) L3 comprising a complementarity determining region (CDR) Hl comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • An antibody that binds to a human KRS comprising an antibody heavy chain variable region (VH) comprising a complementarity determining region (CDR) H2 and a complementarity determining region (CDR) H3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or and it provides the fragment.
  • VH antibody heavy chain variable region
  • CDR complementarity determining region
  • CDR complementarity determining region
  • Lai chamber -tRNA synthetase (KRS, Lysyl -tRNA synthet ase) are lysine (Lys) with an enzyme that promotes the binding of the tRNA is a kind of ARS (Aminoacyl -tRNA synthet ase) i.
  • KRS is generally the ratio of native or recombinant human KRS, and human KRS - represents the human homologue.
  • antibody used in the broadest sense of the present invention, Monoclonal antibodies (including monoclonal antibodies, full length monoclonal antibodies), polyclonal antibodies (polyclonal antibodies), multispecific antibodies (eg bispecific antibodies), and antibody fragments (eg variable regions And other portions of an antibody exhibiting the desired biological activity (eg, binding to KRS).
  • Antibodies of the present invention are antibodies in which specific amino acid sequences are included in the light and heavy chain CDRs to selectively bind to KS. All may be included, Preferably it may be a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention includes all chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and preferably human antibodies.
  • Monoclonal antibodies of the invention represent antibodies obtained substantially from a population of homologous antibodies, ie, the individual antibodies that make up the population are identical except for naturally occurring mutations that may be present in small amounts. .
  • Monoclonal antibodies bind very specifically to single antigen epitopes.
  • the term "monoclonal" refers to the characteristics of an antibody as it is obtained from a substantial homology population, and does not necessarily mean that the antibody is produced by a particular method.
  • monoclonal antibodies of the invention are described in Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, or by recombinant DNA methods (see US Pat. No. 4, 816, 567). See also, for example, Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 and Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731 can be used to differentiate from phage antibody libraries using the techniques described.
  • Antibodies of the present invention specifically include chimeric antibodies, wherein some of the heavy and / or light chains originate from a particular species or exhibit the same or homologous sequence as that of the specific antibody, but the remainder As long as the antibody of the invention exhibits desirable biological activity (eg, selective binding with KRS), it may be of the same or homologous originating from another species or with the matching sequence of another antibody. 4, 816 567; And Morrison et al. , (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 6851-6855].
  • Humanized antibodies are antibodies that contain sequences of both human and non-human (eg rat, rat) antibodies. Generally, all but the portion of the epitope-binding site (CDR) is from a human antibody.
  • the binding site (CDR) may comprise a non-human derived sequence.
  • Intact human antibodies refer to antibodies comprising only human immunoglobulin protein sequences, which are derived from mice, mouse cells, or hybridomas derived from mouse cells. Can be produced or produced by phage display. Natural antibodies produced in vivo are typically heterologous-tetrameric glycoproteins of about 150,000 Daltons, consisting of two identical light chains (L) and two identical chains (H). Each light chain is linked to the heavy chain by one covalent disulfide bond, but the disulfide chain number varies between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has regularly spaced intrachain disulfide bridges. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH) followed by a number of constant domains.
  • VH variable domain
  • Each light chain has a variable domain (VL) at one end and a constant domain at its other end;
  • the constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain.
  • Particular amino acid residues are believed to form an interface between the light chain and heavy chain variable domains.
  • variable region or “variable domain” of an antibody refers to the amino one terminal domain of the heavy or light chain of the antibody.
  • the variable region of the heavy chain is described as “VH” or “VH”, and the variable region of the light chain is “ VL “or” VL ". These domains are generally the most variable portions of antibodies and contain antigen binding sites.
  • variable refers to a moiety in which several sequences within the variable region differ widely in sequence between antibodies and are directly related to the binding and specificity of each particular antibody to its specific antigenic determinants. It refers to the fact that it includes.
  • CDRs complementarity determining regions
  • HVLs hypervariable loops
  • CDR-L1 is located approximately residues 24-34 in the light chain variable region
  • CDR-L2 is approximately residues 56 and CDRL3 is approximately residues 89-97
  • CDR-H1 is located approximately residues 31 ′ 35 in the heavy chain variable region
  • CDR-H2 is approximately residues 50-65
  • CDR-H3 is approximately residues 95-102.
  • the site includes sequences that tend to be less variable. From the amino terminus to the carboxy terminus of the heavy and light chain variable regions, the FRs and CDRs are arranged in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4. Large sheet placement of the FRs brings the CDRs within each chain close to each other as well as to CDRs from other chains. The resulting form contributes to the antigen binding site (see Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669), but not all CDR residues need to be directly involved in antigen binding.
  • each CDR belonging to the light chain and heavy chain variable region each includes a specific sequence, and specifically binds to KRS.
  • the antibody of the present invention comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Complementarity determining region (CDR) Ll comprising, Complementarity determining region (CDR) L2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and Complementarity determining region (CDR) L3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • Complementarity determining region (CDR) Hl comprising an antibody light chain variable region (VL) and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • complementarity determining region (CDR) H2 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 6 It may be an antibody comprising an antibody heavy chain variable region (VH) comprising a complementarity determining region (CDR) H3 comprising an amino acid sequence represented by.
  • the antibody of the present invention preferably may include a specific light chain variable region and a heavy chain variable region, and specifically, the light chain variable region comprises amino acid sequences 137 to 246 of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 13 as a heavy chain variable region It may be an antibody comprising the 1 st to 121 st amino acid sequence of.
  • the antibody of the present invention may be an antibody comprising an amino acid sequence most preferably represented by SEQ ID NO: 13.
  • Antibody fragments, fragments or “fragments” of the invention typically comprise at least a portion or variable region (eg, one or more CDRs) of the antigen binding of the parent antibody, retaining at least a portion of the binding specificity of the parent antibody To include fragments or derivatives of the antibody.
  • antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv fragments; Diabodies; Linear antibodies; Single-chain antibody molecules such as sc-Fv; And multispecific antibodies formed from antibody fragments.
  • antibody fragments or milk The conductor retains at least 10% of its KRS binding activity when its activity is expressed on a molar basis.
  • the antibody fragment or derivative has at least 203 ⁇ 4>, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% or 100% or more of KRS binding affinity as the parent antibody.
  • KRS antibody fragments may also include conservative amino acid substitutions (called conservative variants of the antibody) that do not substantially alter their biological activity. “Binding compound 1 ′ of the present invention refers to both antibodies and fragments thereof.
  • Fab consists of one light chain and one heavy chain CH1 (first constant domain) and variable region.
  • the heavy chain of the Fab molecule cannot form disulfide bonds with other chain molecules.
  • the Fc region contains two heavy chain fragments comprising the CH1 and CH2 domains of an antibody. Two heavy chain fragments are held together by two or more disulfide bonds and by hydrophobic interaction of the CH3 domain.
  • F (ab ') 2 contains two light chains and two heavy chains containing a portion of the anchoring region between the CH1 and CH2 domains so that intrachain disulfide bonds are formed between the two heavy chains.
  • the F (ab ') 2 fragment consists of two Fab' fragments held together by disulfide bonds between the two reprints.
  • Fv is an antibody. Fragment that contains both heavy and light chain variable regions but lacks a fixed region.
  • Single-chain Fv or scFv refers to an antibody fragment comprising the VH and VL domains of an antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain.
  • the FV polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains, which allows the scFv to form the desired structure for antigen binding.
  • scFv see Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Spr inger- Ver lag, New York, pp. 269-315. See also International Patent Publication No. WO 88/01649 and US Pat. Nos. 4, 946,778 and 5,260,203.
  • Diabody refers to a small antibody fragment having two antigenic binding sites, wherein the fragment comprises a heavy chain variable domain (VH) (VH-VU) linked to the light chain variable domain (VL) in the same polypeptide chain. Allow pairing between two domains in a chain Using a short linker that is not linked, the domain is forced to pair with the complementary domain of the other chain to create two antigen-binding sites.
  • VH heavy chain variable domain
  • VL light chain variable domain
  • a linear antibody refers to an antibody comprising a pair of tandem Fd fragments (VH-CH1-VH-CH1) that form a pair of antigen binding sites.
  • Linear antibodies are described, for example, in Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8 (10): 1057-1062, which may be bispecific or monospecific.
  • Domain antibodies are immunologically functional immunoglobulin fragments containing only the variable region of the heavy chain or the variable region of the light chain.
  • two or more VH regions are covalently linked to a peptide linker to produce a bivalent domain antibody.
  • Two VH regions of a bivalent domain antibody may target the same or different antigens.
  • Bivalent antibodies comprise two antigen binding regions. In some instances, the two binding regions have the same antigen specificity. However, bivalent antibodies may be bi speci fic. Antibodies or fragments thereof of the invention can be produced using methods known in the art, such as phage display methods or yeast cell surface expression systems. As a method for preparing scFv, the method described in US Pat. Nos. 4, 946, 778 and 5, 258, 498 may be used, and recombinantly generating Fab, Fab 1 and F (ab ') 2 fragments. As the above method, the method described in W) 92/22324 may be used. Antibodies of the invention can be derived from any animal, including mammals, birds, and the like, including humans. Preferably, the antibody may be an antibody of human, mouse, donkey, sheep, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse or chicken.
  • Human antibodies are antibodies having the amino acid sequence of human immunoglobulins, which include antibodies isolated from human immunoglobulin libraries or antibodies isolated from animals transfected against one or more human immunoglobulins and not expressing endogenous immunoglobulins ( US Patent No. 5, 939-598).
  • Antibodies of the present invention are conjugated to enzymes, fluorescent materials, radioactive materials and proteins It may be, but is not limited thereto. In addition, methods of bonding the material to the hing are well known in the art.
  • the invention also provides a polynucleotide encoding an antibody or fragment thereof according to the invention as described above.
  • Polynucleotides may also be described as oligonucleotides or nucleic acids,
  • DNA molecules e.g. cDNA or genomi c DNA
  • RNA molecules e.g. mRNA
  • analogs of the DNA or RNA generated using nucleotide analogues e.g. peptide nucleic acids and non-naturally included are nucleotide analogues s
  • those of the hybrid caused by the polynucleotide is single-stranded (si ng le-stranded) or a double-can be a strand (doubl e-stranded)
  • the sequence is not particularly limited, but may preferably include a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 7 to 12.
  • Polynucleotides encoding the antibodies of the invention or fragments thereof can be obtained by methods well known in the art. For example, oligonucleotide synthesis techniques well known in the art, for example, polymerase chain reaction (PCR), etc., based on DNA sequences or corresponding amino acid sequences encoding portions or all of the heavy and light chains of the antibody. Can be synthesized using The present invention also provides a vector comprising the polynucleotide.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the vector of the present invention is used for the purpose of replicating or expressing the polynucleotide of the present invention for recombinant production of the antibody or fragment thereof of the present invention, and is generally used for signal sequence, origin of replication, one or more marker genes, enhancer elements, promoters. And transcription termination sequences.
  • the vector of the present invention may preferably be an expression vector, more preferably a vector comprising a polynucleotide of the present invention operably linked to a regulatory sequence, for example, a promoter.
  • Plasmid refers to a linear or circular double helix DNA molecule into which external polynucleotide fragments can be joined.
  • Other forms of vectors include viral vectors (e.g., replication-deficient retroviruses). (replication defective retroviruses), adenoviruses and adeno-associated viruses, wherein additional DNA fragments comprise the viral genome. (viral genome) can be introduced. Certain vectors are contained within the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors, including bacterial origin and episomal mammal i an vectors). Autonomous repl icat ion. Other vectors (eg, non-episcmal maal alian vectors) are integrated into the genome of the host cell by introduction into host cells and By replication with the host genome.
  • Expression vectors are a form of expressible vector of a selected polynucleotide.
  • One polynucleotide sequence is “operably linked” to the regulatory sequence if the regulatory sequence affects the expression (eg, level, timing or location of expression) of the polynucleotide sequence.
  • the regulatory sequence is a sequence that affects the expression (eg, level, timing or location of expression) of the nucleic acid to which it is operably linked. May be influenced directly or through the action of one or more other molecules (eg, the regulatory sequence and / or the polypeptides that bind to the nucleic acid).
  • the pCom3x may be (phagmid) vector.
  • the present invention provides a cell comprising a vector of the present invention.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it can be used to express the polynucleotide of the present invention.
  • the cells of the present invention may comprise a prokaryote (e.g. E. coli), a eukaryote (e.g. yeast or other fungus), a plant cell (e.g. tobacco or tomato plant cell), an animal cell (e.g. human cell). , Monkey cells, hamster cells, rat cells, mouse cells or insect cells) or hybridomas.
  • Prokaryotes suitable for this purpose include Gram-negative or Gram-positive organisms, such as Enterobacteriaceae, for example Escherichia, For example this. E.
  • the cells of the present invention are not particularly limited as long as they can express the vector of the present invention, but preferably. Coli, but not limited to this. E. coli ER2537, this. E. coli B. Lee. E. coli X1776 (ATCC 31,537). E.
  • Saccharomyces cerevisiae is most commonly used as a eukaryotes.
  • Saccharomyces cerevisiae is most commonly used as a eukaryotes.
  • many other genera, species and strains include, but are not limited to, for example, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces hosts, eg K. K.lactis, K. K. fragilis (ATCC 12,424), k. Bulgaricus. (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. K. ickerami i (ATCC 24,178), K. Walti (ATCC 56,500), K. K.
  • drosophi larum ATCC 36,906), K. Termoreranance (K. thermotolerans and K. marxianus); yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, for example Schwaniomyses occidental is; and filaments Sex fungi, for example neurospora, penicillium, tolypocladium and Aspergillus hosts, for example A. nidulans and niger ) Is available.
  • the cells of the present invention may be animal cells, particularly vertebrate cells.
  • Proliferation of vertebrate cells in culture has become a routine method and techniques are widely available.
  • useful mammalian host cells include, but are not limited to, SV40.
  • Year-transformed monkey kidney CV1 line COS AT 7, ATCC CRL 1651
  • human embryonic kidney lys (293 or 293 cells subcloned from suspension culture [Graham et al., 1977, J Gen Virol. 36: 59]
  • Baby hamster kidney cells BHK, ATCC CCL10)
  • Chinese hamster ovary cells / -DHFR "(CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • mice ser Lolli cells (TM4, Mather, 1980, Biol. Eprod. 23: 243-251), monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70), African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587), human cervical Cancer cells (HELA, ATCC CCL 2), dog kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34), buffalo rat hepatocytes (BRL 3A, ATCC CRL 1442), human lung cells (W138, ATCC CCL 75), human hepatocytes (Hep G2, HB 8065), mouse breast tumor ( ⁇ T 060562, ATCC CCL51), TRI cells (Mather et al., 1982, Annals NY.Acad. Sci.
  • MRC 5 cells MRC 5 cells
  • FS4 cells human liver cancer cell line (Hep G2) ⁇ HEK 293 cells (human embryonic kidney cells) and Ex i293FTM cells, and preferably may be CHO cells, HEK 293 cells (human embryonic kidney cells) or Expi293FTM cells.
  • a polynucleotide or a vector comprising the same which is a cultured cell that can be transformed or transfected, which can subsequently be expressed in the host cell. Refers to a transformed or transfected cell.
  • the cells of the invention may also be cells which contain a polynucleotide of the invention but which do not express it to the desired level unless a regulatory sequence is introduced into the cell to be operably linked to the polynucleotide.
  • Cells of the invention can be cultured in a variety of media. Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma— Aldrich Co., St. Louis, M0), minimum essential medium (MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma— Aldrich Co.) , And Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma-Aldrich Co.) are suitable for culturing cells. The medium may be added with hormones and / or other growth factors, salts, lamina, nucleotides, antibiotics, trace elements and glucose or equivalent energy sources if necessary.
  • the medium of the present invention may be preferably SB (Bactotrytone 30g, yeast extract 20g, MOPS buffer lOg / L) Medium, FreeStyleTM 293 Medium or Ex i293TM Medium.
  • the present invention is to culture the cells under the conditions in which the polynucleotide is expressed, producing a polypeptide comprising a light chain and heavy chain variable region, and recovering the polypeptide from the cell or culture medium cultured thereof
  • the cells of the production method of the present invention are as described above, and contain a plenucleotide encoding the antibody of the present invention.
  • Polypeptide of the production method of the present invention may be an antibody of the present invention or a fragment thereof, or an amino acid sequence other than the antibody of the present invention or a fragment thereof may be further bound. In this case, it can be removed from the antibody or fragment thereof of the present invention using methods well known to those skilled in the art.
  • the culture may vary in medium composition and culture conditions depending on the type of lung cells, which can be appropriately selected and controlled by those skilled in the art.
  • the antibody molecule may accumulate in the cytoplasm of the cell, be secreted from the cell, or targeted to periplasm or extracellular medium by appropriate signal sequences, and targeted to periplasm or extracellular medium. It is windy. It is also desirable to refold the antibody molecules produced using methods well known to those skilled in the art and to have a functional format.
  • the recovery of the polypeptide may vary depending on the properties of the produced polypeptide and the properties of the cells, which can be appropriately selected and controlled by one of ordinary skill in the art.
  • the polypeptide may be produced intracellularly, in the surrounding cytoplasmic space or secreted directly into the medium. If the polypeptide is produced in a cell, the cell can be destroyed to release the protein as the first step. Particulate debris, host cells or lysed fragments are removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration. When the antibody is secreted into the medium, the supernatant from this expression system is generally first concentrated using a commercially available protein enrichment filter, for example Ami con or Mill ipor.e Pel li con ultrafiltration unit. Protease inhibitors such as PMSF may be included in any preceding step to inhibit proteolysis, and antibiotics may be included to prevent the growth of accidental contaminants.
  • a commercially available protein enrichment filter for example Ami con or Mill ipor.e Pel li con ultrafiltration unit. Protease inhibitors such as PMSF may be included in any preceding step to inhibit proteolysis, and antibiotics may be included to prevent the growth of accidental contaminants.
  • Antibodies prepared from cells can be purified using, for example, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis and affinity chromatography, and the antibodies of the invention can be purified preferably via affinity chromatography. have. Since the antibody or fragment thereof of the present invention specifically binds KRS, it is useful for diagnostic analysis for detecting and quantifying KRS protein, for example, detecting KRS expression in specific cells, tissues, or serum.
  • the present invention provides a method for detecting RS-specific detection comprising contacting the antibody or fragment thereof of claim 1 with a sample and detecting the antibody or fragment thereof.
  • the antibody, or fragment thereof, an antibody or fragment thereof can generally be labeled with a detectable moiety to.
  • Radioactivity can be measured, for example, by scintillation counting, and fluorescence can be quantified using a fluorometer.
  • enzymatic labels include luciferase, luciferin, luciferin, 2,3'diede, such as choparic luciferase and bacterial luciferase (US Pat. No. 4,737,456).
  • horseradish peroxidase is a peroxidase, a phosphatase, Alcala, ⁇ - galactosidase, glucoamylase, lysozyme, such as (HRP0) Saccharide oxidases (eg glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose ⁇ 6-phosphate dehydrogenase) ⁇ heterocyclic oxidases (eg freecase and xanthine oxidase), lactopers Oxidase, microperoxidase and the like.
  • HRP0 Saccharide oxidases
  • heterocyclic oxidases eg freecase and xanthine oxidase
  • Labels can be indirectly conjugated to antibodies using a variety of known techniques.
  • antibodies can be conjugated to biotin and the three broad categories of catechins mentioned above Any markers belonging to the ring can be conjugated with avidin and vice versa. Biotin binds selectively to avidin and thus the label can be conjugated to the antibody in this indirect manner.
  • the antibody may be conjugated with a small hapten (eg digoxin) and one of the different types of labels mentioned above may be anti- Hapten antibodies can be conjugated (eg, anti-dioxine antibodies).
  • a small hapten eg digoxin
  • one of the different types of labels mentioned above may be anti- Hapten antibodies can be conjugated (eg, anti-dioxine antibodies).
  • antibodies or fragments thereof of the invention can be used in any known assay methods such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention may be used in a diagnostic kit, i.e., a diagnostic kit for performing a diagnostic assay, i.e., a packaged combination of reagents in a predetermined amount together with instructions for use.
  • a diagnostic kit for performing a diagnostic assay, i.e., a packaged combination of reagents in a predetermined amount together with instructions for use.
  • the kit may contain the cofactors required by the enzyme as substrate precursors to provide the substrate and chromophores or fluorophores.
  • other additives may be included, such as stabilizers, complete fluids (eg, blocked complete fluids or lysis buffers).
  • the relative amounts of the various reagents can be varied widely to provide concentrations in solution of the reagents that further optimize the assay and sensitivity.
  • the reagent may be provided as a generally lyophilized, dry powder, comprising an excipient that will provide a reagent solution with the appropriate concentration upon dissolution.
  • S detected by the antibody of the present invention was found to be stimulated out of the cell by TNF ⁇ ⁇ secreted KRS to bind to the macrophage cells to activate the immune response was found that the combined KRS p38 mitogen acti.vivated kinase It has been reported to increase TNF- ⁇ activity of macrophage cells or to promote cell migration by signaling. (Park, SG, et al Kim, HJ, Min, YH, Choi, EC, Shin, YK, Park, BJ, Lee, SW and Kim, S.
  • KRS has also recently been found to be involved in various diseases. Autoantibodies to KRS have been reported in patients with inflammatory muscle disease (Gelpi, C., Kanterewicz, E., Gratacos, J., Targoff, IN & Rodriguez I Sanchez, JL Coexistence of two ant i synthetases in a patient with the ant i synthetase syndrome (1996) Arthritis Rheum. 39, 692-697) and KRS binding to this enzyme in S0D1 gene mutations that cause Lou Gehrig's disease.
  • KRS can be used as a diagnostic marker for the diagnosis of certain cancers or autoimmune diseases and inflammatory diseases through the detection, the progression of the disease and the evaluation of the prognosis before and after treatment.
  • Diagnosis and prognosis of cancer or autoimmune diseases and inflammatory diseases according to the present invention can be performed by detecting RS proteins in biological samples.
  • the present invention provides a cancer diagnostic composition comprising the antibody or fragment thereof of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for diagnosing autoimmune diseases comprising the antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing inflammatory diseases comprising the antibody of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a use for the preparation of an agent for diagnosing cancer of the antibody or fragment thereof.
  • the present invention also provides a use of the antibody or fragment thereof for the preparation of a diagnostic agent for autosomal disease.
  • the present invention also provides a use of the antibody or fragment thereof for producing an agent for diagnosing inflammatory disease.
  • the present invention provides a method for preparing a biological sample, comprising the steps of (a) obtaining a biological sample from an individual, (b) measuring the KRS protein level in the biological sample using the antibody or fragment thereof, and (c) normalizing the KRS protein level. It provides a method for diagnosing cancer, autoimmune disease or inflammatory disease, which comprises comparing the individual's RS protein levels.
  • biological samples include solid tissue samples such as blood and other liquid samples of biological origin, biopsy samples, tissue cultures or cells derived therefrom.
  • tissue, extract, cell lysate whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, peritoneal fluid, and the like.
  • the sample can be obtained from an animal, preferably a mammal, most preferably a human.
  • the sample may be pretreated before use for detection. For example, it may include filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interference components, addition of reagents, and the like.
  • nucleic acids and proteins can be separated from the sample and used for detection. The detection is as described above.
  • the diagnostic method of the present invention can diagnose the actual disease by comparing the KRS protein level in the biological sample of the normal individual with the protein expression level in the biological sample of the suspected cancer, autoimmune disease or inflammatory disease. That is, the antibody or fragment thereof dissolved KRS protein is measured from a biological sample suspected of cancer, autoimmune disease or inflammatory disease, and the KRS antibody or fragment thereof is used from a biological sample of a normal individual. After comparing the two by measuring the protein level, if the KRS protein expression level of the suspected disease is higher than that of the normal subject, it can be diagnosed as the disease.
  • the cancer is not particularly limited in kind, for example, breast cancer, colon cancer, lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular myeloma, uterine cancer, Ovarian cancer, rectal cancer, anal muscle cancer, colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, vaginal cancer, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma , Urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma and It may be a pituitary adenoma, preferably
  • the autoimmune diseases include, for example, Crohn's disease, hepatitis, atopy, rheumatoid arthritis, Hashimoto's thyroiditis, pernicious anemia, Edison's disease, type 1 diabetes, Lou Gehrig's disease, and inflammatory muscle disease (for example, polymyosi).
  • scleroderma a combination of myositis and dermatomyosi tis and lupus, chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, hypothyroidism and hypertension, scleroderma, Behcet's disease, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, myasthenia gravis, Meniere syndrome (Meni ere's) syndrome), Guili an-Barre syndrome, Sjogren's syndrome, vitiligo, endometriosis, psoriasis, vitiligo, systemic scleroderma, asthma and ulcerative colitis And preferably, rheumatoid arthritis, Lou Gehrig's disease, multiple myositis or dermatitis.
  • the inflammatory disease is not limited thereto, but general inflammation such as edema Inflammatory bowel disease including peritonitis, peritonitis, osteomyelitis, cellulitis, pancreatitis, trauma-induced shock, bronchial asthma, allergic rhinitis, cystic fibrosis, acute bronchitis, chronic bronchitis, acute bronchiolitis, chronic bronchiolitis, osteoarthritis, gout, vertebral joints Conditions, ankylosing spondylitis, lighter syndrome, psoriatic arthrosis, enteropathic spondylitis, juvenile arthrosis, juvenile ankylosing spondylitis, reactive arthrosis, infectious arthritis, post-infectious arthritis, gonococcal arthritis, tuberculosis arthritis, viral arthritis , Fungal arthritis, syphilis arthritis, Lyme disease, arthritis associated with 'angiopathy syndrome', nodular polyarthritis, irritable vasculitis, Lou Gehrig's granulomato
  • scoliosis scoliosis, hemoglobinopathy, hemoglobinopathy, hyperlipoproteinemia, reduced magglobulinemia, familial Mediterranean fever, Behcet's disease, pandemic lupus erythematosus, recurrent fever, multiple sclerosis, sepsis, septic shock, acute respiratory distress Syndrome, multiple organ failure, chronic obstructive pulmonary disease, rheumatoid arthritis, acute lung injury, broncho-pulmonary dysplasia, crab type diabetes, Atherosclerosis, Alzheimer's dementia, familial cold autoinf lammatory syndrome, Muckle_Wel Is syndrome, neonatal muti system inflammatory disease, chronic
  • Methods for diagnosing cancer, autoimmune diseases and inflammatory diseases can be achieved through antibody-antigen reactions between the anti-KRS antibodies or fragments thereof and the KRS proteins specifically binding thereto, wherein the term "antigen" —Antibody complex ” refers to KRS, a marker of cancer, autoimmune and inflammatory diseases, and the anti-KRS antibodies of the present invention specific thereto, wherein the amount of antigen-antibody complex formed is the magnitude of the signal of the detection ion label. Through the Can be measured quantitatively.
  • the detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes, but is not necessarily limited thereto.
  • enzymes When enzymes are used as detection labels, examples of available enzymes include ⁇ -glucuronidase, ⁇ -D-glucosidase, ⁇ -D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetyl Cholinesterase, glucose oxidase, nucleokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphphenolpyruvate Decarboxylase, ⁇ -latamase and the like, but are not limited thereto.
  • Examples of the fluorescent substance include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, 0-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like.
  • Examples of ligands include biotin derivatives, but are not limited to these.
  • Examples of the light emitting material include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like.
  • Examples of the microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like.
  • redox molecules examples include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, 4 W (CN) 8, [Os (bpy) 3] 2+, [RU (bpy) 3] 2+, [MO (CN) 8] 4-, and the like, but are not limited to these.
  • radioisotopes include, but are not limited to, 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 1251, 1311, 186Re, and the like.
  • a human VH3-23 / VLlg gene is used as a skeleton, and a library for inserting random sequences into CDRs is constructed, and phages that selectively bind to KRS are selected to isolate, purify and sequence antibodies. Analyzed. In another embodiment of the present invention confirmed whether the purified antibody is bound to KRS by western blot method. As a result, it was confirmed that the antibody of the present invention binds to KRS. In another embodiment of the present invention, the affinity between the anti-KRS scFv antibody and KRS of the present invention was measured by surface resonance analysis. As a result, the antibody of the present invention has an equilibrium dissociation constant.
  • the cross-reactivity of the anti-KRS scFv antibody of the present invention was measured. As a result of measuring the reaction between the antibody of the present invention and 8 similar proteins including KRS using luminex bead, it was confirmed that the antibody of the present invention did not bind to other ARS proteins except KRS.
  • the usefulness of the anti-KRS scFv antibody of the present invention as a diagnostic antibody was tested. After preparing a protein coated with the antibody of the present invention, the KRS standard was diluted by concentration and reacted, and binding was measured by ELISA.
  • the antibody of the present invention can be used for the diagnosis of cancer or autoimmune diseases and inflammatory diseases.
  • KRS is equivalent to CA19-9, the most representative biomarker of pancreatic cancer Confirmed that the expression :, KRS can be used as a biomarker for diagnosing cancer, it was confirmed that the antibody of the present invention is useful.
  • biomarker candidates of pancreatic cancer we analyzed the biomarker candidates using a mul t iplex bead assay kit and compared them. It can be used as a representative cancer biomarker and it was confirmed that the antibody of the present invention is useful.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention specifically binds to human KRS, and does not have cross-reaction with other proteins including the same ARS fami ly, so that KRS can be detected and suppressed. It is effective in the diagnosis of autoimmune diseases and inflammatory diseases.
  • [Brief Description of Drawings] 1 is a western blot test result confirming that the antibody of the present invention binds to the target protein KRS.
  • Figure 2 is a graph of the result of measuring the binding affinity of the antibody of the present invention anti-K S scFv Biocon-Kl by surface plasmon resonance (SPR) (Kd: equilibrium dissociation constant, horizontal axis: time (seconds), Vertical axis: response unit (RU).
  • SPR surface plasmon resonance
  • Fig. 3 is a graph of the cross activity of anti—KRS scFv Biocon ⁇ Kl, an antibody of the present invention, measured by Luminex Multiplex Assay method (vertical axis (FI): fluorescent intensity, WRS: trip) Tryptophanyl-tRNA synthetase, HRS: Histidyl-tRNA synthetase, NRS: Asparaginyl-tRNA synthetase, KRS: Lysyl-tRNA Synthetase Enzyme (Lysyl-tRNA synthetase), SRS: Seryl-tRNA synthetase, YRS: Tyrosyl-tRNA synthetase, GRS: Glycyl-tRNA synthetase synthetase), AIMP1: ARS-binding multifunctional protein (Aminoacyl_tRNA—synthetase—interacting multifunctional protein 1).
  • FI vertical axi
  • FIG. 4 is an ELISA test result for confirming that the antibody of the present invention can detect KRS (vertical axis: 450 kHz absorbance, horizontal axis: KRS standard concentration (ng / ml)).
  • FIG. 5 is a result of measuring the serum of normal human and pancreatic cancer patients by ELISA method containing the antibody of the present invention in order to confirm the detection and mutual comparison of blood KRS amount in normal and cancer patients using the antibody of the present invention .
  • A blood KRS concentration
  • B blood CA19-9 concentration
  • Figure 6 is a comprehensive comparison of the biomarker quantification values measured by ELISA and multiplex bead assay method of several biomarker candidate groups in order to determine whether KRS biomarker measurement using the antibody of the present invention as a major biomarker for pancreatic cancer diagnosis It is a rich result.
  • Libraries are designed by placing human VH3-23 / VLl g genes in the backbone and inserting random sequences into complementarity tying regions (CDRs) and selecting beta lactase genes as select ion markers.
  • CDRs complementarity tying regions
  • beta lactase genes as select ion markers.
  • CDRs complementarity tying regions
  • plasmid vector immediately after the leader sequence of the beta lactamase gene, restriction enzyme cleavage sequences were introduced to prepare a pFDV plasmid vector, an scFv gene library was inserted, transfected into E. coli and cultured. . Through this process, it is possible to improve the quality of the library by removing most of the scFv gene sequence having abnormal stop codon or frame shift (fraineshi ft) in the library.
  • Sequences whose errors were removed from the cultured library were amplified by polymerase chain reaction, from which the scFv gene library was recombined and inserted into the pComb3X phagemid vector, and the final library was obtained by transfecting Escherichia coli of the E. coli ER2537 strain. .
  • the library was incubated in 400 mL of SB (Super broth) medium containing carbenicillin, and the absorbance at 600 nanometers was 0.5, adding 1013 CFU of VCSM13 auxiliary phage and stirring at 80 rpm for 37 hours. Infected in the island.
  • the final 70 ug / mL kanamycin antibiotic was added and stirred at 30 degrees Celsius, 200 rpm and incubated overnight to produce a scFv surface-treated phage.
  • the culture medium was centrifuged and the phages in the culture medium were precipitated by adding 4% polyethylene glycol -8000 and 3% sodium chloride.
  • the precipitated phage was dissolved in 50 mL of a complete PBS solution, precipitated again in the same manner as above, and finally dissolved in 2 mL of PBS buffer solution.
  • the phage scFv library was obtained by centrifugation to remove foreign substances.
  • the final phage library contains phage particles of 1013 CFU / mL or more. .
  • KRS at 10 ug / ml was added to the immunoassay tube (i ⁇ unotube) to adsorb proteins on the surface of the test tube for 1 hour, and then 3% solution of powdered milk was added to the test tube. Unattached surfaces were protected. After emptying the test tube was added to the antibody phage library of 1012 CFU dispersed in powdered milk 3% solution to bind to the antigen. Nonspecifically bound phages were washed three times with TBST (tr is buf fered sal ine-tween20) solution, and the remaining antigen-specific phage antibody was eluted with 100 mM triethylamine solution.
  • the eluted phage was neutralized with 1.0M Tr is—HC1 buffer (pH 7.8) and then infected with ER2537 Escherichia coli at 37 ° C for 1 hour, and the infected E. coli was carbicicillin-containing LB (Lur i a-Bertani). It was applied to agar medium and incubated at 37 ° C. The next day, E. coli cultured was suspended in 3 niL of super broth (SB) -carbenicillin culture and 15% glycerol was added to keep some at -8 (C and 50 microliters of 20 mL of SB-Carr. Inoculated with benicillin-2% glucose solution and incubated at 37 ° C.
  • SB super broth
  • kanamycin 70ug / ml was added and incubated overnight with rapid stirring (250 rpm) at 30 ° C. The next day, after centrifuging the culture, the antigen-specific clone was concentrated by repeating the panning process using 1 mL of the supernatant containing phage particles as a library.
  • E. coli containing the antibody gene was applied to LB agar medium containing carbenicillin and cultured to obtain single colonies, and then inoculated and cultured in 200 uL SB-carbenicillin solution. After induction with IPTG, scFv protein was expressed in E. coli periplasm. E. coli was suspended in 40 uL of IX TES (50 mM Tr is, 1 inM EDTA, 20% Sucrose, H 8.0) solution, and then mixed with 60 uL of 0.2X TES solution and mixed for 30 minutes at 4 degrees Celsius and centrifuged. The periplasm was extracted with the supernatant.
  • IX TES 50 mM Tr is, 1 inM EDTA, 20% Sucrose, H 8.0
  • the final 5 mM MgS04 was added to the scFV antibody extracted from periplasm, mixed with Ni-NTA bead previously equilibrated in PBS, stirred in the refrigerator for 1 hour, bound to Ni-bead, and then subjected to affinity chromatography. Protein was rinsed thoroughly with PBS. After washing more sufficiently with the buffer containing 5 mM Imidazole, the bound scFv antibody was eluted with 200 mM Imidazole buffer. The eluted antibody was dialyzed to confirm purity through electrophoresis, the protein was quantified by BCA method, and the amount of purified antibody was recorded, and then a constant amount was dispensed and stored.
  • the scFv antibodies extracted from periplasm were used to determine whether scFv antibodies bind to KRS originally expressed in human cells using immunoblot techniques. After 50ug of Hela cell lysate was electrophoresed through SDS PAGE, it was transferred to Nitrocel lulos membrane by Wet transfer method and bound by adding extracted scFv antibody blocked with 3% skim milk. For detection, the anti-HA secondary antibody to which HRP (horseradish peroxidase) was connected was bound to the bound scFv, and the film was photosensitive in the dark room using ECL reagent as a substrate. The photosensitized bands were compared with standard molecular markers to identify the bands corresponding to the size of the KRS.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the identified antigen-specific antibody clones were cultured overnight in SB medium IOII containing carbenicillin, plasmid DNA was extracted using the plasmid miniprep kit, and the nucleotide sequence was analyzed by capillary sequencing service (Macrogen Co). CDR sequences were analyzed based on seqeunce database and IMGT (the international ImMunoGeneTics information system) analysis method. As a result, the number of scFVs bound to the KRS antigen was 1 in total, and their nucleotide sequences were confirmed to be SEQ ID NO: 14.
  • the binding affinity of the antibody of the present invention to the KRS antigen was measured using a Prote0nTMXPR36 surface plasmon resonance (SPR) biosensor (Bi Rad). Specifically, about 10 ug / ml KRS antigen was added to the GLC chip (Bio-Rad 6 X 6 sensor chip, Compact capacity amine coupling for protein-protein interact ions) according to the manufacturer's instructions. ) Immobilized to various concentrations using PBS. 30 ul each of the purified scFv antibody (500-30 nM) of the invention was quantitatively interacted with the antigen by pressurizing the chip at a rate of 50 ul / min at 25 ° C.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the surface of the chip was regenerated with 0.85% phosphoric acid, and the association rate and dissociation rate were calculated using ProteOn Manager software, and the equilibrium dissociation constant (KD) was calculated as the dissociation rate / association rate ratio.
  • KD equilibrium dissociation constant
  • the antibody of the present invention had a maximum KD ⁇ value and was confirmed to have a relatively high KRS affinity.
  • Anti-KRS scFv antibody cross activity measurement In order to determine whether the scFv antibody is reactive with other antigens, cross-reactivity of the antibody of the present invention with KRS and other ARS family proteins was measured using Luminex bead.
  • Coupling was performed according to the experimental procedure of Bi rad's Amine coupling kit to bind amine residues of protein to each bead with different Code No.
  • S-NHS N hydroxysulfosuccinimide
  • EDAC l_ethy—3 ⁇ [3 ⁇ [3 ⁇ ] dimethylaminopropyUcarbodiimide
  • Each activated bead was washed with PBS and added to each purified ARS antigen of purified purity of 90% or more, WRS.HRS, NS, KRS, SRS, YRS, GRS, ⁇ 1 ( ⁇ 43) at room temperature. The reaction was time. The bead connected to each ARS was washed twice with PBS and then added with a blocking buffer to react at room temperature for 30 minutes to block unbound residues. After washing twice with PBS, it was suspended in lOOul PBS again and the tube was blocked with light Stored. The number of bound beads was recorded by measuring with a hemocytometer.
  • the antibody of the present invention extracted from the periplasm was first diluted at 1: 400 concentration in sample diluent (PBST + 2% BSA.), And then diluted twice with sample dilution in 96 well filter plates, and then aliquoted at 50ul. Only sample dilutions were added to blank wells without antibodies.
  • Each ARS-coupled bead was placed in a bead mix tube so that 2000 beads per well were added in a volume capable of dispensing 50 ul of sample diluent per well. The bead mix solution was mixed well and then dispensed into each well and reacted in the dark for 1 hour.
  • Sandwich EL ISA pairing test using purified anti-KRS scFv antibody KRS sandwich EL ISA pairing test was performed to determine whether the antibody of the present invention is useful as a diagnostic antibody.
  • the detection antibody was paired with the rabbit polyclonal antibody of the existing product to confirm whether a quantitative curve for the KRS standard was produced.
  • the purified antibody of the present invention was diluted in a coating buffer (0.1M sodium carbonate H 9.0) and dispensed 100 ul on an ELISA plate at 100-400 ng per well, and left for 3 hours at room temperature. After washing three times with PBST, 350 ul PBST containing 2% BSA was added and blocked at room temperature for 1 hour, and then washed three times with PBST. The recombinant K S standard purified on the antibody-coated plate well was diluted two-fold in sample dilution for each concentration, and 100 ul was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • a coating buffer 0.1M sodium carbonate H 9.0
  • the plate was washed three times with PBST, and then added 100 ul of the dilution detection antibody (4 ug / ml) and reacted for 1 hour at room temperature.
  • the plate was washed three times with PBST, and then HRP-linked anti-rabbit IgG was added and allowed to react for 1 hour at room temperature.
  • HRP add 50 ul of HMB substrate TMB solution for 10 minutes, and add 50 ul of 2N sulfuric acid to stop the reaction reaction by using ELISA reader 450 ⁇ Absorbance was measured at.
  • ELISA kits and mul t ipl ex bead assay kits were used to commercialize several candidate biomarkers for comparative analysis with the measurements of other candidate biomarkers in order to explore the importance and usefulness of KRS in the diagnosis of pancreatic cancer.
  • the biomarkers measured were KRS, WRS, AIMP1, CA19-9, CA125, IL-8, CEA, TNF- ⁇ , and CEACAM-1.
  • the experimental results were expressed in heatmap format.
  • Commercial ELISA kits and mult iplex assay kits are conducted according to the manufacturer's instructions.Mul tipl ex assays specifically require each biomarker antibody bead to a final volume of 3 ml with a volume equivalent to 2000 beads.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention specifically binds to human KS and does not have cross-reaction with other proteins including the same ARS fami ly, so that KRS can be detected and suppressed. It can be used for diagnostic purposes of human cancer or autoimmune diseases and inflammatory diseases, and thus the industrial applicability is high.

Abstract

본 발명은 KRS(Lysy1- tRNA synthetase)에 선택적으로 결합하는 항 KRS 항체 및 이의 용도에 관한 것으로 보다 구체적으로는 인간 KRS에 결합하는 항체 또는 그 단편, 이의 생산방법 및 이를 포함하는 암 또는 자가면역질환 및 염증성질환 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 KRS에 특이적으로 결합하며， 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어 KRS 검출 및 억제가 가능하므로 KRS 검출 및 KRS가 관련된 질환인 암 또는 자가면역질환 및 염증성질환의 진단 목적으로 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
항 KRS 모노클로날 항체 및 이의 용도
【기술분야】
본 출원은 2013년 12월 30일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10—2013- 0166791호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 KRS(Lysyl-tRNA synthetase)에 선택적으로 결합하는 항 KRS 항체 및 이의 용도에 관한 것으로 보다 구체적으로는 인간 KRS에 결합하는 항체 또는 그 단편， 이의 생산방법 및 이를 포함하는 암 또는 자가면역질환 및 염증성질환의 진 단용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
Aminoacyl-tRNA synthetase(ARS)는 특정 아미노산을 그 해당하는 tRNA에 붙 여주는 역할을 하는 효소이며. 고등생물의 경우 아미노산 종류에 따른 20 개의 효 소외에 ΑΙΜΡ1(ρ43) , (AIMP2)p38 , (AIMP3)pl8 등 mul t isynthetase complex 형성에 관여하는 3종류를 포함하여 23종의 효소로 구성되어 있으며 mult isynthetase complex에 참여하는 효소외에 몇몇은 free form 형태로도 존재한다. 그러나 최근에 들어 기본적인 기능외에 특정 환경에서 다양한 다른 활성기능을 가지고 있음이 보 고 되었는데 KRS (Lysyl-tRNA synthetase)가 그중의 하나이다. KRS는 macrophage활 성화를 통해 면역반웅을 유도하는 것으로 밝혀졌는데 TNF— α에 의하여 세포 밖으로 분비 촉진된 KRS는 p38 mi togen act ivivated kinase 등에 의한 신호전달에 의하여 macrophage 세포의 TNF- α에 의한 활성을 증가시키거나 세포의 migrat ion을 촉진시 키는 것으로 보고되었다. KRS는 또한 다양한 질환에서 관여하는 것으로 최근 밝혀 지고 있다. 염증성 근육질환환자에서 KRS에 대한 자가항체가 존재함이 보고되었고, 루게릭병의 원인이 되는 S0D1 유전자 변이환자에서 KRS가 이 효소에 결합하여 관여 함이， 또한 최근에는 암세포에서 인산화된 KRS가 Laminin 수용체의 안정화에 기여 함으로 암세포의 전이를 촉진함이 보고되었다. 이와 같은 결과로 KRS는 자가면역 질환 및 암 환자의 혈청내에 존재 할 수 있으며 중요한 진단 바이오마커로 사용될 수 있음을 보여준다.
하지만 KRS를 비롯한 ARS들에 대한 바이오마커로서의 중요성에도 불구하고 ARS들은 단백질 구조상 유사한 점이 많아 동물로부터 면역반응으로 얻어지는 항체 는 다른 ARS에도 결합하는 교차 반응올 보이고 아예 고 감도의 항체가 생성되지 않 은 경우가 많다. 본 발명의 항체는 우수한 감도와 ARS간 교차반웅이 없는 점에서 연구용 뿐만 아니라 진단용 및 산업상 이용가능성이 높은 항체라 예상된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 KRS에 특이적으로 결합하는 항체를 연구하던 중， 파지디스플 레이 방법으로 만들어진 라이브러리에서 KRS에 특이적으로 결합하는 단편들을 찾아 내고, 이의 서열 및 결합특이성을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은 인간 KRS에 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공하 는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오 티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 .상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 백터를 포함하는 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 인간 KRS에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법 을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상 기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 KRS 특이적 검출 방법을 제공하 는 것이다. 본 발명의 다론 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 자 가면역질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 염 증성질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서 열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)Ll , 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포 함하는 상보성 결정부위 (CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역 (VU 및 서열번호 4 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)Hl , 서열번호 5로 표 시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)H2 및 서열번호 6으로 표시 되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변 영역 (VH)을 포함하는 인간 KRS에 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 백터를 포함하는 세포 를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오 티드가 발현되는 조건하에서 배양하여， 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타 이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양 "한 배양 배지로부터 상기 폴리 펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 KRS에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 항체 또는 그 단편을 시료 와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 KRS 특이적 검출 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편의 암 진단용 제제 제조를 위한 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계， (b) 제 1항의 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 KRS 단백질 수준을 측정하는 단계 및 (c) 상기 KRS 단백질 수준을 정상 개 체의 KRS 단백질 수준과 비교하는 단계로 이루어진 개체의 암 진단방법을 제공한 다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편의 자가면역질환 진단용 제제 제조를 위한 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계, (b) 제 1항의 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 KRS 단백질 수준을 측정하는 단계 및 (c) 상기 KRS 단백질 수준을 정상 개 체의 KRS 단백질 수준과 비교하는 단계로 이루어진 개체의 자가면역질환 진단방법 을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 염증성질환 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편의 염증성질환 진단용 제제 제조를 위한 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계， (b) 게 1항의 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 KRS 단백질 수준을 측정하는 단계 및 (c ) 상기 KRS 단백질 수준을 정상 개 체의 KRS 단백질 수준과 비교하는 단계로 이루어진 개체의 염증성질환 진단방법을 제공한다. ■ 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부 위 (CDR)Ll , 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역 (VU 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산ᅵ서 열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)Hl , 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포 함하는 상보성 결정부위 (CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역 (VH)을 포함하는 인 간 KRS에 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다. 라이실 -tRNA 합성효소 (KRS , Lysyl -tRNA synthet ase)는 라이신 (Lys )과 tRNA의 결합을 촉진시키는 효소로 ARS(Aminoacyl -tRNA synthet ase)의 일종이다ᅵ. 본 발명의 KRS는 일반적으로 천연형 또는 재조합 인간 KRS , 및 인간 KRS의 비 -인간 동족체를 나타낸다.
"항체 "， "항 KRS 항체" , "인간화 항 K S 항체" 및 "변형 인간화 항 KRS 항 체 ， "ant i -KRS ant i body' '라는 용어는 본 발명에서 가장 광의의 의미로 사용되며, 구체적으로 단일클론 항체 (모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론 항체 포함) , 다클 론 항체 (폴리클로날 항체) , 다중특이 항체 (예를 들어 이중특이 항체)， 및 항체 단 편 (예를 들어 가변 영역 및 목적하는 생물 활성 (예를 들어 KRS와의 결합)을 나타내 는 항체의 다른 부분)을 포함한다. 본 발명의 항체는 K S와 선택적으로 결합할 수 있도록 특정 아미노산 서열이 경쇄 및 중쇄 CDR에 포함되어 있는 항체로 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하며， 바람직하게는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체， 인간항체를 모두 포함하며 바람직하게는 인간항체 일 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며， 즉， 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가 능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단 일 항원 에피토프에 매우 특이적으로 결합한다.
"모노클로날"이라는 말은 항체가 실질적인 상동성 집단으로부터 수득되는 것 과 같이 항체의 특성을 나타내는 말이며， 반드시 항체를 특정 방법에 의해 생산해 야 한다는 것은 아니다.
예를 들어， 본 발명의 모노클로날 항체는 문헌 [참조: Kohler et al . (1975) Nature 256： 495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또 는 재조합 DNA 방법 (참조: 미국 특허 제 4, 816, 567호)에 의해 제조할 수 있다. 또 한， 예를 들어 문헌 [참조: Clackson et al . (1991) Nature 352： 624-628 및 Marks et al. (1991) J. Mol . Biol. 222： 581-597 및 Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731]에 기술된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분라 할 수 있다. *본 발명의 항체는 구체적으로 키메라 항체를 포함하며， 이 경우 중쇄 및 /또 는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 기원하거나 또는 특정 항체의 상웅하는.서열과 동일하거나 상동성을 보이지만， 나머지 부분은 본 발명의 항체가 바람직한 생물학 적 활성 (예를 들어 KRS와의 선택적 결합)을 나타내는 한， 다른 종으로부터 기원하 거나 또는 다른 항체의 상웅하는 서열과 동일하거나 상동성을 나타내는 것이어도 무방하다 [참조: 미국 특허 제 4, 816 567호; 및 Morrison et al. , (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81： 6851-6855] .
인간화된 항체는 인간 및 비 -인간 (예: 쥐, 랫트) 항체의 서열을 모두 포함하 는 항체로 일반적으로， 에피토프와 결합하는 부위 (CDR)을 제외한 나머지 부분은 인 간 항체의 것이며， 에피토프와 결합하는 부위 (CDR)는 비 -인간 유래의 서열을 포함 할 수 있다.
완전한 인간항체는 사람 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 말 하며， 마우스， 마우스 세포， 또는 마우스 세포로부터 기원한 하이브리도마에서 생 산하거나， 파지 디스플레이 방법으로 생산할 수 있다. 생체에서 생산되는 천연 항체는 통상적으로， 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 증쇄 (H)로 구성된， 약 150,000 달톤의 이종—사량체성 당단백질이다. 각 경 쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄와 연결되지만， 디설파이드 연쇄수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄들 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으 로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 또한 갖고 있다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)에 이어 수 많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메 인 (VL)을 갖고， 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는데; 경쇄의 불변 도메인은 중 쇄의 제 1 불변 도메인과 정렬되고， 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬 된다. 특별한 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 간에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인' '은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노一 말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 영역은 "VH" 또는' 'VH"로 기재하며， 경쇄의 가변 영역은 "VL" 또는 "VL"로 기재한다. 이들 도메인은 일반적으로， 항체의 가장 가변 부분이고， 항원 결합 부위를 포함한다.
"초가변성 (hypervariable)"이란 용어는 상기 가변 영역 내의 몇몇 서열들이 항체들간 서열에 있어서 광범위하게 상이하며 그의 특이적인 항원 결정인자들에 대 한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 직접적으로 관련되는 잔기들을 포함한다 는 사실을 지칭한다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두에 있어서 초가변성은 상보성 결정부위 (CDR) 또 는 초가변성 루프 (HVL)로서 공지된 3 개의 분절들에 집중된다. CDR은 문헌 [Kabat 등， 1991， In: Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.]에서의 서열 비교 에 의해 한정되는 반면, HVL은 문헌 [Chothia and Le나 1987, J. Mol. Biol. 196:901-91기에 개시된 바와 같이， 상기 가변 영역의 3 차원 구조에 따라 구조적으 로 한정된다. 카바트 (Kabat)에 의해 한정된 바와 같이， CDR-L1은 경쇄 가변 영역 에서 대략 잔기 24-34에， CDR-L2는 대략 잔기 5으56에， CDRL3은 대략 잔기 89-97에 위치하며; CDR-H1은 중쇄 가변 영역에서 대략 잔기 31ᅳ 35에, CDR-H2는 대략 잔기 50-65에， CDR-H3은 대략 잔기 95-102에 위치한다.
상기 중쇄 및 경쇄 각각 내의 3 개의 CDR들은 를 부위 (FR)에 의해 분리되 며， 상기 부위는 덜 가변적인 경향이 있는 서열들을 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지， 상기 FR 및 CDR은 하기의 순서 로 배열된다: FR1 , CDR1 , FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 및 FR4. 상기 FR의 큰 시트 배 치는 상기 각각의 쇄 내부의 CDR을 서로뿐만 아니라 다른 쇄로부터의 CDR에 가깝게 한다. 생성되는 형태는 항원 결합 부위에 기여하지만 (Kabat 등， 1991， NIH Publ . No . 91-3242 , Vol . I， pages 647-669 참조)， 모든 CDR 잔기들이 항원 결합에 직접 관여할 필요는 없다.
본 발명의 항체는 경쇄 및 중쇄 가변영역에 속하는 각 CDR이 각각 특정 서열 을 포함하여， KRS와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하며， 구체적으로 본 발명 의 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)Ll , 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역 (VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서 열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)Hl , 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포 함하는 상보성 결정부위 (CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역 (VH)을 포함하는 항 체일 수 있다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 특정 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역을 포함 할 수 있으며 구체적으로 경쇄가변영역으로 서열번호 13의 137 번째 내지 246 번 째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 13의 1 번째 내지 121 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 가장 바람직하게는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서 열을 포함하는 항체일 수 있다. 본 발명의 항체 단편， 단편 또는 "그 단편" 은 모 항체의 결합 특이성의 적 어도 일부를 보유하는， 전형적으로 적어도 모 항체의 항원 결합의 일부 또는 가변 영역 (예를 들어, 하나 이상의 CDR)를 포함하는 항체의 단편 또는 유도체를 포함한 다. 항체 단편의 예는 Fab , Fab ' , F(ab ' )2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 일본 쇄 (single-chain) 항체 분자， 예를 들어， sc-Fv; 및 항체 단편으로부터 형성된 다 특이적 항체를 포함하지만， 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 항체 단편 또는 유 도체는 해당 활성이 몰 기준으로 표현되는 경우 이의 KRS 결합 활성의 10% 이상을 보유한다. 바람직하게는， 항체 단편 또는 유도체는 모 항체로서의 KRS 결합 친화도 의 적어도 20¾>， 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 또 한， KRS 항체 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미 노산 치환 (항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다. 본 발명의 "결합 화합 물1'은 항체 및 그 단편 둘 다를 나타낸다.
Fab는 하나의 경쇄， 및 하나의 중쇄의 CH1 (제 1 불변 도메인) 및 가변 영역으 로 이루어진다. Fab 분자의 중쇄는 다른 증쇄 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다.
Fc 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 두 개의 중쇄 단편을 함유 한다. 두 개의 중쇄 단편은 두 개 이상의 디설파이드 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
Fab'은 하나의 경쇄， 및 VH 도메인과 CH1 도메인 및 CH1과 CH2 도메인 사이 의 영역을 함유하여 쇄내디설파이드 결합이 두 개의 Fab' 단편의 두 개의 중쇄 사 이에 형성되어 F(ab' )2 분자를 형성하도록 하는 하나의 중쇄의 일부를 함유한다. ■
F(ab')2는 두 개의 경쇄， 및 쇄내 디설파이드 결합이 두 개의 중쇄 사이에 형성되도록 CH1 및 CH2 도메인 사이의 고정 영역의 일부를 함유하는 두 개의 중쇄ᅵ： 를 함유한다. 따라서， F(ab' )2 단편은 두 개의 증쇄 사이의 디설파이드 결합에 의 해 함께 유지되는 두 개의 Fab' 단편으로 이루어진다.
Fv는 중쇄와 경쇄 가변 영역을 모두 포함하지만， 고정 영역이 결여되어 있는 항체 .단편이다.
일본쇄 (single-chain) Fv 또는 scFv는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 나타내며， 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄내에 존재한 다. 일반적으로， FV 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형 성하도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 개요에 대해서는 문헌 [참조: Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol . 113, Rosenburg and Moore eds. Spr inger-Ver lag, New York, pp. 269-315]을 참조한다. 또한， 국제 특허 공개공보 제 W0 88/01649호 및 미국 특허 제 4, 946,778호 및 게 5,260,203호를 참조한다.
디아바디는 2개의 항원ᅳ결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미하며， 여기 서 단편은 동일한 폴리펩티드쇄에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도 메인 (VH) (VH-VU을 포함한다. 동일 쇄 상의 2개 도메인 사이에 페어링을 허용하 지 않는 짧은 링커를 사용하여， 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 페어 링시켜 2개의 항원 -결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는， 예를 들어 유럽 특허 제 404 , 097호; W0 93/11161； 및 문헌 [Hol l inger et al . , Proc . Nat l . Acad . Sc i . USA, 90： 6444-6448 ( 1993) ]에 보다 상세히 기재되어 있다.
선형 항체는 한 쌍의 항원 결합 부위를 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 단편 (VH- CH1-VH-CH1)을 포함하는 항체를 지칭한다. 선형 항체는 예를 들어 문헌 [Zapata 등 1995 , Protein Eng. 8 ( 10)： 1057— 1062]에 개시된 바와 같이 이중특이적 또는 단일 특이적일 수 있다.
"도메인 항체 "는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면 역 기능성 면역글로불린 단편이다.
몇몇 예에저， 두 개 이상의 VH 영역은 펩타이드 링커와 공유결합하여 2가 도 메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 두 개의 VH 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
2가 항체는 두 개의 항원 결합 영역을 포함한다. 몇몇 예에서， 두 개의 결합 영역은 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 2가 항체는 이특이적 (bi speci f ic )일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 당업계에 알려져 있는 방법 예를 들어， 파 지 디스플레이 방법 또는 효모 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. scFv를 제조하는 방법으로는 미국특허 제 4， 946 , 778호 및 제 5， 258， 498호에 기재된 방법이 사용될 수 있으며， Fab , Fab 1 및 F(ab ' )2 단편을 재조합적으로 생성하기 위 한 방법으로는 W) 92/22324 등에 기재된 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물， 조류 등을 포함한 임의의 동물 로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간， 생쥐， 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타， 말 또는 닭의 항체일 수 있다.
인간 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체로서， 인간 면 역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 형질 이식되고 내재적 면역글로불린은 발현하지 않는 동물로부터 분라된 항 체가 포함된다 (미국특허 제 5 , 939ᅳ 598호 참조) .
본 발명의 항체는 효소， 형광 물질， 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한， 힝 에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명은 또한 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호 화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며 ,
DNA분자들 (예를 들어， cDNA 또는 유전체 (genomi c DNA) , RNA 분자들 (예를 들어， mRNA) , 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들( 예를 들어， 펩티드 핵산들 및 비 -자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 -가닥 ( s i ng l e- stranded) 또는 이중 -가닥 (doubl e-stranded)이 될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이면, 그 서열이 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 서열번호 7 내지 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어， 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일 부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당분야 에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법， 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다. 또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공한다.
본 발명의 백터는 본 발명의 항체 또는 그 단편의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며， 일반적으로 시그 날 서열， 복제 기원， 하나 이상의 마커 유전자， 인핸서 요소， 프로모터 및 전사 종 결 서열 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 백터는 바람직하게는 발현백터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시뭔스, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오 티드를 포함하는 백터일 수 있다.
백터의 일종인 플라스미드 (pl asmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결 합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 백터의 다른 형 태는 바이러스성 백터 (vi ral vector ； 예를 들어， 복제 -결핍 레트로바이러스 (replication defective retroviruses), 아데노바이러스들 및 아데노 -연관 바이러 스들 (adenoassociated viruses))이며， 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러 스성 게놈. (viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 백터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포 (예를 들어, 박테리아 유래 (bacterial origin) 및 에피좀의 포유 류 백터 (episomal mammal i an vectors)를 포함하는 박테리아성 백터들 (bacterial vectors)) 내에서의 자가복제 (autonomous repl icat ion)를 할 수 있다. 다른 백터들 (예를 들어， 비-에피좀의 포유동물 백터들 (non-episc)mal ma隱 alian vectors))이 숙 주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈 내로 통합 (integrated)되고 그리고 그- 에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.
발현백터 (expression vector)는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현할 수 있는 백터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시뭔스는， 조절 시퀀스가 상기 폴리 뉴클레오티드 시뭔스의 발현 (예를 들어， 수준， 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우， 상기 조절 시퀀스 (regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결' '된다-. 상기 조절 시뭔스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현 (예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시퀀스는， 예를 들 어， 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들 (예를 들어, 상기 조절 시뭔스 및 /또는 상기 핵산에 결합하는 플리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도록 할 수 있다. 상기 조절 시퀀스에는 프로모터 (promoters), 인: 핸서 (enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 포함된다. 본 발명의 백터는 바람직 하게는 Sfil site에 scFv Insert가 포함된 pCom3x (phagmid) vector일 수 있다. 한편 본 발명은 본 발명의 백터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 세포는 숙주세포는 원핵생물 (예를 들어 대장균)， 진핵생물 (예를 들어 효모 또는 다른 균류)， 식물 세포 (예를 들어 담배 또는 토마토 식물 세포)， 동물 세포 (예를 들어 인간 세포， 원숭이 세포, 햄스터 (hamster) 세포， 집쥐 세포 (rat cell), 생쥐 세포 (mouse cell) 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마가 될 수 있다. 본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이， 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시 엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살 모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimur ium) , 세라티아 (Serratia), 예를 들어， 세 라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli), 예를 들어， 비. 섭틸리스 (B. subtil is) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis), 슈도모나스 (Pseudomonas)， 예를 들어 피 . 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 백터를 발현가능 한 것이면， 특별히 제한되지 아니하나， 바람직하게는 이 . 콜라이， 이에 한정되지 아니하나 예를 들어， 이 . 콜라이 ER2537, 이 . 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이 . 콜라이 W3110 (ATCC 27,325) 또는 LacZ가 발현 가능한 이. 콜라이일 수 있으며， 더욱 바람직하게는 이. 콜라이 ER2537일 수 있다. 본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속， 종 및 균주， 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스품베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주， 예를 들어 케이. 락티스 (K.lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스. (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. ickerami i ) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (Κ· waltii) (ATCC 56,500)， 케이. 드로소필라룸 (K. drosophi larum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모를레란스 ((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누 스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226)； 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070)； 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia (EP 244,234))； 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬바 니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidental is); 및 필라멘트성 진균， 예를 들어 뉴로스포라， 페니실리움 (Penicillium), 를리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙 주， 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) 및 에이. 니거 (niger)가 사용가능 하 다.
한편 본 발명의 세포는 동물세포 특히 척추동물 세포일 수 있다. 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었고 기술들이 폭넓게 이용 가능하다. 이에 제한되지 아니하나, 유용한 포유동물 숙주 세포의 예는 SV40에 의 해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COSᅳ 7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라 이 (현탁 배양으로부터 서브클로닝된 293 또는 293 세포 [Graham 등， 1977， J Gen Virol. 36： 59]), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL10), 차이니즈 햄스터 난 소 세포 /-DHFR" (CHO, Urlaub 등， 1980, Proc. Natl . Acad. Sci. USA 77: 4216； 예 를 들어, DG44), 마우스 세르를리 세포 (TM4, Mather , 1980, Biol . eprod. 23:243-251), 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70)， 아프리카 녹색 원숭이 신장 세 포 (VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2)， 개 신장 세 포 (MDCK, ATCC CCL 34)， 버팔로 랫트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐세 포 (W138,ATCC CCL 75)， 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065)， 마우스 유방 종양 (匪 T 060562, ATCC CCL51), TRI 세포 (Mather 등， 1982, Annals NY. Acad. Sci. 383： 44— 68 ), MRC 5 세포， FS4 세포， 인간 간암 세포주 (Hep G2)ᅳ HEK 293 cell (human embryonic kidney cell) 및 Ex i293FTM cell일 수 있으며， 바람직하게는 CHO cell, HEK 293 cell (human embryonic kidney cell) 또는 Expi293FTM cell일 수 있다. 본 발명의 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 백터로. 형질전환되거나 또는 형질감염 (transfected)될 수 있는 배양된 세포이고, 이는 계 속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세.포는 발현되어야 할 폴리 뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한다. 본 발명의 세포는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하나， 조절 시뭔스가 상기 폴리뉴클레오티 드에 작동 가능하게 연결되도록 상기 세포 내로 도입되지 않는 한 이를 원하는 수 준으로 발현하지 않는 세포가 될 수 있다. 본 발명의 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지， 예컨대 햄 (Ham's) F10 (Sigma— Aldrich Co., St. Louis, M0), 최소 필수 배 지 (MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma— Aldrich Co.), 및 둘베코 (Dulbecco's) 개질 이글 (Eagle's) 배지 (DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양 하기에 적합하다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및 /또는 다른 성장 인자， 염， 완 층액, 뉴클레오티드, 항생제， 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.
본 발명의 배지는 바람직하게는 SB (Bactotrytone 30g, yeast extract 20g, MOPS buffer lOg/L) Medium, FreeStyleTM 293 Medium 또는 Ex i293TM Medium일 수 있다. 한편 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양 하여， 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세 포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함 하는 인간 KRS에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다. 본 발명 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며， 본 발명의 항체를 암호화하는 플리뉴클레오티드를 포함하고 있다.
본 발명 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며， 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다. 이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다.
상기 배양은 상기 .세포의 종류폐 따라 배지조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며， 이는 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지 (supernatant )로 표적화 (targeted)될 수 있으며， 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람작 하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩 (refolding)시키고 기능적 형태 (conformat ion)를 갖도록 하는 것이 바람직하다.
상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 폴리펩타이드의 특성 및 세포의 특성에 따라 달라질 수 있으며， 이는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 세포내， 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직 접 분비될 수 있다. 만약 폴리펩타이드가 세포 내에서 생산되면, 이 세포는 제 1 단 계로서 단백질을 방출하기 위하여 파괴될 수 있다. 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우， 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상 업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터， 예를 들어 Ami con 또는 Mi l l ipor.e Pel l i con 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로 테아제 억제제 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다. 세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동， 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 본 발명 의 항체는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 KRS와 특이적으로 결합하므로 예를 들어， 특 정 세포， 조직, 또는 혈청 내 KRS 발현을 검출하는， KRS 단백질을 검출하고 정량하 기 위한 진단 분석에 유용하다.
따라서 본 발명은 게 1항의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 RS 특이적 검출 방법을 제공 한다.
상기 항체 또는 그 단편을 1검출'하기 위하여, 항체 또는 그 단편은 일반적 으로 검출가능 모이어티로 표지될 수 있다.
예를 들어， 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Col i gen 등， Ed. Wi ley-Interscience, New York, N. Y. , Pubs]에 기술된 기 술을 이용하여, 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 방사능은, 예를 들어， 신틸레이션 계수 (scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며， 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.
또는 다양한 효소 -기질 표지가 이용가능하며， 상기 효소적 표지의 예는 초파 리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 제 4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린 (luciferin), 2，3ᅳ다이하이드로프탈라진디오네스， 말레이트 디하이드로게 나제， 유라제 (urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP0)와 같은 퍼옥시다제， 알칼라 인 포스파타제, β—갈락토시다제， 글루코아밀라제, 라이소자임， 사카라이드 옥시다 제 (예를 들어 글루코스옥시다제， 갈락토스 옥시다제， 및 글루코스ᅳ 6-포스페이트 디하이드로게나제)ᅳ 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다 제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등올 포함한다. 항체에 효소를 접합시키 는 기술은 예를 들어， 문헌 [0' Sullivan 등， 1981， Methods for the Preparation of Enzymeᅳ항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym . (J. Langone & H. Van Vunakis, eds . ) , Academic press, N. Y. , 73： 147一166]에 기 술되어 있다. 표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 간접적으로 접합될 수 있디-. 예를 들어， 항체는 바이오틴에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테 고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과， 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오 틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고， 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항 체에 접합될 수 있다. 또는， 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체 는 작은 합텐 (hapten) (예를 들어， 딕옥신 [digoxin])과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항 -합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨 대 , 항-딕옥신 항체). 따라서， 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있디-. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 경쟁적 결합 분석， 직접 및 간접 샌드위치 분석， 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 진단 킷트 즉， 진단 분석을 수행하기 위한 진단 킷트， 즉 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사 용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에， 킷트는 기질 및 발색단 또는 형광단 을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자 (cofactor)를 포함할 수 있다. 또한， 안정화제， 완층액 (예를 들어， 차단 완층액 또는 용해 완충액) 등 과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석와 민감도를 층분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화 될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제 를 포함하는， 일반적으로 동결건조된， 건조 분말로서 제공될 수 있다. 본 발명의 항체에 의해 검출되는 S는 TNFᅳ α에 의하여 세포 밖으로 분비가 촉진되면 분비된 KRS는 macrophage 세포에 결합하여 활성화 시켜 면역반웅을 유도 하는 것으로 밝혀졌는데 결합된 KRS가 p38 mitogen acti.vivated kinase 등에 의한 신호전달에 의하여 macrophage 세포의 TNF- α에 의한 활성을 증가시키거나 세포의 migration을 촉진시키는 것으로 보고되었다. (Park, S.G. , et al Kim, H.J. , Min, Y.H. , Choi, E.C., Shin, Y.K. , Park, B.J. , Lee, S.W. and Kim, S. 2005 Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger proinflammatory response 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. 102(18), 6356-6361) KRS는 또한 다양한 질환에서 관여하 는 것으로 최근 밝혀지고 있다. 염증성 근육질환 환자에서 KRS에 대한 자가항체가 존재함이 보고 (Gelpi, C. , Kanterewicz, E. , Gratacos, J., Targoff , I. N. & Rodriguez一 Sanchez, J. L. Coexistence of two ant i synthetases in a patient with the ant i synthetase syndrome (1996) Arthritis Rheum. 39, 692-697)되었으며 루게 릭병의 원인이 되는 S0D1 유전자 변이환자에서 KRS가 이 효소에 결합하여 관여함이 (Kunst , C. B. , Mezey , E. , Brownstein, M. J. & Patterson, D. Mutations in S0D1 associated with amyotrophic lateral sclerosis cause novel protein interactions (1997) Nat. Genet . 15， 91-94.)， 또한 최근에는 암세포에서 인산화 된 KRS가 Larainin 수용체의 안정화에 기여함으로 암세포의 전이를 촉진함 (Kim, DG et al Chemical inhibit ion of prometastat ic lysyl-tRNA synthetaselaminin receptor interact ion. (2013) Nat Chem. Biol.)이 보고되었다. 따라서， KRS는 검출을 통해 특정 암 또는 자가면역질환 및 염증성질환의 진 단， 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 암 또는 자가면역질환 및 염증성질환의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에서 RS 단백질을 검출함으로써 수행될 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 항체를 유효성분으로 포함하 는 자가면역질환 진단용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 항체를 유 효성분으로 포함하는 염증성질환 진단용 조성물을 제공한다.
따라서 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 단편의 암 진단용 제제 제조를 위 한 용도를 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 단편의 자가면열질환 진단용 제제 제조를 위한 용도를 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 단편의 염증성질환 진단용 제제 제조를 위한 용도를 제공한다.
따라서 본 발명은 (a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계, (b) 제 1 항의 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 KRS 단백질 수준을 측 정하는 단계 및 (c) 상기 KRS 단백질 수준을 정상 개체의 RS 단백질 수준과 비교 하는 단계로 이루어진 암， 자가면역질환 또는 염증성질환 진단방법을 제공한다. 상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본， 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구 체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직， 추출물， 세포 용해물， 전혈， 혈 장, 혈청, 침, 안구액， 뇌척수액， 땀， 뇨， 젖， 복수액, 활액， 복막액 등일 수 있 다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물， 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출， 농축, 방해 성분의 불활성화， 시약의 첨가 등을 포함할 수 있 다. 또한， 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다. 상기 검출에 관하여는 앞서 설명한 바와 같다. 본 발명의 진단방법은, 정상개체의 생물학적 시료 내 KRS 단백질 수준을 암, 자가면역질환 또는 염증성질환 의심 개체의 생물학적 시료 내 단백질 발현 수준과 비교함으로써 실제 질환 발병 여부를 진단할 수 있다. 즉, 암， 자가면역질환 또는 염증성질환으로 추정되는 생물학적 시료로부터 본 발명의 항체 또는 그 단편을 이 용해 KRS 단백질의 수준을 측정하고， 정상개체의 생물학적 시료로부터 본 발명의 항체 또는 그 단편을 이용해 KRS 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후， 질 환 의심개체의 KRS 단백질 발현 수준이 정상개체의 것보다 더 높으면 이를 해당 질 환으로 진단할 수 있다. 상기 암은 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며， 예를 들어 유방암， 대장암， 폐암， 소세포폐암， 위암, 간암， 혈액암， 골암， 췌장암， 피부암， 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 혹색종, 자궁암， 난소암， 직장암， 항문부근암, 결장암， 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암， 질암， 음문암종， 호지킨병, 식도암， 소장 암， 내분비선암, 갑상선암， 부갑상선암， 부신암， 연조직 육종， 요도암， 음경암, 전 립선암, 만성 또는 급성 백혈병， 림프구 림프종， 방광암, 신장 또는 수뇨관 암， 신 장세포 암종， 신장골반 암종， CNS 종양， 1차 CNS 림프종， 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종 일 수 있으며， 바람직하게는 Laiiiinhi receptor에 작용하여 전이 를 촉진하는 암종， 예를 들어 폐암 또는 췌장암 일 수 있다. 상기 자가면역질환은 예를 들어 크론씨병, 흥반병, 아토피， 류마티스 관절 염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈， 에디슨씨 병， 제 1형 당뇨， 루게릭병， 염증성 근 육질환 (예를들어, 다발성 근염 (polymyosi t i s) , 피부근염 (dermatomyosi t i s) ) , 루프 스, 만성피로증후군, 섬유근육통， 갑상선기능저하증과 항진증， 경피증, 베체트병， 염증성 장질환， 다발성 경화증， 중증 근무력증， 메니에르 증후군 (Meni ere ' s syndrome) , 길리안ᅳ바레 증후근 (Gui l i an-Barre syndrome) , 쇼그렌 증후군 (Sjogren ' s syndrome) , 백반증, 자궁내막증, 건선， 백반증， 전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 류마 티스 관절염， 루게릭병， 다발성 근염 또는 피부근염일 수 있다. 상기 염증성 질환은 이에 제한되지는 않으나， 부종 등과 같은 일반적인 염증 증상을 포함하여 염증성 장 질환, 복막염， 골수염， 봉소염， 췌장염， 외상 유발 쇼 크， 기관지 천식， 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염， 만성 세기관지염， 골관절염， 통풍， 척추관절병증, 강직성 척추 염， 라이터 증후군， 건선성 관절병증， 장질환 척추염， 연소자성 관절병증， 연소자 성 강직성 척추염， 반응성 관절병증， 감염성 관절염， 후-감염성 관절염, 임균성 관 절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염， 진균성 관절염， 매독성 관절염, 라임 병 ， '혈관염 증후군 '과 관련된 관절염， 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염 , 루게릭 육아종증， 류마티스성 다발성근육통， 관절 세포 동맥염 칼슘 결정 침착 관절병증， 가성 통풍.， 비 -관절 류마티즘， 점액낭염， 건초염， 상과염 (테니스 엘보)， 신경병증 성 관절 질환 (neuropathic joint disease; 또는 ' Charcot joint'이라고도 함), 줄 혈성 관절증 (hemarthrosic), 헤노흐—쉔라인 자반병， 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종， 척추측만증 (scoliosis), 혈색소증， 혈색소병증， 고지단백혈증, 저감 마글로불린혈증， 가족성 지중해열 (familial Mediterranean fever), 베체트 병, 전 신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증， 패혈증， 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전， 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease) , 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis) , 급성 폐손상 (acute lung injury), 기관지 폐 형성장애 (broncho-pulmonary dysplasia), 게 2형 당뇨병, 동맥 경화， 알츠하이머성 치매， 가족성 한탱 자가염증 증훈군 (familial cold autoinf lammatory syndrome) , 머클一웰스 증후군 (Muckle_Wel Is syndrome) , 신생아발 병다발염증성질환 (neonatal muti system inflammatory disease) , 만성유아신경피부 관절증루군 (chronic infantile neurologic cutaneous articular syndrome) , 성인발 증형 스틸병 (adult-onset Still's disease), 접촉성 피부염， 포상기태 (hydat idi form mole), PAPA 증후군 (syndrome of pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum, and acne) , 고면역글로불린 D 증후군 (hyper i画 unoglobul in cl syndrome) 및 크리오피린 관련 주기적 증후군 (cryopyrin-associated periodic syndromes)등을 포함할 수 있다. 암， 자가면역질환 및 염증성질환을 진단하는 방법은 본 발명의 항 KRS 항체 또는 그 단편 및 이와 특이적으로 결합하는 KRS 단백질 간에 항체 -항원 반웅을 통 하여 달성될 수 있는데， 본 발명에서 용어 "항원—항체 복합체 "란 암, 자가면역질환 및 염증성질환의 마커인 KRS와 이에 특이적인 본원발명의 항 KRS 항체를 의미하고， 항원 -항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detect ion label)의 시그널의 크기를 통해 서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소， 형광물， 리간드， 발광물， 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경 우 이용 가능한 효소의 예로는 β—글루쿠로니다제， β-D-글루코시다제， β-D-갈락 토시다제， 우레아제， 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제， 아세틸콜린에스테 라제， 글루코즈 옥시다제， 핵소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시 페라제, 포스포프럭토키나제， 포스포에놀피루베이트 카복실라제， 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제， β-라타마제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 형광물의 예로는 플루오레신， 이소티오시아네이트， 로다민, 피코에리테린， 피코시아닌, 알로피코시아닌, 0-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나， 이로 제한되지 않는다. 리간드의 예로는 바이오틴 유도체 등이 있으니-, 이 로 제한되지 않는다. 발광물의 예로는 아크리디늄 에스테르， 루시페린， 루시퍼라아 제 등이 있으나， 이로 제한되지 않는다. 미소입자의 예로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으나， 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자의 예로는 페로센， 루테늄 착화합물， 바이올로젠， 퀴논， Ti 이온， Cs 이온, 디이미드， 1,4-벤조퀴논， 하이드 로퀴논, 4 W(CN)8 ， [Os(bpy) 3 ] 2+ , [RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포 함되나， 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소의 예로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 1251, 1311 ， 186Re 등이 포함되나， 이로 제 한되지 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 인간의 VH3-23/VLlg 유전자를 골격으로 하고 CDR 에 무작위 서열을 삽입하는 라이브러리를 구축하고， KRS와 선택적으로 결합하는 파 지를 선별하여 항체를 분리， 정제 하고 염기서열을 분석하였다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 정제한 항체가 KRS와 결합하는지 western blot 방법으로 확인하였다. 그 결과 본 발명의 항체는 KRS와 결합하는 것을 확인하 였다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 항 KRS scFv 항체와 KRS의 친화도 를 표면공명분석방법으로 측정하였다. 그 결과 본 발명의 항체는 평형해리상수 ΙΟΟηΜ 값을 가져 비교적 높은 친화도를 나타내는 것을 확인하였다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 항 KRS scFv 항체의 교차반응성을 측정하였다. Luminex bead를 이용하여 본 발명의 항체와 KRS를 포함한 8종의 유사 단백질과의 반웅성을 측정한 결과 본 발명의 항체는 KRS를 제외한 다른 ARS 단백질 에는 결합하지 않는 것을 확인하였다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 항 KRS scFv 항체의 진단용 항체 로의 유용성 여부를 실험하였다. 본 발명의 항체로 코팅된 pl ate를 제작한 후， KRS 표준물질을 농도별로 희석하여 반응시키고, 결합여부를 ELISA로 측정하였다. 그 결 과 KRS 표준물질에 대하여 농도 의존적으로 항체 결합이 측정되는 것을 확인하여， 본 발명의 항체가 암 또는 자가면역질환 및 염증성질환 진단용으로 사용될 수 있음 을 확인하였다. . 본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 항 K S 항체를 이용하여 개발된 ELISA 키트를 사용하여 췌장암 환자의 혈액을 분석하여 본 결과 췌장암의 가장 대 표적인 바이오마커인 CA19-9와 동등한 정도로 KRS가 발현되어 있음을 확인하여:, KRS가 암 진단용 바이오마커로 사용될 수 있으며， 본 발명의 항체가 유용함을 확인 하였다.
또한 췌장암의 여러 다른 바이오마커 후보들과 비교 분석하기 위해 mul t iplex bead Assay 키트를 사용하여 다른 바이오마커 후보들을 분석하여 종합 적으로 비교 분석하여 본 결과 다른 바이오 마커에 비해서 KRS가 CA 19-9과 함께 대표적인 암 바이오마커로 사용될 수 있으며 본 발명의 항체가 유용함을 확인하였 다.
【유리한 효과】
따라서， 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 KRS에 특이적으로 결합하며 , 동일한 ARS fami ly를 포함한 다른 단백질과 교차반웅성이 없어 KRS 검출 및 억제가 가능하므로 KRS 검출 및 KRS가 관련된 질환인 암 또는 자가면역질환 및 염증성질환 의 진단에 효과적이다.
【도면의 간단한 설명】 도 1은 본 발명의 항체가 목적단백질인 KRS에 결합하는지를 확인한 western blot 실험 결과이다.
도 2는 본 발명의 항체인 anti-K S scFv Biocon-Kl의 결합친화도를.표면 플 라즈몬 공명 (SPR)으로 측정한 결과 그래프이다 (Kd ： 평형해리상수， 가로축 ： 시간 ( 초)， 세로축 ： response unit(RU)) .
도 3은 본 발명의 항체인 anti— KRS scFv Bioconᅳ Kl의 교차반웅성 (cross activity)을 Luminex Multiplex Assay 방법으로 측정한 결과 그래프이다 (세로축 (FI) ： 형광강도 (fluorescent intensity), WRS ： 트립토파닐 -tRNA 합성효소 (Tryptophanyl-tRNA synthetase), HRS ： 히스티딜— tRNA 합성효소 (Histidyl-tRNA synthetase), NRS ： 아스파라기닐딜 -tRNA 합성효소 (Asparaginyl-tRNA synthetase), KRS ： 리실 -tRNA 합성효소 (Lysyl-tRNA synthetase), SRS ： 세릴 -tRNA 합성효소 (Seryl-tRNA synthetase), YRS ： 타이로실 -tRNA 합성효소 (Tyrosyl— tRNA synthetase), GRS ： 글리실 -tRNA 합성효소 (Glycyl-tRNA synthetase), AIMP1 ： ARS 결합 다기능 단백질 (Aminoacyl_tRNA— synthetase— interacting multifunctional protein 1)) .
도 4는 본 발명의 항체가 KRS를 detection 할 수 있는지를 확인하기 위한 ELISA 실험 결과이다 (세로축 ： 450扇 흡광도， 가로축 ： KRS 표준물질의 농도 (ng/ml )) .
도 5는 본 발명의 항체를 사용하여 정상인 및 암 환자에 있어 혈중 KRS양의 검출 및 상호 비교를 확인하기 위해 본 발명의 항체가 포함된 ELISA 방법으로 정상 인 및 췌장암 환자의 혈청에서 측정한 결과이다. (A: 혈중 KRS 농도， B: 혈중 CA19-9 농도).
도 6은 본 발명의 항체를 이용한 KRS 바이오마커 측정이 췌장암 진단용 주요 바이오마커로 유용성이 있는지 알아보기 위해 여러 바이오마커 후보 군을 ELISA 및 multiplex bead assay 방법으로 측정한 바이오마커 정량값들을 종합적으로 비교 분 석한 결과이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다. <실시예 1> .
scFv 라이브러리 구축 및 항 KRS scFv 선별
<1-1> scFv 라이브러리 구축
scFv 라이브러리는 대한민국특허 10-0961392호에 나온 방법에 따라 구축하였 다.
인간의 VH3-23/VLlg 유전자를 골격으로 하고 상보성 결정부위 (complementar i ty determining regions , CDR)에 무작위 서열을 삽입하는 것으로 라 이브러리를 설계하고， 베타락타메이즈 유전자를 선택마커 (select ion marker )로 가 지는 플라스미드 백터에서 베타락타메이즈 유전자의 리더서열 직후에 제한효소 절 단서열들을 도입하여 pFDV 플라스미드 백터를 제조하고 scFv 유전자 라이브러리를 삽입한 후, 대장균에 형질감염 시킨 후 이를 배양하여 라이브러리를 구축하였다. 이 과정을 통하여 라이브러리 내에서 비정상적인 정지코돈 혹은 프레임시프트 ( fraineshi ft )를 가지는 scFv 유전자 서열을 대부분 제거하여 라이브러리의 품질을 향상시키는 것이 가능하다. 배양된 라이브러리로부터 오류가 제거된 서열들을 중합 효소 연쇄반웅으로 증폭한 후 이로부터 scFv 유전자 라이브러리를 재조합하여 pComb3X 파아지미드 백터에 삽입하고， 이 .콜라이 ER2537 스트레인의 대장균을 형질 감염하여 최종 라이브러리를 획득하였다. 라이브러리를 카르베니실린을 함유하는 SB (Super broth) 배지 400 mL에 배양하고， 600 나노미터에서의 흡광도가 0.5가 되 었을 때 1013 CFU의 VCSM13 보조파아지를 가하여 80 rpm에서 교반하며 1시간동안 섭씨 37도에서 감염시켰다. 여기에 최종 70 ug/mL의 카나마이신 항생제를 넣고 섭 씨 30도， 200 rpm에서 교반하며 밤새 배양하여 scFv가 표면제시된 파지를 생산하였 다. 다음날 아침에 배양액올 원심분리하고 배양액 속의 파지를 4%의 폴리에틸렌글 리콜 -8000과 3%의 염화소듐을 가하여 침전시켰다. 침전된 파지를 50 mL의 PBS 완층 용액에 녹이고， 위와 같은 방식으로 재차 침전하여 최종적으로 2 mL의 PBS 완충용 액에 녹였다. 이를 원심분리하여 이물질을 제거함으로써 파지 scFv 라이브러리를 얻었으며 일반적으로 최종 파지 라이브러리에는 1013 CFU/mL 이상의 파지 입자가 포함된다. .
<1-2> 항 KRS scFv 선별
면역시험관 ( i隱 unotube)에 10 ug/ml 농도의 KRS를 첨가하여 1시간동안 시험 관 표면에 단백질을 흡착시킨 후 분말우유 3% 용액을 시험관에 첨가하여 KRS가 흡 착되지 않은 표면을 보호하였다. 시험관을 비운 후 여기에 분말우유 3% 용액에 분 산된 1012 CFU의 항체파지 라이브러리를 넣어 항원과 결합시켰다. 비특이적으로 결 합한 파지를 TBST (tr i s buf fered sal ine - tween20) 용액으로 3회 씻어낸 후, 남 아있는 항원특이적 파지 항체를 100 mM 트리에틸아민 용액을 이용하여 용리하였다. 용리된 파지를 1.0M 농도의 Tr i s— HC1 버퍼 (pH 7.8)로 중화시킨 후 ER2537 대장균에 37°C에서 1시간 감염시키고， 감염된 대장균을 카르베니실린을 함유하는 LB(Lur i a-Bertani ) 한천배지에 도포하여 37°C에서 배양하였다. 다음날 배양된 대장 균을 3 niL의 SB (super broth) - 카르베니실린 배양액에 현탁하고 15% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -8( C에 보관하고， 나머지 중 50마이크로리터를 20 mL의 SB-카르 베니실린 -2% 포도당 용액에 접종하여 37°C에서 배양하였다. 배양액의 600 나노미터 광선의 흡광도가 0.5가 되면 원심분리하여 박테리아만을 분리하고， 이를 다시 20 mL의 SB-카르베니실린 배양액에 현탁한 후 1012PFU (플라크 형성단위)의 VCSM13 보 조파지를 넣고 서서히 교반하며 37°C에서 배양하였다.
1시간 후 카나마이신 70ug/ml을 첨가하고 30 °C에서 빠르게 교반하며 (250 rpm) 밤새 배양하였다. 다음날 배양액을 원심분리한 후, 파지 입자를 포함하는 상 층액 1 mL을 라이브러리로 사용하여 위의 패닝 과정을 반복함으로써 항원특이적 클 론을 농축시켰다.
<실시예 2>
항 KRS scFv 항체 발현 및 정제
3-4회 정도의 반복적인 패닝 후 항체유전자를 포함하는 대장균을 카르베니실 린을 함유하는 LB 한천배지에 도포， 배양하여 단일 콜로니들을 얻고, 이를 200 uL SB-카르베니실린 용액에 접종， 배양한 후 IPTG로 유도하여 scFv 단백질을 대장균의 페리플라즘 (per iplasm)에서 발현하였다. 대장균을 40 uL의 IX TES (50 mM Tr i s , 1 inM EDTA, 20% Sucrose , H 8.0) 용액에 현탁한 후 여기에 0.2X TES 용액 60 uL를 가하고 섞어서 섭씨 4도에서 30분 이상 처리하고 원심분리하여 상층액으로 페리플 라즘을 추출하였다.
<2-1> KRS에 대해 선별된 scFV 항체 발현
선별된 KRS에 대한 scFv 양성 단일 콜로니 클론을 카르베니실린을 함유하는 SB 배지 (Bactotrytone 30g, yeast extract 20g,M0PS buffer lOg/L)에 5 ml에 배양 하여 seed culture를 시작하여 overnight 배양후 500ml 카네니실린함유 SB배지에 옮겨 0D 600 = 0.5 정도 되었을때 IPTG를 ImM되게 넣어 30도에서 overnight 배양하 여 scFv 단백질을 대장균의 페리플라즘 (periplasm)에서 발현하였다. 다음날 원심분 리하여 수득한 대장균을 IX TES buffer에 (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20% Sucrose , pH 8.0) 현탁한 후 0.2 X TES를 1.5배 첨가하여 섞어주고 원심분리하여 페리플라즘 을 추줄하였다.
<2-2> 선별된 scFv 항체 정제
페리플라즘에서 추출한 scFV 항체에 최종 5 mM MgS04를 가하고 이를 미리 PBS에 평형시킨 Ni-NTA bead 와 섞어 1시간 동안 냉장에서 교반하여 Ni- bead에 결 합시킨후 친화도 크로마토그래피를 수행하여 결합하지 않은 단백질을 PBS로 층분히 씻어내었다. 5 mM Imidazole이 함유된 buffer로 더 충분히 씻어 준 다음 결합한 scFv 항체는 200 mM Imidazole buffer를 이용하여 용출하였다. 용출된 항체는 투석 하여 전기이동을 통해 순도를 확인하고 BCA 방법으로 단백질 정량을 하여 정제된 항체양을 기록후 일정양을 분주하여 넁동 보관하였다.
<2-3> 면역블롯 및 sequencing
페리플라즘에서 추출한 scFv 항체는 면역블롯 (western blot) 기법을 사용하 여 human 세포에서 원래 발현된 KRS에 scFv 항체가 결합하는지 여부를 확인하는 데 사용하였다. 50ug의 Hela cell lysate를 SDS PAGE를 통해 전기이동한 후 Wet transfer 방법으로 Nitrocel lulos membrane에 옮겨 3% skim mi lk로 blocking 한 추출한 scFv 항체를 첨가하여 결합시켰다. 검출을 위해 결합한 scFv에 HRP(horseradish peroxidase)가 연결된 Anti-HA 이차항체를 반웅시킨후 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비 교하여 KRS의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다. 이로부터 확인된 항원특이적 항체 클론은 카베니실린이 함유된 SB 배지 IOII 에 overnight 배양하여 plasmid miniprep kit를 사용하여 plasmid DNA를 추출하여 Capillary sequencing service (Macrogen Co) 를 통해 염기서열을 분석하고 Kabat protein seqeunce database와 IMGT(the international ImMunoGeneTics information system) 분석방법에 근거하여 CDR서열을 분석하였다. 그 결과 KRS 항원과 결합한 scFV의 개수는 총 1 건이며, 이들의 염기서열은 서열번호 14인 것으로 확인되었다.
<실시예 3>
항 KRS scFv 항체의 친화도 측정
KRS 항원에 대한 본 발명 항체의 결합 친화도를 Prote0nTMXPR36 SPR (surface plasmon resonance) 바이오센서 (Bi으 Rad사)를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 약 10 ug/ml의 KRS 항원을 제조사의 설명서에 따라 GLC 칩 (Bio-Rad 6 X 6 sensor chip, Compact capacity amine coupling for protein- protein interact ions)에 약 2,000 내지 4,000 반응 단위 (response unit)로 고정 화시킨 후, PBS를 이용하여 다양한 농도로 희석한 본. 발명의 정제된 scFv 항체 (500-30nM) 30ul씩을 25°C에서 50 ul/min의 속도로 칩에 주압하여 항원과의 상호작 용을 정량하였다. 칩의 표면은 0.85% phosphoric acid로 재생하였으며， ProteOn Manager 소프트웨어를 이용하여 연합 속도와 해리속도를 계산하였고， 평형 해리 상 수 (KD)는 해리속도 /연합속도 비로서 계산하였다 그 결과 [도 2]에서 보는 바와 같이， 본 발명의 항체는 최대 KD ΙΟΟηΜ 값을 가져 비교적 높은 KRS 친화도를 가지는 것을 확인하였다.
<실시예 4>
항 KRS scFv 항체 교차 반응성 (cross activity) 측정 scFv 항체가 다른 항원과 반응성이 있는지 판단하기 위하여 Luminex bead를 이용하여 본 발명의 항체와 KRS 및 다른 ARS family protein과의 교차 반응성을 측 정하였다.
<4-1> 각각의 protein이 결합된 Luminex bead 제조
Code No가 다른 각각의 bead에 protein의 amine 잔기를 결합시키기 위해 Bi으 rad사의 Amine coupling kit의 실험과정에 따라 coupling을 수행하였다. 먼저 1 xl06 에 해당하는 각각의 bead를 96well filter plate로 옮겨 activation buffer 로 vacuum manifold를 이용하여 세척 후 50 mg/ml S-NHS(N一 hydroxysulfosuccinimide)와 50 mg/ml EDAC(l_ethy—3一 [3一 dimethylaminopropyUcarbodiimide)를 첨가하여 상온에서 20 분 활성화시켰디-. 활 성화된 각각의 bead는 PBS로 세척 후 순도 90%이상의 정제된 각각의 재조합 ARS 항 원 즉 WRS.HRS, N S, KRS, SRS, YRS, GRS, ΑΙΜΡ1(ρ43) 10 ug을 첨가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 각각의 ARS에 연결된 bead는 PBS로 2번 세척 후 Blocking buffer를 첨가하여 30분간 상온에서 반응시켜 결합하지 않은 잔기를 blocking 시킨 후 PBS로 2번 세척 후 lOOul PBS에 다시 현탁하고 빛이 차단된 tube에 보관하였다. 결합된 bead의 수는 hemocytometer로 측정하여 기록하였다.
<4-2> Multiplex Assay를 이용한 Cross activity측정
페리플라즘에서 추출된 본 발명의 항체를 검체 회석액 (PBST + 2% BSA.)에 1:400농도로 우선 회석한 다음 96 well filter 플레이트에 검체 희석액으로 순차적 으로 2배씩 희석하여 50ul 씩 분주하였고 항체가 없는 Blank well에는 검체 희석액 만을 첨가하였다. ARS가 결합된 각각의 bead는 well 당 2000 개 bead가 되도록 bead mix tube에 각각 넣고 검체 회석액을 각 well당 50 ul 씩 분주 할 수 있는 부 피만큼 넣어주었다. bead mix용액을 잘 섞은 후 각 well에 분주하여 암실에서 1시 간 동안 반웅 시켰다. 반응이 끝난 후 vacuum manifold를 이용하여 PBS (200 ul/well)로 3번 세척 후 50 ul Anti-(HA)ᅳ biotin 이차 항체를 첨가하여 암실에서 1 시간동안 추가로 반웅시켰다. 이차 항체와 결합한 bead는 PBS로 3번 세척후 형광 표지를 위해 SA-PE (Streptavidin- Phycoerythr in)을 2 ug/ml 되게 첨가하여 암실 에서 30분간 반응시킨 후 PBS 3번 세척과정을 거쳐 PBS lOOul에 다시 현탁하였다. 형광 표지된 bead는 Bio-Plex (Luminex) 200 장비와 Bio—Plex manager 프로그램을 이용하여 형광 세기를 측정한 결과 값을 분석하여 각각의 ARS에 대한 항체의 결합 여부를 확인하였다. . 그 결과 [도 3]에서 보는 바와 같이， 본 발명의 항체는 모든 농도에서 KRS를 제외한 다른 ARS family protein과 반웅하지 않는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 항체는 다른 단백질과 교차 반응성이 없는 것을 확인하였 다. <실시예 5>
정제된 항 -KRS scFv 항체를 이용한 sandwich EL ISA pairing test 본 발명의 항체가 진단용 항체로의 유용성 여부를 알아보기 위해 KRS sandwich EL ISA pairing test를 수행하였다 ELISA 구성중 capture 항체를 본 발명 의 항체로 사용하고 detection 항체를 기존 제품의 rabbit 폴리클로날 항체로 pairing test를 해보아 KRS 표준물질에 대한 정량 곡선이 만들어지는 지를 확인하 였다.
먼저 본 발명의 정제된 항체를 coating buffer (0.1M sodium carbonate H 9.0)에 희석하여 well 당 100 - 400ng 되게 ELISA plate에 lOOul 씩 분주한 후 상 온에서 3시간 방치하였다. PBST로 3번 세척후 2% BSA를 함유한 PBST 350 ul를 첨가 하여 상온에서 1시간 blocking한후 PBST로 3번 세척하였다. 항체를 coating한 plate well에 정제된 재조합 K S 표준물질을 농도별로 검체 회석액에 2배씩 희석하 여 100 ul씩 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응후 plate는 PBST로 3번 세척후 회석된 detection 항체 (4 ug/ml) 100 ul 첨가하여 추가로 상온에서 1시간 반웅하 였다. 검출을 위해 plate를 PBST 3번 세척후 HRP가 연결된 anti-rabbit IgG를 넣어 상온에서 1시간 반응시켜 결합시켰다. HRP에 의한 발색반웅을 보고자 plate를 PBST 로 3번 세척후 HRP 기질인 TMB solution 50 ul를 첨가하여 10분 동안 발색반웅올 보고 2N 황산 50 ul 첨가하여 발색반웅을 멈춘후 ELISA reader를 이용하여 450 ηηι 에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 [도 4]에서 보는 바와 같이 재조합 KRS 표준물질에 대해 ng/ml 농도 에 해당하는 표준 직선이 그려짐을 확인 할 수 있었다. 이로서 본 발명의 항체가 암 진단용으로 사용 될 수 있는 것을 확인하였다.
<실시예 6>
항 KRS 항체를 이용한 췌장암 환자의 혈중 KRS 바이오마커 비교 분석 새로 개발한 KRS 항체를 이용하여 연구용 ELISA 키트 제품개발을 완료하고 이 키트 제품을 이용하여 혈증 KRS 단백질의 췌장암에 대한 바이오 마커로서의 유 용성을 검증하고 환자 혈청의 바이오 마커측정에 개발된 ELISA 키트가 유용하게 쓰일 수 있는지를 확인하기 위해 정상인과 췌장암 환자의 혈정을 받아 실험을 진행 하였다. 한국의 질병관리본부 한국인체자원은행 네트워크로부터 IRB 심의 통과를 얻 고 경북대학교병원으로부터 정상인 (N=8)과 췌장암 환자 (N=16)의 혈청을 받아 실험 을 수행하였다. 혈중 KRS 단백질의 췌장암에 대한 바이오마커로서의 유용성을 검증 하기 위해 기존의 췌장암 바이오마커인 CA19-9의 혈중농도와 비교하여 실험하였다. 본 출원인이 개발한 KRS ELISA 키트 시제품과 상업화 된 CA19-9 ELISA 키트 는 제조자의 지시에 따라 진행하였다. 구체적으로， 항체가 코팅된 96-wel l 플레이 트에 검체 희석액을 첨가하고 1시간 동안 상온에서 방치한 후 세 번 이상 워성버퍼 로 워싱하였다. 디텍션 안티바디를 각 wel l에 첨가한 후 1시간 동안 상온에서 방치 한 후 세 번 이상 워싱 버퍼로 워싱하였다. 2nd 안티바디를 첨가한 후 1시간 동안 상은에서 방치한 후 워싱 버퍼로 세 번 이상 워싱하였다. TMB substrate를 각 wel l 에 넣은 후 빛이 없는 상온조건에서 15분간 방치하고 2N 황산을 첨가하여 발색반응 을 중단한 후 450腿에서 흡광도를 측정하였다.
[도 5]에서 보는 바와 같이， 정상인군과 비교해 췌장암 환자군에서 KRS가 통 계적으로 유의성 있게 (p=0.003) 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과를 췌장암의 단일 바이오마커로 대표적인 CA19-9의 측정값 (p=0.002)과 비교해 볼 때 KRS가 췌장 암에 대한 진단 바이오마커로서 이용 가능성이 크다는 것을 알 수 있으며, 본 출원 인이 개발한 항 KRS 항체가 췌장암의 진단용 항체로서 우수한 효과를 나타낸다는 것을 검증할 수 있었다.
또한 췌장암의 진단에 있어 KRS가 바이오마커로서의 중요성 및 유용성을 살 펴보기 위해 다른 후보 바이오마커들의 측정값과 함께 비교 분석하기 위해 여러 후 보 바이오마커들을 상업화된 ELISA 키트 및 mul t ipl ex bead assay 키트들을 구입하 여 측정해 보았다 측정한 바이오마커들은 모두 KRS , WRS , AIMP1 , CA19-9 , CA125 , IL-8 , CEA , TNF- α , 및 CEACAM-1이며 실험결과는 heatmap 형식으로 표현하였다. 상업용 ELISA ki t와 mul t iplex assay 킷트의 경우는 제조사의 지시에 따라 진행하며 mul t i pl ex assay는 구체적으로， 각각의 바이오마커 안티바디 비드를 2000 비드에 해당하는 용량을 취해 최종용량 3 ml로 맞춘 후 각 wel l에 25 ul씩 첨가하 고, 25 ul의 검체를 각 wel l에 첨가하였다. 4도씨에서 교반하며 overnight 방치하 였다. 각 wel l을 워싱한 후 25 ul의 디텍션 안티바디를 첨가하고 1시간 30분동안 상온에서 방치하였다. 25 ul의 streptav lin-phycoerythr in을 각 wel l에 첨가하고 30분간 상은에서 방치한 후 워싱하였다. 플레이트를 Luminex instrument (Bio-pl ex 200)으로 측정한 후 Medi an Fluorescent Intensi ty 자료로 분석하였다.
[도 6]에서 볼 수 있듯이， 정상인군과 비교해 췌장암 환자군에서 RS와 췌장 암의 단일 바이오마커로 대표적인 CA 19-9이 통계적 유의성으로 증가되어 있음을 알 수 있었다. 또한 다른 후보 바이오마커 측정값들과 비교 해 볼 때 KRS가 췌장암 에 대한 진단 바이오마커로서 이용 가능성이 매우 크다는 것을 알 수 있으며， 본 출원인이 개발한 항 KRS 항체가 췌장암의 진단용 항체로서 우수한 효과를 나타낸다 는 것을 검증할 수 있었다.
【산업상 이용가능성】
이상 살펴본 바와 같이， 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 K S에 특이적 으로 결합하며， 동일한 ARS fami ly를 포함한 다른 단백질과 교차반웅성이 없어 KRS 검출 및 억제가 가능하므로 KRS 검출 및 KRS가 관련된 질환인 암 또는 자가면역질 환 및 염증성질환의 진단 목적으로 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)Ll , 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)L2 및 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)L3을 포함하 는 항체 경쇄가변영역 (VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상 보성 결정부위 (CDR)Hl , 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위 (CDR)H2 , 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 부위 (CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역 (VH)을 포함하는 인간 KRS에 결합하는 항체 또는 그 단편 .
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 항체는 경쇄가변영역으로 서열번호 13의 137 번찌 1 내 지 246 번째 아미노산 서열을 포함하며， 중쇄가변영역으로 서열번호 13의 1 번째 내지 121 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는 인간 KRS애 결합하는 항체 또는 그 단편 .
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 항체는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산서열을 포 함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편 .
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 단편은 디아바디， Fab , Fab ' , F(ab)2 , F(ab ' )2 , Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 단편인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
【청구항 5】
제 1항의 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 6】
제 5항에 있어서， 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 내지 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 7]
제 5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터.
【청구항 8】
제 7항의 백터를 포함하는 세포.
【청구항 9】
게 8항의 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여， 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 KRS 에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법 .
【청구항 10]
제 1항의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 KRS 특이적 검출 방법 .
【청구항 11】
거 U항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
【청구항 12]
제 1항의 항체 또는 그 단편의 암 진단용 제제 제조를 위한 용도.
【청구항 13]
하기의 단계로 이루어진， 개체의 암 진단방법:
(a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 게 1항의 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 RS 단백 질 수준을 측정하는 단계 ; 및
(c) 상기 RS 단백질 수준을 정상 개체의 KRS 단백질 수준과 비교하는 단계.
【청구항 14]
제 1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물.
【청구항 15】
제 1항의 항체 또는 그 단편의 자가면역질환 진단용 제제 제조를 위한 용도.
【청구항 16]
하기의 단계로 이루어진, 개체의 자가면역질환 진단방법:
(a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 제 1항의 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 K S 단백 질 수준을 측정하는 단계 ; 및
(c) 상기 KRS 단백질 수준을 정상 개체의 KRS 단백질 수준과 비교하는 단계.
【청구항 17】.
제 1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 진단용 조 성물. 【청구항 18]
제 1항의 항체 또는 그 단편의 염증성 질환 진단용 제제 제조를 위한 용도. 【청구항 19]
하기의 단계로 이루어진， 개체의 염증성 질환 진단방법:
(a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
(b) 제 1항의 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 생물학적 시료 내 KRS 단백 질 수준을 측정하는 단계 ; 및
(c) 상기 KRS 단백질 수준을 정상 개체의 KRS 단백질 수준과 비교하는 단계.
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